Yetişkin Rats gelen bozulmamış Dorsal Kök Ganglia üzerinde Patch Kelepçe Kayıtlar

Bu deneyin genel amacı, sağlam dorsal kök gangliyonlarını hazırlamak için yöntemler tanıtmak ve bu preparasyonu kullanarak yama klemp kaydı yapmaktır. Bu yöntem, giren omurilik sinirini veya çıkan sırt kökünü uyarırken sağlam dorsal kök gangliyonlarından tek hücre kaydına izin verir. Bu yaklaşım, birincil duyusal nöronların ağrıya katkısını incelerken özellikle yararlıdır.

Bu tekniğin temel avantajı, hem nöronu hem de bitişik uydu glial hücreleri korumasıdır. Bu nedenle, bu hazırlık in vivo duruma daha yakındır. Bu prosedürde, sıçan uyuşturulduktan sonra bel bölgesini tıraş edin.

Ardından, cildi ve deri altı dokusunu orta hat boyunca kesin. Daha sonra, ince bir periosteal elevatör kullanarak perispinal kasları L1 ila S2 seviyesindeki dikenli süreçlerden ayırın. Ardından, dikenli işlemleri L1'den S2'ye kesin. Daha sonra, açıkta kalan vertebral kolonda yaklaşık L1 ve S1'de iki enine kesi yapın ve vertebral kolonunun bu segmentini blok halinde çıkarın.

Ardından, iki ila üç dakika boyunca hızlı bir şekilde soğuk aCSF'ye daldırın. Bundan sonra, çıkarılan vertebral kolondaki kanı yıkayın ve vertebral kolonu, soğuk aCSF'li bir petri kabına aktarın, ardından laminaları çıkarmak için ince bir rongeur kullanın. Omuriliği ortaya çıkarmak için dura materini orta hat boyunca mikromakasla kesin.

Daha sonra, DRG ile kalan omurları soğuk aCSF ile doldurulmuş ikinci petri kabına aktarın. L4 ve L5 DRG'leri, enine süreçlere ve siyatik sinire göreceli konumlarına göre tanımlayın. Ardından, DRG'yi çevredeki bağ dokularından serbest bırakın ve sinir kökünü ve omurilik sinirini DRG'ye bağlı tutun.

Bundan sonra, daha fazla diseksiyon için DRG'yi üçüncü petri kabına aktarın. Dorsal ve ventral köklerin DRG'ye katıldığı bir açıklık kesin ve ventral kökü ondan ayırın. Ardından, epineurium'u tutmak için künt uçlu forseps kullanın ve DRG'yi epineuriumdan yuvarlamak için başka bir ince forseps kullanın.

DRG'ye bağlı olan mümkün olduğunca fazla epinöryum çıkarmaya devam edin. Şimdi, DRG'yi kayıt odasına aktarın. DRG'nin sinir köklerinin çıktığı tarafının aşağı baktığından emin olun.

Ardından, DRG'yi bir çapa ile stabilize edin. Daha sonra, DRG'yi peristaltik bir pompaya bağlı plastik tüplerden oksijenli aCSF ile perfüze edin ve hücrelerin 30 dakika boyunca iyileşmesine izin verin. 30 dakika sonra, bir CCD kamera aracılığıyla 40x büyütmede IR-DIC optikler altında DRG kalitesini değerlendirin.

İki adet bir mililitrelik şırınga, iki parça küçük çaplı kauçuk boru ile pipet tutuculara ayrı ayrı bağlandı. Ardından, pipet tutuculardan birine kollajenaz ile doldurulmuş bir cam pipeti ve diğerine boş bir cam pipeti yerleştirin. Ardından, pipetleri DRG'nin hemen üzerine yerleştirmek için mikromanipülatörü kullanın.

Pipet uçlarının açıklıklarını genişletmek için iki pipetin uçlarını hafifçe birbirine çarptırın. Bundan sonra, kollajenaz ile doldurulmuş pipeti DRG yüzeyine yakın hareket ettirin. Pistonu yaklaşık 0,5 mililitre yer değiştirerek tutucuyu ve şırıngayı bağlayan tüp boyunca kollajenaz içeren pipete kısaca pozitif basınç uygulayın.

10 ila 15 dakika sonra, kalan epinöryumun kalıntıları gözlendiğinde, kalıntıları emmek için boş pipete hafif bir negatif basınç uygulayın. Bu şekilde, nöronlar ve çevresindeki uydu glial hücreler net bir şekilde açığa çıkacak ve yama kaydı için hazır olacaktır. Bu prosedürde, bozulmayı önlemek için elektrot çözeltisini buzun üzerine yerleştirin.

Ardından, cam yama pipetini filtrelenmiş hücre içi çözelti ile doldurun. Ardından, pipeti baş aşaması pipet tutucusuna yerleştirin. Pipeti banyo solüsyonuna indirmeden önce pistonu yaklaşık bir mililitre yerinden çıkararak beş mililitrelik bir şırınga aracılığıyla pipete hafif pozitif basınç uygulayın.

Ardından, amplifikatörde V-Clamp modunu seçin ve yazılımdaki membran test arayüzünü açın. Mikroskop altında, pipeti hedef nörona yaklaştırın. Daha sonra, nöron ile çevresindeki uydu glial hücre tabakası arasında ani bir boşluk genişlemesi gözlenene kadar uydu glial hücre tabakasını geçmek için pipetten pozitif basınç uygulayın.

Ardından, nöron üzerinde bir çukur görülene kadar pipeti nörona doğru hareket ettirmeye devam edin. Hazırlığımızda, nöronlar uydu glial hücrelerle çevrilidir. Bu nedenle, glial hücre katmanlarına nüfuz etmek ve tek tek nöronlara ulaşmak için, kayıt pipeti yüksek bir pozitif basınçta tutulur.

Bundan sonra, pozitif basıncı azaltın. Nazik emiş ile giga-ohm'luk bir sızdırmazlık elde edin. Tüm hücre kayıt konfigürasyonunu elde etmek için, kısa ama güçlü bir emme yoluyla nöron hücre zarına nüfuz edin.

Alternatif olarak, emme uygulanırken amplifikatör üzerindeki zap işlevini kullanın. Bir bütün hücre modu oluşturulduktan sonra, amplifikatör üzerindeki kapasitans ve direnç kompanzasyon düğmelerini çevirerek tüm hücre kapasitansını ve seri direnci telafi edin. Ardından, membran test penceresini kapatın.

I-Clamp Normal Modu üzerindeki mod düğmesini çevirerek amplifikatörü seçin. Daha sonra, tıklayın Protokolü aç yazılımda. Reobaz ölçümü için protokolü seçin ve yükleyin ve kayda başlamak için kayda tıklayın.

Nöronal uyarılabilirliği incelemek için, 100 pikoamperlik adımlarla kademeli bir dizi depolarize edici akım enjekte ederek giriş direncini ve reobazı ölçün. Ardından, Protokolü Aç'a tekrar tıklayın ve membran eşiğini ölçmek için protokolü seçin. Daha sonra, nörona 500 milisaniyelik bir depolarize rampa akımı enjekte edin.

Ligand kaynaklı akımları kaydetmek için, bir pipeti belirli agonistlerle doldurun. İçinde hava kabarcığı olmadığından emin olmak için pipeti kontrol edin. Ardından, pipeti bir ilaç dağıtım sistemine bağlı olan pipet tutucusuna yerleştirin.

Pipeti nöronun 15 mikrometre yakınına taşımak için manipülatörü kullanın. İlaç dağıtım sistemi basıncını bir PSI'ye ve süreyi bir saniyeye ayarlayın. Ardından, kayıt modunu 70 milivoltta voltaj kelepçesine geçirin.

İlacın neden olduğu bir akımı kaydetmek için ilaç dağıtım sistemi aracılığıyla kısaca basınç uygulayın. Bu şekilde, reobaz, DRG nöronuna bir dizi akım enjekte edilerek ölçülmüştür. Bir aksiyon potansiyelini indükleyebilecek en düşük akım yoğunluğu, okla gösterildiği gibi reobaz olarak tanımlanır.

Bu nöronun reobazı 300 pikoamperdir. Membran eşiği, bir rampa akımı enjekte edilerek ölçüldü. Potansiyel, bir aksiyon potansiyeli uyandırıldığında zar eşiği olarak tanımlanır.

Bu nöron için zar eşiği 11.9 milivolttur. Bu şekilde, akımlar bir saniye boyunca glutamat veya AITC'nin puff uygulamasıyla indüklenmiştir. Her iki agonist de içe doğru akımları indükledi, bu da küçük DRG nöronlarında glutamat reseptörlerinin ve TRPA-1 reseptörlerinin varlığını düşündürdü.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa bir saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, epineurium'u çıkarmayı ve kayıt pipeti için yüksek basıncı korumayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, uydu glial hücrelerdeki reseptörler ve kanallar gibi ek soruları yanıtlamak için uydu glial hücreler üzerinde yama kelepçesi kaydı yapılabilir.

Bu teknik, ağrı alanındaki araştırmacıların dorsal kök gangliyonlarının nosisepsiyona katkısını incelemelerinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, bütün bir dorsal kök gangliyonunun nasıl hazırlanacağı ve daha sonra bu tüm dorsal kök gangliyonları üzerindeki tek hücrelerden kelepçenin nasıl yamalanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.