Name: Dev ünilamellar vesikül (GUV) membranlanna bağlanan, HIV-1 Gag Görselleştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Keşfedin, HIV-1 Gag proteininin dev ünilamellar vesikül membranlarına bağlanmasını görselleştirme yöntemini. Bu teknik, lipid-protein etkileşimlerini incelemek ve viral montaj mekanizmalarını anlamak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz yararlı tartışmalar için Mohammad Saleem, Jing Wu ve Krishnan Raghunathan teşekkür etmek istiyorum. Biz de çekimler sırasında yardım için Priya Begani teşekkür ederiz. Bu eser (AO) R01 AI071727 ve (SLV için) R01 GM110052 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından hibe desteklenmektedir.

1. Gün: buğday tohumu Lizat tabanlı In Vitro Transkripsiyon-çeviri Sisteminin Kullanılması Gag Proteinlerin İfadesi HIV-1 Gag hazırlanması 1. <ol><li> (-20 ºC diğer reaktifler buğday tohumu lizatları -80 ºC &#39;de saklanır) dondurucular ticari buğday tohumu CECF kiti tüm reaktifleri çıkarın. Buz üzerine çözülme ve Tablo 1 &#39;de gösterildiği gibi, bileşenler karışımı. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Mix-1 (Besleme mix) </td><td></td></tr><tr><td> besleme çözümü </td><td> 900 ul </td></tr><tr><td> Amino asitler </td><td> 80 ul </td></tr><tr><td> metionin </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td> Genel Toplam </td><td> 1000 ul </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Karışım-2 (Lizat mix) </strong&gt; </td><td></td></tr><tr><td> wheatgerm lizatları </td><td> 15 ul </td></tr><tr><td> RNaz ücretsiz su </td><td> 7 ul </td></tr><tr><td> Amino asitler </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> metionin </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> TE tamponunda Plasmid DNA (1 ug / ul) ** </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> Reaksiyon tampon Maddesi </td><td> 15 ul </td></tr><tr><td> RNasin * </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> Genel Toplam </td><td> 50 ul </td></tr></tbody></table> Tablo 1: buğday tohumu reaksiyonları için gerekli olan karışımların bileşimler. Not: Deney bağlayıcı Gag zar üzerinde RNaz RNA çıkarılması etkisini incelemek üzere tasarlanmış ise, RNaz içermeyen su ile ribonükleaz inhibitörleri değiştirin. Plazmid DNA, üretici talimatlarına uygun olarak yabancı maddelerden arındırılmış olmalıdır. Bununla birlikte, slasmids alışılmış kullanılarak hazırlandı, ancak endotoksin içermeyen plazmit izolasyonu teçhizatı başarılı bir şekilde kullanılmıştır değildir. Üreticinin talimat da nükleaz içermeyen suda çözünmüş DNA kullanılmasını önerir. TE [10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA ihtiva eden (pH 7.4)] içinde süspanse edilmiş DNA kullanılarak durumunda, TE içinde EDTA verim etkileyebilir, çünkü DNA daha düşük konsantrasyonlarını kullanmayın. 0.8-1 mg / ml bir konsantrasyon aralığında TE tamponu içinde çözülmüştür plazmid başarıyla kullanılmıştır. <ol start="2"><li> İlk reaksiyon kaset (saydam odacık) içine Besleme karışımı (Mix-1) ekleyin. Sonra diğer odasının (kırmızı) için lizat karışımı (mix-2) ekleyin. kendi odalarına karışımları eklerken bu çözüm bileşenlerinin verimsiz alışverişi yol ve bu nedenle reaksiyon etkinliğini azaltabilecek herhangi bir kabarcıkları tanıtmak etmeyin. </li><li> kiti ile sağlanan yapışkan film ile odaları kaplayın. </li><li> Kaset tutucu ve doğmuş iyileşmesini içine reaksiyon kaset takınte bir Eppendorf Termomikserin R. 900 rpm sabit sallayarak hızında 24 ° C&#39;de 24 saat süreyle montaj </li></ol> 2. Gün: Electroformation ve Hasat buğday tohumu Lisatlardan hazırlayın GUVs GUVs 2. hazırlanması <ol><li> Böyle teflon gömlekleri ile kaplı ve Parafilm ile sarılmış, vidalı kapakları cam şişelere kloroform veya kloroform karışımları ve metanol gibi inorganik çözücüler içinde çözünmüş Kısım lipidler. Hamilton-tipi cam şırınga ile lipidler Kulp, ya da varsa, kloroform dayanıklı plastik ipuçları. -20 ºC dondurucu GUV hazırlanması için kullanılacak lipit içeren cam şişeleri dışarı atın. <ol><li> Şişeler oda sıcaklığına dengelenir sonra, lipid süspansiyonlar açık görsel inceleme ile emin olun. Bu palmitoil-oleoil fosfatidilserin (POP) ve PI (4,5) P2 gibi lipitler, özellikle asidik lipidler, kalitesi, başarılı bir şekilde deneyler için önemlidir. olan lipidler kullanmayındaha uzun bir süre, 2 ay boyunca parçalar halinde. </li></ol></li><li> istenen sıcaklığa ısı bloğu önceden ısıtmak. Bu sıcaklık en Tm lipid (ler) in erime sıcaklığı (Tm) en az 5 ° C daha yüksek olmalıdır. </li><li> İstenilen molar lipit oranlarına göre ihtiyaç duyulan lipid hacimleri hesaplayın. Tablo 2&#39;de gösterildiği gibi, burada bağlama HIV-1 Gag eğitim için aşağıdaki molar oranları kullanın. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> lipid karışımı </td><td> Molar oran </td><td> Hacim (ul içinde) </td><td> stok konsantrasyonu </td></tr><tr><td> POPC + kol POPS </td><td> 46,6 + 23,3 + 30 </td><td> 19,74 + 10,18 + 6,57 </td><td> POPC, POPS, Kol: 10 mg / ml </td></tr><tr><td rowspan="2"> POPC + POPS + Chol + Beyin-PI (4,5) P2 </td><tdrowspan = &quot;2&quot;&gt; 40 + 20 + 30 + 10 </td><td rowspan="2"> 16,11 + 8,3 + 6,25 + 58,19 </td><td> POPC, POPS, Kol: 10 mg / ml </td></tr><tr><td> Beyin-PI (4,5) P2: 1 mg / ml </td></tr></tbody></table> Tablo 2: Farklı lipit Birimleri GUVs elde etmek için kullanılır. <ol start="4"><li> Temiz vidalı kapaklı bir cam viyal içine lipidlerin, istenen miktarlar ekleyin. </li><li> Kullanım (katalogda tarif edildiği gibi) boyutlarında 25 x 50 x 1,1 mm 3 ve direnç 70-100 omega slaytlarını ITO kaplı. Temiz bir bankta iki ITO kaplı slaytlar yerleştirin. Her electroformation bölmesi iki indiyum-kalay-oksit (İTO) kaplı cam slaytlar gerektirir. cam slayt iletken yan bir multimetre kullanarak direnç kontrol ederek yukarı baktığından emin olun. Yaklaşık 200 Ω değeri göstermesi gerekir. slaytlar yüzeyi hafifçe havsız mendil kullanarak% 70 etanol ile silerek temiz olduğundan emin olun. </li><li> ri ile şırınganın iğne dış yüzeyi temizlemekloroform ile nsing ve ısı bloğu üzerine şırınga yerleştirin. </li><li> yukarı bakacak şekilde iletken tarafı ısı bloğu üzerinde yeni bir ITO-kaplı cam slayt yerleştirin ve genellikle istenilen sıcaklığa yaklaşık 2-3 dk gelmesini sağlayınız. cam slaytlar İTO kaplama prosedürleri temizlik esnasında hasar görmüş olabilir o potansiyel bir risk için ITO-kaplı cam slaytlar tekrar kullanmayın. </li><li> üniforma ve cam slayt lipitlerin yayılması henüz hızlı için her slayt için lipit karışımı 40-50 ul hacmi kullanın. kloroform gibi uygun bir organik çözücü ile toplam hacmi ayarlayın. <ol><li> Cam slayt lipid karışımın toplam hacminin yarısına yerleştirin ve hemen (slaytta iğne 2-3 kez hareketli) muntazam bir lipid filmi terk etmek için temizlenir şırınga (aşama 2.6) kullanarak lipid yayıldı. İnce İTO kaplama zarar görmemesi için yavaşça (ama hızlı bir şekilde) lipit sürün. Düzgün olmayan yayma ya da sub-optimal yol açabilir yayılan kabaverimleri veya GUVs hesaplama heterojen. </li><li> Bu nedenle, sonraki adıma geçmeden önce yayılmış lipit filmi inceleyerek üniforma yayılmasını sağlamak. Filmin donukluk aşırı olmayan üniforma belirirse, yeni bir slayt kullanarak işlemini tekrarlamanız. </li></ol></li><li> kaplanmış yüzü yukarı bakacak şekilde bir Petri kabı içine kaplı slayt yerleştirin. </li><li> Tekrarlayın başka ITO kaplı slayt kullanarak karışımın geri kalanı için 2.6-2.9 adımları tekrarlayın. </li><li> Organik çözücülerin arındırıldı 60-90 dakika boyunca geleneksel bir vakumlu kurutma bölmesi içinde kayar her ikisini ihtiva eden bir petri tabağına yerleştirin. </li><li> Bu işlem sırasında, ısıtma bloğu (çoğu durumda 65 ° C) ve önceden sıcak 300 mM inkübatör sukroz çözeltisi ile aynı sıcaklığa inkübatör ayarlayın. </li><li> Kuruduktan sonra, tezgah petri getirmek ve temiz bir yüzeye cam slayt yerleştirin. </li><li> Yavaşça% 70 etanol ve kuru o Comple kullanarak bir PDMS conta (Şekil 1) temizlemektely. </li><li> Şekil 1 &#39;de gösterilen ve yavaşça ve sıkıca conta şekilleri bir su geçirmez sızdırmazlık böylece pres lipid kaplı cam slayt üzerine yerleştirin. PDMS conta ve slayt arasındaki boşlukların olmaması onaylayın. Bu sakroz çözeltisi sahip sığ bir bölme oluşumu ile sonuçlanır. </li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig1.jpg" /> Şekil 1:. Electroformation için kullanılan ITO kaplı cam slayt düzeni <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54293/54293fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol start="16"><li> herhangi kabarcığı olmadan önceden ısıtılmış sakaroz çözeltisi ile odasına doldurun. </li><li> sıkı bir mühür yapmak için üstüne başka kaplı slayt yerleştirin. hava kabarcığı olmadığından emin olun. Son montaj Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi. Görünür bölmesi usin sabitleyin olmalıdırg bağlayıcı klipleri. </li></ol><img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig2.jpg" /> Şekil 2:. Electroformation odasının (yandan görünüm) şematik gösterimi <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54293/54293fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol start="18"><li> Aspirasyon ile aşırı sukroz çıkarın ve tüy bırakmayan bir mendil kullanarak slaytları temizleyin. iletken taraf bar üniforma temas böylece bakır bara slaytlar sabitleyin. cam slayt sadece bir iletken tarafı bir bakır çubuk ile temas halinde olduğundan emin olun. </li><li> timsah klipleri kullanarak fonksiyon jeneratörü çıkışına bakır çubuğu bağlayın. Montaj istenen sıcaklığa gelmesini sağlamak için inkübatör içinde grubunu yerleştirin. </li><li> 10 Hz, sinüs dalga frekansı ve 90 dakika için 1 V&#39;lik bir potansiyel farkı uygulanması. ensurŞekil 3 &#39;de gösterildiği gibi gerilim multimetre 1 V e. 90 dakika süreyle işleme devam edin. </li></ol><img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54293/54293fig3.jpg" /> Şekil 3:. Multimetre gelen elektrotlar sıklığını ve akımı ölçmek için yerleştirilir hangi pozisyonları <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54293/54293fig3large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol start="21"><li> 90 dakika sonra, yavaşça 2 Hz azaltılması ve başka bir 10 dakika daha electroformation devam edin. Bu süre boyunca, nitro için reaksiyonlarda hasat (3.1-3.2 adım). </li><li> fonksiyon jeneratörü kapatın ve montaj (inkübatör kapatarak ve biraz açılmış inkübatör kapı bırakarak) yavaş yavaş oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. </li><li> Soğuduktan sonra, jeneratör kabloları çıkarınslayt meclisleri. GUVs çok kırılgan olması ve bu nedenle de çok yavaşça ele alınması gerekir. Dikkatle tezgah derleme getirmek. </li><li> yavaşça forseps kullanarak üst slayt kaldırarak odasına sökün. temiz bir tüpe bir kesim 1,000 ul ucu ve transfer kullanarak sükroz süspansiyon içeren GUVs hasat. GUVs aksamaması için tüp hafifçe tutun. </li><li> Hemen GUVs kullanın. Oda sıcaklığında depolandığında GUVs hasattan sonra en az 90 dakika boyunca stabildir. </li></ol> 3. Hasat İn Vitro Çeviri Reaksiyonları <ol><li> Bir tüp içine mikropipet kullanarak kırmızı odasından istenilen proteinleri içeren in vitro çeviri reaksiyonlar hasat. </li><li> , Toplu proteinler kaldırmak bir masaüstü santrifüj üzerinde 15 dakika süreyle 16,200 xg&#39;de lizatları dönmeye ve dikkatli bir tüp içine süpernatant aktarmak için. </li></ol> 4. GUV Bağlanma Tahlili <ol><li> bir kesim ucu kullanarak, 5 mix1 &#39;dir; çevrilmiş proteinlerin bir tüp içinde GUVs 5 ul ihtiva eden in vitro çeviri reaksiyonlar, L ve 2-3 dakika için oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Temiz bir kapak kayma küçük bir delik (3-4 mm çapında) bir PDMS levha takın ve hafifçe ve sıkıca lamel karşı basarak sıkı sızdırmazlık sağlamak. </li><li> küçük deliğe adım 4.1 10 ul karışımı yerleştirin. </li><li> Resim oda sıcaklığında ters epi veya konfokal floresan mikroskobu altında karışımı ile gerçekleştirilmektedir. Not: buharlaşmasını önlemek için, görüntüleme odası, bir lamel ile kaplı olabilir. </li></ol>

<ol><li>Chukkapalli, V., Inlora, J., Todd, G. C., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+in+support+of+RNA-mediated+inhibition+of+phosphatidylserine-dependent+HIV-1+Gag+membrane+binding+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Evidence in support of RNA-mediated inhibition of phosphatidylserine-dependent HIV-1 Gag membrane binding in cells.</a> J Virol. 87 (12), 7155-7159 (2013).</li>
<li>Chukkapalli, V., Oh, S. J., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+mechanisms+involving+RNA+and+lipids+regulate+HIV-1+Gag+membrane+binding+through+the+highly+basic+region+of+the+matrix+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Opposing mechanisms involving RNA and lipids regulate HIV-1 Gag membrane binding through the highly basic region of the matrix domain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (4), 1600-1605 (2010).</li>
<li>Chukkapalli, V., Hogue, I. B., Boyko, V., Hu, W. S., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+Gag+matrix+domain+and+phosphatidylinositol-%284%2C5%29-bisphosphate+is+essential+for+efficient+gag+membrane+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Interaction between the human immunodeficiency virus type 1 Gag matrix domain and phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate is essential for efficient gag membrane binding.</a> J Virol. 82 (5), 2405-2417 (2008).</li>
<li>Zhou, W., Parent, L. J., Wills, J. W., Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+membrane-binding+domain+within+the+amino-terminal+region+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+Gag+protein+which+interacts+with+acidic+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of a membrane-binding domain within the amino-terminal region of human immunodeficiency virus type 1 Gag protein which interacts with acidic phospholipids.</a> J Virol. 68 (4), 2556-2569 (1994).</li>
<li>Ono, A., Ablan, S. D., Lockett, S. J., Nagashima, K., Freed, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol+%284%2C5%29+bisphosphate+regulates+HIV-1+Gag+targeting+to+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol (4,5) bisphosphate regulates HIV-1 Gag targeting to the plasma membrane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14889-14894 (2004).</li>
<li>Saad, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+targeting+HIV-1+Gag+proteins+to+the+plasma+membrane+for+virus+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11364-11369 (2006).</li>
<li>Shkriabai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+HIV-1+Gag+with+assembly+cofactors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interactions of HIV-1 Gag with assembly cofactors.</a> Biochemistry. 45 (13), 4077-4083 (2006).</li>
<li>Vlach, J., Saad, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trio+engagement+via+plasma+membrane+phospholipids+and+the+myristoyl+moiety+governs+HIV-1+matrix+binding+to+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Trio engagement via plasma membrane phospholipids and the myristoyl moiety governs HIV-1 matrix binding to bilayers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3525-3530 (2013).</li>
<li>Anraku, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+analysis+of+the+interaction+between+HIV-1+Gag+and+phosphoinositide+derivatives+based+on+surface+plasmon+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive analysis of the interaction between HIV-1 Gag and phosphoinositide derivatives based on surface plasmon resonance.</a> Biochemistry. 49 (25), 5109-5116 (2010).</li>
<li>Llewellyn, G. N., Grover, J. R., Olety, B., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Gag+associates+with+specific+uropod-directed+microdomains+in+a+manner+dependent+on+its+MA+highly+basic+region%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Gag associates with specific uropod-directed microdomains in a manner dependent on its MA highly basic region.</a> J Virol. 87 (11), 6441-6454 (2013).</li>
<li>Inlora, J., Chukkapalli, V., Derse, D., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gag+localization+and+virus-like+particle+release+mediated+by+the+matrix+domain+of+human+T-lymphotropic+virus+type+1+Gag+are+less+dependent+on+phosphatidylinositol-%284%2C5%29-bisphosphate+than+those+mediated+by+the+matrix+domain+of+HIV-1+Gag%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Gag localization and virus-like particle release mediated by the matrix domain of human T-lymphotropic virus type 1 Gag are less dependent on phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate than those mediated by the matrix domain of HIV-1 Gag.</a> J Virol. 85 (8), 3802-3810 (2011).</li>
<li>Inlora, J., Collins, D. R., Trubin, M. E., Chung, J. Y., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+binding+and+subcellular+localization+of+retroviral+Gag+proteins+are+differentially+regulated+by+MA+interactions+with+phosphatidylinositol-%284%2C5%29-bisphosphate+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Membrane binding and subcellular localization of retroviral Gag proteins are differentially regulated by MA interactions with phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate and RNA.</a> MBio. 5 (6), e02202(2014).</li>
<li>Valentine, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+micelle+encapsulation+of+membrane-anchored+proteins+for+solution+NMR+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Reverse micelle encapsulation of membrane-anchored proteins for solution NMR studies.</a> Structure. 18 (1), 9-16 (2010).</li>
<li>Dick, R. A., Goh, S. L., Feigenson, G. W., Vogt, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Gag+protein+can+sense+the+cholesterol+and+acyl+chain+environment+in+model+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Gag protein can sense the cholesterol and acyl chain environment in model membranes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), 18761-18766 (2012).</li>
<li>Dick, R. A., Kamynina, E., Vogt, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+multimerization+on+membrane+association+of+Rous+sarcoma+virus+and+HIV-1+MA+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Effect of multimerization on membrane association of Rous sarcoma virus and HIV-1 MA proteins.</a> J Virol. 87 (24), 13598-13608 (2013).</li>
<li>Alfadhli, A., Still, A., Barklis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+matrix+binding+to+membranes+and+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Analysis of human immunodeficiency virus type 1 matrix binding to membranes and nucleic acids.</a> J Virol. 83 (23), 12196-12203 (2009).</li>
<li>Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+vesicles+formed+by+gentle+hydration+and+electroformation%3A+a+comparison+by+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).</li>
<li>Needham, D., McIntosh, T. J., Evans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermomechanical+and+transition+properties+of+dimyristoylphosphatidylcholine%2Fcholesterol+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermomechanical and transition properties of dimyristoylphosphatidylcholine/cholesterol bilayers.</a> Biochemistry. 27 (13), 4668-4673 (1988).</li>
<li>Darszon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassembly+of+protein-lipid+complexes+into+large+bilayer+vesicles%3A+perspectives+for+membrane+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reassembly of protein-lipid complexes into large bilayer vesicles: perspectives for membrane reconstitution.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (1), 239-243 (1980).</li>
<li>Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+electroformation%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discuss.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Liposome electroformation.</a> Faraday Discuss. Chem. Soc. (81), 303-311 (1986).</li>
<li>Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P. h, Faucon, F., Bothorel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+giant+vesicles+by+external+AC+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Progr+Colloid+Polymer+Sci%22%5BJournal%5D)">Preparation of giant vesicles by external AC electric fields.</a> Progr Colloid Polymer Sci. 89, 127-131 (1992).</li>
<li>Stachowiak, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unilamellar+vesicle+formation+and+encapsulation+by+microfluidic+jetting%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (12), 4697-4702 (2008).</li>
<li>Yamauchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+consensus+motif+for+N-myristoylation+of+plant+proteins+in+a+wheat+germ+cell-free+translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">The consensus motif for N-myristoylation of plant proteins in a wheat germ cell-free translation system.</a> FEBS J. 277 (17), 3596-3607 (2010).</li>
<li>Olety, B., Veatch, S. L., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol-%284%2C5%29-Bisphosphate+Acyl+Chains+Differentiate+Membrane+Binding+of+HIV-1+Gag+from+That+of+the+Phospholipase+Cdelta1+Pleckstrin+Homology+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol-(4,5)-Bisphosphate Acyl Chains Differentiate Membrane Binding of HIV-1 Gag from That of the Phospholipase Cdelta1 Pleckstrin Homology Domain.</a> J Virol. 89 (15), 7861-7873 (2015).</li>
<li>Morales-Penningston, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GUV+preparation+and+imaging%3A+minimizing+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">GUV preparation and imaging: minimizing artifacts.</a> Biochim Biophys Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).</li>
<li>Veatch, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electro-formation+and+fluorescence+microscopy+of+giant+vesicles+with+coexisting+liquid+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases.</a> Methods Mol Biol. 398, 59-72 (2007).</li>
<li>Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+peroxides+promote+large+rafts%3A+effects+of+excitation+of+probes+in+fluorescence+microscopy+and+electrochemical+reactions+during+vesicle+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Lipid peroxides promote large rafts: effects of excitation of probes in fluorescence microscopy and electrochemical reactions during vesicle formation.</a> Biophys J. 91 (6), 2172-2183 (2006).</li>
<li>Montes, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroformation+of+giant+unilamellar+vesicles+from+native+membranes+and+organic+lipid+mixtures+for+the+study+of+lipid+domains+under+physiological+ionic-strength+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroformation of giant unilamellar vesicles from native membranes and organic lipid mixtures for the study of lipid domains under physiological ionic-strength conditions.</a> Methods Mol Biol. 606, 105-114 (2010).</li>
<li>Olety, B., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+played+by+acidic+lipids+in+HIV-1+Gag+membrane+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Roles played by acidic lipids in HIV-1 Gag membrane binding.</a> Virus Res. 193, 108-115 (2014).</li>
<li>Keller, H., Krausslich, H. G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimerizable+HIV+Gag+derivative+binds+to+the+liquid-disordered+phase+in+model+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multimerizable HIV Gag derivative binds to the liquid-disordered phase in model membranes.</a> Cell Microbiol. 15 (2), 237-247 (2013).</li>
<li>Carlson, L. A., Hurley, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reconstitution+of+the+ordered+assembly+of+the+endosomal+sorting+complex+required+for+transport+at+membrane-bound+HIV-1+Gag+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vitro reconstitution of the ordered assembly of the endosomal sorting complex required for transport at membrane-bound HIV-1 Gag clusters.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (42), 16928-16933 (2012).</li>
<li>Gui, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+minimal+in+vitro+system+for+analyzing+HIV-1+Gag-mediated+budding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Phys%22%5BJournal%5D)">A novel minimal in vitro system for analyzing HIV-1 Gag-mediated budding.</a> J Biol Phys. 41 (2), 135-149 (2015).</li>
<li>Prevost, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRSp53+senses+negative+membrane+curvature+and+phase+separates+along+membrane+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules.</a> Nat Commun. 6, 8529(2015).</li>
</ol>

Çatışan çıkarlarımız olmadığını beyan ederiz.

Yukarıda açıklandığı gibi GUV bağlama deneyi diğer protein-lipid etkileşim deneyleri kendi sınırlamaları vardır senaryolarda iyi bir alternatif sunuyor. Bu tahlil bize çift katlı lipid bağlamında yerli uzunlukta açil zincirleri ile miristoillenmiş tam uzunlukta Gag ve asidik lipidler arasındaki etkileşimi incelemek ve Gag-lipit yüksek yoğunluklu sakaroz geçişlerini veya diğer post-bağlayıcı işleme yoluyla uzun yüzdürme santrifüj olmadan bunu sağlar kompleksleri. Bir başka avantaj Gag davranışı kolaylıkla gibi yüzey plaz...

İnsan bağışıklık yetersizliği virüsü tip 1 (HIV-1), çoğu hücre tiplerinde de toplanır ve plazma membranı (PM) ile ilgili tomurcukları zarflı bir virüstür. HİV-1 virüs parçacıklarının montajı Pr55 GAG (GAG) olarak adlandırılan 55 kDa viral çekirdek proteini ile tahrik edilir. Gag dört ana yapısal alana, yani, matris kapsid nükleokapsid ve P6, ve iki aralayıcı peptit SP1 ve SP2 arasında oluşan bir ön-madde poliprotein olarak sentezlenir. Montaj sırasında, matris (MA) etki montaj sitesine Gag hedeflenmesi sorumludur, kapsid (CA) etki Gag-Gag etkileşimlerini aracılık, nükleokapsid (NC) etki viral genomik RNA acemi ve p6 acemi ev sahibi faktörler yardım plazma membran virüs partikül kesme. Gag aynı zamanda, N-terminal ucunda bir 14-karbonlu yağlı asit ya da miristat parçasının ilave edilmesi ile bir ko-translasyonel modifikasyon maruz kalır. Gag bağlayıcı Membran m beri viral montaj için temel bir gerekliliktirbağlama zarda arızalı utants virüs parçacıkları üretmek için başarısız olur. çift ​​katlı lipid ve son derece temel bir bölge olarak adlandırılan MA etki alanı içinde temel kalıntıların bir küme (hidrofobik etkileşimler aracılık N-terminal miristat yarımı: Biz ve diğerleri MA etki alanı içinde ikili sinyaller aracılık Gag bağlanmasının o zarı göstermiştir PM 1-4 asidik lipidler ile etkileşime HBr). Polyphosphoinositide 5-fosfataz IV (5ptaseIV), AM-özel bir asidik fosfolipid phosphatidylinositol- hidrolizini katalize eden bir enzim, ektopik ekspresyonu ile Gag-membran etkileşim çalışmalar (4,5) -bisphosphate [PI (4,5) P2] fosfatidilinositol-4-fosfat, hücrelerde Gag-PM localisation PI (4,5) P2 3,5 aracılık ettiğini göstermiştir. Bununla birlikte, in vitro çalışmalar, gag-PI (4,5) P fazla mekanik detayları kavramaya yönelik 2 etkileşimlerinin bir takım nedenlerden için zor olduğu kanıtlanmıştır. İçinÖrnek biyokimyasal deneyler için tam boyda saflaştırılması miristoillenmiş HIV-1 Gag bağlı saflaştırma sırasında agregasyon GAG eğilimi en azından kısmen, teknik olarak zor olmuştur. Dolayısıyla, bu tür Myr-MA ya Myr-MS-CA, ya da olmayan miristoillenmiş form olarak, HIV-1 Gag kesilmiş biçimleri sık sık, Gag saflaştırmayı gerektirmektedir çalışmalarda kullanılmıştır (örneğin, nükleer manyetik rezonans, bir protein ayak izi ve yüzey plazmon rezonans 6-9). Seçenek olarak ise, in vitro transkripsiyon için reaksiyonlarda bağlanmış diğer biyokimyasal çalışmalar 1,2 tam uzunluktaki miristoillenmiş HIV-1 Gag üretilmesi için kullanılmıştır. Tipik haliyle, bu sistemde, bir GAG kodlayan plazmid transkripsiyonu ve herhangi bir hücresel membranlar ve haberci RNA yoksun transkripsiyon ve çeviri için makine içeren ökaryotik hücre lizatları (örneğin, tavşan retikülosit lizatları) ile çevrilmiştir. Tepkimeden sonra, Gag içeren hücre lizatları bana karıştırılırlipidler ile Gag etkileşimlerin analizine mbranes. Gag miristoillenmiş tam uzunluktaki hazırlama kolaylığı ile birlikte, in vitro transkripsiyon için sistemi kullanan yöntemler Gag sentezi ve takip eden membran bağlanma reaksiyonları daha fizyolojik koşulları temsil edebilir bir &quot;ökaryotik sitosol benzeri &#39;ortamda meydana gelen bir avantaja sahiptir. Bu özellik MA etki bağlı RNA molekülleri Gag rekabetçi bir şekilde 1,2,10-12 asidik lipidler bağlanmasını düzenleyen olduğunu gösterdi çalışmalara katkıda bulunmuştur. Bu hücre lizatları elde Gag proteinleri toplam miktarı, yüksek değildir Ancak, radyo-etiketli amino asitler protein metabolik etiketleme bunların saptanması için gereklidir. yöntemine bağlı olarak gag-lipit etkileşimi ölçmek için, membran preparatları çeşitli kullanılmıştır. Bu yöntemlerin her biri kendi güçlü ve sınırlamaları vardır. En NMR bazlı deneyler, kısa asil lipidlerin kullanımını gerektirirsuda çözünen (örneğin, C4 ve C8-PI (4,5) P2) 6,8 olan zincirler. NMR yöntemler geliştirilmektedir hücrelerde bulunan uzun bir asil zincirine sahip lipidler GAG bağlanma test ederken, şu ana kadar 8,13 yalnızca miristoillenmiş veya nonmyristoylated MA kullanılmıştır. Seçenek olarak ise, yerel uzunlukta açil zincirlerine sahiptir lipidlerden hazırlanan lipozomlar, örneğin lipozom yüzdürme veya floresan lipozom boncuk bağlama analizleri 2,3,10,14-16 biyokimyasal yöntemler kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu deneylerde kullanılan lipozomlar, küçük çaplı, ve böylece de bunların membranlar, dik ve pozitif eğriliğe sahiptir. Bunun aksine, HIV-1 ile enfekte olmuş hücrelerde partikül tertibatının erken aşamasında, Gag yaklaşık GAG ölçekte düzlemsel PM, bağlanan ve daha sonra filizlenen sırasında negatif bir eğrilik indükler. Bu nedenle, dik ve pozitif eğrilik ile lipozom membranlar Gag-lipit etkileşimleri çalışmak için ideal bir lipit bilayers olmayabilir. Lipozom flot gelinceation deneyleri, başka potansiyel ihtar deneysel sonucunu etkileyebilecek santrifüj sırasında hipertonik sakaroz degrade Gag-lipit komplekslerinin olduğu maruz kalmasıdır. Bu sınırlamaları azaltmak ve tamamlayıcı bir deneysel sistem sağlamak için, Gag dev tek lamelli vesiküller (GUVs) bağlanma için deneyler, son yıllarda geliştirilmiştir. GUVs çapları onlarca mikrometre büyüklüğünde uzanır, tek iki tabakalı vesiküllerin husule bulunmaktadır. Böylece, bu membranların eğrilik Gag ölçeğinde PM benzer. Üstelik, optik mikroskoplar altında görsel denetim sağlayan büyük boyutu, membran kolayca Gag-lipit komplekslerinin sonraki işlem olmadan tespit edilebilir karıştırma üzerine bu veziküller floresan etiketli veya etiketli Gag bağlayıcı proteinlerin. Burada, bir electroformation yöntemiyle elde GUVs kullanarak bağlama, HIV-1 Gag membran incelemek için bir protokol açıklar. Böyle nazik hidrasyon, jel destekli hidrasyon, mikrofon olarak çeşitli yöntemlerrofluidic püskürtme ve electroformation 17-22 GUVs elde edilmesi için kullanılmıştır. Burada tarif edilen protokol için, electroformation yöntemi asidik lipidler ve pahalı düzeneklerinin gerek kalmadan kullanılması da göreli kolaylıkla GUVs oluşturulmasında öncelikle kendi verimliliği kullanılır. GAG görselleştirme bir flüoresan raportör zorunlu kıldığı için, sarı floresan proteini (YFP) genetik GAG (gag-YFP) C-terminaline ilave edilmiştir. Gag-YFP proteinleri sürekli değişimi sürekli akışı (CECF) teknolojisine dayalı buğday tohumu lizatlarında in vitro transkripsiyon ve çeviri reaksiyonları ile elde edilir. Bu teknolojide, tepki ve reaksiyon, substrat ve enerji bileşenlerinin besleme önleyici yan her iki kaldırma, bir diyaliz tabanlı bir mekanizma elde edilir. Bu reaksiyonlar için, bir T7 promoterinin kontrolü altında gag-YFP kodlayan bir plazmid kullanılır. Daha önce gösterildiği gibi notun, buğday tohumu lizatları ek bileşenler 2 olmadan miristoillenmesi destek3,24. Bu yöntemi kullanarak, GUV zarları 24 Gag görselleştirilmesi için gag-YFP miristoillenmiş tam boy yeterli miktarlarda elde etmek mümkün olmuştur. Burada, HIV-1 Gag PI bağlanma hangi bir protokol açıklar (4,5) P2 GUV membranları ihtiva-eden bağlanma reaksiyonları, aşağıdaki ve bu yöntem, bağlanma tahlilleri, önceden var olan gag-membran tamamlar ve olabilir teklif uzun sonradan bir işleme tabi tutulmadan incelenebilir ek bağlanma HIV-1 Gag-membran anlamak için genişletilmiş.

<table><tbody><tr><td>Dijital Multimetre</td><td>Meterman</td><td>30XR</td><td>Direnç ve volt ölçebilen genel bir multimetre amaca hizmet edecektir.</td></tr><tr><td>Fonksiyon Üreteci</td><td>Instek</td><td>GFG-8216A</td><td>10 Hz ve 1 V'ta sinüs dalgası üretebilen genel bir fonksiyon üreteci yeterlidir.</td></tr><tr><td>ITO kaplı cam kaydıraklar</td><td>Delta Technologies, Loveland, CO</td><td>CG-90IN</td><td></td></tr><tr><td>Kuluçka makinesi</td><td>Hoefer</td><td></td><td>Sıcaklığı doğru bir şekilde koruyabilen herhangi bir inkübatör yeterli olacaktır</td></tr><tr><td>Vakum odası</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td>21516-166</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga</td><td>Hamilton</td><td>80400</td><td>Ölçer 22S, Şırınga numarası 702</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Sylgard elastomer taban kiti, Dow-Corning</td><td>Sylgard, 184</td><td></td></tr><tr><td>RTS 100 Buğday Ruşeymi CECF Kiti</td><td>BiotechRabbit, Berlin, Almanya</td><td>BR1401001</td><td></td></tr><tr><td>DiD</td><td>Life Technologies, Carlsbad, CA&nbsp;</td><td>D7757</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti Polar Lipidler, Alabaster, AL&nbsp;</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>POPS</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>840034C</td><td></td></tr><tr><td>Kolesterol</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>700041P</td><td></td></tr><tr><td>Beyin-PI(4,5)P2&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>840046X</td><td></td></tr></tbody></table>

dev ünilamellar vesikül (guv) membranlanna bağlanan, hiv-1 gag görselleştirme

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

HIV-1, yapısal bir protein, Pr55 Gag (veya Gag) virüs montaj sırasında hücrelerin plazma zarına bağlanmaktadır. Gag bağlayıcı Membran viral parçacık üretimi ciddi bozulmaya Gag membran bağlama sonuçlarında bir kusur beri virüs parçacık oluşumu için önemli bir adımdır. Gag-lipid membran etkileşimlerin mekanik ayrıntıları elde etmek için, in vitro yöntemler, NMR protein ayak izi, yüzey plazmon rezonansı, lipozom flotasyon santrifüj veya floresan lipit boncuk göre, şimdiye kadar geliştirilmiş bağlanma. Bununla birlikte, bu, in vitro yöntemler, her birinin kısıtlamaları vardır. Bu sınırlamaların bazılarının üstesinden gelmek ve daha önce kurulmuş yöntemleri tamamlayıcı bir yaklaşım sağlamak için, biz HIV-1 Gag ve lipid membranların arasındaki etkileşimleri bir &quot;hücre benzeri&quot; bir ortamda gerçekleştiği in vitro testi geliştirdi. Bu testte, Gag lipid zarlar bağlanabilen görsel YFP tagge kullanılarak analiz edilird Gag buğday sentezlenen vitro çeviri sistemi ve bir electroformation tekniği ile hazırlanan GUVs içinde germ-merkezli. Burada arka plan açıklamak ve protokoller tahlil için gerekli miristoillenmiş tam uzunlukta Gag proteinleri ve GUV membranlar elde etmek ve mikroskopi ile bağlayıcı Gag-Şef algılamak için.

<html> Yukarıdaki protokolü kullanarak, POPC + POPS + Chol oluşan GUVs hazırlanan (: 4.66: 2.33: mol oranında 3). Bu bileşim, yaklaşık PM PS ve kolesterol konsantrasyonları yansıtacak şekilde seçildi. Beyin-PI (4,5) P2 POPC + POPS + Kol karışımın içine dahil edildiğinde Sağlam ve Gag bağlayıcı verimli yalnızca gözlendi (POPC + POPS + Chol + beyin-PI (4,5) P2 [molar oran 4: 2: 3: 1] örnekte) (Şekil 4, A ve C) panel B ve D karşılaştırın. POPC + oluşan ...

Burada, HIV-1 Gag ve lipid membranları arasındaki etkileşimlerin, buğday tohumu bazlı in vitro translasyon sisteminde sentezlenen YFP etiketli Gag ve bir elektroformasyon tekniği ile hazırlanan GUV'ler kullanılarak görsel olarak analiz edildiği bir in vitro membran bağlanma testini gösteriyoruz.

Dev ünilamellar vesikül (GUV) membranlanna bağlanan, HIV-1 Gag Görselleştirme

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Bu prosedürün genel amacı, dev tek tabakalı vezikül membranları üzerindeki HIV-1 Gag bağlanmasını görselleştirmektir. Bu yöntem, Biyo Montaj alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, farklı osteo zincirli lipidlerin membran bağlanmasındaki rolleri veya vitro viral Gag proteinleri gibi virostruktürel proteinlerin rolleri gibi konular.Bu tekniğin temel avantajı, Gag'ın membran bağlanmasının dev tek katmanlı vezikül membranları üzerinde görsel olarak tespit edilebilmesidir. Karıştırmanın hemen ardından tespit yapılması, potansiyel olarak zararlı ve uzun süren karıştırma sonrası işlem adımlarını ortadan kaldırır. HIV-1 Gag hazırlığı metin protokolünde açıklanmıştır ve GUV'lar hazırlanmadan bir gün önce tamamlanmalıdır.Lipid stoklarını dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığına gelmesini bekleyin. Bu sırada, ısıtma bloğunun sıcaklığını, kullanılan lipidlerin en yüksek erime sıcaklığından en az beş derece santigrat daha yüksek olacak şekilde ayarlayın. Bu gösterimde sıcaklık, kullandığımız en yüksek sıcaklık olan 65 derece santigrat olarak ayarlanmıştır.Lipidler inorganik çözücülerde çözülmeli, Teflon kapaklı cam şişelerde saklanmalı ve Parafilm ile sarılmalıdır. Çözündükten sonra, süspansiyonların berrak olduğundan emin olun. İstenen molar/lipid oranlarına göre gerekli lipid hacimlerini hesaplayın.Ardından, hesaplanan hacimleri Hamilton tipi cam şırınga gibi kloroforma dayanıklı bir cihaz kullanarak temiz, vidalı kapaklı, cam bir flakona paylaştırın. Toplam hacmi kloroform gibi uygun bir organik çözücü ile ayarlayın. Daha sonra, her bir elektroformasyon odası için iki yeni ITO kaplı lam hazırlayın.Bir multimetre kullanarak direnci kontrol edin; direnç yaklaşık 200 ohm olmalıdır, böylece lamın iletken tarafının yukarı baktığından emin olun. Ardından, yüzeylerini %70 etanol ve tüy bırakmayan mendiller kullanarak nazikçe temizleyin. Sonrasında, şırınga iğnesinin dış yüzeyini kloroform ile durulayarak temizleyin ve şırıngayı ısıtma bloğuna yerleştirin.Temizlenmiş ITO kaplı lamları, iletken yüzeyleri yukarı bakacak şekilde ısıtma bloğuna yerleştirin. Birkaç dakika içinde lamlar hedef sıcaklığa ulaşacaktır. Ardından, lamlardan birine 40 ila 50 µL lipid karışımı ekleyin.Lipid hızlıca, ancak mümkün olduğunca homojen bir şekilde yayılmalıdır. Ardından, lipid karışımının yarım hacmi kadar daha başka bir lam üzerine ekleyin ve üniform bir lipid film oluşturmak için hemen yayın. İnce ITO kaplamaya zarar vermemek için hızlı ve nazik olun.Filmin opasitesi aşırı derecede heterojen görünüyorsa, yeni bir lam kullanarak prosedürü tekrarlayın. Ardından, ilki gibi farklı bir lipid karışımı için ikinci bir lam çifti hazırlayın. Optimal GUV verimi ve GUV'ların bileşimsel homojenliği için lipidlerin düzgün bir tabaka oluşturması gereklidir.Eser miktardaki organik çözücüyü uzaklaştırmak için lamları 60 ila 90 dakika boyunca bir vakumlu desikasyon kabında saklayın. Bir sonraki adım için, bir inkübatörü önceki adımlarda kullanılan ısıtma bloğunun sıcaklığına ayarlayın ve 300 millimolar sükroz çözeltisi stokunu bu sıcaklığa kadar ısıtın. Ayrıca, bir PDMS contayı %70 etanol ile nazikçe silerek ve tamamen kurumaya bırakarak hazırlayın.Lamlar kuruduktan sonra, bunları temiz bir yüzeye yerleştirin ve contayı bir lamın üzerine, su sızdırmaz bir mühür oluşturacak şekilde nazik ama sıkıca bastırın. PDMS conta ile lam arasında gaz bulunmadığını doğrulayın. Ardından, contayı önceden ısıtılmış sükroz çözeltisiyle tamamen doldurun.Hiç kabarcık kalmadığından emin olun. Şimdi, diğer kaplı lamı, diğer lamla hizalı olacak şekilde contanın üzerine bastırın. Kabarcık kalmadığından emin olun ve hücreyi kıskaçlar kullanarak sabitleyin.Ardından, fazla sakkaroz çözeltisini aspirasyonla uzaklaştırın ve lamları tüy bırakmayan mendillerle temizleyin. Devam etmek için, her lamın iletken tarafı barla tekdüze temas edecek şekilde lam düzeneğini bir bakır bara sabitleyin. Daha sonra, bakır barı fonksiyon jeneratörü çıkışına bağlayın ve fonksiyon jeneratörü dışarıda kalacak şekilde düzeneği inkübatörün içine yerleştirin.Sıcaklık ulaşıldığında, fonksiyon jeneratörünü 90 dakika boyunca 10 Hz sinüs dalgası ve bir voltluk potansiyel fark uygulamak üzere programlayın. Bir multimetre kullanarak voltajın bir volt olduğundan emin olun. 90 dakika sonra, frekansı yavaşça iki Hz'e düşürün ve elektroformasyon işlemine 10 dakika daha devam edin.Bu süre zarfında, bir gün önce kurulan in vitro translasyon reaksiyonundan HIV-1 Gag'ı hasat edin. Lizatları santrifüjleyerek istenmeyen agregatları uzaklaştırın ve süpernatantı dikkatlice başka bir tüpe aktarın. İki Hz'de 10 dakika geçtikten sonra fonksiyon jeneratörünü kapatın, inkübatörü kapatın ve montaj oda sıcaklığına dönene kadar inkübatör kapağını açık bırakın.Soğuma tamamlandıktan sonra, lam düzeneğini dikkatlice tezgaha getirin ve üst lamı pensetle çıkararak hücreyi nazikçe sökün. GUV'leri, ucu kesilmiş 1000 microliter pipet ucuyla yeni bir tüpe aktarın. Bu tüpü nazikçe taşıyın ve GUV'leri 90 dakika içinde kullanın.Ardından, bir görüntüleme odası hazırlayın. Küçük bir delik içeren bir PDMS tabakasını temiz bir lam üzerine sabitleyin. Sıkı bir sızdırmazlık sağlamak için tabakayı nazikçe ve sıkıca bastırın.Ardından, beş µL in vitro translasyon reaksiyonunu beş µL GUV ile karıştırın. Birkaç dakika sonra karışımı görüntüleme haznesine aktarın ve görüntüleme işlemine geçin. Buharlaşmayı önlemek için görüntüleme haznesi bir lam ile kapatılabilir.Tanımlanan protokol kullanılarak, 4,7'ye 2,3'e 3 molar oranında POPC, POPS ve kolesterolden oluşan GUV'ler hazırlandı. GUV üzerindeki Gag YFP sinyallerinin floresan ölçümü, bunların GUV yüzeyinde arka planın üzerinde tespit edilemediğini göstermektedir. Bununla birlikte, lipid karışımına beyin-PIP2 eklendiğinde Gag-YFP proteini GUV'lere verimli bir şekilde bağlandı.Gag bağlanması, membran yüzeyindeki floresan yoğunluğunun artışıyla belirginleşir ve tarama yapıldığında bu durum keskin bir pik olarak görülür. Protein floresan işaretli bir formda mevcut olduğu sürece, bu teknik bir kez kavrandığında dört ila beş saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, GUV'lerle işlem yaparken nazik olmayı hatırlamak ve mümkün olduğunca her zaman taze lipidler kullanmak önemlidir.Bu teknik, retrovirüs montajı alanındaki araştırmacıların, etkileşimlerin latent durumunu değiştirebilen uzun süreli Karıştırma Sonrası prosedürlerine gerek kalmadan, retroviral Gag proteinlerinin membran etkileşimlerini in vitro olarak incelemesine olanak sağlamıştır.

visualization-hiv-1-gag-binding-to-giant-unilamellar-vesicle-guv

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu görüntülenmiştir deney canlı konfokal görüntüleme deneyleri için HIV floresan moleküler klon kullanan için bir rehber.

HIV ve Live Konfokal Mikroskop Floresan Klonlar kullanılarak HIV görselleştirme Hücre-hücre Transferi

Protokol zarı proteinleri kullanarak kriyo-elektron tomografisi ve 3D görüntü işleme yapıları belirlemek için yüksek verimli bir yaklaşımı açıklar. Numune hazırlama, veri toplama, veri işleme ve yorumlama kapsar ve yaklaşım, HIV-1 zarf glikoprotein bir temsilcisi hedef üretim ile son bulur. Bu hesaplama prosedürleri, araştırmacılar ve öğrenciler uzaktan çalışma ve veri işleme ve yapısal analiz için katkıda bulunmayı sağlayan bir şekilde dizayn edilmiştir.

Cryo-Elektron Tomografi ve Otomatik Sub-tomogram Ortalaması kullanarak HIV Zarf Glikoproteinler Moleküler Yapılarının Belirlenmesi

Bu makale toplam iç yansıma floresans (TIRF) mikroskop camı desteklenen düzlemsel bilayers bir HIV-1 zarf kaynaklı virolojik sinaps oluşumu görselleştirmek için bir yöntem açıklanır. Yöntem ayrıca, HIV-1 zarfı ile endüklenen virolojik sinaps oluşumu sırasında meydana gelen sinyal molekülleri aktivasyonu ve dağıtılması algılamak için immünfloresans boyama yöntemi ile kombine edilebilir.

Görüntülemede HIV-1 Zarf bağlı Virolojik Synapse ve Sentetik Lipid Bilayers üzerine Sinyal

Source: Olety, B., et. al., Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (2016)This study demonstrates a fluorescence-based assay to observe the membrane-binding behavior of human immunodeficiency virus type-1 structural protein. Using synthetic giant unilamellar vesicles as model membranes, the assay visualizes protein recruitment and assembly, mimicking early steps of viral particle formation.

Visualizing Viral Structural Protein Assembly on Giant Unilamellar Vesicle Membranes

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

electroformation ve jel destekli şişme - dev tek tabakalı veziküller (GUVs) içine transmembran protein, KvAP, şifreden iki dehidrasyon-rehidrasyon yöntemleri için gösterilmiştir. Her iki yöntemde de, protein içeren küçük tek lamelli kesecikler, sonra, flüoresans mikroskopisi ve yama klempi elektrofizyoloji ile incelenebilir GUVs oluşturmak üzere bir araya birleştirilir.

Bir transmembran proteinin yeniden oluşturulması, Mikroskop ve yama kelepçe Çalışmaları Dev tek-katmanlı keseler içine Voltaj kapılı iyon kanalı, KvAP,

HIV-1 füzyon yoluyla üzerinde akış sitometresi veya floresan mikroskopi tarafından algılanabilir yeşil flüoresan proteinin ifade bildirmek için bir hücre tabanlı tahlil açıklar. İnhibitörleri (füzyon aşamada özellikle) viral girdisinin boş hücre ve hücre-hücre enfeksiyonu sistemlerinde test etmek için kullanılabilir.

Bir yüksek-den geçerek Cre-Lox Viral membran Fusion tahlil inhibitörleri HIV-1 Viral membran füzyon tanımlamak için aktive

Bu protokol, farmakolojik olarak önemli G proteini bağlantılı reseptör sınıflarından biri olan insan 1A serotonin reseptör proteininin (5-HT1AR) yeniden uzlaştırılması için burada açıklandığı gibi, integral membran proteinlerini (IMP'ler) dev unilamellar lipid veziküllerine (GUVs) dahil etmek için güçlü ve genelleştirilebilir bir teknik olarak agarose şişmesini kullanır.

G-protein Bağlantılı Reseptörleri (GPCR) içeren Model Lipid Membranlarının yapımı

Bu makalede, kapsüllenmiş sitoiskelet proteinleri ile dev unilamellar veziküllerin hızlı üretimi için basit bir yöntem tanıtılmaktadır. Yöntemin, hapsetmede ve sitoiskelet-membran etkileşimlerinde sitoiskelet yapılarının aşağıdan yukarıya doğru resulaştırılmasında yararlı olduğu kanıtlanmıştır.

Yeniden Yapılandırılmış Hücre İskeletinin Dev Unilameller Veziküller İçinde Hızlı Kapsüllenmesi

Yapı ve bileşimdeki membran lipid çeşitliliği, hücresel süreçlere önemli bir katkıda bulunur ve bir hastalık belirteci olabilir. Moleküler dinamik simülasyonları, membranları ve bunların biyomoleküllerle etkileşimlerini atomistik çözünürlükte incelememizi sağlar. Burada, karmaşık membran sistemlerini oluşturmak, çalıştırmak ve analiz etmek için bir protokol sağlıyoruz.

Simülasyon Çalışmalarında Kompleks Lipid Karışımları Kullanılarak Gerçekçi Membran Modellemesi

Bu makale, iç, halka ve dış bölgelerde özelleştirilmiş elektriksel iletkenliğe sahip, vezikül içinde vezikül yapısına sahip bileşik Dev Unilamellar Veziküllerin (cGUV'ler) hazırlanması için bir yöntem sunar. Elektroformasyon, ozmotik şok yoluyla stomatositlere ve cGUV'lara dönüştürülen basit GUV'leri sentezler ve çekirdekli hücrelerin biyofiziğini incelemek için değerli bir model sağlar.

Bileşik Dev Unilamellar Veziküllerin Sentezi: Çekirdek Hücrelerin Biyomimetik Bir Modeli

Keşfedin, HIV-1 Gag proteininin dev ünilamellar vesikül membranlarına bağlanmasını görselleştirme yöntemini. Bu teknik, lipid-protein etkileşimlerini incelemek ve viral montaj mekanizmalarını anlamak için kullanılır.

Dev ünilamellar vesikül (GUV) membranlanna bağlanan, HIV-1 Gag Görselleştirme

Daha fazla video keşfet