Name: Yetişkin Rats gelen bozulmamış Dorsal Kök Ganglia üzerinde Patch Kelepçe Kayıtlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Keşfedin patch clamp kayıt yöntemini, bozulmamış dorsal kök gangliyonlarında (DRG) tek hücre kaydı yapmak için. Bu teknik, nöronları ve uydu glial hücreleri koruyarak ağrı mekanizmalarının in vivo koşullara yakın şekilde incelenmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, çalışmaya destek verdiği için Painless Research Foundation'a teşekkür eder. Bu çalışma aynı zamanda NIH hibeleri R01 NS080921-01 ve R21 NS079897-01A1 tarafından da desteklenmiştir.

Etik Beyanı: Deney hayvanlarının bakım ve kullanımı için tüm işlemler Hayvan Araştırma UCSF Komitelerinin düzenlemelerine uyulur ve hayvan kullanımı ve bakımı (Yayın 85 NIH düzenlemeleri kurallarına uygun olarak yürütülmüştür - 23 1996 Revize ). UCSF Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi, bu çalışmada kullanılan protokoller onayladı. Göstergeler, Çözümler ve Yemekleri 1. Hazırlık <ol><li> Yapay beyin omurilik sıvısı (CSF) hazırlayın. <ol><li> 10x Düşük katyon çözeltisi, 500 ml ve 10 x bikarbonat çözeltisi (çözelti hazırlanması için Tablo 1 ve 2&#39;ye bakınız) 500 ml hazırlayın. Bir ay içinde 4 o C ve kullanım saklayın. </li><li> bikarbonat çözeltisi, 60 ml 10x Düşük katyon çözeltisi 60 ml karıştırılarak taze aCSF 600 ml hazırlayın ve daha sonra, 600 ml&#39;lik bir nihai hacim elde etmek için deiyonize su 480 ml ekle. Kabarcık aCSF karbojen ileKullanımdan önce en az 10 dakika süre ile (% 5 O2 ve% 95 CO2). </li></ol></li><li> Kılcal Camından Patch Pipet çekin. <ol><li> kayıt pipetler hazırlamak için bir pipet çektirmenin içine ince duvarlı kılcal cam yerleştirin. Laboratuvarda, çektirmenin aşağıdaki ayar parametreleri ideal bir pipet şekli elde etmek için kullanılır: Not: Isı (510), hız (32). bozulmamış DRG kayıt için ideal bir pipet şekli, düşük koni açısına sahip bir kademeli ince konik olmalı, ve bu en iyi deneme yanılma yoluyla elde edilebilir. </li><li> İç çözümleri (çözüm hazırlanması için Tablo 3) ile dolu olduğunda pipet direnci 3-5 MQ olduğundan emin olun. Pipet direnci 18 ölçüm detaylı yöntemi Akson Kılavuzuna bakınız. </li></ol></li><li> 13 birim / ml bir nihai konsantrasyon vermek üzere, aCSF 400 ul kolajenaz 1 mg ekleyin. Daha sonra kolajenaz çözeltisi 20 ul ile her bir cam pipet doldurun. mağaza-20 o C dondurucuda dolu pipetler ve üç hafta içinde bunları kullanmak. </li><li> Soğuk aCSF (yaklaşık 4 ° C) 200 ml hazırlayın. O dondurmak başlayana dek hızla aCSF serin bir beher içine yerleştirmek için, yaklaşık 20 dakika boyunca -20 o C dondurucuda plastik wrap ve yer ile mühür. 10 dakika karbojen bir buz banyosu ve kabarcık behere koyun. Kabarcık oda sıcaklığında karbojen ile aCSF 400 ml kalan. </li><li> CSF soğurken 5 mm bir çapa açıklığı (bu DRG aktarmak için kullanılır) hali için bir plastik tek aktarım pipet ucu kesin. Aşağıdaki cerrahi aletler toplayın: neşter (# 15), Mayo düz ve eğimli makas, ince 2 mm uç rongeur, Adson (dişli) forseps, iris makas, yaylı makas ve iki ince forseps. 3 cam petri içine oksijenli soğuk aCSF (: 10 cm Dış çap) dökün. </li></ol> 2. DRG Diseksiyon <ol><li> sodyum pe ile bir sıçan (200-220 gr) uyutmakntobarbital (100 mg / kg, ip) ve anestezi düzeyi pedal refleks ve göz kırpma refleksi test ederek yeterli olduğunu doğrulayın. </li><li> sıçan anestezi olduğunu doğruladıktan sonra, bel alanı tıraş ve orta hat boyunca deri ve deri altı doku insizyon. ince periost Asansör kullanarak L1-S2 düzeyinde spinöz süreçlerden paraspinal kasları ayırın. </li><li> S2&#39;ye L1 spinöz süreçleri kesmek için kavisli makas kullanın. 2-3 dakika boyunca (adım 1.5 hazırlanmış) maruz vertebra yaklaşık L1 ve S1 enine kesimler yapmak ve en blok vertebral kolonun bu segmenti kaldırmak ve hızlı bir şekilde soğuk aCSF içine daldırın düz Mayo makas kullanın. Sıçan derin pentobarbital anestezisi altında iken lomber DRG&#39;lerde çıkarılmasının ardından, ötenazi ikili torakotomi tarafından yürütülmektedir. </li><li> Kaldırılan vertebral kolon kan ve bağlı doku kapalı yıkayın ve soğuk aCSF ile bir petri transfer. Ulaminalar kaldırmak için iyi bir rongeur se. omurilik maruz microscissors orta hat boyunca dura mater kesin. Yavaşça omuriliği kaldırın ve iris makas kullanarak omurilik kendi giriş noktasında sinir kökleri kesmek, daha sonra omurilik çıkarın. </li><li> Soğuk aCSF ile dolu ikinci petri DRG&#39;li kalan omur aktarın. L4 ve enine süreçler ve siyatik sinir göreceli konumuna göre L5 DRG&#39;ler tanımlayın. Not: sağlam siyatik siniri bakımı L4 ve L5 DRG (siyatik sinir L4-6 spinal sinirlerden kaynaklanan) tanımlamak için yardımcı olacaktır. </li><li> çevreleyen bağ dokulardan DRG&#39;ler boşaltmak için Dumont forseps ve Noyes makas kullanın. DRG&#39;lerde bağlı sinir kökü ve omurilik sinir tutun. </li><li> Daha fazla diseksiyon için üçüncü bir petri içine DRG&#39;ler taşımak için transfer pipet kullanın. </li><li> diseksiyon mikroskobu altında dikkatlice epinöriyuma çevreleyen th mümkün olduğu kadar ortadan kaldırmake DRG. <ol><li> dorsal ve ventral kökleri DRG katılmak ve DRG ventral kök ayrı bir açılış kesmek için Noyes yaylı makas kullanın. epinöriyum tutmak için Dumont # künt ipuçları ile 5 forseps kullanabilir ve epinöriumun gelen DRG rulo başka ince forseps kullanabilir. </li><li> ince forseps kullanarak DRG&#39;lerde olarak çok epinöriumun mümkün olduğunca bağlı kaldırmak için devam edin. Not: iyi parçalara DRG sonraki aşamada iyi bir sindirim edinmek önemlidir. </li></ol></li></ol> 3. DRG Sindirim <ol><li> kayıt odasına DRG aktarın. sinir kökleri aşağı yüzleri köken DRG emin tarafını olun. Not: Bu şekilde, çok nöronlar erişilebilir. </li><li> DRG stabilize bir çapa kullanın. Kayıt teçhizat yanındaki bir masa üzerine yerleştirilir, bir peristaltik pompa ile bağlantılı plastik tüpler aracılığıyla, 0.5 ml / dk&#39;lık bir oranda oksijenli ACSF perfüze DRG. </li><li> Hücreler geri izin 30 dakika bekleyin. CCD kamera aracılığıyla 40X objektif büyütme kızılötesi diferansiyel arayüzü kontrast altında DRG kalitesini (IR-DIC) optik değerlendirin. Not: İyi DRG genellikle birçok yuvarlak, iyi tezat, yüzeyinde uydu glial hücrelerin çevrili nöronlar içerir. </li><li> DRG yüzeyinde küçük bir alanda sindiremez. Not: Cam yama pipetler boru hava geçirmez bir mühür ile cam pipet bağlı izin küçük kaplinlerdir pipet sahipleri, yerleştirilir. <ol><li> Bireysel küçük çaplı kauçuk tüp iki adet aracılığıyla pipet sahiplerine iki 1 ml&#39;lik şırınga bağlayın. pipet sahiplerinin birinin diğeri içine boş bir cam pipet içine kollajenaz ile dolu bir cam pipet koyun. </li><li> Sadece DRG üzerinde pipetler konumlandırmak için Mikromanipülatör kullanın. Sonra, mikroskop büyütme altında, 5- İdeal bir çap pipet uçları (açıklıklar büyütmek için hafifçe birbirine karşı iki pipetler ipuçları çarpışır10 mikron). </li><li> tutucu ve piston yaklaşık 0.5 ml yerinden şırıngayı bağlayan tüp aracılığıyla pipet içeren kollajenaz pozitif basınç uygulayın kısaca yakın DRG yüzeyine enzim dolu pipet hareket ettirin. Not: baskısı altında, pipetle enzimin akışını biraz enzim uygulaması için işareti olarak hizmet verebilir DRG nöronlar arasındaki boşluk büyütmek olacaktır. </li><li> 10 ila 15 dakika sonra, kalan epinöriumun enkaz gözlendiğinde, enkaz emmek için boş pipet nazik negatif basınç uygulayın. Not: Bu şekilde, nöronlar ve çevresindeki uydu glial hücreler açık maruz kalacağı ve yama kayıt için hazırdır. </li><li> kesici kabına iki pipetler atın. </li></ol></li></ol> 4. Patch Kelepçe Kayıtlar <ol><li> Bozulmasını önlemek için buz üzerinde, elektrot çözeltisi (bakınız Tablo 3) yerleştirin. cam yama pipet doldurunsüzülmüş hücre içi çözeltisi (şırınga filtresi, gözenek boyutu: 0.2 um) ve headstage pipet tutucu pipet yerleştirin. banyo çözeltisi içine pipet indirmeden önce 1 ml ilgili pistonu yerinden bir 5 ml şırınga yoluyla pipet nazik bir pozitif basınç uygulayın. Not: Bu taåmadan pipet engeller. </li><li> Daha sonra yazılımı &quot;Membran testi&quot; arayüzü açık, amplifikatör mod düğmesini çevirerek &quot;V-kelepçe&quot; modunu seçin. mikroskop denetiminde hedef nöron yakın pipet hareket ettirin. Not: sağlam TİG hazırlık olarak, uydu glial hücrelerin ince bir tabaka her nöron kapsüller. </li><li> görülmektedir nöron ve uydu glial hücre çevreleyen tabaka arasındaki boşluk ani bir genişleme kadar uydu glial hücre katmanı geçiş yapmak için pipet pozitif basınç uygulayın. Bir &quot;gamze&quot; nöron gözlenen kadar nöron doğru pipet hareket tutun. Not: ile karşılaştırıldığındailişkisiz nöronların kayıtları, pozitif basınç uydu glial hücre tabakası nüfuz ve başarılı yama için şansını artırmak için yardımcı olacak, biraz daha büyük olması gerekir. </li><li> pozitif basınç azaltın. Sonraki, nazik vakum ile bir giga ohm mühür elde. Not: Bu yöntemde, kayıt başarı oranı en az 70% &#39;dir. </li><li> Daha önce 19 açıklandığı gibi tüm hücre kayıt yapılandırmasını alın. <ol><li> Kısaca, bir kısa ama güçlü emme yoluyla nöron hücre zarı nüfuz. emme uygulanırken Alternatif olarak, amplifikatör &quot;zap&quot; işlevini kullanın. </li><li> bir bütün hücre modu kurulduktan sonra, amplifikatör kapasitans ve direnç tazminat düğmeleri çevirerek tüm hücre kapasitans ve seri direnç (Rs) telafi. Not: Rs normalde 5-20 MQ olduğunu. </li><li> Rs başlangıçta 30&#39;dan MQ ise hücreyi terk; kayıt sırasında% 20&#39;den fazla ya da Rs değişir. Ayrıcaistirahat membran potansiyeli ölçmek; istirahat membran potansiyeli mV fazla -50 ise bir hücreyi terk. </li></ol></li><li> &quot;Membran testi&quot; penceresini kapatın. amplifikatör mod düğmesini çevirerek &quot;Ben-kelepçe normal&quot; modunu seçin. </li><li> , Yazılımda &quot;açık protokolü&quot; tıklayın seçin ve rheobase ölçmek için protokol yükleyin. Kaydı başlatmak için &quot;kayıt&quot; tıklayın. giriş direncini ölçün ve 100 pA adımlarla akımları depolarizan kademeli bir dizi enjekte edilerek nöronal uyarılabilirliği incelemek rheobase. <ol><li> Yine &quot;açık protokolü&quot; tıklayın ve membran eşik ölçmek için protokol seçin. rampa akımı (2.000 pA / s) depolarize edici bir 500 ms nöron enjekte edilecektir. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre kaydedilen izleri analiz etmek için veri toplama ve analiz yazılımı (örneğin Clampfit) kullanın. Kararlı durum IV relat temelinde giriş direnci (Rin) hesaplamak için yazılımı kullanınteslim hiperpolarizan akımlar sırasında ionship. rheobase ve membran eşik değerini ölçmek için imleci hareket ettirin. Not: AP oluşturmak için gereken akım genliği rheobase olarak tanımlanır ve AP indüklemek için en düşük voltaj membran eşik olarak tanımlanır. </li></ol></li><li> Ligand Kaynaklı Currents kaydedin. <ol><li> Belirli agonistleri ile bir pipet doldurun. Not: Mevcut yazıda, sırasıyla glutamat reseptörleri ve TRPA1 reseptörlerinin aracılık ettiği akımları ikna etmek için 100 mcM glutamat ve 100 uM AITC kullanılır. </li><li> içinde hiç hava kabarcığı olmadığından emin olmak için pipet kontrol edin. pipet tutucu pipet yerleştirin. ilaç tevzi sistemine bağlanmış bir boru ile pipet tutucu bağlayın. </li><li> nöronun 50 mikron içinde pipet hareket etmek manipülatör kullanın. 1 psi ilaç dağıtım sistem basıncını ve 1 sn süresini ayarlayın. gerilim kelepçe kayıt moduna geçmek ve -70 mV kelepçe. Kısaca bir ilaca bağlı akımı kaydetmek için ilaç dağıtım sistemi üzerinden basınç uygulayın. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of pain.</a> Cell. 139, 267-284 (2009).</li>
<li>Caterina, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+capsaicin+receptor%3A+a+heat-activated+ion+channel+in+the+pain+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway.</a> Nature. 389, 816-824 (1997).</li>
<li>Gong, K., Bhargava, A., Jasmin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GluN2B+N-methyl-D-aspartate+receptor+and+excitatory+amino+acid+transporter+3+are+upregulated+in+primary+sensory+neurons+after+7+days+of+morphine+administration+in+rats%3A+implication+for+opiate-induced+hyperalgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">GluN2B N-methyl-D-aspartate receptor and excitatory amino acid transporter 3 are upregulated in primary sensory neurons after 7 days of morphine administration in rats: implication for opiate-induced hyperalgesia.</a> Pain. 157, 147-158 (2016).</li>
<li>Gong, K., Kung, L. H., Magni, G., Bhargava, A., Jasmin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+response+to+glutamate+in+small+diameter+dorsal+root+ganglion+neurons+after+sciatic+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Increased response to glutamate in small diameter dorsal root ganglion neurons after sciatic nerve injury.</a> PloS one. 9, 95491(2014).</li>
<li>Gong, K., Zou, X., Fuchs, P. N., Lin, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minocycline+inhibits+neurogenic+inflammation+by+blocking+the+effects+of+tumor+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Pharmacol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Minocycline inhibits neurogenic inflammation by blocking the effects of tumor necrosis factor-alpha.</a> Clin Exp Pharmacol Physiol. , (2015).</li>
<li>Ohtori, S., Takahashi, K., Moriya, H., Myers, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+and+TNF-alpha+receptor+type+1+upregulation+in+glia+and+neurons+after+peripheral+nerve+injury%3A+studies+in+murine+DRG+and+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha and TNF-alpha receptor type 1 upregulation in glia and neurons after peripheral nerve injury: studies in murine DRG and spinal cord.</a> Spine. 29, 1082-1088 (2004).</li>
<li>Waxman, S. G., Cummins, T. R., Dib-Hajj, S., Fjell, J., Black, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+channels%2C+excitability+of+primary+sensory+neurons%2C+and+the+molecular+basis+of+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+nerve%22%5BJournal%5D)">Sodium channels, excitability of primary sensory neurons, and the molecular basis of pain.</a> Muscle nerve. 22, 1177-1187 (1999).</li>
<li>Zhang, J. M., Song, X. J., LaMotte, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+excitability+of+sensory+neurons+in+rats+with+cutaneous+hyperalgesia+produced+by+chronic+compression+of+the+dorsal+root+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Enhanced excitability of sensory neurons in rats with cutaneous hyperalgesia produced by chronic compression of the dorsal root ganglion.</a> J Neurophysiol. 82, 3359-3366 (1999).</li>
<li>Dib-Hajj, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+sodium+channel+expression+in+DRG+neurons+in+the+chronic+constriction+injury+model+of+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Plasticity of sodium channel expression in DRG neurons in the chronic constriction injury model of neuropathic pain.</a> Pain. 83, 591-600 (1999).</li>
<li>Cummins, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+persistent+tetrodotoxin-resistant+sodium+current+in+SNS-null+and+wild-type+small+primary+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A novel persistent tetrodotoxin-resistant sodium current in SNS-null and wild-type small primary sensory neurons.</a> J Neurosci. 19, RC43(1999).</li>
<li>Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+dorsal+root+ganglion+neurons+induces+hyperexcitability+that+is+maintained+by+increased+responsiveness+to+cAMP+and+cGMP%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP.</a> J Neurophysiol. 97, 15-25 (2007).</li>
<li>Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitter+phenotype+plasticity+in+cultured+dissociated+adult+rat+dorsal+root+ganglia%3A+an+immunocytochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study.</a> J Neurosci Res. 22, 473-487 (1989).</li>
<li>Hanani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+glial+cells%3A+more+than+just+%27rings+around+the+neuron%27%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron+Glia+Biol%22%5BJournal%5D)">Satellite glial cells: more than just 'rings around the neuron'.</a> Neuron Glia Biol. 6, 1-2 (2010).</li>
<li>Takeda, M., Nasu, M., Kanazawa, T., Shimazu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+GABA%28B%29+receptors+potentiates+inward+rectifying+potassium+currents+in+satellite+glial+cells+from+rat+trigeminal+ganglia%3A+in+vivo+patch-clamp+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activation of GABA(B) receptors potentiates inward rectifying potassium currents in satellite glial cells from rat trigeminal ganglia: in vivo patch-clamp analysis.</a> Neuroscience. 288, 51-58 (2015).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+functional+properties+of+satellite+glial+cells+in+compressed+spinal+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Altered functional properties of satellite glial cells in compressed spinal ganglia.</a> Glia. 57, 1588-1599 (2009).</li>
<li>Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+compression+of+mouse+dorsal+root+ganglion+alters+voltage-gated+sodium+and+potassium+currents+in+medium-sized+dorsal+root+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons.</a> J Neurophysiol. 106, 3067-3072 (2011).</li>
<li>Fan, N., Sikand, P., Donnelly, D. F., Ma, C., Lamotte, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Na%2B+and+K%2B+currents+in+small+mouse+dorsal+root+ganglion+neurons+after+ganglion+compression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Increased Na+ and K+ currents in small mouse dorsal root ganglion neurons after ganglion compression.</a> J Neurophysiol. 106, 211-218 (2011).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+Axon+Guide%22">The Axon Guide</a>. Sherman-Gold, R. , Axon Instruments. Foster City, CA. (2008).</li>
<li>Cummins, T. R., Rush, A. M., Estacion, M., Dib-Hajj, S. D., Waxman, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-clamp+and+current-clamp+recordings+from+mammalian+DRG+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Voltage-clamp and current-clamp recordings from mammalian DRG neurons.</a> Nat Protoc. 4, 1103-1112 (2009).</li>
<li>Zhang, J. M., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+recording+from+the+intact+dorsal+root+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Patch clamp recording from the intact dorsal root ganglion.</a> J Neurosci Methods. 79, 97-103 (1998).</li>
<li>Benn, S. C., Costigan, M., Tate, S., Fitzgerald, M., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+the+TTX-resistant+voltage-gated+sodium+channels+Nav1.8+%28SNS%29+and+Nav1.9+%28SNS2%29+in+primary+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of the TTX-resistant voltage-gated sodium channels Nav1.8 (SNS) and Nav1.9 (SNS2) in primary sensory neurons.</a> J Neurosci. 21, 6077-6085 (2001).</li>
<li>Funakoshi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+development+of+TRPV1-expressing+sensory+nerves+in+peripheral+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Differential development of TRPV1-expressing sensory nerves in peripheral organs.</a> Cell Tissue Res. 323, 27-41 (2006).</li>
<li>Hayar, A., Gu, C., Al-Chaer, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+patch+clamp+recording+and+calcium+imaging+of+neurons+in+the+intact+dorsal+root+ganglion+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved method for patch clamp recording and calcium imaging of neurons in the intact dorsal root ganglion in rats.</a> J Neurosci Methods. 173, 74-82 (2008).</li>
<li>Yagi, J., Sumino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+a+hyperpolarization-activated+current+by+clonidine+in+rat+dorsal+root+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of a hyperpolarization-activated current by clonidine in rat dorsal root ganglion neurons.</a> J Neurophysiol. 80, 1094-1104 (1998).</li>
<li>Ma, C., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+visualization+and+functional+characterization+of+primary+somatic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo visualization and functional characterization of primary somatic neurons.</a> J Neurosci Methods. 191, 60-65 (2010).</li>
<li>Vit, J. P., Jasmin, L., Bhargava, A., Ohara, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+glial+cells+in+the+trigeminal+ganglion+as+a+determinant+of+orofacial+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron+Glia+Biol%22%5BJournal%5D)">Satellite glial cells in the trigeminal ganglion as a determinant of orofacial neuropathic pain.</a> Neuron Glia Biol. 2, 247-257 (2006).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Bu yama kelepçe çalışmaları için bütün DRG&#39;ler hazırlamak için bir yöntem sunulmaktadır. İdeal numune hazırlamak için birkaç önemli unsur vardır. İlk olarak, ekteki dorsal kökleri DRG&#39;ler incelemek için önemlidir. Bundan sonra, epinöriyuma nöronların zarar gelmesini de önler dikkatli bir şekilde çıkarılması gereklidir. Son olarak, nöronlar ve çevreleyen uydu glial hücreler ortaya çıkarmak için, kalan bağ dokusu sindirimi gereklidir. Burada tarif edilen yöntem ile hazırlanan yetişkin farelerin bozulmamış DRG&#39;...

Duyum ​​bir organizmanın hayatta kalması ve iyiliği için gereklidir. uyaranların iletimi birincil duyu nöronların akson periferal uçlarından başlayan duyu yollarıyla bağlıdır. Birincil duyu nöronları, trigeminal sinir mezensefalik çekirdeğin dışında, üçlü gangliyon ve dorsal kök ganglion (DRG) yer almaktadır. Bunlar duyusal bilginin 1 bekçisi olarak hizmet vermektedir. Perikarial membran, sadece santral ve periferal terminallerinde olduğu gibi, DRG nöronlar vb glutamat reseptörleri, TNF alfa reseptörleri, geçici reseptör potansiyeli katyon kanalı alt ailesi V üyesi 1 (TRPV1), sodyum kanallarının, 2 olarak reseptörler ve iyon kanallarını ifade -7. perikarial membran yama kelepçe kayıtları nöron boyunca bu reseptörlerin ve kanalların birçoğu fonksiyonel değişiklikleri anlamaya olanak sağlar. yama kelepçe kayıt tekniği stu için güçlü bir araçtırkanal veya reseptörlerin ve çalışmaların çok sayıda faaliyetlerini ölen DRG nöronlar 8-10 bu tekniği uygulanarak yapılmıştır. Çalışmaların çoğunda DRG dorsal rootlets ve ganglion spinal sinir yakın kesilerek çıkarılır. Ufalamadan sonra ganglion daha sonra kayıttan önce birkaç gün hemen veya kültürlenmiş kaydedilebilir DRG nöronlarının, ayrışma neden sindirim enzimleri yerleştirilir. Ne yazık ki, DRG nöronlarının ayrışma perikaryada yakın gerekli Axotomy içerir. Bir kez ayrışmış ve axotomized, DRG nöronlar membran eksitabilite 11,12 fenotipik değişiklikler yanı sıra değişikliklere uğrarlar. Normalde onları çevreleyen bireysel nöronların perikaryada ve uydu glial hücreleri arasındaki temas kaybı bu değişikliklerden 13 katkıda muhtemeldir. nöronlar ve uydu glial hücreler arasındaki çapraz-karışma fizyolojik koşullarda önemli ve patholog adaptasyonda hemBöyle zorlu ağrı 14,15 lider gibi ical koşullar. Ayrışmış DRG hazırlık kullanarak nöronlar ve uydu glial hücreler arasındaki etkileşimi incelemek için zor olurdu. Bozulmamış DRG Öte yandan, in vivo koşullarında daha yakın bulunur. Son birkaç yıl içinde, laboratuar, hem de başka bir grubu, kronik ağrı 3-5,11,15-17 ile bağlantılı farklı koşullarda birincil duyu nöronlarının değişiklikleri belirlemek amacıyla, yetişkin sıçanlardan sağlam DRG&#39;ler kullanmaktadır. Bu çalışmalarda kullanılan teknikler biraz kurulmuş olmasına rağmen, bir adım-adım bir tanım yapılmamış yayımlanmamıştır. Mevcut yazıda, sağlam DRG&#39;ler ve yama kelepçe kayıtları için kullanımını hazırlamak için uygun ve hızlı bir şekilde açıklanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>Pentobarbital sodyum</td><td>vortech İlaç</td><td></td><td></td></tr><tr><td>şırıngası</td><td>BD</td><td>309659</td><td>1 ml, 5 ml.</td></tr><tr><td>neşter</td><td>BD</td><td></td><td>boyutu: 15</td></tr><tr><td>Mayo düz makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14010-15</td><td></td></tr><tr><td>Mayo kavisli makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14011-15</td><td></td></tr><tr><td>Rongeur</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>16021-14</td><td></td></tr><tr><td>Adson dişli forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>İris Makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Noyes yaylı makas</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>15124-12</td><td></td></tr><tr><td>Kemik makası</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>16044-10</td><td>Kemikleri kesmek için özel.</td></tr><tr><td>Forseps: Dumont, Dumoxel Biologie #5</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11252-30</td><td>Bunlar, ilk satın alındığında bileme gerektirmeyen ince uçlara sahiptir.</td></tr><tr><td>periosteal asansör</td><td>Sklar</td><td>97-0530</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>WILD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipeti</td><td>Fisher marka</td><td>13-711-5AM</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı (10 cm)</td><td>Pyrex</td><td></td><td>Cam petri kabı ince forsepslerin uçlarına zarar vermekten kaçınabilir</td></tr><tr><td>Kollajenaz (Liberaz TM)</td><td>Roche</td><td>05-401-119-001</td><td>13 U/ml konsantrasyonda çözün, alikot cam pipet içine alınır. Tekrarlanan dondurma ve çözülmeden kaçının.</td></tr><tr><td>filtre</td><td>Termo bilimsel</td><td>7232520</td><td>Tıkanmayı önlemek için yama kelepçesi kaydı için dahili çözeltileri filtreleyin.</td></tr><tr><td>Cam pipet</td><td>Sutter</td><td>BF150-110-7.5</td><td></td></tr><tr><td>Ankraj</td><td>Havard aparatı</td><td>64-0250</td>, <td>kaymayı önlemek için DRG'yi stabilize eder.</td></tr><tr><td>Peristaltik pompa</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipet çektirme</td><td>Sutter</td><td>P97</td><td></td></tr><tr><td>Amplifikatör</td><td>Moleküler cihazlar</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>Sayısallaştırıcı</td><td>Moleküler cihazlar</td><td>1440D</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>NIKON</td><td>FN600</td><td></td></tr><tr><td>Mikro manipülatör</td><td>Sutter</td><td>MPC200</td><td></td></tr><tr><td>mikroenjeksiyon dağıtım sistemi</td><td>Genel Valf</td><td>Picrospitzer II</td><td>hızlı ilaç uygulama sistemi</td></tr><tr><td>Karbojen (%95 O2, %5 CO2)</td><td>Yerel Tıbbi Gaz tedarikçisi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

yetişkin rats gelen bozulmamış dorsal kök ganglia üzerinde patch kelepçe kayıtlar

Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats

dorsal kök ganglionlar yama kelepçe çalışmaları (DRG) nöronlar periferik sinir sisteminin anlayışımızı artmıştır. Şu anda, kayıtların çoğunluğu çoğu laboratuvarlar için standart bir hazırlık ayrışmış DRG nöronlar üzerinde yapılmaktadır. Nöronal özellikleri, yine de, ayrışmış nöronların elde kullanılan enzim sindiriminden elde edilen aksonal yaralanma değiştirilebilir. birincil duyu nöronları çevreleyen uydu glial hücreleri ile temas kaybı bu yöntemin kaçınılmaz bir sonuçtur çünkü Dahası, ayrışmış nöron hazırlıkları tam DRG mikro temsil edemez. Bu raporda, yama kelepçe kayıtları için geleneksel ayrışmış DRG nöronlarını kullanarak sınırlamaları aşmak için biz sağlam DRG&#39;ler hazırlamak ve bireysel primer duyu nöronlar ex vivo yama kelepçe kayıtları yapmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım içinde taklit, bozulmamış DRG&#39;lerde hızlı ve basit hazırlık izinonların çevredeki uydu glial hücreler ve bazal membran ile ilişkili DRG nöronlarını tutarak koşulları vivo. Ayrıca, yöntem manipülasyon aksonal yaralanma önler ve bu tür DRG&#39;ler dissociating olduğu gibi sindirim enzim. Ex vivo olarak preparat ek olarak birincil duyu nöronları ve uydu glial hücreler arasındaki etkileşimi incelemek için kullanılabilir.

Şekil 1 yama kayıt için sağlam DRG hazırlama sürecini göstermektedir. Şekil 1A laminektomi. Figure1B sonra ganglionlar maruz kalmasını ve konumunu omuriliği çıkardıktan sonra ekli sinir kökleri ile L3, L4 ve L5 DRG&#39;ler gösterir gösterir. Sonra L4 ve 5 DRG dikkatle disseke ve omurları kurtulmuş oldular. Sonraki, epinöriyuma, DRG çevreleyen şeffaf bir zar, (sarı ok, Şekil 1D) çıkarılır. Epinöriyum ayırmak için en iyi y...

Bu el yazması, yama kelepçesi kayıtları için sağlam dorsal kök gangliyonlarının nasıl hazırlanacağını açıklar. Bu hazırlık, nöronlar ve uydu glial hücreler için mikro çevreyi korur, böylece ayrışmış DRG nöronları kullanılarak görülen fenotipik ve fonksiyonel değişikliklerden kaçınır.

Yetişkin Rats gelen bozulmamış Dorsal Kök Ganglia üzerinde Patch Kelepçe Kayıtlar

Patch clamp studies from dorsal root ganglia (DRGs) neurons have increased our understanding of the peripheral nervous system. Currently, the majority of ...

Bu deneyin genel amacı, bozulmamış dorsal kök gangliyonlarını hazırlama yöntemlerini tanıtmak ve bu hazırlık kullanılarak patch clamp kaydı gerçekleştirmektir. Bu yöntem, giren spinal siniri veya çıkan dorsal kökü stimüle ederken, bozulmamış dorsal kök gangliyonlarından tek hücre kaydı yapılmasına olanak tanır. Bu yaklaşım, özellikle primer duyusal nöronların ağrıya katkısını incelerken kullanışlıdır.Bu tekniğin temel avantajı, hem nöronları hem de bitişik uydu glial hücrelerini korumasıdır. Bu nedenle, bu preparat in vivo duruma daha yakındır. Bu prosedürde, sıçan anestezi altına alındıktan sonra lomber bölgesi tıraşlanır.Ardından, orta hat boyunca cildi ve deri altı dokusunu kesin. Sonrasında, ince bir periost elevatörü kullanarak L1 ile S2 seviyesindeki perispinal kasları spinöz çıkıntılardan ayırın. Daha sonra, L1'den S2'ye kadar olan spinöz çıkıntıları kesin. Ardından, açığa çıkan omurganın yaklaşık L1 ve S1 bölgelerinden iki transvers kesi yapın ve omurganın bu segmentini blok halinde çıkarın.Ardından, numuneyi hızlıca iki ila üç dakika boyunca soğuk aCSF içine daldırın. Bunun ardından, çıkarılan vertebra kolonundaki kanı yıkayın ve vertebra kolonunu soğuk aCSF içeren bir pet

patch-clamp-recordings-on-intact-dorsal-root-ganglia-from-adult-rats

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu video, dendritik membran yüzeyinden yama kelepçesi kaydı için bir tekniği göstermektedir. Bu, dopaminerjik nöronlardaki dendritlerin ve altta yatan voltaj kapılı iyon kanallarının elektriksel özelliklerini doğrudan incelemeye yardımcı olur.

Bir Beyin Dilimindeki Dopaminerjik Nöronun Dendritinden Yama-Kelepçe Kayıtları

Bu video, nöron ateşleme modellerini analiz etmek için tam hücre yama-klemp tekniklerini kullanarak omurilik dilimlerinin substantia gelatinosa (SG) nöronlarında elektrofizyolojik kayıtlar gerçekleştirme prosedürünü göstermektedir. Bu yöntem, omuriliğin SG nöronlarındaki uyaranlara verilen sinirsel tepkilerin incelenmesine izin verir.

Bir omurilik diliminin substantia jelatinosa nöronunda tam hücre yama kelepçesi kaydı

Bu video, reobaz ve membran potansiyelini ölçmek için yama kelepçesi tekniği kullanılarak dorsal kök gangliyonlarındaki duyusal nöron uyarılabilirliğinin incelenmesini ve nöronların artımlı akım enjeksiyonlarına tepkilerini analiz etmeyi göstermektedir.

Sağlam Sıçan Dorsal Kök Gangliyonlarında Tüm Hücre Yama Kelepçesi Kayıtları

Bu video makalede hücre gövdeleri yama kurulum, usul ve nasıl tüm montaj fare retinae ganglion hücrelerinden dinamik kelepçe kayıtları uygulamaya göstermektedir. Bu teknik, eksitatör ve inhibitör sinaptik girdi kesin katkısının incelenmesi ve nöronal spike için göreceli büyüklüğü ve zamanlaması sağlar.

Fare Retina Ganglion Hücreleri Synaptic ve Yapay iletkenlikleri Dinamik Kelepçe Uygulama

GABAerjik presinaptik inhibisyonu motor ve omurilik ağlarında duyusal sinyal entegrasyon için önemli omurilikteki güçlü bir önleyici mekanizmadır. Altta yatan primer afferent depolarizasyon dorsal kök potansiyelleri (DRP) kaydı ile ölçülebilir. Burada farelerde DRP in vivo kayıt için bir yöntem ortaya koymaktadır.

Dorsal Kök Potansiyel Kayıt By Farelerde Spinal Presinaptik Engellenme Ölçme<em&gt; In Vivo</em

Biz genç farelerde omurilik eğik dilim nasıl hazırlanacağını göstermektedir. Bu preparat, ventral köklerin uyarılması için izin verir.

Ventral Kök Stimulation için eğik Omurilik Dilimleri hazırlanması

Hücre altı yama-klemp kayıtları, dendritlerin fonksiyonel özelliklerini araştırma imkanı sunar. Ancak bu ince yapılara küçük çapları nedeniyle kolayca erişilememektedir. Burada açıklanan protokol, dopamin nöronlarının dendritlerinden in vitro dilimler halinde kararlı ve güvenilir kayıtların toplanmasını kolaylaştırmayı amaçlamaktadır.

Nigral Dopamin Nöronlar somatodendritik Domain hücre içi Patch-kelepçe Kayıtlar

Tek lifli kayıt, merkezi ve periferik sinir sistemleri için geçerli olan etkili bir elektrofizyolojik tekniktir. Bağlı siyatik sinir ile bozulmamış DRG hazırlanması ile birlikte, iletim yetmezliği mekanizması incelenir. Her iki protokol de periferik sinir sisteminin ağrı ile ilişkisini geliştirmek.

İletim Yetmezliği Mekanizmasını İncelemek Için Bağlı Siyatik Sinir ile In Vivo Tek Lifli Kayıt ve Bozulmamış Dorsal Kök Ganglion Kullanımı

Burada, iç kulağın vestibüler ganglion ve spiral ganglion nöronlarından diseksiyon, ayrıştırma, kültürleme ve yama-klemp kaydı için ayrıntılı talimatlar sağlayan yöntemler sunulmaktadır.

Patch-Clamp Kayıtları için Yenidoğan Kemirgenlerinden Vestibüler ve Spiral Ganglion Somata'nın İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi

Bu protokol, motor nöronların omurilik stimülasyonuna (SCS) elektriksel tepkilerini yüksek uzay-zamansal çözünürlükle incelemek için bir yama kelepçesi kullanan bir yöntemi açıklar ve bu da araştırmacıların omuriliği ayırma ve aynı anda hücre canlılığını sürdürme becerilerini geliştirmelerine yardımcı olabilir.

Spinal Kord Stimülasyonu Sırasında Motor Nöronlarda Tüm Hücre Yama-Klemp Kaydı için Omurilik Diliminin Ex vivo Hazırlanması

Bu çalışma, senkron EKG kayıtları ile birlikte in vivo kalsiyum görüntüleme için anestezi uygulanmış farelerde T-DRG'yi ortaya çıkarmak için cerrahi bir manipülasyon sunmaktadır. Bu yöntem, periferik elektriksel sinir stimülasyonu ve torasik viseral organ girdilerinin yanı sıra bunların birincil duyusal düzeydeki etkileşimlerini incelemek için son teknoloji bir araçtır.

Periferik Sinir Stimülasyonunu İncelemek için İn Vivo Torasik Dorsal Kök Gangliyonları (DRG) Kalsiyum Görüntüleme ve EKG Kaydı

Keşfedin patch clamp kayıt yöntemini, bozulmamış dorsal kök gangliyonlarında (DRG) tek hücre kaydı yapmak için. Bu teknik, nöronları ve uydu glial hücreleri koruyarak ağrı mekanizmalarının in vivo koşullara yakın şekilde incelenmesini sağlar.

Yetişkin Rats gelen bozulmamış Dorsal Kök Ganglia üzerinde Patch Kelepçe Kayıtlar

Daha fazla video keşfet