Name: Görüntüleme Tek hücreli Çözünürlük embriyonik ve Postnatal Kalpleri Temizlendi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Öğrenin tek hücreli çözünürlükte embriyonik ve postnatal kalplerin görüntülenmesi için doku temizleme yöntemini. Bu protokol gen fonksiyonlarını in vivo çalışmada basit ve ekonomik bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bilimsel tartışma için M.W. laboratuvar üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma, AHA [13SDG16920099] tarafından M.W.'ye ve Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü hibeleri [R01HL121700] tarafından M.W.'ye desteklenmektedir. Görüntüler, Albany Tıp Koleji'ndeki Görüntüleme Çekirdek Tesisinde çekildi.

Tüm hayvan deneyleri Bakımı NIH Kılavuzu&#39;na ve Laboratuvar Hayvanları Kullanımı göre Albany Medical College Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve gerçekleştirilmiştir. 1. solüsyon preparasyonlarda NOT: Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Konfeti 16, αMHC-Cre 17 ve Rosa26-mTmG (mTmG) 20 fare hatları ticari satın alındı cTnT-Cre 18 Alabama Üniversitesi&#39;nden Dr. Jiao bir hediye oldu Nfatc1-Cre.. Tıp 19 Albert Einstein College of Dr. Bin Zhou bir hediye oldu. Fareler bilateral torakotomi kesilerek ya da servikal bozma ile ölüm doğrulama fiziksel yollarla ve ardından en az 60 saniye boyunca kapalı bir odada, karbon dioksit inhalasyonu ile ötenazi uygulandı. <ol><li> Tamoksifen hazırlayın. ayçiçeği oi, 10 ml Tamoksifen 10 mg çözülürl. -20 ° C de tamamen çözüldükten sonra, kısım ve mağaza. </li><li> Fosfat tamponlu tuz (PBS) hazırlayın. Na 2 HPO 4 (1,41960 g), KH 2 PO 4 (0,24496 g), NaCl (8,0669 g) ve damıtılmış su, 1 L KCl (0,20129 g) çözülür ve pH 7.4 ayarlanır. </li><li> PBST hazırlanması:% 0.1 Tween-20 çözeltisi PBS içinde PBS, 100 ml Tween-20, 100 ul çözülmesiyle. </li><li> tampon engelleme hazırlayın. % 0.2 Tween-20 içeren PBST 100 ml BSA, 3 g çözülmesiyle% 3 sığır serum albümini (BSA) Bloklama çözeltisi, sağlayın. </li><li> CUBIC-1 (reaktif 1) hazırlayın. Ağırlıkça% 25 üre, ağırlıkça% 25 N, N, N &#39;, N&#39;-tetrakis (2-hidroksipropil) etilendiamin 15 ağırlık% Karışım dH 2 O Triton X-100 </li><li> CUBIC-2 (reaktif 2) hazırlayın. Ağırlıkça% 50 sakaroz, ağırlık olarak% 25 üre, ağırlıkça% 10 oranında 2, 2 &#39;, 2&#39; &#39;karıştırın - nitrilotriethanol ve% 0.1 (v / v) dH 2 O Triton X-100 </li><li> Sca Le A2 hazırlanması: 4 M üre,% 10 w / v gliserol ve / Triton V X-10,% 0.1DH 2 O. 0 7.7 pH ayarlayın. </li><li> Sca le B4 hazırlayın: 8 M üre ve / Triton v X-100 w% 0.1 dH 2 O. 8.7 pH ayarlayın. </li><li> Hazırlama Sca Le 70: 4 M üre,% 70 ağırlık / hacim gliserol ve DH 2 O. / Triton v X-100% 0.1 </li></ol> 2. Tamoksifen İndüksiyon, Embriyo İzolasyon ve Fiksasyon <ol><li> Tamoksifen İndüksiyon ve Embriyo İzolasyonu <ol><li> Embriyonik gelişim günde E7.75 33. Tamoksifen 10 ug / g (R26Cre ERT2 erkek fareler tarafından takılı) kavisli bir beslenme tüpü onaylanan protokole (ACUP 13-12007), sonda kadın R26Cre ERT2 Confetti fareler kullanma. Embriyonik gün 9.5 (E9.5) veya E10.5 anda, CO 2 ve servikal dislokasyon ile dişi farelerin euthanize. </li><li> Fare ölüm doğrulanmasının ardından, makasla fare karın boşluğu açın ve uterin boynuz teşrih (Bölüm 1 Not bakınız) makas ve cımbız ve yeniden yardımıyla rahim tüp katmanlarını kaldırmakrahim tüp 23,24 embriyolar kira. <ol><li> PBS (pH 7.4) ihtiva eden bir petri embriyolar aktarın. Diseksiyon mikroskobu altında, cımbız yardımı ile embriyonik olmayan katmanları (koryon, yolk kesesi ve amniyon) çıkarın. </li></ol></li><li> Daha önce 22 bildirildiği gibi cımbız ve makas kullanarak, genotipleme için dişi fare ve embriyo kuyruk örnekleri toplamak. Bir pipet kullanarak, 1x PBS 1 ml içeren 48 çukurlu bir levhanın bir kuyucuğuna, her embriyo transferi. </li><li> Bir floresan mikroskop altında, bir kamera ile bir inverted mikroskop aracılığıyla GFP / RFP / CFP pozitif embriyolar tespit. uzakta Peel cımbız kullanarak perikard ve GFP / RFP / OBP filtreleri ile kalbin her iki tarafında floresan klonların sayısını belirlemek için kavisli cımbız yardımı ile kalp / embriyo döndürün. Hiçbir kesikler ihtiyaç vardır. </li></ol></li><li> GFP / RFP / CFP pozitif embriyolar belirledikten sonra, hızlı bir şekilde th 1x PBS ile iki kez (2 dk her biri) embriyolar yıkayınE 48, oda sıcaklığında (RT), bir plaka karıştırıcısı üzerinde iyi plaka. Bu aşırı kan kaldıracaktır. </li><li> Oda sıcaklığında% 4 paraformaldehid (PFA) kullanılarak embriyo / embriyonik kalbini düzelt. sabitleme süresi embriyonik yaş ve doku büyüklüğüne bağlıdır. E9.5 oda sıcaklığında 2 st için embriyo düzeltin. Geç embriyonik evre embriyolar bile doğum sonrası kalp için 24 saat için uzatılabilir uzun fiksasyon süresi gerektirir. UYARI: Paraformaldehyde toksik, deri, göz ve mukoza zarı ile temasından kaçının. </li><li> Tespit edildikten sonra, oda sıcaklığında, bir plaka karıştırıcısı üzerinde iki kez 48 çukurlu plaka içinde 1x PBS (10 dk) embriyo / kalp yıkayın. Bu embriyo / kalp aşırı PFA kaldırır. Embriyolar daha sonra tüm montaj boyama ve doku temizlenmesi için işlenir. </li></ol> 3. Tüm Dağı Boyama NOT: aşağıdaki gibi PFA Tespit edildikten sonra embriyo / kalp tüm montaj boyama tabi tutulur. <ol><li> 1 m kullanarak bir 48 iyi plaka embriyo / kalbi permeabilizeOda sıcaklığında plaka karıştırıcısı üzerinde 2 saat boyunca% 0.1 PBST l. </li><li> geçirgenliği sonra, 4 ° C&#39;de bir plaka karıştırıcısı üzerinde 2 saat veya gece boyunca bloke tamponu 1 ml embriyo / kalp bırakın. </li><li> 4 ° C&#39;de plaka karıştırıcısı üzerinde 48 saat süre ile blokaj tamponu 0.3 ml (100 1) ile seyreltildi, endotelyal hücreye özgü antikor PECAM (CD31), embriyo / kalp bırakın. </li><li> plaka karıştırıcısı üzerinde oda sıcaklığında PBST 5 kez, 30 dakika her kullanılarak embriyo / kalbi yıkayın. Bu dokudan fazla spesifik olmayan bağlanmış primer antikor kaldırır. </li><li> 4 ° C&#39;de plaka karıştırıcısı üzerinde 48 saat süre ile blokaj tamponu 1 ml (1.000 1) ile seyreltildi ve Alexa Fluor 647 keçi anti-fare ikincil antikoru embriyo / kalp, bırakın. </li><li> Adımı yineleyin 3.4 ikincil antikor yıkayın. </li><li> plaka karıştırıcısı üzerinde oda sıcaklığında 1 saat süreyle% 4 PFA ile embriyo / kalp sonrası düzeltmek ve PBS her biri 5 dakika iki kez yıkayın. </li><li> Bir konsantrasyonlarda ise PBST içinde seyreltilmiş Nükleer soya 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (embriyo / kalp LekeOda sıcaklığında plaka karıştırıcısı üzerinde 10 dakika boyunca, 0.01 mg / mL) oranı. Her biri 5 dakika iki PBS yıkama ile takip edin. </li></ol> 4. Embriyo / Sca l e veya KÜBİK Yöntemi ile kalp Takas NOT: Bütün montaj boyamadan sonra, embriyo / kalp Sca le veya KÜBİK doku takas yöntemiyle ya tabi tutulur. Metodun seçimi dokunun büyüklüğüne ve embriyonik yaşına bağlıdır. E11.5 veya daha önceki yaş embriyolar, kullanım Sca l e doku temizleme yöntemi için eski embriyolar ya da doğum sonrası kalpler için KÜBİK doku temizleme yöntemi tercih edilir. <ol><li> Ölçek Doku Takas Yöntemi <ol><li> Yumuşak bir arada 4 ° C&#39;de 48 saat süre ile (elle) çalkalanarak (alüminyum folyo ile sarılmış) bir sintilasyon şişesine Sca l e A2 çözeltisinin 1 ml&#39;si ile embriyo / kalp inkübe edin. </li><li> Sca l e A2 inkübasyondan sonra, ara sıra nazik bir anot çalkalanarak aynı şişe içinde, 4 ° C&#39;de Sca l e B4 çözeltisi 1 mL embriyo / kalp inkübeOnu 48 saat. </li><li> Zaman zaman hafifçe çalkalanarak 4 ^ &#39;de, 1 ml Sca l e 70 sahip bir 48 saat daha embriyo / kalp inkübe edin. % 90 gliserol kullanılarak Dağı embriyo (bakınız bölüm 5.1). </li></ol></li><li> KÜBİK Doku Takas Yöntemi <ol><li> Bütün embriyo / kalp KÜBİK takas için, nazik arada 37 ºC 7&#39;de 48 saat boyunca çalkalanarak CUBIC-1 1 ml her embriyo / kalbi batırmayın. 48 saat sonra, taze, KÜP indikatör 1 aynı hacimde çözelti yerine ve zaman zaman elle çalkalanarak 37 ° C&#39;de ek bir 48 saat boyunca örnek inkübe edin. </li><li> yumuşak el ile çalkalayarak oda sıcaklığında 1 x PBS ile birkaç kez kübik 1 ile tedavi, kalp / embriyo yıkayın. Bu aşırı CUBIC-1 çözümü kaldırır. </li><li> PBS ile CUBIC-1 yıkanmasından sonra, zaman zaman nazik eliyle çalkalanarak 37 ºC&#39;de 48 saat süreyle CUBIC-2 çözeltisi (embriyo / kalp başına 1 gr) embriyolar / kalpleri batırmayın. Bu gliserol kullanarak montaj embriyo / kalbi izler (bakınız Bölüm 5.2). </li></ol></li></ol> 5. Numune Montaj ve Görüntüleme NOT: Sca l e 70 ya da CUBIC-2 çözeltisi içinde temizlenir embriyolar veya organlar sırasıyla görüntüleme aracı olarak Ölçeği 70 ve CUBIC-2 çözeltisi ile doğrudan görüntülenebilir. Numuneler aşağıda protokol izlenerek% 90 gliserol örnekleri saklamak, hemen görüntülü, ancak uzun vadeli saklanabilir değilse Ancak, takas reaktif embriyonik örneklerin açığı göz önüne alındığında. <ol><li> Doğrudan Sca Le görüntüleme kadar 4 ° C &#39;de% 90 gliserol ve deposunun 1 ml örneği temizlenir bırakın. </li><li> Iki kez 1 x PBS ile her biri 5 dakika KÜP muamele edilmiş numune yıkanır ve sırasıyla 30 dakika için% 30,% 50,% 70 ve% 90 gliserol çözeltisi, her biri 1 ml örnek inkübe edin. </li><li> Görüntüleme için, iki foton yetenekleri ile donatılmış bir konfokal mikroskop ile% 90 gliserol ve görüntü klonlarının bir az miktarda cam alt Petri kabı örnek aktarmak. </li><li> Görüntü kalp ya da embriyo 10X / 0.3 NA ile gliserol, bir 25X / 0.8 NA daldırma veya 40X / 1.2 NA su düzeltici objektif lens. Görüntü DAPI tutarlı bir titanyumdan 2-foton uyarma kullanarak: safir bukalemun lazer. Mikroskop ve objektif lens seçimi süper çözünürlük için örneğin deneyler, amacına bağlı olacaktır, hafif bir tabaka floresan mikroskop yararlanılabilir. </li></ol>

<ol><li>Vincent, S. D., Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+a+heart%3A+the+origin+and+regulation+of+cardiac+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">How to make a heart: the origin and regulation of cardiac progenitor cells.</a> Curr Top Dev Biol. 90, 1-41 (2010).</li>
<li>Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+discoveries+in+cardiac+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A decade of discoveries in cardiac biology.</a> Nat Med. 10, 467-474 (2004).</li>
<li>Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+networks+in+the+evolution+and+development+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory networks in the evolution and development of the heart.</a> Science. 313, 1922-1927 (2006).</li>
<li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+genetics+of+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The developmental genetics of congenital heart disease.</a> Nature. 451, 943-948 (2008).</li>
<li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embedding+embryos+for+high-resolution+episcopic+microscopy+%28HREM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Embedding embryos for high-resolution episcopic microscopy (HREM).</a> Cold Spring Harb Protoc. , 678-680 (2012).</li>
<li>Soufan, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+gene+expression+patterns+during+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of gene expression patterns during cardiac development.</a> Physiol Genomics. 13, 187-195 (2003).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+Tissue+Clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li>
<li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PLoS One. 7, e33916(2012).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158, 945-958 (2014).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li>
<li>Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+noninvasive+genetic%2Fpharmacologic+strategy+for+visualizing+cell+morphology+and+clonal+relationships+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse.</a> J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).</li>
<li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li>
<li>Agah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+recombination+in+postmitotic+cells.+Targeted+expression+of+Cre+recombinase+provokes+cardiac-restricted%2C+site-specific+rearrangement+in+adult+ventricular+muscle+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Gene recombination in postmitotic cells. Targeted expression of Cre recombinase provokes cardiac-restricted, site-specific rearrangement in adult ventricular muscle in vivo.</a> J Clin Invest. 100, 169-179 (1997).</li>
<li>Jiao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+of+Bmp4+in+the+atrioventricular+septation+of+the+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart.</a> Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).</li>
<li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151, 1083-1096 (2012).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li>
<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardial+spindle+orientation+controls+cell+entry+into+the+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium.</a> Dev Cell. 19, 114-125 (2010).</li>
<li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numb+family+proteins+are+essential+for+cardiac+morphogenesis+and+progenitor+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Numb family proteins are essential for cardiac morphogenesis and progenitor differentiation.</a> Development. 141, 281-295 (2014).</li>
<li>Kaufman, M. H., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaufman%2C+MH+%22The+atlas+of+mouse+development%22">The atlas of mouse development</a>. , Academic Press. London. (1992).</li>
<li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+mouse+embryo+%3A+a+laboratory+manual%22">Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual</a>. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2003).</li>
<li>Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+the+mammalian+heart+from+two+sources+of+myocardial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells.</a> Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).</li>
<li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anterior+heart-forming+field%3A+voyage+to+the+arterial+pole+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The anterior heart-forming field: voyage to the arterial pole of the heart.</a> Trends Genet. 18, 210-216 (2002).</li>
<li>Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+right+ventricle%2C+outflow+tract%2C+and+ventricular+septum+comprise+a+restricted+expression+domain+within+the+secondary%2Fanterior+heart+field%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field.</a> Dev Biol. 287, 134-145 (2005).</li>
<li>Ward, C., Stadt, H., Hutson, M., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+the+secondary+heart+field+leads+to+tetralogy+of+Fallot+and+pulmonary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Ablation of the secondary heart field leads to tetralogy of Fallot and pulmonary atresia.</a> Dev Biol. 284, 72-83 (2005).</li>
<li>Echelard, Y., Vassileva, G., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cis-acting+regulatory+sequences+governing+Wnt-1+expression+in+the+developing+mouse+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cis-acting regulatory sequences governing Wnt-1 expression in the developing mouse CNS.</a> Development. 120, 2213-2224 (1994).</li>
<li>Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+the+mammalian+cardiac+neural%5BTitle%5D)+AND+%22Developement%22%5BJournal%5D)">Fate of the mammalian cardiac neural.</a> Developement. 127, 1607-1616 (2000).</li>
<li>Viragh, S., Challice, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+the+epicardium+and+the+embryonic+myocardial+circulation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse.</a> Anat Rec. 201, 157-168 (1981).</li>
<li>Wu, M., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numb+family+proteins%3A+novel+players+in+cardiac+morphogenesis+and+cardiac+progenitor+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+concepts%22%5BJournal%5D)">Numb family proteins: novel players in cardiac morphogenesis and cardiac progenitor cell differentiation.</a> Biomolecular concepts. 6, 137-148 (2015).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Lineage+Tracing+Reveals+that+Oriented+Cell+Division+Contributes+to+Trabecular+Morphogenesis+and+Regional+Specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Lineage Tracing Reveals that Oriented Cell Division Contributes to Trabecular Morphogenesis and Regional Specification.</a> Cell reports. 15, 158-170 (2016).</li>
<li>Alkaabi, K. M., Yafea, A., Ashraf, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pH+on+thermal-+and+chemical-induced+denaturation+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Biochem+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Effect of pH on thermal- and chemical-induced denaturation of GFP.</a> Appl Biochem Biotechnol. 126, 149-156 (2005).</li>
<li>Captur, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+myocardial+trabeculae+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of myocardial trabeculae in the mouse embryo.</a> J Anat. , (2016).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir rakip mali çıkar beyan etmemektedir.

embriyo izolasyonu çok kritik bir adımdır. E9.5 embriyolar bu yüzden ekstra bakım izolasyonu sırasında embriyo / kalp yapıları zarar vermemek için alınmalıdır, boyutu çok kırılgan ve küçük. Bütün embriyo görüntüleme sırasında embriyo / kalbi saran olmayan embriyonik ekstra katmanları dikkatlice özellikle çıkarılmalıdır. Bu embriyonik dokularda derinliklerine antikor ve takas karışımı penetrasyon sağlar ve aynı zamanda görüntüleme arka plan sinyali giderilmesinde yardımcı olur. PECAM karşı antikorlar, asetile α-tübülin v...

Kardiyak morphogenesis kalbin farklı sektörleri içine kalp progenitör hücrelerin dört farklı tipte zamanmekansal organizasyon gerektiren bir ardışık bir olay olduğunu ve aynı zamanda fonksiyonel kalp 1,2 oluşturmak için bu süreci düzenlemek için birden fazla genetik düzenleyici ağları gerektirir. Kardiyak şartname, farklılaşma, desenleme ve bölme olgunlaşma kardiyojenik transkripsiyon faktörleri 3 düzenlenir. Genetik mutasyon veya kardiyak progenitör hücrelerin bu faktörlerin posttranskripsiyonel sapmaları embriyonik öldürücülüğü veya konjenital kalp kusurları (KKH) 4 ya neden olabilir. Kalp morfolojilerinden çalışma kardiyak morfojenezinde anlayışı teşvik edecek kalp gelişimi sırasında izleme üç boyutlu (3D) doğasında yapısal detayları ve tek etiketli kalp progenitör hücre soyu anlamayı gerektirir. yüksek çözünürlüklü bölümü tomografi bir dizi yöntem inci geliştirilmiştirGörüntü organ yapısı 5,6 birkaç on yıl geçmiş, e; Ancak, bu yöntemler pahalı, özel araçlar, geniş emek gerektiren ve son hacimsel görüntü 7,8 yeniden tek hücreli çözünürlükte ayrıntılı yapısal organizasyon eksikliği. Tek hücre düzeyinde 3D hacimsel görüntüleme in vivo 7 progenitör hücre farklılaşması ve hücre davranışlarını incelemek için bir araç sağlar. Ancak, doku ışık saçılması derin bozulmamış kalp içinde 3D hücreleri ve yapıları görüntüleme önündeki en önemli engel olmaya devam etmektedir. Doku şeffaflığı 8 artırmak için potansiyel yaklaşımlar lipidler ışık saçılması önemli bir kaynak ve lipidler ve / veya lipidler ve çevresinde arasındaki kırılma indeksi farkı ayarlama kaldırma are. Son birkaç yıl içinde, doku temizleme bir dizi yöntem, doku donukluk ve ışık saçılması azaltan, geliştirilmiş Babb (benzil alkol ve benzil benzoat gibiE karışımı) ile DBE (tetrahidrofuran ve dibenzylether); ancak bu yöntemlerde, floresans bir sorun 8-10 devam etmektedir. Solvent gibi SeeDB (fruktoz / tiyogliserol) ve 3DISCO (diklorometan / dibenzylether) gibi hidrofilik yöntemleri, bazlı floresan sinyalleri korumak, ancak 7,8,11 şeffaf bütün organı render yoktur. Buna karşılık, CLARITY doku temizleme yöntemi organı saydam yapar, ama aynı zamanda hidrojel 7,13 gömme gerektirir PACT (pasif berraklık tekniği), yaptığı gibi, lipidler 8,12 kaldırmak için özel bir elektroforez aygıtı gerektirir. Tüm doku temizleme yöntemleri hakkında ayrıntılı bilgi için, ark Richardson ve Lichtman, Tablo 1&#39;e bakınız. 7.. 2011 yılında, Hama ve ark. Tesadüfen bir hidrofilik karışım &#39;Sca Le&#39; keşfettik (üre, gliserol ve Triton X-100 karışımı) fare beyin ve embriyo transpar hale getirdiğiKBB tamamen etiketli klonları 14 floresan sinyalleri koruyarak. Bu hücre içi çözünürlükte birkaç milimetre ve nöronal nüfus ve çıkıntılar büyük ölçekli yeniden derinlikte bozulmamış beyin görüntüleme sağlar. Susaki ve ark. ayrıca aminoalkoldür ekleyerek le SCA geliştirilmiş ve fosfolipid çözülmesini arttı &#39;CUBIC&#39; (net, engelsiz beyin görüntüleme kokteyller ve hesaplamalı analiz) doku temizleme yöntemi, azaltılmış temizleme zamanı geliştirdi ve çok renkli floresan görüntüleme 8 sağladı. Bu çalışmada, cardiogenesis sırasında kalbin içinde Sca le avantajı ve KÜBİK doku takas teknikleri ve yüksek çözünürlüklü 3D optik bölümlendirilmeleri, bireysel klonlar alarak Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, αMHC-Cre 17, cTnT-Cre kullanılarak takip edildi 18, </strong&gt; Nfatc1-Cre 19 ve Rosa26-mTmG (mTmG), 20 fare soyları. Tüm montaj boyama (WMS) yönteminin kombinasyonu, daha önce 21,22 daha etiketli klonlar diğer proteinlerin boyama ve 3D hacimsel bağlamında kendi davranış çalışma için izin verilen doku temizleme yöntemleri ile gelişti. Doku temizleme ve WMS kombinasyonu kalp gelişimi sırasında farklı genlerin ve proteinlerin rolleri daha iyi anlaşılması ve konjenital kalp etyolojisinde sağlar. Bu protokol, geliştirme sırasında diğer progenitör hücre farklılaşması, hücre davranışını ve organ morfogenez olayları incelemek için uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>2,2&asal;,2&prime; '-nitrilotrioetanol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90279</td><td></td></tr><tr>PBS <td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td>BSA Fischer<td>Scientific'te %4 Paraformaldehit</td></tr><tr><td></td><td>&nbsp;</td><td></td><td></td>BP16000</tr><tr><td>N, N, N ', N'-tetrakis (2-hidroksipropil) etilendiamin ve nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>122262</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tampon Tuzlu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Üre</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U-1250</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8773</td><td></td></tr><tr><td>Tamoksifen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>Ayçiçeği tohumu yağı</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5007</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>PECAM (CD31)</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td></td><td></td>550274</tr><tr><td>Alexa Fluor 647&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-21247</td><td></td></tr><tr><td>DAPI nükleer leke</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>37oC İnkübatör</td><td>Termobilimsel Fischer</td><td>Heratherm, Kompakt Mikrobiyolojik İnkübatörler</td><td></td></tr><tr><td>48 kuyulu plakalar</td><td>Hücre Tedavisi</td><td>229148</td><td></td></tr><tr><td>Analitik Terazi</td><td>Metler Toledo</td><td>PB153-S/FACT</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss 510 konfokal mikroskop</td><td></td></tr><tr><td>Disecting Mikroskop</td><td>Unitron</td><td>Z850</td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Observer. Z1</td><td></td></tr><tr><td>Germinator 500 Cam Boncuk Sterilizatörü</td><td>CellPoint Scientific</td><td>GER-5287-120V</td><td></td></tr><tr><td>Işık Kaynağı</td><td>SCHOTT</td><td>ACE I</td><td></td></tr><tr><td>Bir Çift Makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı 60 mm x15 mm&nbsp;</td><td>TPP Tekno Plastik Ürünler AG</td><td>93060</td><td></td></tr><tr><td>Rocker II&nbsp; Platform Rocker</td><td>Boekel Scientific</td><td>260350</td><td></td></tr><tr><td>Parıldayan tüpler</td><td>Fischer Scientific&nbsp;</td><td>03-337-26</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipeti</td><td>Samco Scientific</td><td>202</td><td></td></tr><tr><td>Cımbız</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11251-20</td><td></td></tr></tbody></table>

görüntüleme tek hücreli Çözünürlük embriyonik ve postnatal kalpleri temizlendi

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Bütün kalp seviyesinde tek klonal izleme ve analiz kalp gelişimi sırasında kalp progenitör hücre davranışını ve farklılaşmasını belirlemek ve normal ve anormal kalp morfolojilerinden hücresel ve moleküler temeli çalışması için izin verebilirsiniz. retrospektif tek klonal analizler Son gelişen teknolojiler tek bir hücre çözünürlükte kalp morfolojilerinden çalışma mümkün olun. Ancak, doku donukluk ve görüntüleme derinliği gibi kalbin ışık saçılması tek bir hücre çözünürlükte hinder bütün kalp görüntüleme artar. Bu engelleri, geliştirilmesi gerekir aydınlatma ve tespiti hem son derece şeffaf kalbi işleyebilir bir bütün embriyo takas sistemini aşmak için. Neyse ki, son birkaç yıl içinde, bu tür CLARITY olarak tüm organizma temizleme sistemleri, Sca le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, Babb ve PACT için birçok yöntemler bildirilmiştir. Bu laboratuvar kartının hücresel ve moleküler mekanizmalar ilgileniyorIAC morphogenesis. Son zamanlarda, biz ROSA26-Cre ERT2 üzerinden izleme tek bir hücre soyu kurulmuş, seyrek etiket hücrelere ROSA26-Konfeti sistemini kalp gelişimi sırasında. Biz kalp içinde görüntü tek klonlar bütün montaj boyama ile birlikte embriyo temizlemek için Sca le ve CUBIC (net, engelsiz beyin görüntüleme kokteyller ve hesaplamalı analizi) dahil olmak üzere birçok bütün embriyo-takas yöntemleri uyarladı. Kalp başarıyla tek bir hücre çözünürlükte görüntülendi. Biz CUBIC doğum sonrası kalbi temizlemek süre Sca le, embriyonik kalbi temizlemek, ancak etkili bir doğum sonrası kalbi temizlemek olamayacağını bulundu, ancak zarar dokuyu eriterek Embriyonik kalp. Burada açıklanan yöntemler sırayla, konjenital kalp defektleri hücresel ve moleküler temelini ortaya çıkarabilir, kalp morfolojilerinden sırasında tek bir klon çözünürlükte gen fonksiyonu çalışma izin verecektir.

temizlenir embriyonik kalbin görüntülenmesi Omurgalı kalp oluşumu spatiotemporally düzenlenmiş morfojenik süreçtir ve dört farklı kaynaklardan 1 organizasyon ve progenitör hücrelerin farklılaşması bağlıdır. Kalp hilalin ilk kalp alanından Hücreler doğrusal bir kalp tüp oluşturacak şekilde ventral orta hat doğru katlanır. Başlangıçta ilk kalp alanına dorsomedially ikamet eden ikinci kalp alanından hücreler, daha sonr...

Bozulmamış embriyonik ve doğum sonrası kalplerin derinliklerindeki floresan protein etiketli hücreleri hacimsel olarak görüntülemek için bir protokol tanımlıyoruz. Tüm montaj boyama ile birlikte doku temizleme yöntemlerini kullanarak, embriyonik veya doğum sonrası bir kalbin içindeki tek floresan protein etiketli hücreler net ve doğru bir şekilde görüntülenebilir.

Görüntüleme Tek hücreli Çözünürlük embriyonik ve Postnatal Kalpleri Temizlendi

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Bu prosedürün genel amacı, kardiyak gelişim sırasında ve postnatal kalp dokularında tek hücre çözünürlüğünde gen fonksiyonlarını incelemek için, bütün kalplerin derinliklerindeki floresan protein işaretli hücrelerin volumetrik olarak görüntülenmesidir. Bu yöntem, gen fonksiyonlarının incelenmesi, kardiyak gelişim sırasında tek hücre çözünürlüğünde görüntüleme yapılması ve hayvan artefaktlarının değerlendirilmesi gibi kardiyak gelişim sırasındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin temel avantajı; nispeten basit, düşük maliyetli ve bütün embriyo veya kalp içerisinde gen ve protein fonksiyonlarının tek hücre çözünürlüğünde özel zamansal analizine olanak sağlamasıdır.Bu sistemi farelerde kalp gelişimini incelemek için kullansak da, kaslar, beyin ve akciğerler gibi diğer organ sistemlerini ve diğer model organizmaları incelemek için de kullanabilirsiniz. Burada, Tamoksifen uygulanmış R-26 Cre-RET2 confetti annelerden elde edilen floresan protein pozitif embriyolar kullanılmaktadır. Her bir paraformaldehit ile fikse edilmiş embriyoyu, 48 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarındaki bir mililitre %0,1 PBST içine daldırarak boyama işlemine başlayın.Dokunun permeabiliz

imaging-cleared-embryonic-postnatal-hearts-at-single-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Konjenital kalp kusurlarına yol açan mutasyonlar, gelişim sırasında kardiyak yapının in vivo araştırılmasından yararlanır, ancak fare embriyonik kalbindeki yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmalar teknik olarak zordur. Burada, gelişmekte olan fare kalbindeki kardiyomiyosite özgü yapıları değerlendirmek için sağlam bir immünofloresan ve görüntü analizi yöntemi sunuyoruz.

Embriyonik Fare Heart Immunofluorescence kullanarak kardiyomiyosit Geliştirme Analizi

Biz optik açıklık ve konfokal mikroskobu ile takip standart immünolojik boyama yöntemleri kullanarak, E15.5 kadar bütün embriyonik fare kalplerinde koroner damarların analizi için bir protokol mevcut. Bu teknik, dizi bölgelerinin zaman alıcı analizi için gerek kalmadan tüm kalp boyunca kan damarlarının görselleştirme sağlar.

Temizlendi Embriyonik Kalpler Koroner Damarlar Analizi

Kardiyomiyositlerde hücre bölünmesini hücre döngüsü varyasyonlarından ayırt etmek için, iki transgenik fare hattı kullanarak protokoller sunuyoruz: kardiyomiyosit çekirdeklerinin kesin olarak tanımlanması için Myh6-H2B-mCh transgenik fareler ve hücre bölünmesini hücre döngüsü varyasyonlarından ayırt etmek için CAG-eGFP-anilin fareleri.

Doğum sonrası kardiyomiyositlerde Hücre Döngüsü Varyasyonları görselleştirme ve Çekirdeklenme Belirlenmesi

Burada, Bütün Dağı ayirt ve nicel hacimsel analizi erken sahne fare embriyo yansıma tabanlı bir protokol açıklayın. Bu teknik nitelik ve nicelik geliştirme sırasında kalp yapıları değerlendirmek ve diğer organ sistemleri yaygın olarak adapte olması teklif için güçlü bir yaklaşım olarak mevcut.

Nicel bütün Dağı ayirt analiz fare embriyo kardiyak progenitör nüfusun

Bu çalışmada optik takas ile kombine bir çift taraflı aydınlatma ışık sayfalık floresans mikroskobu (LSFM) fare kalp çalışmaya kullanmaktadır.

Fare kalp çalışma için ışık sayfalık floresans mikroskobu

Yaralanma sonrası kardiyomiyosit proliferasyonu, miyosit dışı hücre popülasyonlarından gelen ekstrasellüler ipuçlarının senfonisini gerektiren dinamik bir süreçtir. Soy takibi, pasif CLARITY ve üç boyutlu tam montajlı konfokal mikroskopi tekniklerini kullanarak, çeşitli hücre tiplerinin kardiyak onarım ve rejenerasyon üzerindeki etkisini analiz edebiliriz.

Temizlenmiş Kalp Üç Boyutlu Görüntüleme ile Hedefhücre Popülasyonlarının Kardiyak Yaralanma Yanıtının Yakalanması

Doku transformasyonu ve boyamadaki yeni gelişmeleri eksenel olarak taranmış bir ışık tabakası mikroskobunun geliştirilmesiyle birleştirerek tüm fare kalbinin mezoskopik rekonstrüksiyonu için bir yöntem sunuyoruz.

Tüm Fare Kalbinin Mezoskopik Optik Görüntülenmesi

Kardiyak progenitör hücrelerin 3D + zaman görüntülemesini sağlayan fare embriyo kültürü ve görüntülemesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu video araç seti, başarılı canlı görüntüleme için gereken temel becerileri ele alır, aksi takdirde yalnızca metin yayınlarından elde edilmesi zordur.

Fare Embriyosundaki Erken Kardiyak Progenitörlerin Canlı Görüntülenmesi

Protokol, kemirgen kalplerindeki karmaşık kardiyak yapıları araştırmak için uyarlanmış doku temizleme yöntemleriyle birlikte gelişmiş ışık tabakası mikroskobunu kullanır ve kardiyak morfogenezin anlaşılması ve yeniden şekillenmesi için büyük bir potansiyele sahiptir.

Kemirgen kalplerinde kalp yapısını ortaya çıkarmak için ışıklı tabaka görüntüleme

Bu protokol, ışık tabakası floresan mikroskobu kullanılarak kantitatif tam montajlı üç boyutlu vasküler görüntüleme için hızlı bir yöntem sunar. Yöntemin etkinliği, civciv embriyo modelinin faringeal ark arter sistemi kullanılarak, hesaplamalı akışkanlar dinamiği yoluyla ölçülen hemodinamik kuvvetler ile gösterilmiştir.

Kantitatif Çalışmalar için Küçük Hayvan Damar Sisteminin Hızlı Tam Montajlı Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesi

Öğrenin tek hücreli çözünürlükte embriyonik ve postnatal kalplerin görüntülenmesi için doku temizleme yöntemini. Bu protokol gen fonksiyonlarını in vivo çalışmada basit ve ekonomik bir yaklaşım sunar.

Görüntüleme Tek hücreli Çözünürlük embriyonik ve Postnatal Kalpleri Temizlendi

Daha fazla video keşfet