Yüksek verim Protoplast İzolasyonu ve Dönüşüm için Robotik Platformu

Bu protokolün genel amacı, özellikle çok sayıda genom düzenleme ve gen susturma hedefinin erken taramasındaki mevcut darboğazı gidermek için bitki protoplastlarının hızlı, otomatik ve yüksek kapasiteli taramasına yönelik bir yöntem geliştirmektir. Bu yöntem, bitki biyoteknolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, gen ifadesindeki promotör fonksiyonlarının hızlı ve paralel taraması için yüksek kapasiteli otomatik protoplast üretimi ve transformasyonuna olanak tanımasıdır.

Bu prosedür, yaygın olarak kullanılan tütün bright yellow two veya BY-2 süspansiyon kültürü kullanılarak gösterilecektir. Protokol metninde açıklandığı şekilde, bir Erlenmeyer flaskında BY-2 kültürü büyüterek başlayın. Protoplast izolasyon gününde, hücreler hızla çökeceği için kültürü iyice karıştırın ve kültürden altı mililitreyi 15 mililitrelik konik tabanlı bir santrifüj tüpüne aktarın.

Hücrelerin çökelmesi için en az 10 dakika bekleyin. Uygun miktarda süpernatantı uzaklaştırarak paketlenmiş hücre hacmini toplam hacmin %50'sine ayarlayın. Tüpü ters çevirerek çalkalayın ve ardından sindirim için geniş ağızlı pipetler kullanarak altı kuyucuklu bir plakadaki her bir kuyucuğa 500 µL hücre süspansiyonu ekleyin.

Bu prosedürün ilk adımı; mikroplaka taşıyıcı, sıvı işleme sistemi, çok modlu plaka okuyucu, çok modlu dağıtıcı, plaka ısıtıcı veya soğutucu ve bilgisayarlar olmak üzere robotik sistemin tüm bileşenlerini açmaktır. Ardından, plakaların her bir ekipman arasında transferini sağlamak için mikroplaka taşıyıcıyı diğer ekipmanlarla entegre eden plaka taşıyıcı görev zamanlama yazılımını açın. Plaka taşıyıcı yazılımında, protokolde kullanılan laboratuvar malzemelerinin teknik özelliklerini tanımlayın.

Ana araç çubuğundan Setup'a tıklayın ve Manage Container Types komutunu seçin. Mevcut Kap Tipleri listesinden uygun Kap Tipini seçin. Plaka taşıyıcının karşılaşacağı tüm laboratuvar ekipmanları için teknik özellikleri tanımlayın.

Bir sonraki adım, her bir kap için Başlangıç ve Bitiş konumlarını tanımlamaktır. Belirli bir protokoldeki Başlangıç/Bitiş (Start/End) sekmesine tıklayın. Her kabın Başlangıç konumunu seçin ve hem Başlangıç hem de Bitiş konumları için Kapaklı (Lidded) veya Kapaksız (Unlidded) kutucuğunu işaretleyin.

Her bir laboratuvar ekipmanı için Başlangıç ve Bitiş konumlarını tanımladıktan sonra, tüm iş akışı için tüm plakaları manuel olarak başlangıç konumuna yükleyin. 96 kuyucuklu floresan tarama plakalarını ikinci otele, BY-2 hücreleri içeren altı kuyucuklu plakaları üçüncü otele, transformasyon için kullanılacak olan 96 derin kuyucuklu plakayı plaka ısıtıcısının veya soğutucusunun ikinci yuvasına ve enzim çözeltisini içeren 50 mililitrelik konik tüpü çok modlu dağıtıcıya yerleştirin. Protokoldeki transformasyonu gerçekleştirmek için, 96 derin kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna turuncu floresan protein raporlayıcı konstrükt içeren 10 µL plazmid DNA önceden yükleyin ve plaka ısıtıcısında veya soğutucusunda 4 °C'de inkübe edin.

Tüm sarf malzemelerini ve plakaları, otomatik sıvı aktarım platformundaki belirlenmiş konumlarına yerleştirin. Birinci sütundaki her kuyucuğa 200 microliter %40 polyethylene glycol çözeltisi önceden doldurulmuş bir 96 kuyucuklu plaka yerleştirin. Sekizinci yuvaya bir kutu pipet ucu yerleştirin.

Otomatik sıvı taşıma platformu yazılımında her bir öğenin konumunu tanımlamak için menüden Tools seçeneğini seçin ve Labware Editor'a tıklayın. Açılır menüden laboratuvar malzemesi tipini seçin. Main Protocol sekmesini seçin ve her bir laboratuvar malzemesinin konumunu tanımlamak için Configure Labware'a tıklayın.

Protokolde kullanılacak tüm cihazları başlatmak için Run'a tıklayın. Son olarak, Work Explorer penceresinde, sistemdeki tüm laboratuvar malzemelerini doğrulamak ve otomatik protokolü başlatmak için Add Work Unit'e tıklayın. Prosedürün en hassas kısmı protoplast transformasyonudur.

Transformasyon robotik sistem tarafından gerçekleştirildiği için, otomatik protokollerin doğru şekilde kurulması kritik önem taşır. Bu videonun amacı doğrultusunda, otomatik protokollerdeki yalnızca seçili adımlar gösterilecektir. Transformasyon protokolü sırasında, otomatik sıvı aktarım platformu altı kuyucuklu plakadan 70 µL protoplast çözeltisi aspire eder ve bunu altıncı yuvadaki 96 derin kuyucuklu plakaya dağıtır.

Ardından, önceden doldurulmuş derin kuyucuklu plakadan 70 microliters yüksek vizkoziteli polietilen glikol çözeltisini yavaşça aspire etmek için yeni pipet uçları kullanılır ve çözelti derin kuyucuklu plakanın ilgili kuyucuklarına tamamen dağıtılır. Daha sonra, otomatik sıvı taşıma platformu derin kuyucuklu plakayı altı numaralı yuvadan dokuz numaralı yuvaya taşır; burada plaka taşıyıcı plakayı alır, plaka çalkalama istasyonuna götürür ve 30 saniye boyunca 1500 RPM hızında çalkalar. Protoplastların dengelenmesine izin vermek için çalkalamasız 20 dakikalık bir inkübasyonun ardından, plaka taşıyıcı 96-derin kuyucuklu plakayı çok modlu dağıtıcıya taşır ve yıkama protokolünü başlatır.

Otomatik protoplast izolasyonu ve transformasyon protokolü tamamlandığında, transforme edilmiş protoplastların bulunduğu plakayı robotik sistemin birinci otelinden çıkarın. Evirtilmiş mikroskobu, kamerayı ve floresan lambayı açın. Protoplastlar üzerinde ilk odaklamayı yapmak için 10X objektifi seçin.

Halojen lambayı açın ve floresan lamba için panjuru kapatın. Plakayı mikroskop sistemine yerleştirin ve parlak alan kullanarak protoplastlara odaklanın. Ardından, halojen ampulü kapatın ve floresan lamba için panjuru açın.

Transgenik protoplastlar tarafından eksprese edilen turuncu floresan proteinin görüntülenmesi için Cy3/TRITC filtre setini seçin. Floresan işaretleyici eksprese eden protoplast sayısını belirlemek için her kuyuyu tarayın. Bu protokolde belirtilen koşullarda protoplastların enzim sindirimi, altı kuyucuklu plaka başına 2, 820, 000 protoplast ile sonuçlanmıştır.

Protokoldeki her bir transfer adımından sonra protoplast konsantrasyonundaki azalma değerlendirildi. Digestion protokolünün ardından, 96'lı derin kuyucuklu plakalardaki her bir kuyucuğa 11.500 protoplast transfer edildi. Transformasyon protokolü tamamlandığında, 96 kuyucuklu floresan tarama plakasına 1.230 protoplast transfer edildi.

Çok aşamalı pipetleme işlemlerinin protoplastlara zarar vermediğinden emin olmak için, canlılıkları propidyum iyodür boyaması ile test edilmiştir. Sonuçlar; sindirim sonrası, 96 kuyucuklu floresan tarama plakasına aktarım sonrası ve transformasyon protokolü sonrası canlılıkta anlamlı bir fark olmadığını göstermiştir. Transformasyon verimliliği düşük olsa da (yalnızca yaklaşık %2), transformasyon protokolü turuncu floresan protein ekspres eden transgenik hücrelerin üretilmesinde başarılı olmuştur. Bu durum, kullanılan büyük binari plazmitten ve protokolün BY-2 protoplastları için özel olarak optimize edilmemiş olmasından kaynaklanmaktadır.

Protokolün zaman seyri için elde edilen ölçümler, zamanın büyük kısmının Sindirim aşamasında harcandığını göstermiştir. Protoplast izolasyonu ve transformasyonun toplam süresi, operatörden herhangi bir dış müdahale gerektirmeden üç saat, 50 dakika ve 53 saniye sürmüştür. Uygun şekilde kurulduktan sonra bu teknik, robot tarafından dört saatten kısa bir sürede gerçekleştirilebilir.

Bu teknik, geliştirilmesinin ardından bitki biyoteknolojisi alanındaki araştırmacıların, genom düzenleme ve promotör tarama gibi yüksek verimli ürün genomik prosedürlerini gerçekleştirmelerine yol açmaktadır.