Doğrudan Serebral emboli görselleştirme için Kombine Yakın kızılötesi Floresan Görüntüleme ve Mikro bilgisayarlı Tomografi

Bu doğrudan trombüs görüntüleme tekniğinin genel amacı; altın nanoparçacıklar, bilgisayarlı tomografi ve yakın kızılötesi floresan görüntüleme kullanarak, floresanla işaretlenmiş serebral tromboembolilerin in vivo ve ex vivo olarak kantitatif şekilde görselleştirilmesidir. Bu yöntem; serebral tromboembolilerin doku plazminojen aktivatörüne veya araştırılmakta olan yeni trombolitik ajanlara karşı zaman veya doz bağımlı ve ciddi ortopedik yanıtları gibi hemostaz ve tromboz alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, altın nanoparçacıkların intravenöz enjeksiyonundan sonra, yüksek çözünürlüklü mikro-BT'nin serebral tromboembolilerin konumlarını ve yüklerini in vivo olarak kantitatif şekilde görselleştirerek dinamik evrimlerini yakalamaya olanak tanıması ve bunun ardından ex vivo yakın kızılötesi floresan trombüs görüntüleme ile doğrulanabilmesidir.

Prosedürün gösterimi, laboratuvarımdaki doktora sonrası araştırmacı olan Jeong-Yeon Kim tarafından gerçekleştirilecektir. Kardiyak ponksiyon ile 300 ila 1.000 µL arteriyel kan topladıktan sonra, örneğin 70 µL'sini uygun aktive edilmiş koagülasyon faktörü 13 aracılı fibrin çapraz bağlama aktivitesine duyarlı floresan probun 30 µL'sine ekleyin ve ortaya çıkan karışımı 23 gauge iğne uçlu üç mL'lik bir şırıngaya doldurun. Ardından, işaretli kanı 20 cm uzunluğunda bir polietilen tüpe enjekte edin ve kanın oda sıcaklığında pıhtılaşmasını bekleyin.

İki saat sonra, tüpü 22 saat boyunca 4 °C'de bekletin ve ardından tüpü 1,5 cm'lik parçalara bölün. PBS ile doldurulmuş 3 mL'lik bir şırınga kullanarak, her bir tüp parçasındaki trombusu, PBS içeren altı kuyucuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına boşaltın. Trombusları PBS ile üç kez yıkayın; ardından, 30 gauge iğne takılmış ve salin ile doldurulmuş 1 mL'lik bir şırıngayı 15 cm'lik PE10 tüpünün bir ucuna yerleştirin ve yıkanmış tek bir trombusu dikkatlice tüpün diğer ucuna çekin.

Ardından, trombüs yüklü PE10 tüpü, 200 mikron çapında konik uca sahip üç santimetre uzunluğundaki bir PE50 tüp ile bağlayın. Ayak parmağı sıkıştırmasına yanıt alınmadığına bakarak anesteziyi onayladıktan sonra, cerrahi alanı Betadine ve %70 alkol ile dezenfekte edin ve sol kulak ile göz arasında bir santimetrelik dikey bir insizyon yapmak için bir skalpel kullanın. Bir lazer Doppler akış ölçerin optik fiberinin distal ucunu, bregmanın 1 mm soluna ve 4 mm altına, açığa çıkan sol temporal kemik yüzeyine yapıştırın ve Doppler izlemeye başlayın.

Ardından, sol karotis bulbus bölgesini açığa çıkarmak için perivasküler yumuşak dokular boyunca üç santimetrelik dikey bir orta hat insizyonu yapın. Steril 6-0 siyah ipek sütür kullanarak önce sol proksimal ortak karotis arteri, ardından steril 7-0 siyah ipek sütürlerle sol internal karotis arteri ve sol pterygopalatin arteri ligat edin. Monopolar elektrikli koter kullanarak sol superior tiroid arteri koterize edin, ardından steril 7-0 siyah ipek sütürler kullanarak sol proksimal eksternal karotis arteri gevşekçe ve damarın distal ucunu sıkıca ligat edin.

Eksternal karotis arterinin ligasyon bölgeleri arasında mikro-makas kullanarak 0,2 ile 0,25 mikronluk bir delik açın ve proksimal eksternal karotis arteri ligasyonunu gevşetirken trombüs içeren kateteri deliğe yerleştirin. Kateteri sabitlemek için common karotis arterine doğru ilerletin ve proksimal eksternal karotis arteri ligasyonunu yeniden sıkın. Eksternal karotis arterinin distal ucunu koterle kesin ve kateteri geri çekerken, damarı internal karotis arteri ile hizalamak için eksternal karotis arterinin serbest proksimal ucunu saat yönünde döndürün.

Ardından, internal karotis arter ligatürünü gevşetin ve kateteri hemen orta serebral arter ile anterior serebral arter bifurkasyonuna doğru yaklaşık dokuz milimetre ilerletin. Şimdi, internal karotis arter sütürünü kateterin etrafında tekrar sıkılaştırın ve trombüsü bifurkasyon bölgesine enjekte etmek için şırıngayı nazikçe bastırın. Doppler'de bazal değerden %30 veya daha fazla düşük bir kan akışı gözlemlenirse, kateteri çıkarın ve eksternal karotis arterin proksimal ucunu hemen ligatize edin.

Uygun deneysel zaman noktasında trombusun mikro-bilgisayarlı tomografi ile görüntülenmesi için, fibrine hedeflenmiş altın nanopartikülleri 10 mM PBS konsantrasyonunda 10 mg/mL olacak şekilde seyreltin ve nanopartiküllerin homojen süspansiyonunu sağlamak için trombus görüntüleme ajanını 30 dakika boyunca sonikasyona tabi tutun. Ardından, 300 µL fibrine hedeflenmiş partikülü deneysel hayvanın penis venine enjekte edin. Hayvanı mikro-BT görüntüleyici yatağına yerleştirin ve boynu düzeltmek için bir pine bağlı bir ip kullanarak üst ön dişleri nazikçe çekin.

Altın nanopartiküller enjekte edildikten beş dakika sonra görüntülemeye başlayın. Trombusu ex vivo yakın kızılötesi görüntüleme ile görselleştirmek için, eksize edilmiş beyin dokusunu tabanı yukarı bakacak şekilde görüntüleme cihazına yerleştirin. Willis çevresi arterlerindeki floresanla işaretlenmiş tromboembolilerin görüntülerini elde edin.

Ardından, dokuyu verteks yukarı bakacak şekilde konumlandırın ve kortikal tromboembolilerin görüntüsünü alın. Dokuyu birkaç damla salin ile nemlendirin, ardından üretici talimatlarına uygun olarak beyin matriks cihazını kullanarak hızlıca iki milimetre kalınlığında altı adet koronal beyin kesiti elde edin. Kesitleri salin ile nemli tutarak, kesitlerin hem ön hem de arka yüzeylerinin ek yakın kızılötesi görüntülerini alın.

Mikro-BT görüntülemeden sonra trombüs alanını nicelleştirmek için, görüntü dizisi dosyalarını açın ve görüntüleri 8-bit gri tonlamaya dönüştürmek için Görüntü'yü, ardından Tür'ü ve ardından 8-bit'i seçin. BT görüntü dosyalarının bir pikseli 0.053 milimetreye karşılık geldiğinde, Piksel cinsinden mesafe, Bilinen mesafe ve Uzunluk birimi için sırasıyla bir, 0.053 ve milimetre değerlerini girmek üzere Ölçeği Ayarla Analiz seçeneğini kullanın. Ardından, Düzenle altında, trombüs veya kemikle ilişkili hiperdens bir bölge içermeyen beyin parankim alanına bir ilgi bölgesi yerleştirmek için Seçim'i ve ardından Belirle'yi seçin.

Belirlenen ilgi alanı yığının her bir kesitine uygulandığı için, bölgenin hiçbir kesitte hiperdens bir bölgeyle örtüşmediğinden emin olun. Ardından, Plugin altında, Region of Interest kısmından Region of Interest and Background Subtraction seçeneğini belirleyin ve Number of standard deviations from the mean kısmına iki değerini girin. Tromboemboli ile ilişkili hiperdens lezyonları bulun ve lezyonlu alana yakınlaştırın.

Şimdi, Image menüsünden Adjust ve ardından Threshold seçeneklerini belirleyin; Alt Eşik Değeri (Lower Threshold Level) olarak 22, Üst Eşik Değeri (Upper Threshold Level) olarak 255 girin. Alt eşik değerinin altındaki pikselleri mavi, eşiklenen pikselleri gri tonlamalı ve üst eşik değerinin üzerindeki pikselleri yeşil renkte görüntülemek için Over/Under seçeneğini seçin. Ardından, kemikli alanları dahil etmeden, tromboemboliye bağlı hiperdens lezyonları çevreleyen ilgi bölgelerini çizmek için Serbest El (Freehand) seçim aracını kullanın.

Alan, Ortalama gri değer ve Entegre yoğunluk alan çarpı ortalama seçeneklerini belirlemek için Analyze, Set Measurements menüsünü kullanın. Limit to threshold ve Display label seçeneklerini işaretleyin. Nicelleştirilmiş verileri elde etmek için Analyze Measure komutunu kullanın ve ardından sonuçları kaydedin.

Bu bazal mikro-BT görüntüleri, farelerde embolik inme sonrası birinci saatte, fibrin hedefli altın nanopartiküllerin enjeksiyonundan beş dakika sonra in vivo olarak elde edilmiştir. Serebral trombus, distal internal karotid arterin orta serebral ve anterior serebral arter bifurkasyon bölgesinde net bir şekilde görülebilmektedir. Takip mikro-BT görüntüleri, salin ile tedavi edilen hayvanlarda Willis çevresi trombusunda herhangi bir değişiklik olmadığını göstermektedir; buna karşın, doku plazminojen aktivatörü ile tedavi edilen hayvanlarda, mavi ok başlarıyla belirtildiği üzere, Willis çevresi trombusunun zamanla kademeli olarak çözündüğü görülmektedir.

24. saatteki kalıntı tromboemboliler için in vivo CT yoğunluğu ile ex vivo yakın kızılötesi görüntüleme arasında güçlü bir korelasyon vardır. Örneğin, bu görüntülerde, fibrin hedefli altın partiküllerle görselleştirilen hiperdens mikro-CT alanları, önceden oluşmuş pıhtı olgunlaşma süreci sırasında trombusa bağlanan ve koagülasyon faktör 13A aracılı fibrin çapraz bağlama aktivitesine duyarlı floresan prob tarafından tanımlanan yakın kızılötesi sinyal alanlarıyla doğrudan örtüşmektedir. Ayrıca, bu görüntülerde görselleştirildiği üzere, TTC boyaması, kontrol salin grubuna kıyasla doku plazminojen aktivatörü ile tedavi edilen hayvanlarda iskemik beyin hasarındaki trombolizin etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir.

Bir kez uzmanlaşıldığında, in vivo mikro-CT görüntüleme ve ex vivo yakın kızılötesi floresan trombüs görüntüleme tekniği, düzgün şekilde uygulandığında ve görüntüleme probları mevcut olduğunda yaklaşık bir saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, mikro-CT tabanlı doğrudan serebral trombüs görüntülemesi için agregat oluşturmamış ve fibrine hedefli altın nanopartiküllerin kullanılması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Bu prosedürün ardından, altın nanopartiküllerin doku dağılımı ve kan kinetiği gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla elektron mikroskobu veya ICPMS (indüktif eşleşmiş plazma kütle spektrometrisi) gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Geliştirilmesinin ardından bu teknik, inme veya kardiyovasküler araştırma alanındaki araştırmacıların, koroner tromboza veya embolik serebral enfarktüse duyarlı hayvan modellerinde tromboemboliyi incelemelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, farelerde tromboembolik inme için floresan işaretli pıhtıların nasıl hazırlanacağı ve ardından serebral tromboembolilerin in vivo ve ex vivo olarak seri görüntülemesi ile kantifikasyonunun nasıl yapılacağı ve böylece trombus evriminin nasıl izleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.