Bir Yüksek içerik İn Vitro Pankreas Adacık β-hücre çoğaltma Keşif Platformu

Bu yüksek içerikli beta hücre replikasyonu tarama platformunun genel amacı, beta hücre büyümesini kısıtlayan moleküler yolların araştırılmasını kolaylaştırmaktır. Bu yöntem, beta hücre biyolojisi alanındaki önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Beta hücre yenilenmesini kontrol eden anahtar sinyal moleküllerinden ve yollarından biri gibi.

Bu tekniğin temel avantajları, verim hücresi astarının belirli bir değerlendirmeye ve birincil adacık hücresi replikasyonunun otomatik veri analistine yükseltilmesini sağlamasıdır. Bu tekniğin kullanılması, diyabet için rejeneratif tedavinin geliştirilmesine doğru genişleme potansiyeline sahiptir. Toplumumuz için büyük sağlık ve ekonomik maliyeti olan bir hastalık.

Kistik ve ortak hepatik kanalların birleştiği yerde veya hemen distalinde ortak safra kanalını keme etmek için 22 gauge iğne ile donatılmış 10 mililitrelik bir pankreas sindirim solüsyonu yüklü şırınga kullanarak başlayın. Ortak safra kanalını bir neşter sapı ile destekleyerek, yavaşça 10 mililitre çözelti enjekte edin. Tüm kollajenaz uygulandıktan sonra, şişirilmiş pankreası inen kolon, bağırsaklar, mide ve spline'dan ayırmak için kavisli forseps ve makas kullanın.

Ardından, beş mililitre pankreas sindirim çözeltisi içeren buzun üzerine 50 mililitrelik bir tüpe iki adede kadar pankreata yerleştirin. Pankreaların tamamı toplandığında, sindirim tüplerini her üç dakikada bir hafifçe döndürerek 15 dakika boyunca 37 santigrat derece su banyosuna yerleştirin. Sindirimin sonunda, tüpleri dikey olarak 10 kez kuvvetlice sallayın.

Ve numunelere 10 mililitre soğuk yıkama tamponu ekleyin. Tüpleri beş kez daha kuvvetlice çalkalayın ve buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, tüpleri soğuk yıkama tamponu ile 50 mililitrelik son hacme kadar doldurun ve tüpleri beş kez ters çevirin.

Daha sonra dokuları döndürün ve süpernatanları dökün, peletleri yerinden çıkarmamaya dikkat edin. Doku bulamacını 25 mililitre yıkama tamponunda yeniden süspanse edin ve ardından hafifçe girdap yapın. Sıkma ve yeniden askıya alma adımlarını iki kez daha tekrarlayın.

Doku süspansiyonlarını 30 gözenekli bir doku süzgecinden steril 250 mililitrelik bir behere dökün. Sindirim tüplerini 20 mililitre ek bir yıkama tamponu ile durulayın ve sindirilmemiş pankreas ve yağ dokularını çıkarmak için yıkamaları ağın üzerine dökün. Filtrelenmiş materyali iki yeni 50 mililitrelik tüp arasında bölün ve dokuyu santrifüjleme ile peletleyin.

Daha sonra süpernatanı boşaltın ve fazla tamponu boşaltmak için tüpleri ters çevirin. Adacıkları saflaştırmak için, pankreas dokusu peletlerine 20 mililitre soğuk yoğunluk gradyanı ekleyin ve içeriği homojen bir şekilde yeniden süspanse etmek için beş kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra, keskin bir sıvı arayüzünü korumaya ve pankreas hücrelerini santrifüjleme ile ayırmaya özen göstererek, her bir gradyan tüpünün duvarına 10 mililitre HBSS'yi yavaşça yerleştirin.

Adacık tabakasını arayüzden yeni 50 mililitrelik konik tüplere aktarmak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın. Daha sonra adacıkları 40 ila 50 mililitre yıkama tamponunda üç kez yıkayın. Her santrifüj arasında peletleri yeniden askıya almak için tüplerini ters çevirmek.

Son yıkamadan sonra, tüpleri bir doku kültürü başlığına getirin. Süpernatanı aspire edin. Ve peletleri altı mililitre adacık ortamında yeniden askıya alın.

Her tüpten adacıkları altı kuyucuklu doku kültürü plakasının ayrı oyuklarında eleyin. Ve kuyuların ortasındaki adacıkları toplamak için plakayı döndürün. Mikroskop altında adacık saflığını değerlendirin.

Adacıkları daha da saflaştırmak için, bir mililitrelik bir pipet kullanarak toplayın ve altı mililitre adacık ortamı kullanarak bitişik kuyuya aktarın. Yüzde 90'dan fazla saflık elde edilene kadar adacık döndürme, toplama, transfer ve mikroskobik değerlendirmeyi tekrarlayın. Daha sonra, adacıkları 20 mililitre adacık ortamı içeren 10 santimetrelik tek bir doku kültürü kabına aktarın.

Tüm adacıklar hasat edildikten sonra, kültür kabını gece boyunca bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. Daha sonra 384 oyuklu bir plakanın kuyularını 40 mikrolitre 804G, şartlandırılmış ortam ile kaplayın ve plakayı gece boyunca inkübatöre yerleştirin. Ertesi gün, adacıkları nazikçe ayırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.

Ardından adacıkları 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Adacıkları santrifüjleme ile toplayın. Sonra 20 mililitre ılık p, b, s ile yıkayın.

Bir dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin. Ve peleti sıfır nokta iki, yüzde beş Tripsin'de yeniden askıya alın.

Adacıkları beş ve 10 dakikada 10 kez aspire etmek ve dağıtmak için bir mililitrelik bir pipet kullanarak adacıkları 37 derecede 10 dakika inkübe edin. İkinci triterasyondan sonra, tripsinizli adacık hücrelerinin 20 mikrolitrelik bir örneğini sayın. Dokular tamamen sindirilirse, ayrışma adacık hücrelerini, adacık fonksiyon ortamında mililitre başına dört hücre konsantrasyonunda dört nokta beş çarpı on ila dört noktada askıya alın.

Ardından, 804G koşul ortamını önceden hazırlanmış 384 kuyulu plakadan çıkarmak için 12 kuyulu manifoldlu bir aspiratör kullanın. Ve oyuk başına 70 mikrolitre adacığı dört ila 21 sütunda c'den n'ye kadar olan sıralara eleyin. Adacıkların doku kültürü inkübatöründe 48 saat boyunca yapışmasına izin verin.

İki gün sonra, adacık ortamını dikkatlice çıkarmak için 12 kuyulu manifold aspiratörünü kullanın ve her oyuğa 35 mikrolitre adacık fonksiyon ortamı eklemek için 12 kanallı bir pipet kullanın. Daha sonra taze hazırlanmış iki, x bileşik çözeltiden 35 mikrolitreyi her bir kuyucuğa aktarın. Ve adacıkları 48 saat daha kuluçka makinesine geri koyun.

48 saat sonra, otomatik bir yüksek içerikli görüntüleme platformu kullanarak bileşikle işlenmiş adacık kültürlerini düzeltin, boyayın ve analiz edin. Tipik bir deneyde, DAPI, PD-1 ve insülin pozitif beta hücrelerinin replikasyon hızı, Ki-67'yi birlikte eksprese eden beta hücrelerinin yüzdesi ile belirlenir. Alfa hücre replikasyonu, DAPI pozitif, PD negatif, Glukagon pozitif, Ki-67 ko-eksprese eden hücrelerin yüzdesi olarak ölçülür.

Örneğin, bu temsili deneyde, Diprididamol'ün beta hücrelerinin replikasyonunu teşvik ettiği, ancak alfa hücrelerinin replikasyonunu teşvik etmediği gözlemlendi. Bu teknik yedi günde tamamlanabilir. Bu prosedürü takiben, beta hücre replikasyonundaki bileşikler, etki mekanizmalarını ortaya çıkarmak için daha fazla incelenebilir.

Bu teknik, beta hücre biyolojisi alanındaki araştırmaların beta hücre büyümesini düzenleyen yeni sinyal faktörlerini ve yolaklarını tanımlamasını sağlamıştır. Bu videoyu izledikten sonra, küçük moleküllerin beta hücre yenilenmesini seçici olarak uyarma yeteneğini nasıl test edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.