Name: Yüksek verim Protoplast İzolasyonu ve Dönüşüm için Robotik Platformu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Öğrenin, BY-2 tütün süspansiyon hücrelerinde yüksek verimli protoplast izolasyonu ve otomatik dönüşüm yöntemini. Bu robotik platform, gen ifadesi çalışmalarında paralel tarama ve genom düzenleme hedeflerinin hızlı taranmasını sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma İleri Araştırma Projeleri Ajansı - Enerji (ARPA-E) Ödül No. tarafından desteklenmiştir. DE-AR0000313.

Süspansiyon Hücre Kültürleri 1. kurulması <ol><li> BY-2 ortamı PO4 4.43 g Linsmaier ve Skoog bazal ortamı, sukroz, 30 gr, 200 mg KH 2 ekleyerek sıvı hazırlayın ve damıtılmış 200 ug ila 900 2,4-diklorofenoksiasetik asit (2,4-D) mi su ve 0.1 M KOH ile pH değeri 5.8&#39;e. pH ayarlandıktan sonra damıtılmış su ve otoklav ile 1000 ml nihai hacim ayarlayın. Ortam, 4 ° C&#39;de 2 hafta kadar saklanabilir. </li><li> % 1 ilave By-2 ortamı, 250 ml&#39;lik bir Erlenmeyer bir katı İLE-2 ortamı üzerinde yetiştirilen 100 ile-2 ortamı sıvı ml x 2 yara dokusunun tek bir parça (&gt; 1 cm çaplı) ile balonun (sıvı inoküle ağar) ve alüminyum folyo ile kapatın. 5 gün çalkalanarak 28-30 ° C &#39;de kültür inkübe edin. NOT: Sıvı kültürler hızla büyümek gibi BY-2 kallus, uzun süreli depolama için katı ortam üzerinde muhafaza edilir. Kültür hacmi, tipik olarak, 100 ml kültür üç otuz 6-w yükleme kapasitesine sahip olacaktır, gerektiğinde ayarlanabilirarşın plakalar. </li><li> Transferi 2 x 2 Kültür Fresh-2 ortamı 98 ml log fazı ml çalkalanarak 28-30 ° C&#39;de 5-7 gün süreyle inkübe edilir. Not: kallus 100, 5-7 günlük kültür dilüsyonları yerine aşı: kurulan sıvı kültürlerin Alt kültür düzenli 1 kullanılarak gerçekleştirilebilir. </li><li> Hücreler hızla yerleşmek gibi, iyice karıştırın kültür, ve transfer hücre kültürü 6 ml 15 ml konik alt santrifüj tüpüne ve hücreler en az 10 dakika süreyle razı olsun. Süpernatan uzaklaştırılmış, toplam hacminin% 50&#39;si için paketlenmiş hücre hacmi ayarlayın. </li><li> sindirim için, 6 gözlü bir plakanın her bir oyuğuna, 500 ul çevrilerek ve bir pipet ile tüp çalkalayın. Onlar yoğun olarak, bu aşamada hücreler aktarmak için geniş çaplı pipetleri kullanın ve standart pipet ipuçları yapışmasına neden olacaktır. </li></ol> 2. Protoplast İzolasyonu <ol><li> Robot sistemi (Şekil 1A) tüm bileşenleri açın ve yumuşak zamanlama plaka taşıyıcı görevi açmakware. görev zamanlama programı her ekipman parçasının arasına plakaların transferini sağlamak için diğer ekipman ile mikroplağı değişenlerden bütünleştirir. </li><li> Aşağıdaki gibi önceki deney için, plaka taşıyıcı yazılım laboratuvar her bir parça, teknik protokolde kullanılan laboratuvar özelliklerini (örneğin, tabak, kapaklar), hem de başlangıç ve bitiş pozisyonları tanımlamak: <ol><li> Plaka taşıyıcı yazılımı ana araç çubuğundan Kur&#39;u tıklatın ve Yönet Konteyner Çeşitleri komutunu seçin. </li><li> konteyner tipi mevcut konteyner tipi kitaplığında listede varsa, o zaman uygun bir kap seçin. </li><li> Konteyner tipi mevcut konteyner tipi kitaplığında yer almıyorsa o zaman yeni bir konteyner türünü belirtmek için Ekle &#39;yi tıklatın. </li><li> Yeni bir konteyner tipi ekledikten sonra, uygun sekmeler halinde (ofset yükseklik, genişlik, istifleme boyutları ve kavrayıcı) yeni konteyner boyutları eklemek ve Kaydet&#39;i tıklatın.<ol><li> Doğru boyutlar üreticinin mevcut değilse, o zaman doğru kumpas kullanılarak en yakın milimetreye kadar tüm boyutlarını belirlemek. konteyner boyutları ölçmek hatalar plaka taşıyıcı başarısızlıkla sonuçlanacaktır. </li></ol></li><li> Tekrarlayın plaka taşıyıcı karşılaşacak tüm konteyner tipleri için 2.2.4.1 ile 2.2.2 adımları. Tüm laboratuvar Bu aşamanın tamamlanmasından sonra, her bir kabın (aşama 2.2.6) için başlangıç ​​ve bitiş konumunu tanımlamak için gereklidir. NOT: Bu protokol için laboratuvar 6-plaka derin oyuklu plaka ve 96 oyuklu flüoresan görüntüleme plaka içerir. </li><li> Her kabın başlangıç ve bitiş konumunu tanımlamak için, belirli bir protokol Başlangıç / Bitiş sekmesini tıklatın. İlk olarak, her kabın başlangıç ​​konumu seçin. Sonraki, başlangıç ve bitiş pozisyonunda hem de Kapaklı / Unlidded kutusunu işaretleyin. tüm konteynerler için tekrarlayın. NOT: Konteyner equ başka bir parça sol edilecek iseipment (yerine levha taşıyıcı içinde) son konumu boş bırakılabilir. </li></ol></li><li> Bu aşamada el ile tüm iş akışı için başlangıç ​​pozisyonuna tüm plakaları yükleyin. , Otel 3&#39;e BY-2 hücreleri ile otel haline levha ısıtıcı / soğutucu yuva 2 üzerine transformasyonu için kullanılacak bir 96 kuyulu plaka ve 50 ml konik 2, 6 oyuklu plakalar 96 oyuklu flüoresan görüntüleme levhaları yük çok modlu dağıtıcı üzerine enzim solüsyonu (Company Dosya, Bölüm 1.2.2 bakınız) içeren tüp. <ol><li> Transformasyon protokolü içinde gerçekleştirilebilir olacaksa, oyuk başına plasmid DNA, 10 ul 96 kuyulu plaka ön yük (1 ug / ml, A 260/280&gt; 1.8) OFP raportör konstruktunu ihtiva eden ve levha üzerinde inkübe 4 ° C&#39;de ısıtma / soğutma. Her iyi, tek bir dönüşüm için deney düzeneği bağlıdır dolu kuyuların böylece sayıda kullanılacaktır. </li></ol></li><li> otomatikleştirmek tüm malzemeleri ve tabak yükleyinbelirlenmiş yerlerde d sıvı taşıma platformu ve otomasyon kontrol yazılımı (Şekil 1B) her öğenin konumunu tanımlar. <ol><li> Sütun 1 mmg içinde% 40 PEG 200 ul (0.4 M manitol, 100 mM MgCl2, 4 mM MES, pH 5.7), propidyum iyodür 200 ul ile önceden yüklenmiş, 96 oyuklu bir plaka yükleme (p, ve 1 ng / ml) 2. sütun ve sütun 3 (yuva 2) etanol 200 ul ve yuva 8 pipet uçları bir kutu içinde. </li><li> Menüden otomatik sıvı taşıma platformunun yazılımında laboratuvar konumunu Araçlar tanımlamak ve Laboratuvar Editör tıklayın. </li><li> Açılan menüden laboratuvar türünü seçin veya Yeni Laboratuvar düğmesini kullanarak yeni bir laboratuvar türü tanımlar. </li><li> Ana Protokol sekmesini seçip yapılandırma laboratuvar tıklayarak seçilen laboratuvar her parçasının konumunu tanımlayın. Otomatik sıvı taşıma platformu üzerine yerleştirilen laboratuvar her parça olduğundan emin olunprotokol çalıştırmadan önce tanımlanmış. </li><li> Otomatik protokolleri tetiklemek için, Profil Explorer penceresini tıklayın ve çalıştırmak için protokolü (Protoplast İzolasyonu, Hücre Sayımı ve PEG-aracılı Dönüşüm) adını seçin. </li><li> Protokolünde kullanılacak olan tüm cihazların başlatmak için Çalıştır&#39;ı tıklatın. </li><li> Son olarak, Çalışma Explorer penceresinde, sistemdeki tüm konteynerler / laboratuar aletlerinin doğrulamak ve otomatikleştirilmiş protokol başlamak için Çalışma Birimi Ekleme tıklayın. NOT: Otomatik protokollerin tam açıklamaları Company Dosya yer almaktadır. </li></ol></li></ol> 3. Hücre Sayımı için Standart Eğrisi oluşturulması <ol><li> El ile 1 ml&#39;lik bir hacim içinde, 1 x 10 6 protoplastlar / ml&#39;lik bir konsantrasyonda protoplast konsantre. Santrifüj 10 dakika boyunca 1.000 xg&#39;de protoplastlannda ve süpernatant kaldırmak. </li><li> El ile protoplast pelet (4 ° C&#39;de),% 70 etanol içinde 900 ulve pelet yeniden askıya. hücrelerin tespit edilmeleri için, buz üzerinde 10 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> çekirdekleri etiket ve plaka okuyucu tarafından fark edilmesine olanak vermek için protoplast için PI, 100 ul (1 ug / ml) eklenir. </li><li> Yük sütununda 2 başlayarak 96-iyi floresan tarama plakasının her sütun ve satır içine BY-2 medya sıvının 80 ul. </li><li> 96 oyuklu bir flüoresan görüntüleme plaka sütun 1 de, her bir kuyucuğa İLE-2 ortamı protoplast 70 ul ve 50 ul ekle. </li><li> otomatik sıvı taşıma platformunun yuva 6 plaka koyun ve 2-kat seri seyreltme çalıştırın. <ol><li> Otomatik sıvı taşıma platformu üzerinde bir seri seyreltme yapmak için, Seri Sulandırma Sihirbazı başlatın tıklayın ve transfer hacmi (60 ul), karışımları ve hacim (2, 70 ul), ilk kuyu sayısı (sütun 1, Satırlar AF), seyreltme ayarlamak kuyular (Sütunlar 2-11, Satırlar AF) ve aspire ve dağıtmak özellikleri (kuyu alt 0,5 mm). </li><li> parametreleri ayarladıktan sonra, bir kaydetmeprotokolü çalıştırmak d. NOT: Tüm protoplastlar (nedeniyle hücrelerin fiksasyon) PI ile etiketlenmiş beri, floresan protoplast konsantrasyonu ile orantılıdır. </li><li> seri seyreltme işlemi tamamlandıktan sonra, yuva 9&#39;dan plaka kaldırmak ve plaka okuyucu içine yerleştirin ve plaka okuyucu yazılımı standart eğri protokolünü çalıştırın. Not: bir standart eğri daha sonra bilinen protoplast konsantrasyonu her bir PI den (eksitasyon 536 nm / emisyon 620 nm) floresan karşılaştırılarak oluşturulur. </li></ol></li><li> plaka okuyucu protokolünün tamamlanmasının ardından, plaka kaldırmak ve otoklav veya &quot;biyo-güvenlik protokolleri de tanımlandığı gibi de-canlandırma prosedürlerinin herhangi bir transgenik hücreleri toplamak. </li></ol> Dönüşüm 4. Mikroskobik Analizi <ol><li> Dönüştürülmüş protoplastların robot sisteminin Otel 1 (Otomatik Protokolünün 3, Ek Dosya ürünü) ile plakasını sökün. </li><li> dönüşinverted mikroskop, kamera ve floresan lamba. </li><li> , Protoplastlar odaklanan ilk için 10X objektif seçmek halojen lamba açmak ve floresan lamba için deklanşöre kapatın. </li><li> aydınlık kullanarak protoplastlar mikroskobik sistemi ve odak üzerine yük plakası. </li><li> protoplastlar odaklanarak sonra, halojen ampul kapatın ve floresan lamba için deklanşöre açın. </li><li> Transgenik protoplastlar tarafından ifade pporRFP proteinin görselleştirme için belirlenen CY3 / TRITC filtresini seçin. </li><li> pporRFP floresan işaretleyici ifade protoplastlar sayısını belirlemek için de her tarayın. </li><li> floresan işaretleyici protoplast sayısı ifade protoplast toplam sayısı olarak transformasyon etkinliğini hesaplayın. </li><li> otoklav ya da &#39;biyogüvenlik protokollerde tanımlanan diğer de-yaşatma işlemleri için onaylanmış biyogüvenlik torbalarda transgenik hücre içeren herhangi bir levha toplayın. </li></ol>

<ol><li>Atkinson, H. J., Lilley, C. J., Urwin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+transgenic+nematode+control+in+developed+and+developing+world+crops%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Strategies for transgenic nematode control in developed and developing world crops.</a> Curr. Opin. Biotech. 23 (2), 251-256 (2012).</li>
<li>Duke, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+transgenic%2C+herbicide-resistant+crops+in+the+United+States+almost+20+years+after+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag.+Sci%22%5BJournal%5D)">Perspectives on transgenic, herbicide-resistant crops in the United States almost 20 years after introduction.</a> Pest Manag. Sci. 71 (5), 652-657 (2015).</li>
<li>Mir, R., Zaman-Allah, M., Sreenivasulu, N., Trethowan, R., Varshney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+genomics%2C+physiology+and+breeding+approaches+for+improving+drought+tolerance+in+crops%5BTitle%5D)+AND+%22Theor.+Appl.+Genet%22%5BJournal%5D)">Integrated genomics, physiology and breeding approaches for improving drought tolerance in crops.</a> Theor. Appl. Genet. 125 (4), 625-645 (2012).</li>
<li>Hu, H., Xiong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+and+breeding+of+drought-resistant+crops%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant+Bio%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering and breeding of drought-resistant crops.</a> Annu. Rev. Plant Bio. 65, 715-741 (2014).</li>
<li>Marco, F., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarco%2C+F+%22Plant+Biology+and+Biotechnology%22">Plant Biology and Biotechnology</a>. , Springer. 579-609 (2015).</li>
<li>Edgerton, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+insect+resistance+traits+increase+corn+yield+and+yield+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transgenic insect resistance traits increase corn yield and yield stability.</a> Nat. Biotechnol. 30 (6), 493-496 (2012).</li>
<li>Vanhercke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+engineering+of+biomass+for+high+energy+density%3A+oilseed-like+triacylglycerol+yields+from+plant+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotech.+J%22%5BJournal%5D)">Metabolic engineering of biomass for high energy density: oilseed-like triacylglycerol yields from plant leaves.</a> Plant Biotech. J. 12 (2), 231-239 (2014).</li>
<li>Baxter, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-year+field+analysis+of+reduced+recalcitrance+transgenic+switchgrass%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotech.+J%22%5BJournal%5D)">Two-year field analysis of reduced recalcitrance transgenic switchgrass.</a> Plant Biotech. J. 12 (7), 914-924 (2014).</li>
<li>Xing, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR%2FCas9+toolkit+for+multiplex+genome+editing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants.</a> BMC Plant Biol. 14 (1), 327(2014).</li>
<li>Cao, J., Yao, D., Lin, F., Jiang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG-mediated+transient+gene+expression+and+silencing+system+in+maize+mesophyll+protoplasts%3A+a+valuable+tool+for+signal+transduction+study+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physio.+Plant%22%5BJournal%5D)">PEG-mediated transient gene expression and silencing system in maize mesophyll protoplasts: a valuable tool for signal transduction study in maize.</a> Acta Physio. Plant. 36 (5), 1271-1281 (2014).</li>
<li>Martinho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+miRNA+pathways+using+Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Dissection of miRNA pathways using Arabidopsis mesophyll protoplasts.</a> Mol. Plant. 8 (2), 261-275 (2015).</li>
<li>Bart, R., Chern, M., Park, C. J., Bartley, L., Ronald, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+system+for+gene+silencing+using+siRNAs+in+rice+leaf+and+stem-derived+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel system for gene silencing using siRNAs in rice leaf and stem-derived protoplasts.</a> Plant Methods. 2 (1), 13(2006).</li>
<li>Jiang, F., Zhu, J., Liu, H. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protoplasts%3A+a+useful+research+system+for+plant+cell+biology%2C+especially+dedifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Protoplasts: a useful research system for plant cell biology, especially dedifferentiation.</a> Protoplasma. 250 (6), 1231-1238 (2013).</li>
<li>Martin-Ortigosa, S., Valenstein, J. S., Lin, V. S. Y., Trewyn, B. G., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotechnology+meets+plant+sciences%3A+Gold+functionalized+mesoporous+silica+nanoparticle+mediated+protein+and+DNA+codelivery+to+plant+cells+via+the+biolistic+method%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">Nanotechnology meets plant sciences: Gold functionalized mesoporous silica nanoparticle mediated protein and DNA codelivery to plant cells via the biolistic method.</a> Adv. Funct. Mater. 22 (17), 3529-3529 (2012).</li>
<li>Křenek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+plant+transformation+mediated+by+Agrobacterium+tumefaciens%3A+Principles%2C+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Transient plant transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens: Principles, methods and applications.</a> Biotechnol. Adv. , (2015).</li>
<li>Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%3A+a+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).</li>
<li>Mustafa, N. R., de Winter, W., van Iren, F., Verpoorte, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation%2C+growth+and+cryopreservation+of+plant+cell+suspension+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures.</a> Nat. Protoc. 6 (6), 715-742 (2011).</li>
<li>Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+BY-2+cell+line+as+the+%26%2334%3BHeLa%26%2334%3B+cell+in+the+cell+biology+of+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Tobacco BY-2 cell line as the &#34;HeLa&#34; cell in the cell biology of higher plants.</a> Int. Rev. Cytol. 132 (1), 1-30 (1992).</li>
<li>Centomani, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+DNA+methylation+in+the+control+of+cell+growth+during+heat+stress+in+tobacco+BY-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Involvement of DNA methylation in the control of cell growth during heat stress in tobacco BY-2 cells.</a> Protoplasma. , 1-9 (2015).</li>
<li>Sgobba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+deficiency+stimulates+a+stress+condition+in+tobacco+BY-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechnologia%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP deficiency stimulates a stress condition in tobacco BY-2 cells.</a> BioTechnologia. 94 (2), (2013).</li>
<li>Väisänen, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coniferyl+alcohol+hinders+the+growth+of+tobacco+BY-2+cells+and+Nicotiana+benthamiana+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Coniferyl alcohol hinders the growth of tobacco BY-2 cells and Nicotiana benthamiana seedlings.</a> Planta. 242 (3), 747-760 (2015).</li>
<li>Ortiz-Espìn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-expression+of+Trxo1+increases+the+viability+of+tobacco+BY-2+cells+under+H2O2+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Botany%22%5BJournal%5D)">Over-expression of Trxo1 increases the viability of tobacco BY-2 cells under H2O2 treatment.</a> Ann. Botany. 116 (4), 571-582 (2015).</li>
<li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cis-Golgi+proteins+accumulate+near+the+ER+exit+sites+and+act+as+the+scaffold+for+Golgi+regeneration+after+brefeldin+A+treatment+in+tobacco+BY-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Bio.+Cell%22%5BJournal%5D)">cis-Golgi proteins accumulate near the ER exit sites and act as the scaffold for Golgi regeneration after brefeldin A treatment in tobacco BY-2 cells.</a> Mol. Bio. Cell. 23 (16), 3203-3214 (2012).</li>
<li>Madison, S. L., Nebenführ, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+dual-labeled+Golgi+stacks+in+tobacco+BY-2+cells+reveals+similar+behaviors+for+different+cisternae+during+movement+and+brefeldin+A+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of dual-labeled Golgi stacks in tobacco BY-2 cells reveals similar behaviors for different cisternae during movement and brefeldin A treatment.</a> Mol. Plant. 4 (5), 896-908 (2011).</li>
<li>de Pinto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-nitrosylation+of+ascorbate+peroxidase+is+part+of+programmed+cell+death+signaling+in+tobacco+Bright+Yellow-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">S-nitrosylation of ascorbate peroxidase is part of programmed cell death signaling in tobacco Bright Yellow-2 cells.</a> Plant Physiol. 163 (4), 1766-1775 (2013).</li>
<li>Hanamata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+and+quantitative+monitoring+of+autophagic+flux+in+tobacco+BY-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signa.+Behav%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging and quantitative monitoring of autophagic flux in tobacco BY-2 cells.</a> Plant Signa. Behav. 8 (1), 22510(2013).</li>
<li>Sakai, A., Takusagawa, M., Nio, A., Sawai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytological+Studies+on+proliferation%2C+differentiation%2C+and+death+of+BY-2+cultured+tobacco+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytologia%22%5BJournal%5D)">Cytological Studies on proliferation, differentiation, and death of BY-2 cultured tobacco cells.</a> Cytologia. 80 (2), 133-141 (2015).</li>
<li>Yasuhara, H., Kitamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aphidicolin-induced+nuclear+elongation+in+tobacco+BY-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Aphidicolin-induced nuclear elongation in tobacco BY-2 cells.</a> Plant Cell Physiol. 55 (5), 913-927 (2014).</li>
<li>Buntru, M., Vogel, S., Stoff, K., Spiegel, H., Schillberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+coupled+cell-free+transcription-translation+system+based+on+tobacco+BY-2+cell+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">A versatile coupled cell-free transcription-translation system based on tobacco BY-2 cell lysates.</a> Biotechnol. Bioeng. 112 (5), 867-878 (2015).</li>
<li>Buntru, M., Vogel, S., Spiegel, H., Schillberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+BY-2+cell-free+lysate%3A+an+alternative+and+highly-productive+plant-based+in+vitro+translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Tobacco BY-2 cell-free lysate: an alternative and highly-productive plant-based in vitro translation system.</a> BMC Biotechnol. 14 (1), 37(2014).</li>
<li>Alieva, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+evolution+of+coral+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Diversity and evolution of coral fluorescent proteins.</a> PLoS ONE. 3 (7), 2680(2008).</li>
<li>Maćkowska, K., Jarosz, A., Grzebelus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+regeneration+from+leaf-derived+protoplasts+within+the+Daucus+genus%3A+effect+of+different+conditions+in+alginate+embedding+and+phytosulfokine+application%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Tiss.+Org%22%5BJournal%5D)">Plant regeneration from leaf-derived protoplasts within the Daucus genus: effect of different conditions in alginate embedding and phytosulfokine application.</a> Plant Cell Tiss. Org. 117 (2), 241-252 (2014).</li>
<li>Guo, Y., Song, X., Zhao, S., Lv, J., Lu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transient+gene+expression+system+in+Populus+euphratica+Oliv.+protoplasts+prepared+from+suspension+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physio.+Plant%22%5BJournal%5D)">A transient gene expression system in Populus euphratica Oliv. protoplasts prepared from suspension cultured cells.</a> Acta Physio. Plant. 37 (8), 1-8 (2015).</li>
<li>Wang, H., Wang, W., Zhan, J., Huang, W., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+PEG-mediated+transient+gene+expression+system+in+grape+protoplasts+and+its+application+in+subcellular+localization+studies+of+flavonoids+biosynthesis+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Hort%22%5BJournal%5D)">An efficient PEG-mediated transient gene expression system in grape protoplasts and its application in subcellular localization studies of flavonoids biosynthesis enzymes.</a> Sci. Hort. 191, 82-89 (2015).</li>
<li>Masani, M. Y. A., Noll, G. A., Parveez, G. K. A., Sambanthamurthi, R., Pruefer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transformation+of+oil+palm+protoplasts+by+PEG-mediated+transfection+and+DNA+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient transformation of oil palm protoplasts by PEG-mediated transfection and DNA microinjection.</a> PLoS One. 9 (5), 96831(2014).</li>
<li>Sasamoto, H., Ashihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+nicotinic+acid%2C+nicotinamide+and+trigonelline+on+the+proliferation+of+lettuce+cells+derived+from+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem.+Lett%22%5BJournal%5D)">Effect of nicotinic acid, nicotinamide and trigonelline on the proliferation of lettuce cells derived from protoplasts.</a> Phytochem. Lett. 7, 38-41 (2014).</li>
<li>Uddin, M. J., Robin, A. H. K., Raffiand, S., Afrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+embryo+formation+from+co-cultivated+protoplasts+of+Brassica+rapa+%26+B.+juncea%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Exp.+Ag%22%5BJournal%5D)">Somatic embryo formation from co-cultivated protoplasts of Brassica rapa & B. juncea.</a> Am. J. Exp. Ag. 8 (6), 342-349 (2015).</li>
<li>Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polyethylene+glycol-mediated+protoplast+transformation+system+for+production+of+fertile+transgenic+rice+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants.</a> Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).</li>
<li>Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Stewart, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protoplast+isolation+and+transient+gene+expression+in+switchgrass%2C+Panicum+virgatum+L%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Protoplast isolation and transient gene expression in switchgrass, Panicum virgatum L.</a> Biotechnol. J. 3 (3), 354-359 (2008).</li>
<li>Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Joyce, B. L., Stewart, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switchgrass+%28Panicum+virgatum+L.%29+cell+suspension+cultures%3A+Establishment%2C+characterization%2C+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Switchgrass (Panicum virgatum L.) cell suspension cultures: Establishment, characterization, and application.</a> Plant Sci. 181 (6), 712-715 (2011).</li>
<li>Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+transient+transformation+in+tobacco+protoplasts+is+independent+of+plasmid+amount%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount.</a> Plant Cell Rep. 21 (9), 865-871 (2003).</li>
<li>Di Sansebastiano, G. P., Paris, N., Marc-Martin, S., Neuhaus, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+accumulation+of+GFP+in+a+non-acididc+vacuolar+compartment+via+a+C-terminal+propeptide-mediated+sorting+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Specific accumulation of GFP in a non-acididc vacuolar compartment via a C-terminal propeptide-mediated sorting pathway.</a> Plant J. 15 (4), 449-457 (1998).</li>
<li>De Sutter, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+jasmonate+signalling+via+automated+and+standardized+transient+expression+assays+in+tobacco+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Exploration of jasmonate signalling via automated and standardized transient expression assays in tobacco cells.</a> Plant J. 44 (6), 1065-1076 (2005).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali ilgi var olduğunu beyan ederiz.

Yukarıda açıklanan protokol başarıyla protoplast izolasyon, numaralandırma ve dönüşüm BY-2 tütün süspansiyon hücre kültürü kullanarak valide edilmiştir; Ancak, protokol kolayca herhangi bir bitki süspansiyon kültürü için uzun olabilir. Şu anda, protoplast izolasyon ve dönüşüm mısır (Zea mays), 10, havuç (Daucus carota) 32, kavak (Populus euphratica) 33, üzüm (Vitis vinifera) 34, palmiye yağı (Elaeis guineensis) 35 de dahi...

Son yıllarda, bitkisel beslenme 6 bilmek biyokütle verimi 7 geliştirmek, ve hücre duvarı rekalsitrantların azaltmak kuraklık 3,4 ve tuz tolerans 5 iletmektedir, herbisite karşı direnç 2 kavuşturulması, çeşitli hastalıkların 1 üstesinden gelmek için transgenik bitkileri tasarım yerleştirilen önemli ivme olmuştur 8. Bu eğilim dsRNA 10, miRNA 11 ve siRNA 12 üzerinden susturma CRISPR ve Talens 9 kullanarak genom düzenleme ve gen dahil olmak üzere transgenik bitkiler, üretmek için yeni moleküler araçlar geliştirilmesi ile yardım görmüştür. Bu teknolojilerin transgenik bitkilerin üretimini basitleştirilmiş olsa da, onlar da transgenik bitkilerin çokluğu bitki rejenerasyonu güveniyor geleneksel sistemler kullanılarak taranabilir olamaz oluşturulan bir darboğaz oluşturduk. Birçoğu susturma ve genom düzenleme konstruktları hızlı bitkilere sokulabilir ise, bu dar ilişkinhedeflenen özellikleri bitkiler serada analiz kadar sık ​​tespit edilmez arzu edilen etkiyi üretmek için başarısız olur. Bu çalışmada, özellikle hedef susturulması genom düzenleme ve genin çok sayıda erken tarama mevcut darboğaz gidermek için, bitki protoplast hızlı, otomatik, yüksek verimli tarama için bir yöntem geliştirdik. sağlam bitki hücrelerine karşı protoplast kullanımı, otomatik bir platformun geliştirilmesi için pek çok avantajı vardır. İlk olarak, protoplastlar, bitki hücre duvarının sindirilmesinden sonra izole edilir, ve bundan sonra, bu, bu bariyer, dönüşüm etkinliği 13 arttırılır. Sağlam bitki hücrelerinde 14 ve Agrobacterium aracılı transformasyon 15 Biolistics transformasyonu için sadece iki yaygın olarak kullanılan yöntemler vardır. biyolistik TRANSFO için özel ekipman gerektirir olarak bu yöntemlerin hiçbiri kolayca sıvı taşıma platformları tercüme edilebilirım, Agrobacterium ise aracılı transformasyon ko-kültür ve bakterilerin sonraki çıkarılmasını gerektirir. Ne yüksek verimli yöntemleri için uygundurlar. Protoplast durumda, dönüşüm rutin ancak birkaç çözeltisi değişimini gerektiren ve ideal olarak sıvı kullanım platformlar için uygundur, polietilen glikol (PEG) aracılı transfeksiyon 16 kullanılarak yapılır. İkinci olarak, protoplastlar, tanımı gereği, tek hücre kültürleri, ve böylece bitki hücresi kültürlerinde topaklanma ve zincir oluşumu ile bağlantılı problemler, protoplastlarda gözlenmez. Bir plaka bazlı spektrofotometre hücre topaklanma kullanılarak süratle taranması açısından ya da birden çok sayıda düzlemde hücre tutarlı ölçümler elde zorluk yol açacaktır. protoplastlar kendi kültür ortamı daha da yoğun oldukları için, plaka tabanlı spektrofotometresi için elverişli bir tek tabaka oluşturan, kuyu dibine tortu. Son olarak, bitki hücre süspansiyon kültürleri Primar ikenily kallustan 17 türetilmiş, protoplastlar dokuya özgü ifade tespit etmek potensitesi, bitki dokularının bir dizi hasat edilebilir. Örneğin, özelliği fenotipi tahmin için çok önemli olabilir kök veya bir genin yaprağa özel ifadesini analiz etmek. Bu nedenlerle, bu işin geliştirilen protokol yaygın olarak kullanılan tütün (Nicotiana tabacum L.) parlak sarı bir &#39;2 (x 2) süspansiyon kültüründen izole edilen protoplastlardan kullanılarak doğrulanmıştır. X 2 süspansiyon kültürü, bitki hücrelerinin 18 moleküler analizlerde her yerde kullanımı sayesinde, daha yüksek bir bitki &quot;, HeLa&quot; hücre olarak tanımlanmıştır. Son zamanlarda, BY-2 hücreleri bitkinin etkilerini incelemek için kullanılır olmuştur hücre içi protein lokalizasyonu 23,24 ve bitki biyolojisinde bu kültürlerin geniş bir kullanım gösteren temel hücre biyolojisi 25-27, 19-22 Stresörler. X 2 kültürlerin ilave bir avantajı, birGen ifadesi için geliştirilmiş tekrarlanabilirlik yol açabilir, aphidicolin ile kültürleri senkronize yeteneği 28 inceler. Ayrıca, araştırılan yöntemler, geleneksel protoplastlar üretilmesi için kullanılan enzimler, maliyeti yüksek olan sistemlerin için engelleyici olarak, düşük maliyetli enzimler 29,30 kullanarak-2 protoplast çıkarılması için geliştirilmiştir. Bu nedenle, aşağıda açıklanan protokol BY-2 süspansiyon kültürü kullanılarak valide edilmiş, ancak herhangi bir bitki hücre süspansiyonu kültürüne amendable olmalıdır. Korumalı kavram deneyleri sabit Poritesin turuncu bir flüoresan proteini (OFP) raportör geni (pporRFP) CaMV 35S promoterinin kontrolü altında 31 Porites kullanılarak gerçekleştirilir.

<table><tbody><tr><td>Orbitor RS Mikroplaka taşıyıcı</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bravo Sıvı İşleyici</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 Çok Modlu Okuyucu</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultiFlo FX Çok Modlu Dağıtıcı</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Teleshake</td><td>Inheco</td><td>3800048</td><td></td></tr><tr><td>CPAC Ultra Düz Isıtıcı / Soğutucu</td><td>Inheco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7000190 Vworks Otomasyon Yazılımı</td><td>Agilent Bravo için protokolleri kontrol etmek ve yazmak için kullanılan</td><td>Agilent</td><td></td></tr><tr><td>Yazılımı Momentum Yazılımı</td><td>Orbiter</td> RS Liquid Handling Control 2.17 Yazılımını kontrol etmek için kullanılan Thermo Scientific <td></td><td>Görev zamanlama yazılımı</td></tr> MultiFlo FX IX81 Ters <tr><td></td> Mikroskop <td>için protokolleri kontrol etmek ve yazmak için kullanılan Biotek Yazılımı</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zyla 3-Tap mikroskop kamera</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ET-CY3/TRITC Filtre Seti</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>49004</td><td></td></tr><tr><td>Rohament CL</td><td>AB Enzimler</td><td>numune şişesi</td><td>düşük maliyetli selülaz</td></tr><tr><td>Rohapect UF</td><td>AB Enzimleri</td><td>numune şişesi</td><td>düşük maliyetli pektinaz</td></tr><tr><td>Rohapect 10L</td><td>AB Enzimleri</td><td>numune şişesi</td><td>düşük maliyetli pektinaz/arabinaz</td></tr><tr><td>Linsmaier & Skoog Bazal Orta</td><td>Fitoteknoloji Laboratuvarları</td><td>L689</td><td></td></tr><tr><td>2,4-diklorofenoksiasetik asit</td><td>Fitoteknoloji Laboratuvarları</td><td>D295</td><td></td></tr><tr><td>propidyum iyodür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Poli (etilen glikol) 4000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>95904-250G-F</td><td>Eski adıyla Fluka PEG</td></tr><tr><td>Propidium İyodür</td><td>Fisher Scientific</td><td>25535-16-4</td><td>Acros Organik</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Asetat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1902-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC424205000</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1767</td><td></td></tr><tr><td>Gelzan CM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1910-250G</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu plaka</td><td>Thermo Scientific</td><td>103184</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu 1.2 ml derin kuyu plakası</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0564</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu optik alt plaka</td><td>Thermo Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>Finntip 1000 Geniş Çaplı Pipet uçları</td><td>Thermo Scientific</td><td>9405 163</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4504-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC17259-5000</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr></tbody></table>

yüksek verim protoplast İzolasyonu ve dönüşüm için robotik platformu

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Son on yıl içinde, sinyal transdüksiyon yollarının, transkripsiyonel düzenleyici ağlar, gen ekspresyonu, genom düzenleme ve gen sessizleştirme analizi için, tür kırpmak için örnek türlerin arasında değişen bitki protoplastlarına kullanımında bir şekilde arttığı gözlenmiştir. Ayrıca, önemli bir ilerleme bitki genomik için bu sistemlerin kullanımında bile daha fazla ilgi üretti protoplast bitkilerin rejenerasyonu, ilerleme kaydedilmiştir. Bu çalışmada, bir protokol bir robot platformu kullanılarak bir &quot;açık san &#39;2 (x 2), tütün süspansiyon kültüründen protoplast izolasyon ve dönüşüm otomasyonu için geliştirilmiştir. dönüşüm yöntemleri Karnabahar mozaik virüsü 35S promoteri (35S) kontrolü altında portakal renkli bir floresan protein (OFP) raportör geni (pporRFP) kullanılarak doğrulanmıştır. protoplastlarda OFP sentezleme epifloresans mikroskopisi ile teyit edilmiştir. Analizler aynı zamanda propidiu kullanarak protoplast üretim verimliliği yöntemleri dahilm iyodür. Son olarak, düşük maliyetli bir yiyecek cinsi enzimler maliyet açısından çok pahalı protoplast izolasyon ve analizi otomatik yüksek verimli olan laboratuvar dereceli enzimler gerektiren gereksinimin ortadan kaldırılmasının, protoplast izolasyon prosedürü kullanılmıştır. Bu çalışmada geliştirilen protokolüne göre, dönüşüm, protoplast izolasyon bütün yöntemi operatörün herhangi bir giriş olmadan 4 saat altında yapılabilir. Bu çalışmada geliştirilen protokol BY-2 hücre kültürü ile doğrulandı iken, prosedürler ve yöntemler ekin genomik araştırma ivmesini etkinleştirmeniz gerekir herhangi bir bitki süspansiyon kültürü / protoplast sistemine çevrilebilir olmalıdır.

Bu çalışmada, x 2 iki katına çıkma oranı 15 saat bir ortalama hücre döngüsü uzunluğu bir önceki raporlar ile uyumludur kültürleri inkübe edildi sıcaklığa bağımlıdır 14-18 saat arasında değişmiştir. Bu katlama oranı ile, 1: 100 Başlangıç ​​aşı 5-7 günde% 50 bir paketlenmiş hücre hacmi (PCV) kültürlerin neden kültürlerini başlatmak için kullanılmıştır. Kültürler ortam 200 ml içinde büyütülmüştür içinde mevcut protokolde dokunun bütünleşmesi, 100 ml&#39;lik bir PCV 33 6 oyuklu plakalar dold...

Bir yüksek verimlilik, otomatik, tütün protoplast üretim ve dönüşüm metodolojisi açıklanmıştır. Robotik sistem dışı bir model ürünlere çevrilebilir olmalıdır modeli BY-2 sistemde güçlü paralel gen ifadesi ve keşif sağlar.

Yüksek verim Protoplast İzolasyonu ve Dönüşüm için Robotik Platformu

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Bu protokolün genel amacı, özellikle çok sayıda genom düzenleme ve gen susturma hedefinin erken taramasındaki mevcut darboğazı gidermek için bitki protoplastlarının hızlı, otomatik ve yüksek kapasiteli taramasına yönelik bir yöntem geliştirmektir. Bu yöntem, bitki biyoteknolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, gen ifadesindeki promotör fonksiyonlarının hızlı ve paralel taraması için yüksek kapasiteli otomatik protoplast üretimi ve transformasyonuna olanak tanımasıdır.Bu prosedür, yaygın olarak kullanılan tütün bright yellow two veya BY-2 süspansiyon kültürü kullanılarak gösterilecektir. Protokol metninde açıklandığı şekilde, bir Erlenmeyer flaskında BY-2 kültürü büyüterek başlayın. Protoplast izolasyon gününde, hücreler hızla çökeceği için kültürü iyice karıştırın ve kültürden altı mililitreyi 15 mililitrelik konik tabanlı bir santrifüj tüpüne aktarın.Hücrelerin çökelmesi için en az 10 dakika bekleyin. Uygun miktarda süpernatantı uzaklaştırarak paketlenmiş hücre hacmini toplam hacmin %50'sine ayarlayın. Tüpü ters çevirerek çalkalayın ve ardından sindirim için geniş ağızlı pipetler kullanarak altı kuyucuklu bir plakadaki her bir kuyucuğa 500 µL hücre süspansiyonu ekleyin.Bu prosedürün ilk adımı; mikroplaka taşıyıcı, sıvı işleme sistemi, çok modlu plaka okuyucu, çok modlu dağıtıcı, plaka ısıtıcı veya soğutucu ve bilgisayarlar olmak üzere robotik sistemin tüm bileşenlerini açmaktır. Ardından, plakaların her bir ekipman arasında transferini sağlamak için mikroplaka taşıyıcıyı diğer ekipmanlarla entegre eden plaka taşıyıcı görev zamanlama yazılımını açın. Plaka taşıyıcı yazılımında, protokolde kullanılan laboratuvar malzemelerinin teknik özelliklerini tanımlayın.Ana araç çubuğundan Setup'a tıklayın ve Manage Container Types komutunu seçin. Mevcut Kap Tipleri listesinden uygun Kap Tipini seçin. Plaka taşıyıcının karşılaşacağı tüm laboratuvar ekipmanları için teknik özellikleri tanımlayın.Bir sonraki adım, her bir kap için Başlangıç ve Bitiş konumlarını tanımlamaktır. Belirli bir protokoldeki Başlangıç/Bitiş (Start/End) sekmesine tıklayın. Her kabın Başlangıç konumunu seçin ve hem Başlangıç hem de Bitiş konumları için Kapaklı (Lidded) veya Kapaksız (Unlidded) kutucuğunu işaretleyin.Her bir laboratuvar ekipmanı için Başlangıç ve Bitiş konumlarını tanımladıktan sonra, tüm iş akışı için tüm plakaları manuel olarak başlangıç konumuna yükleyin. 96 kuyucuklu floresan tarama plakalarını ikinci otele, BY-2 hücreleri içeren altı kuyucuklu plakaları üçüncü otele, transformasyon için kullanılacak olan 96 derin kuyucuklu plakayı plaka ısıtıcısının veya soğutucusunun ikinci yuvasına ve enzim çözeltisini içeren 50 mililitrelik konik tüpü çok modlu dağıtıcıya yerleştirin. Protokoldeki transformasyonu gerçekleştirmek için, 96 derin kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna turuncu floresan protein raporlayıcı konstrükt içeren 10 µL plazmid DNA önceden yükleyin ve plaka ısıtıcısında veya soğutucusunda 4 °C'de inkübe edin.Tüm sarf malzemelerini ve plakaları, otomatik sıvı aktarım platformundaki belirlenmiş konumlarına yerleştirin. Birinci sütundaki her kuyucuğa 200 microliter %40 polyethylene glycol çözeltisi önceden doldurulmuş bir 96 kuyucuklu plaka yerleştirin. Sekizinci yuvaya bir kutu pipet ucu yerleştirin.Otomatik sıvı taşıma platformu yazılımında her bir öğenin konumunu tanımlamak için menüden Tools seçeneğini seçin ve Labware Editor'a tıklayın. Açılır menüden laboratuvar malzemesi tipini seçin. Main Protocol sekmesini seçin ve her bir laboratuvar malzemesinin konumunu tanımlamak için Configure Labware'a tıklayın.Protokolde kullanılacak tüm cihazları başlatmak için Run'a tıklayın. Son olarak, Work Explorer penceresinde, sistemdeki tüm laboratuvar malzemelerini doğrulamak ve otomatik protokolü başlatmak için Add Work Unit'e tıklayın. Prosedürün en hassas kısmı protoplast transformasyonudur.Transformasyon robotik sistem tarafından gerçekleştirildiği için, otomatik protokollerin doğru şekilde kurulması kritik önem taşır. Bu videonun amacı doğrultusunda, otomatik protokollerdeki yalnızca seçili adımlar gösterilecektir. Transformasyon protokolü sırasında, otomatik sıvı aktarım platformu altı kuyucuklu plakadan 70 µL protoplast çözeltisi aspire eder ve bunu altıncı yuvadaki 96 derin kuyucuklu plakaya dağıtır.Ardından, önceden doldurulmuş derin kuyucuklu plakadan 70 microliters yüksek vizkoziteli polietilen glikol çözeltisini yavaşça aspire etmek için yeni pipet uçları kullanılır ve çözelti derin kuyucuklu plakanın ilgili kuyucuklarına tamamen dağıtılır. Daha sonra, otomatik sıvı taşıma platformu derin kuyucuklu plakayı altı numaralı yuvadan dokuz numaralı yuvaya taşır; burada plaka taşıyıcı plakayı alır, plaka çalkalama istasyonuna götürür ve 30 saniye boyunca 1500 RPM hızında çalkalar. Protoplastların dengelenmesine izin vermek için çalkalamasız 20 dakikalık bir inkübasyonun ardından, plaka taşıyıcı 96-derin kuyucuklu plakayı çok modlu dağıtıcıya taşır ve yıkama protokolünü başlatır.Otomatik protoplast izolasyonu ve transformasyon protokolü tamamlandığında, transforme edilmiş protoplastların bulunduğu plakayı robotik sistemin birinci otelinden çıkarın. Evirtilmiş mikroskobu, kamerayı ve floresan lambayı açın. Protoplastlar üzerinde ilk odaklamayı yapmak için 10X objektifi seçin.Halojen lambayı açın ve floresan lamba için panjuru kapatın. Plakayı mikroskop sistemine yerleştirin ve parlak alan kullanarak protoplastlara odaklanın. Ardından, halojen ampulü kapatın ve floresan lamba için panjuru açın.Transgenik protoplastlar tarafından eksprese edilen turuncu floresan proteinin görüntülenmesi için Cy3/TRITC filtre setini seçin. Floresan işaretleyici eksprese eden protoplast sayısını belirlemek için her kuyuyu tarayın. Bu protokolde belirtilen koşullarda protoplastların enzim sindirimi, altı kuyucuklu plaka başına 2, 820, 000 protoplast ile sonuçlanmıştır.Protokoldeki her bir transfer adımından sonra protoplast konsantrasyonundaki azalma değerlendirildi. Digestion protokolünün ardından, 96'lı derin kuyucuklu plakalardaki her bir kuyucuğa 11.500 protoplast transfer edildi. Transformasyon protokolü tamamlandığında, 96 kuyucuklu floresan tarama plakasına 1.230 protoplast transfer edildi.Çok aşamalı pipetleme işlemlerinin protoplastlara zarar vermediğinden emin olmak için, canlılıkları propidyum iyodür boyaması ile test edilmiştir. Sonuçlar; sindirim sonrası, 96 kuyucuklu floresan tarama plakasına aktarım sonrası ve transformasyon protokolü sonrası canlılıkta anlamlı bir fark olmadığını göstermiştir. Transformasyon verimliliği düşük olsa da (yalnızca yaklaşık %2), transformasyon protokolü turuncu floresan protein ekspres eden transgenik hücrelerin üretilmesinde başarılı olmuştur. Bu durum, kullanılan büyük binari plazmitten ve protokolün BY-2 protoplastları için özel olarak optimize edilmemiş olmasından kaynaklanmaktadır.Protokolün zaman seyri için elde edilen ölçümler, zamanın büyük kısmının Sindirim aşamasında harcandığını göstermiştir. Protoplast izolasyonu ve transformasyonun toplam süresi, operatörden herhangi bir dış müdahale gerektirmeden üç saat, 50 dakika ve 53 saniye sürmüştür. Uygun şekilde kurulduktan sonra bu teknik, robot tarafından dört saatten kısa bir sürede gerçekleştirilebilir.Bu teknik, geliştirilmesinin ardından bitki biyoteknolojisi alanındaki araştırmacıların, genom düzenleme ve promotör tarama gibi yüksek verimli ürün genomik prosedürlerini gerçekleştirmelerine yol açmaktadır.

a-robotic-platform-for-high-throughput-protoplast-isolation

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Dönüştürmek için basit ve etkili bir...

Moss Verimli Polietilen Glikol (PEG) aracılığı ile Dönüşüm Physcomitrella Dini ayinlerde kullanılan patenler</em

Burada bir plazmid aşırı ekspresyonu ekran...

Yüksek verim Maya Plazmid overekspresyonu Ekran

Protein terapötikler üretmek için hücre hattı geliştirme, üretim, yüksek verimlilik, otomatik bir platform açıklanmıştır. Uygulama, BD FACS Aria Hücre Sıralayıcısı CloneSelect Imager ve Tecan Özgürlük EVO sıvı taşıma sistemi, gelişmiş hücre hattı kalite ve yüksek tekrarlanabilirlik hücre hattı geliştirme işleme kapasitesi önemli ölçüde artış göstermiştir.

Protein Therapeutics İmalat Hücre Hatları Kalkınma Yüksek throughput Otomatik Platformu

Bu makalede, tek hücreli deniz alg genetik dönüşümü...

Picoeukaryote genomik Dönüşüm<em&gt; Ostreococcus tauri</em

Bu sıvı işleme robot kullanılarak rekombinant protein benzerlik-etiketli saflaştırılması için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, genel olarak, bir yüksek verimli biçimde çözünür His-etiketli proteinlerin küçük ölçekli arıtma için de geçerlidir.

Affinity etiketli Rekombinant Proteinler Yüksek throughput Arıtma

Sıvı işleme robotlar üzerinde modüler bir klon DNA derleme yöntemi kullanılarak modüler DNA "aygıt" derleme gerçekleştirmek için otomatik bir iş akışı burada anlatılan. Protokol bir sezgisel yazılım aracı kullanarak iki sıvı taşıma platformları göstermek Kombinatorik DNA aygıt kitaplığı oluşturma için sıvı işleyicisi picklists üretmek için kullanır.

Robot sıvı işleme derleme modüler DNA cihazların otomatik

Biz canlı hücrelerdeki karmaşık düzenleyici ve sinyal mekanizmaları incelemek soya önceki büyük miktarlarda hazırlanması için basit ve etkili iletişim kuralı geliştirilmiştir.

Soya önceki ve geçici gen ifade analiz için uygulama yalıtım için basit bir yöntem

Burada PEG aracılı dönüşüm yöntemi kullanarak önceki proteinler ifade için bir protokol açıklayın. Kolay ifade ilgi protein ve protein yerelleştirme ve çeşitli deneysel koşullar için alma işlemini verimli soruşturma yöntemdir içinde vivo.

Önceki kullanarak kloroplast eğitim Protein içe aktarma işlemi

Burada, mısır mezofil hücrelerinde büyük plazmid kütüphanelerini test etmek için milyonlarca mısır protoplastını geçici olarak transfekte etmek için yüksek verimli bir protokol sunuyoruz.

Mısır Mezofil Protoplastlarının Ölçeklenebilir Transfeksiyonu

Amplifikasyona ihtiyaç duymadan biyolojik substratlardaki molekülleri barkodlayarak ve sayarak gen ekspresyonunu ölçen çoğullanmış yüksek verimli bir gen ekspresyon platformunun kullanımını açıklıyoruz. Platformu, irritabl bağırsak sendromu olan ve olmayan kişilerde tam kandaki mikroRNA (miRNA) ekspresyonunu ölçmek için kullandık.

İrritabl Bağırsak Sendromu içinde miRNA&#39;lar Sirkülasyon tedirginlikler bir Çoklanmış Yüksek verim Gen İfadesi Platformu Kullanma Algılanan

Öğrenin, BY-2 tütün süspansiyon hücrelerinde yüksek verimli protoplast izolasyonu ve otomatik dönüşüm yöntemini. Bu robotik platform, gen ifadesi çalışmalarında paralel tarama ve genom düzenleme hedeflerinin hızlı taranmasını sağlar.

Yüksek verim Protoplast İzolasyonu ve Dönüşüm için Robotik Platformu

Daha fazla video keşfet