Name: Bir Yüksek içerik İn Vitro Pankreas Adacık β-hücre çoğaltma Keşif Platformu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Keşfedin, pankreas adacık β-hücre çoğaltmasını teşvik eden küçük molekülleri yüksek içerikli tarama yöntemiyle belirleyin. Bu platform, diyabet araştırmalarında rejeneratif tedaviler geliştirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, NIH (JPA), Stanford'un Spectrum Çocuk Sağlığı Araştırma Enstitüsü (CHRI) ve SPARK'tan (UL1 TR001085, JPA) DK098143 ve DK101530 NIDDK hibeleri tarafından desteklenmiştir.

Bu protokol, Stanford Üniversitesi Tıp Okulu Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) uygun olarak gerçekleştirilmiştir. adacık hücre replikasyonu değerlendirilmesi için 384 oyuklu plakanın 228 kuyu üretilmesi için yeterli olan - (9 haftalık 8) erkek Sprague Dawley sıçanlarında, 300 g - açıklanan protokol altı 250 doku adacığı izolasyonu ölçeklenir. 1. Malzeme Hazırlama <ol><li> 15 cm&#39;lik bir doku kültürü kabı 28 3 gün birleştiği noktada muhafaza 804G fare mesane kanseri hücre koşullu ortam (RPMI-1640 20 mi) toplayarak doku adacığı izolasyonu başlatmadan önce kaplama ortamı hazırlar. Steril filtre ve mağaza (-20 ° C), daha sonra kullanılmak üzere koşullu ortam. </li><li> cerrahi aletleri sterilize (bir 12 cm dişli doku forseps, bir 11.5 cm ince makas, bir 14.5 cm cerrahi makas, iki 16 cm kavisli forseps, bir 12 cm kavisli hemostat, bir 12 cm neşter sapı) ve init önce bir 30 gözlü doku elekadacık izolasyon iating. </li><li> Bir% 60 eritilerek pankreatik sindirim çözeltisi hazırlayın: Saflaştırılmış sınıf I% 40 karışımı: sınıf II kollajenazlar (300.000 toplam kolajenaz aktivitesi - 400.000 birim), kalsiyum ve magnezyum ile desteklenmiş 1 x Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi (HBSS), 60 ml. Yük buz üzerinde 1 &quot;22 G iğne ve yerine 10 ml şırınga (altı) olarak pankreas sindirim tamponu, 10 ml. Not: sindirim çözeltisi, 10 ml sıçan başına enjekte edilmiştir. buna göre Scale. </li><li> ketamin 1.3 ml (100 mg / ml), ksilazin 0.2 ml (100 mg / ml) ve 3 mL PBS karıştırılarak bir havalandırılmış başlığı içinde anestezi kokteyl 4.5 ml hazırlayın. adacık izolasyonu başlatılması 1 saat içinde anestezik kokteyl hazırlayın. </li><li> HBSS 500 ml yeni doğmuş dana serumu, 25 ml ekleyerek yıkama tamponu hazırlayın. daha sonra kullanmak için buz üzerinde yıkama tamponu yerleştirin. </li><li> Düşük glukoz Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM), 5, 500 ml adacık ortamın 1 şişesi hazırlayın0 ml cenin sığır serumu (FBS), penisilin 5000 ünite / ml streptomisin 5.000 ug / ml olmuştur. </li><li> % 2 FBS, 2 mM glutamin, 5 mM glukoz, penisilin 5000 ünite / ml streptomisin 5.000 ug / ml işlevsellik / canlılığı çözeltisi (500 mi) doku adacığı fonksiyonu orta hazırlayın. Daha sonra kullanmak üzere adacık fonksiyonu medya (4 ° C) saklayın. </li><li> 1X fosfat tamponlu salin içinde 37.38 ml (PBS) 2.5 mi eşek serumu ve 0.12 ml Triton X-100 eklenmesi ile bloke edici tampon 40 mi hazırlayın. daha sonra kullanmak için mağazası bloke tamponu (4 ° C). </li><li> protokolü başlamadan önce gerekli antikorları edinin. Not: PDX-1 (TRITC), Ki-67 (FITC) eş boyama primer β-hücresi çoğaltma taranması için kullanılır. nükleer (DAPI), PDX (Cy5) ve KI-67 (FITC) boyama ile birlikte, soya özel çoğaltma analiz edilmesi için ilave hücre kimliği belirteçleri (TRITC insülin, glukagon, vimentin ya da somatostatin) için immünofloresan boyama yapar. alternatif temsilcisilication belirteçler, örneğin, PCNA, de kullanılabilir. </li><li> dört nüsha olarak gerçekleştirilen her tedavi koşulu ile bir 228-kuyu tedavi planı hazırlayın. (: 666 seyreltme DMSO 1) kuyular pozitif-(5-iyodotübersidindir [1 uM] veya dipiridamol [15 mM]) ve araç kontrolü ekleyin. </li></ol> Pankreas 2. perfüzyon <ol><li> seyreltilmiş anestezik kokteyl çözeltisi (0.30 mL / 100 g vücut ağırlığı) IP enjeksiyonu ile sıçanlarda anestezisi. Sıçan tam anestezi ve ağrılı uyarılara tepkisiz sonra, servikal dislokasyon gerçekleştirin. </li><li> kağıt havlu bir yığın yatar pozisyon (kranial-kaudal yönde) ötenazi sıçan yerleştirin ve% 70 etanol ile karın bölgesini püskürtün. </li><li> U-kesi (kasık bölgesinde baz) ile karın boşluğuna açın ve karın boşluğuna maruz göğüs üzerinde rostral yönde cildi geri çekin. </li><li> Dikkatle, kavisli bir forseps iki çift kullanarak duodenum kapmak ortak b duodenum girdisini bulunile kanal (Oddi sfinkter) ve kavisli hemostatla papillada duodenum açılış kelepçe. </li><li> koledok papilla kelepçe ve kavisli bir forseps kullanarak karaciğere yakın safra kanalı kapmak için kullanılan kavisli hemostat kaldırın. yalıtmak ve safra kanalı ortaya çıkarmak için kavisli bir forseps ile künt diseksiyon kullanın. </li><li> Baş proksimal ve ayak distal ile sıçan yerleştirin. </li><li> Bir pankreas sindirim çözeltisi ile kistik ve hepatik kanalların birleştiği ortak safra kanalı da (MİA) ya da sadece uzak cannulate 10 ml şırınga -yüklü ve yavaş yavaş pankreas sindirim çözeltisi 10 ml enjekte edilir. enjekte ederken, bir neşter sapı ile CBD destek. kanal ve pankreas şişirmek için başarısız olursa iğne yerleştirin. </li><li> inen kolon, bağırsak, mide ve dalak ayırmak için kavisli bir forseps ve ince makas kullanarak şişirilmiş pankreas kaldırın. 5 ml içeren 50 ml&#39;lik bir tüp içinde buz üzerinde, şişirilmiş pankreas yerleştirin <em&gt; pankreas sindirim çözüm. Not: Maksimum adacık verimi için, her biri 50 mi sindirim tüp içinde 30 dakika ve yerine, sadece 1 veya 2 pankreası içindeki tüm pancreata toplar. </li></ol> Pankreas 3. Ayrışma <ol><li> Bir kez tüm pankreata, toplanan 15 dakika süreyle 37 ° C su banyosu içine sindirim tüpü yerleştirmek edilir. Tüpleri yavaşça her 3 dk girdap. </li><li> 15 dakika sonra, şiddetle boruları (dikey) 10 kez sallayın ve soğuk yıkama tamponu 10 ml ekleyin. Şiddetle boruları ek 5 kez sallayın ve buz üzerine yerleştirin. </li><li> Tüpler, 5 kez ters yüz edilerek gibi soğuk yıkama tamponu ile bir karışımı, 50 ml sindirim tüpü doldurmak. </li><li> 1 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 97 x g&#39;de tüpler santrifüj ve süpernatant dökün. pelet haline doku çıkarmak için dikkatli olun. </li><li> 25 ml yıkama tamponu ekleyin ve hafifçe karıştırın doku yeniden askıya. Tekrarlayın iki kez daha 3.4 ve 3.5 adımları tekrarlayın. </li><li> Bir st üzerinde 30 gözlü doku elek yerleştirin250 ml beher erile ve elek üzerine doku süspansiyonu dökün. Yıkama tamponu ilave 20 ml ile sindirim borusunu yıkayın ve örgü üzerine dökün. sindirilmemiş pankreas ve yağ dokuları bu aşamada çıkarılır. </li><li> İki yeni bir 50 ml&#39;lik tüplere süzüldü malzeme dökün ve 4 ° C&#39;de 1 dakika için 97 x g&#39;de iplik doku topağı. Durusu süpernatant ve invert tüpleri aşırı tampon süzün. </li></ol> Adacık 4. saflaştırılması <ol><li> tanelenmiş pankreas dokusu soğuk polisükroz / sodyum Diatrizoate çözeltisinin 20 ml (1.119 ug / ml yoğunlukta) eklenir. Homojen hafifçe yukarı pipetleme ve beş kat aşağı her tüpün içeriğini yeniden askıya. </li><li> Yavaşça 10 ml HBSS ile polisükroz / sodyum diatrizoate çözümü kaplaması. yavaş yavaş tüp duvarı boyunca HBSS ekleyerek keskin bir sıvı arayüzü koruyun. </li><li> Yavaş hızlanma ve hiçbir fren 15 dakika (4 ° C) 560 xg&#39;de sindirilmiş pancreata santrifüj. </li><li> CoTaze 50 ml tüpler içinde 10 ml pipet ve yer adacıklar kullanarak arayüzü adacık katmanı llect. Bu aşamada adacıklar havuz yok. </li><li> 4 ° C&#39;de 140 x g&#39;de 1 dakika boyunca, her bir 50 ml tüp ve spin yıkama tamponu 40 ml ekleyin. </li><li> Süpernatantı dökün ve boruları birkaç kez ters yüz edilerek yıkama tamponu 50 ml toplanmış adacıklar yeniden askıya. Bir pelet adacıklar toplamak için 4 ° C&#39;de 97 x g&#39;de 1 dakika için tüpler santrifüjleyin. </li><li> Yıkama tamponu dökün ve yıkama tekrarlayın. doku kültürü kaputu içine adacıklar getirin ve süpernatant aspire. </li><li> Adacık orta 6 ml adacıkların her tüp yeniden askıya. </li><li> Altı oyuklu doku kültürü kabına her bir 50 ml tüp adacıklar aktarın. Kuyunun ortasına adacıklar toplamak ve bir mikroskop altında adacık kalite ve saflıkta gözlemlemek için 6-çukurlu bir tabak döndürülür. </li><li> El ile 1 ml pipet kullanarak adacıklar toplamak ve bitişik içine aldı adacıklar transferide doku adacığı ortam 6 ml ihtiva etmektedir. Tekrarlayın adacık dönen ve 90&gt; kadar% saflık toplama elde edilir. </li><li> Adacık ortamı 20 ml içeren 10 cm&#39;lik bir doku kültürü kabı saflaştırılmıştır adacıklar aktarın. </li><li> Bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde yer adacıklar (37 ° C,% 5 CO2), gece boyunca (Şekil 1A). </li><li> Adacık hücrelerinin, her kat de 804G koşullu ortamın 40 ul 384 gözlü bir levhanın gözleri kaplama hazırlanmasında. bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde bir gece boyunca inkübe edin. </li></ol> 5. Dağılma ve adacık hücresi Kaplama <ol><li> Ertesi gün, nazikçe hücre kazıyıcı ile 10 cm çanak adacıklar ayırmak ve 50 ml&#39;lik bir tüp içine adacıklar aktarın. </li><li> Oda sıcaklığında 22 xg&#39;de 1 dakika için santrifüjleme ile adacıklar Pelet. süpernatant aspire. </li><li> ılık PBS, 20 ml adacıklar yıkanır ve yukarıdaki gibi süzün. </li><li> % 0.25 tripsin adacıklar (sıçan pankreas başına 150 ul yeniden askıya10 dakika için 37 ° C &#39;de) ile inkübe edilir. Pipet adacıklar ve aşağı 10 kat inkübasyondan 5 ve 10 dakika sonra 1 mL pipet kullanılarak. </li><li> 10 dakika sonra, tam bir sindirim sağlamak ve bir hemositometre kullanılarak adacık hücreleri saymak için mikroskop altında tripsinize adacık 20 ul örnek değerlendirir. 5 dakika ve pipet yukarı ve aşağı 10 kez daha - sindirilmemiş adacıklar kalırsa, ek 3 inkübasyon devam ediyor. Gerektiği kadar tekrarlayın. Not: Tipik verim ~ 125.000 olan - sıçan başına 150.000 adacık hücreleri. </li><li> inkübatör 804G klimalı ortam kaplı 384-plaka çıkarın ve bir 12-iyi manifoldu aspiratörü kullanarak ortamı çıkarın. </li><li> Adacık fonksiyonu ortamı içinde ml başına 45.000 hücre yoğunluğunda doku adacığı hücre askıya alma ve çok kanallı bir pipet (Şekil 1B) ile oyuk başına 70 ul (3.150 hücre) plaka. Not: Dış kuyularda bulunan β-hücrelerinin N ve sütunlar 4 plaka kullanım satırlar C çevresine doğru göç eğilimi nedeniyle21 6 sıçanlardan izole edilen adacık hücreleri ile 228 kuyu plaka. </li><li> hücre yapışmasını sağlamak için 48 saat boyunca doku kültür inkübatörü içinde plaka koyun. </li></ol> 6. Adacık hücre Kültür Tedavi Tespit ve Boyama <ol><li> Adacık fonksiyonu ortamında 2x konsantrasyonda (muamele koşulları dört kez yapılır) araç ve bileşik 200 ul hazırlayın. Çok-çukurlu pipetleme kolaylaştırmak için bir steril 96 oyuklu plaka içinde bileşikleri düzenlemek. </li><li> Dikkatli bir şekilde 12 oyuklu manifoldu aspiratör adacık orta kaldırmak ve 12 oyuklu bir pipet kullanarak doku adacığı fonksiyonu ortamında (35 ul / oyuk) ile değiştirin. Çıkarın ve (Şekil 1C) kuruma riskini sınırlamak için bir defada bir satır ortamı değiştirin. </li><li> 35 ul / transfer kuyunun 2x bileşik çözeltileri ile muamele başlatın. 48 saat tedavi süresi için inkübatör plaka dönün. </li><li> Tedavinin 48 saat sonra, plakayı baş aşağı çevirerek işleme ortamı süzün. &lt;/ Li&gt; <li> Yavaşça 1 x PBS (1 dakika) oyuk başına 50 ul adacık hücrelerinin yıkayın. Çok kanallı bir pipet kullanılarak PBS ekleyin. </li><li> PBS süzün ve 1 x PBS içinde seyreltilmiş, soğuk% 4 paraformaldehit (PFA), oyuk başına 50 ul ilave edilerek hücrelerin tespit. 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca inkübe hücreleri. </li><li> PFA çıkması için plakayı baş aşağı çevrilerek ve yavaşça yukarıdaki gibi göz başına PBS 60 ul ekleyerek hücreleri üç kez (her biri 5 dakika) yıkanır. </li><li> formamid 14.25 ml ve 0.75 mL, 0.15 M sodyum sitrat (pH 6) karıştırılarak 15 mi antijen alma çözeltisi hazırlayın. Kullanmadan önce hemen antijen alma çözüm olun. </li><li> plakayı baş aşağı çevirerek oyuklardan çıkarın PBS ve her bir oyuğa 60 ul, antijen alma çözeltisi ilave edilir. 45 dakika süre ile 70 ° C su banyosu içinde plaka ısıtılır. Çok-çukurlu plaka kırışmayı önlemek için Bu kuluçka sırasında plaka üzerine bir ısıtıcı blok yerleştirin. Not: Su yarım yukarı plaka etek olmalıdır; Plaka batık edilmemelidir. </li><li&gt; Su banyosu plaka çıkarın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca soğumaya bırakın. plaka görsel muayene ile çarpık olmadığından emin olun. </li><li> 1x PBS üç kez oyuk başına 60 ul (her biri 5 dakika) ile hücrelerin yıkayın. Çok kanallı bir pipet ile PBS ilave edin ve plakayı baş aşağı çevirerek PBS süzün. </li><li> Bloke edici tamponun oyuk başına 40 ul ilave edilir ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe etmek çok kanallı bir pipet kullanın. plakayı baş aşağı ve aktarma yoluyla Bloklama tamponunu çıkarın. </li><li> ve keçi anti-insan PDX-1 (1: 100): Fare Ki-67 (200 1) anti-insan 40 ul ekle her oyuğa blokaj tamponunda seyreltilmiş antikor ve gece boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Bir sonraki gün, yukarıda tarif edildiği gibi üç kez (her biri 5 dakika), anti-vücut çözeltisi süzün ve 1 x PBS ile yıkama hücreleri. PBS Durusu. </li><li> bloke edici tampon içinde (200 1) biyotinile edilmiş eşek anti-fare IgG ve rodamin-konjüge edilmiş eşek anti-keçi IgG seyreltilmiş oyuk başına 40 ul ekle. 1 saat süre ile inkübeoda sıcaklığında. </li><li> 1x PBS ile üç kez, her biri 5 dakika hücreleri yıkayın. Her kuyucuğa Flüoresanla Birleşik streptavidin (bloke edici tampon içinde 400 1) ile seyreltildi ve 40 ul ekle. Oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkalayın. </li><li> 1x PBS ile üç kez, her biri 5 dakika hücreleri yıkayın. DAPI oyuk (bloklama tamponu içinde 300 nM) başına 40 ul ilave edilir ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. </li><li> 1x PBS ile iki kez hücreleri yıkayın ve PBS 1x 40 ul hücreleri bırakın. Plaka hemen analiz için hazırdır. </li></ol> 7. β-hücre çoğaltma Analizi Not: Bir deney protokolü β-hücre çoğaltma ölçmek için kullanılan yüksek içerik tarama mikroskop için oluşturulmalıdır. En basit bileşim, bu protokol, bir kimlik markör β-hücrelerinin tanımlamak için kullanılan bir iki-renkli deneyidir (PDX-1 + p-hücreleri) ve bir çoğaltma işaret (Ki-67), hücre bölünmesi olayları tanımlamak için kullanılır. <ol><li> ORTALAMA dayanan nesne (β-hücreleri) belirlenmesiBir β-hücresi çekirdeğine (Şekil 2A) beklenen piksel alanı içinde: (genişlik &lt;1.6 uzunluğu) yaklaşık daire içinde PDX-1 boyama (549 nm filtre) e flüoresans şiddeti. </li><li> Sonraki, PDX-1 + alanda (Şekil 2B) içinde ortalama floresan yoğunluğu (485 nm filtresi) dayalı çoğaltma olayları (Ki-67-pozitifliği) tanımlamak için ayarları oluşturmak. Not: Pozlama süreleri görüntüler arasında piksel yoğunluğu karşılaştırmalar izin sabitlenmelidir. Deney protokol parametreleri makine çağrıları sürekli olumsuz veri kalitesini etkileyecek spesifik olmayan boyama, enkaz ve hücre agrega hariç şekilde ayarlanır. </li><li> doğruluğu ve limit değişkenliği en üst düzeye çıkarmak için, göz başına 500 β-hücrelerinin en az analiz edin. Not: Sıçan adacık kültürlerde bazal β-hücre replikasyonu indeksi 0.5 olması beklenmektedir -% 3. Tipik olarak, kuyu başına 40 resim 500 β-hücreleri tanımlamak için fazlasıyla yeterli. </li><li> analiz öncesindetüm plaka, seçilen negatif-(DMSO-tedavi) ve pozitif kontrol analiz (5-iyodotübersidindir [1 uM] veya dipiridamol [15 mM]) tahlil protokolü geçerliliğini değerlendirmek için kuyu ile tedavi edilen. Deney doğru kurulduğunda, pozitif kontrol bileşikleri, β-hücrelerinin replike yüzdesi en az iki kat artışa neden olur. </li><li> tahlil protokolü doğrulandıktan sonra tüm plaka okuyun. </li></ol>

<ol><li>Butler, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-cell+deficit+and+increased+beta-cell+apoptosis+in+humans+with+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes.</a> Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).</li>
<li>Kloppel, G., Lohr, M., Habich, K., Oberholzer, M., Heitz, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+pathology+and+the+pathogenesis+of+type+1+and+type+2+diabetes+mellitus+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Surv+Synth+Pathol+Res%22%5BJournal%5D)">Islet pathology and the pathogenesis of type 1 and type 2 diabetes mellitus revisited.</a> Surv Synth Pathol Res. 4 (2), 110-125 (1985).</li>
<li>Harlan, D. M., Kenyon, N. S., Korsgren, O., Roep, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+advances+and+travails+in+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Current advances and travails in islet transplantation.</a> Diabetes. 58 (10), 2175-2184 (2009).</li>
<li>Nath, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outcomes+of+pancreas+transplants+for+patients+with+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transplant%22%5BJournal%5D)">Outcomes of pancreas transplants for patients with type 2 diabetes mellitus.</a> Clin Transplant. 19 (6), 792-797 (2005).</li>
<li>Nichols, R. J., New, C., Annes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+tissue+sources+for+new+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Adult tissue sources for new beta cells.</a> Transl Res. 163 (4), 418-431 (2014).</li>
<li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+human+pancreatic+beta+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li>
<li>Kushner, J. A., MacDonald, P. E., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+to+insulin+secreting+cells%3A+two+steps+forward+and+now+a+time+to+pause%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stem cells to insulin secreting cells: two steps forward and now a time to pause.</a> Cell Stem Cell. 15 (5), 535-536 (2014).</li>
<li>Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+pancreatic+beta-cells+are+formed+by+self-duplication+rather+than+stem-cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation.</a> Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).</li>
<li>Meier, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-cell+replication+is+the+primary+mechanism+subserving+the+postnatal+expansion+of+beta-cell+mass+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans.</a> Diabetes. 57 (6), 1584-1594 (2008).</li>
<li>Chick, W. L., Lauris, V., Flewelling, J. H., Andrews, K. A., Woodruff, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+glucose+on+beta+cells+in+pancreatic+monolayer+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Effects of glucose on beta cells in pancreatic monolayer cultures.</a> Endocrinology. 92 (1), 212-218 (1973).</li>
<li>Brelje, T. C., Sorenson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+prolactin+versus+growth+hormone+on+islet+B-cell+proliferation+in+vitro%3A+implications+for+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Role of prolactin versus growth hormone on islet B-cell proliferation in vitro: implications for pregnancy.</a> Endocrinology. 128 (1), 45-57 (1991).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGF+signalling+controls+age-dependent+proliferation+in+pancreatic+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PDGF signalling controls age-dependent proliferation in pancreatic beta-cells.</a> Nature. 478 (7369), 349-355 (2011).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+synthase+kinase-3+and+mammalian+target+of+rapamycin+pathways+contribute+to+DNA+synthesis%2C+cell+cycle+progression%2C+and+proliferation+in+human+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glycogen synthase kinase-3 and mammalian target of rapamycin pathways contribute to DNA synthesis, cell cycle progression, and proliferation in human islets.</a> Diabetes. 58 (3), 663-672 (2009).</li>
<li>Metukuri, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChREBP+mediates+glucose-stimulated+pancreatic+beta-cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">ChREBP mediates glucose-stimulated pancreatic beta-cell proliferation.</a> Diabetes. 61 (8), 2004-2015 (2012).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+chemical+screen+reveals+that+harmine-mediated+inhibition+of+DYRK1A+increases+human+pancreatic+beta+cell+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A high-throughput chemical screen reveals that harmine-mediated inhibition of DYRK1A increases human pancreatic beta cell replication.</a> Nat Med. 21 (4), 383-388 (2015).</li>
<li>Schisler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+human+and+rat+islet+beta-cell+proliferation+with+retention+of+function+by+the+homeodomain+transcription+factor+Nkx6.1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1.</a> Mol Cell Biol. 28 (10), 3465-3476 (2008).</li>
<li>Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+replication+and+beta+cell+function+in+adenovirally-transduced+isolated+rodent+islets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessing replication and beta cell function in adenovirally-transduced isolated rodent islets.</a> J Vis Exp. (64), (2012).</li>
<li>Walpita, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+islet+cell+culture+system+for+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A human islet cell culture system for high-throughput screening.</a> J Biomol Screen. 17 (4), 509-518 (2012).</li>
<li>Miyazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+pancreatic+beta+cell+line+that+retains+glucose-inducible+insulin+secretion%3A+special+reference+to+expression+of+glucose+transporter+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Establishment of a pancreatic beta cell line that retains glucose-inducible insulin secretion: special reference to expression of glucose transporter isoforms.</a> Endocrinology. 127 (1), 126-132 (1990).</li>
<li>Song, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+and+inactivation+of+glycogen+synthase+kinase+3beta+%28GSK3beta%29+by+dual-specificity+tyrosine+phosphorylation-regulated+kinase+1A+%28Dyrk1A%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation and inactivation of glycogen synthase kinase 3beta (GSK3beta) by dual-specificity tyrosine phosphorylation-regulated kinase 1A (Dyrk1A).</a> J Biol Chem. 290 (4), 2321-2333 (2015).</li>
<li>Hohmeier, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+INS-1-derived+cell+lines+with+robust+ATP-sensitive+K%2B+channel-dependent+and+-independent+glucose-stimulated+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion.</a> Diabetes. 49 (3), 424-430 (2000).</li>
<li>Cozar-Castellano, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+the+first+comprehensive+molecular+characterization+of+cell+cycle+control+in+rodent+insulinoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Lessons from the first comprehensive molecular characterization of cell cycle control in rodent insulinoma cell lines.</a> Diabetes. 57 (11), 3056-3068 (2008).</li>
<li>Efrat, S., Fusco-DeMane, D., Lemberg, H., aL Emran, O., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+transformation+of+a+pancreatic+beta-cell+line+derived+from+transgenic+mice+expressing+a+tetracycline-regulated+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Conditional transformation of a pancreatic beta-cell line derived from transgenic mice expressing a tetracycline-regulated oncogene.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (8), 3576-3580 (1995).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+small-molecule+inducers+of+pancreatic+beta-cell+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of small-molecule inducers of pancreatic beta-cell expansion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (5), 1427-1432 (2009).</li>
<li>Annes, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine+kinase+inhibition+selectively+promotes+rodent+and+porcine+islet+beta-cell+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Adenosine kinase inhibition selectively promotes rodent and porcine islet beta-cell replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (10), 3915-3920 (2012).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+cAMP-modulating+medications+to+promote+beta-cell+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Repurposing cAMP-modulating medications to promote beta-cell replication.</a> Mol Endocrinol. 28 (10), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Chen, C. A., Carolan, P. J., Annes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+screening+for+secreted+proteins+that+modulate+glucose+handling+identifies+interleukin-6+family+members+as+potent+hypoglycemic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo screening for secreted proteins that modulate glucose handling identifies interleukin-6 family members as potent hypoglycemic agents.</a> PLoS One. 7 (9), e44600(2012).</li>
<li>Izumi, K., Hirao, Y., Hopp, L., Oyasu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+induction+of+ornithine+decarboxylase+in+urinary+bladder+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro induction of ornithine decarboxylase in urinary bladder carcinoma cells.</a> Cancer Res. 41 (2), 405-409 (1981).</li>
<li>Serup, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homeodomain+protein+IPF-1%2FSTF-1+is+expressed+in+a+subset+of+islet+cells+and+promotes+rat+insulin+1+gene+expression+dependent+on+an+intact+E1+helix-loop-helix+factor+binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site.</a> Biochem J. 310, (Pt 3) 997-1003 (1995).</li>
<li>Szabat, M., Luciani, D. S., Piret, J. M., Johnson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+adult+beta-cells+revealed+using+a+Pdx1%2Finsulin+dual-reporter+lentivirus%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Maturation of adult beta-cells revealed using a Pdx1/insulin dual-reporter lentivirus.</a> Endocrinology. 150 (4), 1627-1635 (2009).</li>
<li>Rieck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+hepatocyte+nuclear+factor-4alpha+initiates+cell+cycle+entry%2C+but+is+not+sufficient+to+promote+beta-cell+expansion+in+human+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Overexpression of hepatocyte nuclear factor-4alpha initiates cell cycle entry, but is not sufficient to promote beta-cell expansion in human islets.</a> Mol Endocrinol. 26 (9), 1590-1602 (2012).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+mellitus--advances+and+challenges+in+human+beta-cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Diabetes mellitus--advances and challenges in human beta-cell proliferation.</a> Nat Rev Endocrinol. 11 (4), 201-212 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

β-hücre büyümesini ve yenilenmesini kontrol moleküler yollarını inceleyerek için deneysel yöntemler diyabet araştırmacılar için önemli araçlardır. Burada, bir fare-adacık bazlı tarama platformu sunulmuştur β-hücresi çoğalmasının küçük moleküllü uyarıcıları belirlemek ve karakterize etmek. Bu protokolün en yönlerini kolaylıkla deneyimli araştırmacılar tarafından yerine getirirken, bir kaç adım belirli teknik gerektirir. İlk olarak, adacık izolasyonu sırasında, kendi bütünlüğünü bozmadan safra...

Diyabet bozulmuş glikoz dengesinin ortak uç noktasını paylaşan bozuklukların bir koleksiyon kapsar. Diyabet alt tiplerinin patojenik mekanizma belirgin olmasına rağmen, azalmış β-hücresi kütlesi, yani insülin üretim kapasitesi 1,2 kaybı sonucu paylaşır. Halen, diyabet tedavi stratejileri eksojen insülin, insülin üretimi veya insülin duyarlılığı geliştirme farmakolojik stimülasyon kronik idaresi itimat ve nadiren, pankreas adacık ya da tüm pankreas 3,4 nakli. Ne yazık ki, bu stratejilerin başarısı kısa sürelidir ve / veya yeterince endojen insülin üretiminin işlevini özetlemek için başarısız olur. β-hücre yenilenmesini teşvik etmek için bir yöntem geliştirme programı olmasına rağmen, böyle bir yaklaşım var. Sonuç olarak, büyük bir şeker araştırma hedefi, yeni bir β-hücrelerinin üretilmesi için ya da endojen β-hücresi kütlesi 5 genişletmek için yöntemler geliştirmektir </sup&gt;. Bu embriyonik kök hücreleri gibi yenilenebilir kaynaklardan β-hücresi rejenerasyonu ilerlemektedir, ancak, güvenlik ve etkinlik ilgilidir olgun β-hücrelerinin genişlemesi, bir öncelik 6,7 dahil olmak üzere alternatif stratejileri, takip edin. Önemli olarak, in vivo olarak, yeni β-hücrelerinin baskın kaynağı önceden var olan β-hücrelerinin yerine özel bir progenitör hücreler 8,9 olan. β-hücrelerinin, sınırlı çoğaltma kapasitesine, β-hücresi kütlesindeki küçük bir artış sahip gibi görünmektedir, ancak (~% 30) pek çok diyabet hastası glukoz homeostazisin yeniden için yeterli olabilir. Ayrıca, β-hücresi kütlesi yerinde farmakolojik stimülasyon potansiyel olarak pahalı olmayan ve ölçeklenebilir bir tedavi stratejisidir. Burada β-hücresi büyümesini teşvik küçük molekülleri tanımlamak ve ayırt etmek için yüksek içerik tarama yöntemi sunulmaktadır. In vitro deney yöntemleri çeşitli gen ürünlerini ve / veya molekülleri tha tanımlamak için kullanılabilirt birincil β-hücre çoğalmasını teşvik. Β-hücre replikasyonu indüksiyonunu ölçen ilk çabalar, belirli bir tedavi koşullarında 10 yanıt olarak aldehit tiyonin veya insülin lekeli nüfus içinde [3H] timidin eklenmesini, BrdU dahil ve mitotik organları ölçmek için, fetal kemirgen pankreası kültürü ya da dokunulmamış izole adacığı kültürleri kullanılan 11. Bunlar in vitro yaklaşımlar ve yakın varyantları birkaç sınırlamaları vardır. Tanınmış eksiklikler olgun β-hücrelerinin aksine, yüksek bazal β-hücre çoğaltma oranı görüntüleyebilir ve farklı bir şekilde 12 düzenlenen büyümesi, fetal hücrelerin (1) kullanımını içerir; (2) β-hücre çoğaltma olaylarının deneyci bağımlı yargı öznel doğası; (3) β-hücre çoğaltma olaylarının deneyci bağımlı sayım emek ve zaman yoğun doğa deneysel verim geciktirir; Nükleer kuruluş / leke / görünüm (4) kullanımı bile çoğaltma tanımlamak içints ve β-hücreleri belirlemek için bir üst üste binmeyen sitoplazmik leke hücreleri olan B için yakın olmayan β-hücre replikasyonu etkinlikleri yanlış atıf yol açar. Daha yakın zamanda, olgun primer β-hücrelerinin β-hücresi çoğaltma 13-16 aşırı ifade transgenin etkisini hem de gen ürünü ya da bileşim tedavisi değerlendirmek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu çalışmalar, çoğaltma etkinlikleri, β-hücresi tanımlama ve / veya hacmini sınırlayan bağımlı adımlar, örneğin, hücre ya da sağlam adacık bir kayma oyuklu kaplama için sitoplazmik staining- veya spesifik olmayan yöntemlerin ilgili sayımı dayanmıştır parafin gömme ve işleme 17. Özellikle, burada sunulan birine benzer bir görüntü tabanlı insan β-hücre çoğaltma tarama yöntemi, 18 yayımlanmıştır; FEA Ancak, bu testin başarılı bir kullanımı ortaya konmamıştır ve birinci tarama için insan adacık kullanımı genel olarak olmayabilirsible. replikasyon teşvik maddelerin belirlenmesi için alternatif bir strateji, β-hücresi çizgilerinin büyümesi indüksiyonunu değerlendirmek için. İlk çabaları dönüştürülmüş β-hücre hatları gibi min6 hücreleri ya da INS 832/13 hücreleri 14,19-21 kullanılır. Ancak, bu hücre hatları kontrolsüz büyüme gösteren ve iyi diferansiye β-hücreleri 22 az benzerlik taşımaktadır. Sonuç olarak, büyüme-indüksiyon kapasitesi, en az belirsiz alaka ve recapitulate bazen zordur. Hücre satırı tabanlı tarama için geliştirilmiş bir strateji tetrasiklin (doksisiklin) yokluğunda tutuklanan büyüme bağımlı SV40 T antijeni ifade 23,24 olan hücreler &quot;geri dönülebilir dönüştürülmüş&quot; kullanmaktadır. Ancak, bu hücrelerin doksisiklin kaldırılması üzerine &quot;normal&quot; bir β-hücre benzeri duruma dönmek belirsizdir. Ne yazık ki, bu hücrelerin kullanımı derhal kullanıma sahip görünmüyor genelleştirilmiş büyüme destekleyici bileşikler vermiştir24. Genel olarak, en az spontan replikasyon aktivitesi gösteren bir hücre tipi büyüme düzenleme çalışma hücre çizgilerinin kullanımı kısıtlı kullanımı olabilir. Burada sunulan β-hücre çoğaltma tarama platformu mümkün olduğu ölçüde, soy-kısıtlı büyüme destekleyici faaliyetlerin tanımlanmasını sağlamak için karma hücre tipi bileşiminin adacık hücre kültürleri, multi canlılarda büyüme yönetmelikte korumak için olgun birincil sıçan β-hücreleri kullanır eh verimlilik ve otomatik analiz maksimize etmek biçimlendirme önyargı ortadan kaldırmak ve verimi kolaylaştırmak için. Bu platformun başarılı kullanımı β-hücre çoğaltma 25,26 teşvik birkaç bileşiklerin belirlenmesini sağladı. Ayrıca, tahlil β-hücre çoğaltma moleküler regülasyonu içine mekanistik anlayış sağlamak için yapı-aktivite ilişkisi çalışmaları ve kimyasal epistasi deneyleri için kullanılır olmuştur. sunulan platformu başarıyla fo uyarlanmıştırβ-hücre çoğalmasının r lentiviral RNAi tabanlı soruşturma 25 yolaklarıyla. tahlilinde sınırlamaları (birincil hücre kullanımının) ölçeklenebilirlik Kısıtlı&#39;dır yerine antikor bazlı görüntüleme ve primer adacık kullanım, kullanım ile bağlantılı (deney insan doku adacığı çalışmaları için adapte edebilir) insan doku adacığı hücrelerinden, giderleri daha kemirgen kullanımı görüntü elde etme ve analiz yeteneği ile otomatik mikroskop doluluk durumuna bağlı olarak otomatik görüntü toplama ve bağımlılığını kolaylaştırmak için dağınık adacıklar (bozulmuş adacık mimarisi). Gen ürünlerinin ya da in situ β-hücresi rejenerasyonunu teşvik eden bileşiklerin belirlenmesi için basit, in vivo bir tarama yöntemi ideal olacaktır, ancak bu platform yapılmamış 27 kullanılamaz. Sonuç olarak, açıklanan platformu β-hücre çoğalmasının en yönlerini araştıran ilgilenen araştırmacı için uygundur.

<table><tbody><tr><td>250 g erkek Erkek Sprague Dawly Sıçan</td><td>Charles Nehri</td><td>Lekesi # 400</td><td></td></tr><tr><td>12 cm diş tisuue forseps</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>11021-12</td><td></td></tr><tr><td>11,5 cm ince makas</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>14,5 cm cerrahi makas</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>14001-14</td><td></td></tr><tr><td>16 cm kavisli forseps</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>11003-16</td><td></td></tr><tr><td>12 cm kavisli hepostat</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>13011-12</td><td></td></tr><tr><td>12 cm neşter sapı</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Doku elek-30 gözenekli</td><td>Bellco Glass</td><td>1985-85000</td><td></td></tr><tr><td>Çimme RI, 375.000 CDA ünitesi</td><td>VitaCyte</td><td>005-1030</td><td></td></tr><tr><td>Hanks'in Dengeli Tuz çözeltisi (Ca++ ve Mg++)</td><td>Gibco</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin HCl (200 mg/20 ml)</td><td>JHP Pharmaceuticals</td><td>NDC# 42023-113-10</td><td>anestezik kokteyl yapmak için&nbsp;</td></tr><tr><td>Ksilazin (5 g / 50 ml)</td> <td>LLOYD</td><td>NADA # 139-236</td><td>anestezik kokteyl yapmak için&nbsp;</td></tr><tr><td>Histopak 1077</td><td>Sigma</td><td>H-1077</td><td>histok yapmak için 1100</td></tr><tr><td>Histopaque 1119</td><td>Sigma</td><td>H-1119</td><td>histok yapmak için 1100</td></tr><tr><td>Yenidoğan Buzağı Serumu 500 ml</td><td>Hyclone</td><td>SH30118.03</td><td></td></tr><tr><td>Hanks'in Dengeli Tuz çözeltisi</td><td>Hyclone</td><td>SH30268.01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle Orta/Düşük Glikozu&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30021.01</td><td></td></tr><tr><td>İşlevsellik/Uygulanabilirlik Çözümü&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>99-768-CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 medya&nbsp;</td><td>Şartlandırılmış</td><td>ortam</td><td></td></tr><tr><td>804G sıçan mesane karsinomu hücre hattı</td> yapmak için hyclone SH30096.01 <td>Şartlandırılmış orta</td>Fetal Sığır Serumu yapmak için <td>istek</td><td></td> üzerine temin edilebilir</tr><tr><td>, Nitelikli</td><td>Gibco</td><td>26160</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax-I</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin (5.000 IU / ml / Strptomisin (5 mg / ml)&nbsp;</td><td>MP Biyomedikaller</td><td>1670049</td><td></td></tr><tr><td>Formamid 500 ml</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP227-500</td><td></td></tr><tr><td>Antijen Maskeleme Solüsyonu 250 ml (pH 6.0)</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-3300</td><td>0.15 M Sodyum Sitrate çözeltisi yapmak için</td></tr><tr><td>Dekstroz, Susuz</td><td>EMD Kimyasalları</td><td>DX0145-1</td><td>1 M glikoz çözeltisi yapmak için</td></tr><tr><td>Nomal Donkey Serum (Toz)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti-insan Ki67 antikoru</td><td>BD Biosciences</td><td>556003</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-insan PDX-1 antikoru</td><td>R& D Sistemleri</td><td>AF2419</td><td></td></tr><tr><td>Poliklonal Kobay anti-insülin antikoru</td><td>Dako</td><td>2016-08</td><td></td></tr><tr><td>Poliklonal Tavşan anti-glukagon antikoru</td><td>Dako</td><td>2014-06</td><td></td></tr><tr><td>Poliklonal Tavşan anti-somatostatin antikoru</td><td>Dako</td><td>2011-08</td><td></td></tr><tr><td>Poliklonal tavuk anti-vimentin antikoru</td><td>abcam</td><td>ab24525</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-SP-konjuge, Eşek Anti-Fare IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-065-150</td><td></td></tr><tr><td>StreptAvidin, Alex Flour 488 konjuge&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>S32354</td><td></td></tr><tr><td>Rodamin konjuge Eşek Anti-Keçi IgG & nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-025-147</td><td></td></tr><tr><td>Rodamin konjuge Eşek Anti-Kobay IgG ve nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-025-148</td><td></td></tr><tr><td>Rodamin konjuge Eşek Anti-Tavşan IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-025-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy 5 konjuge Eşek Anti-Kobay IgG & nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-175-148</td><td></td></tr><tr><td>Cy 5-konjuge Eşek Anti-Keçi IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-175-147</td><td></td></tr><tr><td>Cy 5-konjuge Eşek Anti-Tavşan IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-175-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy 5-konjuge Eşek Anti-Tavuk IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-175-155</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Millipore</td><td>S7113</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Reaktif Rezervuarı 25 ml</td><td>Sorenson BioScience</td><td>39900</td><td></td></tr><tr><td>384 kuyu, siyah/şeffaf, doku kültürü uygulanmış plaka</td><td>BD Falcon</td><td>353962</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu, siyah/şeffaf, doku kültürü uygulanmış plaka</td><td>Costar</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Çok kanallı pipetleyici</td><td>Costar</td><td>4880</td><td></td></tr><tr><td>12 kanallı vakum aspiratörü</td><td>Drummond</td><td>3-000-096</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Kazıyıcı</td><td>Falcon</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Su Banyosu Modeli 2223 ve nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yüksek içerikli tarama cihazı: ArrayScan VTI</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bir yüksek içerik<em&gt; İn vitro</em&gt; pankreas adacık β-hücre çoğaltma keşif platformu

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

İnsülin üreten β hücrelerinin kaybı diyabetin merkezi bir özelliğidir. Çeşitli potansiyel replasman tedavileri araştırılırken, endojen insülin üreten pankreas adacık β hücrelerinin genişletilmesi çekici bir strateji olmaya devam etmektedir. β hücreleri sınırlı spontan rejeneratif aktiviteye sahiptir; Sonuç olarak, çok önemli bir araştırma çabası, β hücresi büyümesini kısıtlayan moleküler yolların kesin bir şekilde anlaşılmasını sağlamak ve bu kısıtlamaların üstesinden gelebilecek ilaçları belirlemektir. Burada, β hücre replikasyonunu teşvik eden küçük molekülleri tanımlamak için otomatik, yüksek içerikli görüntü tabanlı bir birincil hücre tarama yöntemi sunulmaktadır. Önceki metodolojilerin birkaç sınırlaması aşılmıştır. İlk olarak, ölümsüzleştirilmiş bir hücre hattı yerine birincil adacık hücrelerinin kullanılması, in vivo büyüme kısıtlamalarının tutulmasını en üst düzeye çıkarır. İkincisi, β hücreli bir hat yerine karışık bileşimli adacık hücre kültürlerinin kullanılması, hem soy kısıtlı hem de genel büyüme uyarıcılarının tanımlanmasına izin verir. Üçüncüsü, teknik, 384 kuyulu bir format kullanarak sınırlayıcı bir kaynak olan birincil adacıkların kullanımını pratik hale getirir. Dördüncüsü, düzensiz adacık kültürü kalitesi ile ilişkili zararlı deneysel değişkenlik, izolasyon, dispersiyon, kaplama ve kültür parametrelerinin optimizasyonu ile aşılır. Beşincisi, adacık endokrin hücrelerinin düşük bazal replikasyon oranını doğru ve tutarlı bir şekilde ölçmenin zorlukları, optimize edilmiş immün boyama parametreleri, otomatik veri toplama ve veri analizi ile aşılır; Otomasyon aynı anda verimi artırır ve deneyci yanlılığını sınırlar. Bu testin dikkate değer sınırlamaları, adacık mimarisini bozan dağınık adacık kültürlerinin kullanımı, insan adacıklarından ziyade kemirgen kullanımı ve birincil hücrelerin kullanımıyla ilişkili verim ve maliyetin doğal sınırlamalarıdır. Daha da önemlisi, strateji insan adacık çoğaltma çalışmaları için kolayca uyarlanabilir. Bu tahlil, maddelerin β hücreleri üzerindeki mitojenik etkisini ve hücre β büyümesini düzenleyen moleküler mekanizmaları araştırmak için çok uygundur.

β-hücre ya da α-hücresi çoğalmasını değerlendirmek için, dört renkli bir deney protokolü gereklidir. İlk olarak, nesnelerin DAPI lekelemesi (kanal 1, 386 nm) ile belirlenmiştir. Sonraki, β-hücreleri (olay 1) sayılır: nesneleri PDX-1 + (kanal 2, 650 nm) ve peri-nükleer insülin (kanal 3, 549 nm) co-ifade eder. Daha sonra, kopyalayan β-hücreleri (olay 2) sayılır: (olay 1) co-express Ki-67 (kanal 4, 485 nm) (Şekil 3)-hücreleri ß. β-hücreleri çoğaltılıyor yüzdesi h...

diyabet araştırma alanı için kritik zorluklar adacık β-hücre çoğalmasını düzenleyen ve β-hücre yenilenmesini teşvik etmek için yöntemler geliştirmek moleküler mekanizmalarını anlamak için vardır. Burada yüksek içeriği tarama yöntemi belirlemek ve küçük moleküllerin β-hücresi replikasyon teşvik aktivitesi sunulmuştur değerlendirmek.

Bir Yüksek içerik<em&gt; İn Vitro</em&gt; Pankreas Adacık β-hücre çoğaltma Keşif Platformu

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

Bu yüksek içerikli beta hücresi replikasyon tarama platformunun genel amacı, beta hücresi büyümesini kısıtlayan moleküler yolakların araştırılmasını kolaylaştırmaktır. Bu yöntem, beta hücresi biyolojisi alanındaki önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin, beta hücresi rejenerasyonunu kontrol eden temel sinyal moleküllerinden ve yolaklarından birinin belirlenmesi gibi.Bu tekniğin temel avantajları, belirli bir değerlendirme için hücre hattı verimliliğinin artırılmasına ve primer adacık hücresi replikasyonunun otomatik veri analizine olanak tanımasıdır. Bu tekniğin kullanımı, toplumumuz için ciddi sağlık ve ekonomik maliyeti olan bir hastalık olan diyabet için rejeneratif tedavinin geliştirilmesine yönelik genişleme potansiyeline sahiptir.İşleme, sistik kanal ile ortak hepatik kanalın birleşme noktasında veya hemen distalinde ortak safra kanalını kanüle etmek için 22 gauge iğne donanımlı ve 10 mililitre pankreatik sindirim solüsyonu yüklü bir şırınga kullanarak başlayın. Ortak safra kanalını bir bistüri sapıyla destekleyerek, solüsyonun 10 mililitresini yavaşça enjekte edin. Kollagenazın tamamı uygulandıktan sonra, şişmiş pankreası descending kolon, bağırsaklar, mid

a-high-content-vitro-pancreatic-islet-cell-replication-discovery

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Burada, fare embriyonik pankreas izolasyonu, kültür ve manipülasyon için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu mükemmel bir...

Için bir sistem<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Pankreas&gt; ekimi

Langerhans adacıkları izole edilmiş fare kullanılarak in vitro β-hücre fonksiyonu denenmesi diyabet patofizyolojisi ve terapötik çalışmada önemli bir bileşenidir. Çok sayıda alt-uygulama mevcut olmakla birlikte, bu protokol, spesifik olarak β-hücresi fonksiyonunu belirleyen önemli bir parametre olarak hücre içi siklik adenozin monofosfat (cAMP) ölçümünü açıklamaktadır.

Fare Pankreas Adacık İzolasyonu ve hücre içi cAMP Belirlenmesi için Bir Yöntem

Izole etmek için bir protokol, insan fetal pankreas hücrelerden türetilen kültür ve görüntü adacık hücre kümeleri (SKK) tarif edilmektedir. Yöntem, doku kültür mono-tabaka olarak veya agrega olarak süspansiyon halinde ve proliferasyon belirteçler ve pankreatik hücre hayati kararlar için resimdeki ÜAK'lerin oluşturmak için gerekli adımları göstermektedir.

İnsan Fetal Pankreas Hücre Kümeleri İzolasyon, Kültür ve Görüntüleme

Bu protokol açıklanan üç boyutlu kültür yöntemi dallı bir organ haline onların önemli genişleme, farklılaşma ve morfojenezinin dahil dağınık embriyonik fare pankreas atalarıdır, gelen pankreas gelişimini özetlediği. Bu yöntem, görüntüleme, niş fonksiyonel müdahale ve manipülasyon için uygun değildir.

Dağınık Fare Embriyonik progenitörlerin gelen Vitro Pankreas organogeneziste

Kendini yenileme ve erişkin fare pankreas izole progenitör hücrelerin farklılaşmasını tespit etmek için in vitro koloni deneylerde icat edilir. Bu analizlerde, pankreas ataları metilselüloz içeren yan-katı bir ortam içinde 3-boyutlu bir uzayda hücre kolonileri yol açar. tek hücreler ve bireysel koloniler karakterizasyonu taşıma protokolleri açıklanmıştır.

In Vitro Colony Tahliller Tri-güçlü Progenitör Hücreleri karakterize Yetişkin Fare Pankreas İzole

Ex vivo pankreas adacık çalışmalar diyabet araştırma için önemlidir. Onların yerli 3 boyutlu mimari kültürlü adacıkları çalışmaya varolan zaman alıcı, verimsiz ve az kullanılan tekniklerdir. Bu eser bütün kültürlü adacıkları yüksek kalitede parafin bölümleri oluşturmak için yeni, basit ve etkili bir yöntem açıklanır.

Pankreas adacık parafin kesitler için katıştırma

Embriyonik, yenidoğan ve postnatal pancreases tek hücreli RNA sıralama tarafından takip endokrin hücrelerden yalıtım için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, analizleri sağlar pankreatik endokrin lineage gelişimi, heterojen ve transcriptomic dinamikleri hücre.

Fare pankreatik endokrin hücreleri tek hücre Transcriptomic analizleri

Burada, bir damlacık bazlı mikrofluidik tek hücreli RNA sıralama teknolojisini kullanarak izole insan pankreatik izletden tek hücrelerin yüksek kaliteli, büyük ölçekli transkriptom veri oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.

Insan pankreatik Izletinin tek hücreli RNA sıralaması ve Analizi

Bu makale, β hücreli benzeri hücrelerin yönlendirilmiş farklılaşması ve fonksiyonel analizi için bir protokol sunmaktadır. İnsülin üreten pankreas hücreleri oluşturmadan önce insan pluripotent kök hücreleri için optimal kültür koşullarını ve pasajlarını tanımladık. Altı aşamalı farklılaşma, kesin endoderm oluşumundan, glikoza yanıt olarak insülin salgılayan fonksiyonel β hücreli hücrelere doğru ilerler.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Fonksiyonel Pankreas İnsülin Salgılayan Hücreler Üretmek için Optimize Edilmiş Protokol

Izole adacık transplantasyonu tip 1 şeker hastalığı için potansiyel bir tedavi olarak öne sürülmüştür. Burada, fare pancreata adacıkları izole, ve böbrek subkapsüler alan nakli için bir yöntem açıklanmaktadır.

Murin Islet İzolasyon ve subkapsüler Böbrek Nakli Bir Yöntem

Keşfedin, pankreas adacık β-hücre çoğaltmasını teşvik eden küçük molekülleri yüksek içerikli tarama yöntemiyle belirleyin. Bu platform, diyabet araştırmalarında rejeneratif tedaviler geliştirmeye yardımcı olur.

Bir Yüksek içerik

Daha fazla video keşfet