Görüntüleme Tek hücreli Çözünürlük embriyonik ve Postnatal Kalpleri Temizlendi

Bu prosedürün genel amacı, sağlam kalplerin derinliklerindeki floresan protein etiketli hücreleri hacimsel olarak görüntülemek, kardiyak gelişim sırasında ve doğum sonrası kalplerde tek hücre çözünürlüğünde gen fonksiyonunu incelemektir. Bu yöntem, gen fonksiyonlarının incelenmesi ve kardiyak gelişim ve animidal artefaktlar sırasında tek hücre çözünürlüğünde görüntülemeye yardımcı olma gibi kardiyak gelişim sırasındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin ana avantajı, nispeten basit, ucuz ve gen ve protein fonksiyonlarının özel zamansal analizinin, sağlam embriyo veya kalpte tek hücre çözünürlüğünde olmasıdır.

Bu sistemi farelerde kalp gelişimini incelemek için kullanmamıza rağmen, kaslar, beyin ve akciğerler gibi diğer organ sistemlerini ve diğer model organizmaları incelemek için de kullanabilirsiniz. Burada Tamoksifren ile muamele edilmiş R-26 Cre-RET2 konfeti barajlarından elde edilen floresan protein pozitif embriyolar kullanılmaktadır. Her bir paraformaldehitle sabitlenmiş embriyoyu 48 oyuklu bir plakanın kuyucuklarında bir mililitre% 0.1 PBST'ye batırarak boyamaya başlayın.

Dokuyu geçirgen hale getirmek için oda sıcaklığında bir plaka çalkalayıcı üzerinde iki saat inkübe edin. Daha sonra, geçirgenleştirme çözeltisini bir mL bloke edici tampon ile değiştirin ve çalkalayarak oda sıcaklığında iki saat veya gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, endotel hücresine özgü antikor olan PECAM'ın her bir kuyucuk için 0.3 mililitre bloke edici tampon içinde bir ila 100 seyreltmesini hazırlayın ve bunu embriyoları içeren oyuklara ekleyin.

Dört santigrat derecede çalkalanarak 48 saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, fazla primer antikoru dokudan çıkarmak için embriyoları her seferinde 30 dakika boyunca PBST ile beş kez yıkayın. Daha sonra, embriyoları Alexa Fluor 647 keçi antivat ikincil antikor çözeltisine daldırın ve ışıktan korunurken dört santigrat derecede 48 saat çalkalayarak inkübe edin.

48 saat sonra, daha önce yıkadıktan sonra, embriyoları oda sıcaklığında bir saat boyunca% 4 PFA ile çalkalayarak sabitleyin. Daha sonra, her seferinde beş dakika boyunca PBS ile iki kez yıkadıktan sonra, embriyoları DAPI nükleer boyası ile on dakika boyunca inkübe edin. Her biri beş dakikalık iki PBS yıkaması ile takip edin, ardından doku temizlemeye devam edin.

Doku temizliği, kalbin tek hücre çözünürlüğünde görüntülenmesi için bu protokoldeki en kritik adımdır. Ayrıca, sağlam embriyonik kalpteki floresan sinyalleri korumak için ölçek veya CUBIC temizleme yönteminin seçilmesi de çok önemlidir. Yıkanmış, lekelenmiş embriyoları, bir mililitre ölçekli A2 çözeltisi içeren alüminyum folyoya sarılmış bir parıldama şişesine aktarın.

48 saat boyunca ara sıra elle hafifçe sallayarak dört santigrat derecede inkübe edin. Ölçek A2 inkübasyonundan sonra, şişedeki çözeltiyi bir mililitre ölçek B4 çözeltisi ile değiştirin ve 48 saat daha ara sıra hafifçe çalkalayarak dört santigrat derecede inkübe edin. Embriyoları, daha önce olduğu gibi ara sıra hafifçe çalkalayarak, dört santigrat derecede bir mililitre ölçek 70 ile 48 saat daha kuluçkaya yatırın.

Son olarak, ölçekten arındırılmış numuneyi bir mililitre %90 gliserol içine daldırın ve görüntülemeye kadar dört santigrat derecede saklayın. Görüntülemek için, numuneyi minimum miktarda %90 gliserol içeren cam tabanlı bir petri kabına aktarın ve iki foton özelliği ile donatılmış konfokal bir mikroskopla görüntüleyin. CUBIC temizleme için, her bir embriyoyu bir mililitre CUBIC bir embriyoya daldırın ve ara sıra 37 santigrat derecede 48 saat boyunca hafifçe sallayın.

48 saat sonra, çözeltiyi aynı hacimde taze CUBIC reaktifi ile değiştirin ve numuneyi daha önce olduğu gibi 48 saat daha inkübe edin. İnkübasyonun ardından, CUBIC one ile tedavi edilen embriyoları PBS ile birkaç kez yıkayın ve fazla CUBIC one solüsyonunu çıkarmak için elle hafifçe sallayın. Daha sonra, embriyoları 37 santigrat derecede 48 saat boyunca CUBIC iki solüsyona daldırın ve ara sıra elle hafifçe sallayın.

Görüntülemeden önce bir gecikme olacaksa, numuneleri bir mililitre %30 50 ve% 70 gliserol ve PBS ile her biri 30 dakika boyunca sırayla inkübe edin. Seri boyunca hareket ettikten sonra, dört santigrat derecede saklamak için% 90 gliserol çözeltisine aktarın. Hazır olduğunda, daha önce olduğu gibi% 90 gliserol içeren cam tabanlı bir petri kabında görüntüleyin.

Bu filmde, ölçek uygulanmış bir E 8.75 kalbin, kalp yüzeyinden lümene kadar optik kesitleri gösterilmektedir. Sarı, PECAM ekspresyonunu işaretler ve tüm kardiyomiyositler yeşil görünür. Derinliği 110.4 mikrondur ve toplamda 93 dilim vardır.

Bu, az önce gösterilen yeniden yapılandırılmış kalbin 3D yüzey resmidir. Yine sarı, PECAM ekspresyonunu işaretler ve yeşil tüm kardiyomiyositleri etiketler. Bu film, çıkış yolu bölgesindeki ölçekle tedavi edilmiş bir E 9.5 kalbinden tek bir progenitör klonun bölümlerini göstermektedir.

Sarı, PECAM ifadesini işaretler ve klon yeşil görünür. Derinliği 36 mikrondur ve toplamda 10 dilim vardır. Bu film, yüzeyden lümene kadar CUBIC ile işlenmiş bir P iki kalbin bölümlerini göstermektedir.

Derinlik, bölüm başına üç mikron olmak üzere 130 mikrondur. Bu film, yüzeyden lümene kadar CUBIC ile işlenmiş bir E 17.5 kalbin bölümlerini göstermektedir. Derinlik 630 mikrondur ve bölüm başına altı mikrondur.

Bu, az önce gösterilen kalbin 3D yüzey resmidir, 3D rekonstrüksiyon yazılımı ile yeniden yapılandırılmıştır. Bu prosedürü denerken, embriyonun kırılgan olduğunu ve kalp patolojisinin kolayca bozulabileceğini hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, ost sonrası ve köpürtmede gen fonksiyonunu incelemek için boyama kullanılarak başka proteinler gerçekleştirilebilir.