Name: ölçme İn Vitro ATPaz Aktivitesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Öğrenin, saflaştırılmış proteinlerin in vitro ATPaz aktivitesini ölçme yöntemini. Bu teknik, yeni ATPazların fonksiyonel karakterizasyonu ve potansiyel aktivatör ya da inhibitörlerin değerlendirilmesi için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe RO1AI049294 (M. S.'ye) fon sağlamak istiyor.

1. Saflaştırılmış proteinin ATP hidroliz reaksiyonu gerçekleştirme <ol><li> Saf Protein Kuluçka İçin Gerekli Tüm Reaktifler stokları hazırlayın. <ol><li> 100 mM HEPES pH 8.5, 65 mM NaCl ve% 5 gliserol (veya başka bir deney tamponu gibi uygun olduğunda) içeren 5x HEPES / NaCl / gliserol (KŞÇ) tamponu hazırlayın. </li><li> Su (ATPaz metal bağımlı olup olmadığını, ya da başka metal), 100 mM MgCl2 hazırlayın. </li><li> yüksek saflıkta ATP kullanılarak (daha fazla pH ayarı yoktur) 200 mM Tris Base taze 100 mM ATP hazırlayın. Kısım ATP zamanla yıkmak gibi, birkaç hafta daha uzun süre -20 ° C&#39;de ATP stok depolamak ve dondurma ve ATP stok çözdürme kaçınmalı ve. </li><li> 1 at Premix MgCl2 ve ATP: 1 oranında sadece ATP hidroliz reaksiyonu kurmadan önce. </li></ol></li><li> Hazırlayın ve reaksiyonun boyunca düzenli aralıklarla numuneler toplanması için 1.5 ml tüpler etiket. 0 zamanında ve zaman 15, 30 numune toplamak için tüpler hazırlamak,45 ve 60 dakika. Not: Alternatif olarak, sadece 0 ve uç noktada numune toplayın. <ol><li> ATP hidroliz reaksiyonları 01:50 alınan numuneler seyreltmek için her bir tüpe 245 ul 1x KŞÇ tampon ekleyin. </li></ol></li><li> hızlı reaksiyonu durdurmak için numunelerin dondurma için kuru buz etanol banyo hazırlayın. Bir lastik buz kovası veya diğer kasa (plastik olmayan) bir kapta, kuru buz birkaç adet ekleyebilir ve dikkatle kuru buz karşılamak için yeterli% 70-100 etanol dökün. </li><li> Uygun (genellikle 5-10 uM) olarak, 1x KŞÇ tamponunda saflaştırılmış protein sulandırmak ve buz üzerinde tutmak. </li><li> ATP hidroliz reaksiyonları ayarlayın. <ol><li> Her bir örnek için ayrı 0.5 ml tüpler içinde (sırayla) aşağıdaki reaktifler ekleyin: 6 ul 5x hng veya başka bir tampon, 3 ul 100 mM MgCl2 -ATP karışımı (nihai 30 ul hacme kadar), H2O, ve 0.25-5 uM proteini. </li><li> Resim proteini ilave edildiği bir tampon yalnızca negatif kontrol koşulu içerir.</li></ol></li><li> 0 zamanında reaksiyon 5 ul çıkarın 245 ul KŞÇ tampon içeren hazır 1.5 ml tüp içinde 1:50 seyreltilmiş ve hemen kuru buz / etanol banyosu içinde örnek dondurma. </li><li> 37 ° C &#39;de reaksiyonlar ATP hidrolizi, 1 saat boyunca oluşmasına izin vermek için inkübe edin. Her bir aralık (15, 30, 45 ve 60 dakika), tepkime 5 ul alikotları çıkarın ve adım 1.6 olarak KŞÇ tampon içeren etiketli numune tüpleri ekle. </li><li> ATP hidroliz reaksiyonunun sonunda, depolama için bir -80 ° C dondurucu seyreltilmiş numune hareket eder. tüm örnekler tamamen donmuş sağlamak için, devam etmeden önce en az 10 dakika bekleyin. </li></ol> Algılama Reaktif Ücretsiz Pi İçeren 2. inkübe Örnekleri <ol><li> Her bir zaman noktasında ATP hidroliz reaksiyonu kısımlarını ihtiva eden çözülme seyreltilmiş numuneler, oda sıcaklığında (adım 1.6 ve 1.7 de elde edilmiş). </li><li> örnekler ve fosfat standartları ihtiva eden 96 oyuklu bir plaka kurulumu. <ol><li> 0.5 ml tu800 uM standart ul 104.5 ile KŞÇ tampon 5.5 ul ekleyerek 800 uM uM 40 ila (Pi algılama reaktifi ile sağlanır) fosfat standardını sulandırmak olmak. İyice karıştırın ve 96 oyuklu bir plaka de A1, bu 40 uM Pi standart 100 ul ilave edin. </li><li> 1 için kuyuların B1-H1 50 ul KŞÇ tamponu ekleyin: Pi standardının 1 seri dilüsyonları. </li><li> A1 kuyusunda 40 uM Pi 50 ul çıkarın ve iyi B1 50 ul deney tamponu eklemek karıştırın ve iyi B1 50 ul kaldırmak ve iyi G1 ile, iyi C1 devam dilüsyonları ekleyin. Her kuyu aynı hacme sahip olmak için karıştırmadan sonra kuyu G1 50 ul atın. Peki H1 40 0 ​​uM bir Pi standardı oluşturmak için tek tampon içermelidir. Not: bir diğer faktör (örneğin, bir önleyici olarak) numunelere ilave edilmişse, bu koşullar altında fosfat serbest ya absorbans değişiklikleri kontrol etmek için bu faktör içeren bir standart eğri oluşturmak. </li><li> Her samp 50 ul ekleplaka yinelenen le. ve farklı zaman noktalarında yatay sütunlar aynı zaman noktasında dikey (Numune 2 kez 0 = B2, B3 örnek 1 kez 0 = A2, A3) numune ekleyin. Bu kadar 8 örnekleri ve plaka başına 5 kez puan için izin verir. </li></ol></li><li> Numuneler ve standartlar içeren oyuklara (reaktif gerekli (mi) = numune ve standartlar 0,1 x sayısı) her birine, 100 ul kadar malakit yeşili / molibdat Pi tespit reajanı kaldırmak için steril bir pipet kullanın ve kolay pipetleme için bir çanak ekle Çok kanallı bir pipet kullanılarak. Pi kirlenme olasılığı yüksektir olarak, çanak içine doğrudan algılama reaktifi dökmeyin. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak, ilk kez noktalarına son kez noktalarından tercihen sırayla, tanıtan kabarcıkları olmadan dikkatlice yukarı pipetleme ve zaman tutarlı bir sayıya indirdi de her Pi algılama reaktif 100 ul ekleyin ve karıştırın. </li><li> Oda sıcaklığında 25 dakika boyunca inkübasyona bırakılır, veya MA görenufacturer en tarifi. </li></ol> Bir Mikroplaka Okuyucusu Kullanma 3. ölçmek Sonuçları <ol><li> absorbans mikro levha okuyucusu kullanarak 650 nm&#39;de numunelerin emme okuyun. </li><li> Bir Pi standart eğri olun. Bir grafik yazılımı kullanılarak, her bir örnek fosfat miktarı için çözmek için kullanılan denklem bulmak için konsantrasyonuna karşı Pi, standart numune için absorbans değerleri grafik. </li><li> fosfat standart kalibrasyon her numune için ATPaz aktivitesinin hesaplanması. Fosfat yayınlandı = (OD 650 - Y kesişimi) / eğim. <ol><li> Her numunenin çiftleri toplam Pi ortalama. Bu numaradan tampon sadece denetimin absorbans okuma çıkartın. seyreltme faktörü ile (bizim örneğimizde 50) bu çarpın. </li><li> ľmol protein başına salınan nmol Pi belirleyin. Kinetik deneyde, her bir zaman noktası için, bu değerleri grafik en az R = 0.99 (şekil 1) doğrusal uyan vermelidir; n iseOT, deney veya daha az protein ya da daha uzun veya daha kısa kuluçka süresi ile ayarlanabilir. </li></ol></li><li> Nmol Pi / umol protein / dak gibi sonuçları istenirse, ya da nmol Pi / mg protein / dak olarak (3 Şekil 2,) temsil eder. </li></ol>

<ol><li>Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAA%2B+proteins%3A+have+engine%2C+will+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">AAA+ proteins: have engine, will work.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (7), 519-529 (2005).</li>
<li>Baker, T. A., Sauer, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClpXP%2C+an+ATP-powered+unfolding+and+protein-degradation+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1823 (1), 15-28 (2012).</li>
<li>Maxson, M. E., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vacuolar-type+H%2B-ATPase+at+a+glance+-+more+than+a+proton+pump%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The vacuolar-type H+-ATPase at a glance - more than a proton pump.</a> J Cell Sci. 127 (23), 4987-4993 (2014).</li>
<li>Planet, P. J., Kachlany, S. C., DeSalle, R., Figurski, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogeny+of+genes+for+secretion+NTPases%3A+Identification+of+the+widespread+tadA+subfamily+and+development+of+a+diagnostic+key+for+gene+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Phylogeny of genes for secretion NTPases: Identification of the widespread tadA subfamily and development of a diagnostic key for gene classification.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2503-2508 (2001).</li>
<li>Robien, M. A., Krumm, B. E., Sandkvist, M., Hol, W. G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+Structure+of+the+Extracellular+Protein+Secretion+NTPase+EpsE+of+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal Structure of the Extracellular Protein Secretion NTPase EpsE of Vibrio cholerae.</a> J Mol Biol. 333 (3), 657-674 (2003).</li>
<li>Camberg, J. L., Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+the+Vibrio+cholerae+type+II+secretion+ATPase+EpsE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of the Vibrio cholerae type II secretion ATPase EpsE.</a> J Bacteriol. 187 (1), 249-256 (2005).</li>
<li>Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+II+secretion+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Type II secretion and pathogenesis.</a> Infect Immun. 69 (6), 3523-3535 (2001).</li>
<li>Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Webb, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct%2C+Real-time+measurement+of+rapid+inorganic+phosphate+release+using+a+novel+fluorescent+probe+and+its+application+to+actomyosin+subfragment+1+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Direct, Real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase.</a> Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).</li>
<li>Carter, S. G., Karl, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inorganic+phosphate+assay+with+malachite+green%3A+An+improvement+and+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem+Biophys+Methods%22%5BJournal%5D)">Inorganic phosphate assay with malachite green: An improvement and evaluation.</a> J Biochem Biophys Methods. 7 (1), 7-13 (1982).</li>
<li>Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microassay+for+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A microassay for ATPase.</a> Anal Biochem. 169 (2), 312-318 (1988).</li>
<li>Harder, K. W., Owen, P., Wong, L. K. H., Aebersold, R., Clark-Lewis, I., Jirik, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+kinetic+analysis+of+the+intracellular+domain+of+human+protein+tyrosine+phosphatase+%CE%B2+%28HPTP+%CE%B2%29+using+synthetic+phosphopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Characterization and kinetic analysis of the intracellular domain of human protein tyrosine phosphatase β (HPTP β) using synthetic phosphopeptides.</a> Biochem J. 298 (2), 395-401 (1994).</li>
<li>Camberg, J. L., Johnson, T. L., Patrick, M., Abendroth, J., Hol, W. G., Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+stimulation+of+EpsE+ATP+hydrolysis+by+EpsL+and+acidic+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Synergistic stimulation of EpsE ATP hydrolysis by EpsL and acidic phospholipids.</a> EMBO J. 26 (1), 19-27 (2006).</li>
<li>McLaughlin, S. H., Smith, H. W., Jackson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+the+weak+ATPase+activity+of+human+Hsp90+by+a+client+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Stimulation of the weak ATPase activity of human Hsp90 by a client protein.</a> J Mol Biol. 315 (4), 787-798 (2002).</li>
<li>Shiue, S., Kao, K., Leu, W., Chen, L., Chan, N., Hu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XpsE+oligomerization+triggered+by+ATP+binding%2C+not+hydrolysis%2C+leads+to+its+association+with+XpsL%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">XpsE oligomerization triggered by ATP binding, not hydrolysis, leads to its association with XpsL.</a> EMBO J. 25 (7), 1426-1435 (2006).</li>
<li>Ghosh, A., Hartung, S., van der Does, C., Tainer, J. A., Albers, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Archaeal+flagellar+ATPase+motor+shows+ATP-dependent+hexameric+assembly+and+activity+stimulation+by+specific+lipid+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Archaeal flagellar ATPase motor shows ATP-dependent hexameric assembly and activity stimulation by specific lipid binding.</a> Biochem J. 437 (1), 43-52 (2011).</li>
<li>Savvides, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VirB11+ATPases+are+dynamic+hexameric+assemblies%3A+new+insights+into+bacterial+type+IV+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">VirB11 ATPases are dynamic hexameric assemblies: new insights into bacterial type IV secretion.</a> EMBO J. 22 (9), 1969-1980 (2003).</li>
<li>Sanghera, J., Li, R., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+luminescent+ADP-Glo+assay+to+a+standard+radiometric+assay+for+measurement+of+protein+kinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Techn%22%5BJournal%5D)">Comparison of the luminescent ADP-Glo assay to a standard radiometric assay for measurement of protein kinase activity.</a> Assay Drug Dev Techn. 7 (6), 615-622 (2009).</li>
<li>Sherman, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoupling+catalytic+activity+from+biological+function+of+the+ATPase+that+powers+lipopolysaccharide+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Decoupling catalytic activity from biological function of the ATPase that powers lipopolysaccharide transport.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), 4982-4987 (2014).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+cofactor+regulation+with+disease-associated+p97%2FVCP+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Altered cofactor regulation with disease-associated p97/VCP mutations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (14), E1705-E1714 (2015).</li>
<li>Rowlands, M. G., Newbatt, Y. M., Prodromou, C., Pearl, L. H., Workman, P., Aherne, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+assay+for+inhibitors+of+heat-shock+protein+90+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity.</a> Anal Biochem. 327 (2), 176-183 (2004).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu biyokimyasal karakterizasyonu için saflaştırılmış proteinlerin in vitro ATPaz aktivitesi ölçüm için genel bir protokoldür. Bu yöntem kolayca optimize edilmiştir; Örneğin protein, tampon ve tuzlu bileşimlerinde, sıcaklık ve deney uzunluğu ve değişken (aralıklarının toplam sayısını da dahil olmak üzere), aralıklarla miktarının ayarlanması aktivitesi kantitatif artırabilir. Ticari olarak temin edilebilen malakit yeşili bazlı reaktifler oldukça duyarlıdır, ve fosfat az miktarda tespit edilebilir (~ 100 ...

ATPazlar, yaşamın tüm krallıklarındaki birçok süreçte ayrılmaz enzimlerdir. ATPazlar, protein kaçakçılığı, açılması ve birleştirilmesi gibi çeşitli reaksiyonlara güç sağlamak için ATP hidrolizinin enerjisini kullanan moleküler motorlar olarak işlev görür; replikasyon ve transkripsiyon; hücresel metabolizma; kas hareketi; hücre motilitesi; ve iyon pompalama1-3. Bazı ATPazlar, çözünen maddelerin zarlar boyunca taşınmasında rol oynayan transmembran proteinlerdir, diğerleri sitoplazmiktir ve plazma zarı veya organellerinki gibi biyolojik bir zarla ilişkilendirilebilir.
AAA+ ATPazlar (çeşitli hücresel aktivitelerle ilişkili ATPazlar), bazı dizi ve yapısal korumayı paylaşan büyük bir ATPaz grubunu oluşturur. Bu proteinler, Walker-A ve -B kutuları gibi korunmuş nükleotid bağlayıcı motifler içerir ve aktif durumlarında oligomerler (genellikle heksamerler) oluşturur1. Nükleotid bağlanması üzerine bu proteinlerde büyük konformasyonel değişiklikler, AAA + ailesinin çeşitli üyeleri arasında karakterize edilmiştir. EpsE, bir AAA + ATPazdır ve NTPaz4-6'nın bakteriyel Tip II / IV sekresyon alt ailesinin bir üyesidir. EpsE, koleranın etken maddesi olan Vibrio cholerae'de Tip II Sekresyona (T2S) güç sağlar. T2S sistemi, V. cholerae insan ince bağırsağını kolonize ettiğinde bol sulu ishale neden olan virülans faktörü kolera toksini gibi çok çeşitli proteinlerin salgılanmasından sorumludur7. 
 İn vitro ATPaz aktivitesini ölçmek için teknikler çeşitlidir, ancak genellikle kolorimetrik, floresan veya radyoaktif substratlar8-11 kullanarak fosfat salınımını ölçer. Serbest bırakılmış inorganik fosfatı (Pi) ölçen, ticari olarak temin edilebilen malakit yeşili içeren bir substrata dayalı bir kolorimetrik test kullanarak saflaştırılmış proteinlerin in vitro ATPaz aktivitesini belirlemek için temel bir yöntemi açıklıyoruz. Düşük pH'ta malakit yeşil molibdat, Pi ile bir kompleks oluşturur ve kompleks oluşum seviyesi 650 nm'de ölçülebilir. Bu basit ve hassas tahlil, yeni ATPazları işlevsel olarak karakterize etmek ve potansiyel aktivatörlerin veya inhibitörlerin rollerini değerlendirmek, alanların ve/veya spesifik kalıntıların önemini belirlemek veya belirli tedavilerin enzimatik aktivite üzerindeki etkisini değerlendirmek için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>HEPES tamponu</td><td>Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Fisher</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Fisher</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Adenozin trifosfat (ATP)</td><td>Fisher</td><td>BP41325</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu plakalar (şeffaf, düz tabanlı)</td><td>VWR</td><td>82050-760</td><td></td></tr><tr><td>BIOMOL Green</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-AK111</td><td>Tercih edilen fosfat tespit reaktifi. Dikkat: tahriş edici.</td></tr><tr><td>Mikroplaka okuyucu</td><td></td><td></td><td>BioTek Synergy veya karşılaştırılabilir</td></tr><tr><td>Prism 5</td><td>GraphPad Yazılımı</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ölçme<em&gt; İn vitro</emenzimatik karakterizasyonu için&gt; atpaz aktivitesi

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

ATP-hidrolize edici enzimler ya da ATPaz, hücresel fonksiyonların çeşitli bir dizi çok önemli bir rol oynar. Bu dinamik proteinler, protein kaçakçılığı ve yıkımı, madde geçişinde ve hücresel hareketler gibi mekanik çalışmaları için enerji üretebilir. Burada açıklanan protokol fonksiyonel karakterizasyon için saflaştınldı ATPazların in vitro aktivitesini ölçmek için basit bir testtir. Proteinler, inorganik fosfat serbest sonuçlanan bir reaksiyon ATP hidroliz ve serbest fosfat miktarının bir kolorimetrik tahlil kullanılarak hesaplanır. Bu son derece uyumlu bir protokol kinetik ve bitiş noktası deneylerinde ATPaz aktivitesini ölçmek için ayarlanabilir. Temsili bir protokol aktivitesi ve Epse gereklerine göre burada sağlanan, AAA + ATPaz bakterisinin Vibrio cholerae Tip II salgılanması yer. aktivitesini ölçmek için ihtiyaç duyulan pürifiye protein miktarı, tayinin uzunluğu ve SA zamanlaması ve sayısımpling aralıkları, tampon ve tuzlu bileşim olup, sıcaklık, ko-faktörler, uyarıcı (eğer varsa) gibi burada açıklanan farklı olabilir, ve bu nedenle bazı optimizasyon gerekli olabilir. Bu protokol karakterize ATPaz&#39;ları için temel bir çerçeve sağlar ve hızlı bir şekilde gerçekleştirilir ve kolay gerektiğinde ayarlanabilir.

T2S ATPaz EPSE in vitro aktivitesi sitoplazmik EpsL (EPSE-cytoEpsL) alanında ve asidik fosfolipid kardiyolipin 12 ilavesi ile EPSE bölgesinin copurification ile stimüle edilebilir. Deney kullanılarak protein varyant formlarının vahşi tip (WT) etkinliğinin kıyaslanmasıyla ATP hidroliz özellikle EPSE kalıntılarının rolü belirlemek için de mümkündür. Burada, EPSE, çinko bağlayıcı alan olarak iki lisin artığına ikame etkisi EPSE K417AK419A-cytoEpsL varyantına saflaştırıla...

in vitro ATPase aktivitesini ölçmek için temel bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, belirli bir saflaştırılmış ATPaz için aktivite düzeyine ve gereksinimlere göre optimize edilebilir.

ölçme<em&gt; İn Vitro</emEnzimatik Karakterizasyonu için&gt; ATPaz Aktivitesi

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate ...

Bu prosedürün genel amacı, fonksiyonel karakterizasyon için saflaştırılmış proteinlerin in vitro ATPase aktivitesini nicel olarak belirlemektir. Bu yöntem, yeni olası ATPase'lerin karakterize edilmesi, etkili potansiyel aktivatörlerin veya inhibitörlerin değerlendirilmesi ve belirli domainlerin veya kalıntıların ATPase aktivitesine olan katkısının belirlenmesi için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, in vitro ATPase aktivitesini ölçmek için basit ve hassas bir yöntem olması ve kolayca optimize edilebilmesidir.Metin protokolünde belirtildiği üzere, saflaştırılmış proteinle inkübasyon için gerekli tüm reaktiflerin stok çözeltilerini hazırlayın. ATP hidroliz reaksiyonunu kurmadan hemen önce, 100 millimolar magnezyum klorür ve 100 millimolar ATP'yi bir bire oranında önceden karıştırın. Reaksiyon boyunca düzenli aralıklarla numune toplamak için 1,5 mililitrelik tüpleri hazırlayın ve etiketleyin.Sıfırın yanı sıra 15, 30, 45 ve 60. dakikalarda örnekleri toplamak için tüpleri hazırlayın. ATP hidroliz reaksiyonlarından toplanan örnekleri 1'e 50 oranında seyreltmek için her tüpe 245 µL 1x HNG tamponu ekleyin. Ardından, reaksiyonu durdurmak amacıyla örnekleri hızlıca dondurmak için kuru buz ve etanolden oluşan bir banyo hazırlayın.Kauçuk bir buz kovasına veya başka bir güvenli kaba birkaç parça kuru buz ekleyin ve kuru buzu örtecek miktarda %70 ila %100 etanolü dikkatlice dökün. Saflaştırılmış proteini 1X HNG tamponu ile seyreltin ve buz üzerinde tutun. Hazırlanan 0,5 mililitrelik tüplere, final reaksiyon hacmini 30 mikrolitreye tamamlayacak şekilde önceden hesaplanmış hacimde su ekleyerek ATP hidroliz reaksiyonlarını kurun.Ardından altı µL 5X HNG veya başka bir tampon, üç µL 100 mM magnezyum klorür ATP karışımı ve 0,25 ila beş µM protein ekleyin. Protein eklenmemiş, sadece tampon içeren bir negatif kontrol koşulunu inkübe edin. Daha sonra, sıfırıncı dakikada reaksiyondan beş µL alın.Ardından, alikotu 245 µL HNG tamponu içeren hazırlanmış 1,5 ml'lik tüpte 1/50 oranında seyreltin. Numuneyi hemen kuru buz etanol banyosunda dondurun. ATP hidrolizinin gerçekleşmesi için reaksiyonları 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin.Her aralıkta reaksiyondan beş µL'lik alikotlar alın ve daha önce olduğu gibi HNG tamponu içeren etiketli örnek tüplerine ekleyin. ATP hidroliz reaksiyonunun sonunda, seyreltilmiş örnekleri saklamak için 80 °C'lik bir dondurucuya taşıyın. Tüm örneklerin tamamen donduğundan emin olmak için, işleme devam etmeden önce en az 10 dakika bekleyin.Her bir zaman noktasından alınan ATP hidroliz reaksiyon alikotlarını içeren seyreltilmiş örnekleri oda sıcaklığında çözdürün. Ardından, örnekleri ve fosfat standartlarını içeren 96 kuyucuklu bir plaka hazırlayın. 0,5 mililitrelik bir tüpte, 5,5 mikrolitre standardı 104,5 mikrolitre HNG tamponuna ekleyerek fosfat standardını 800 mikromolar'dan 40 mikromolar'a seyreltin.İyice karıştırın ve bu 40 µM fosfat standardından 100 µL'yi 96 kuyucuklu plakanın A1 kuyucuğuna ekleyin. Fosfat standardının bire bir seri dilüsyonları için B1'den H1'e kadar olan kuyucuklara 50 µL HNG tamponu ekleyin. A1 kuyucuğundan 40 µM fosfatın 50 µL'sini alın, bunu B1 kuyucuğundaki 50 µL analiz tamponuna ekleyin ve karıştırın.Ardından, B1 kuyucuğundan 50 µL alıp C1 kuyucuğuna ekleyin ve dilüsyonlara G1 kuyucuğuna kadar devam edin. Her kuyucuğun aynı hacimde olduğundan emin olmak için, karıştırma işleminden sonra G1 kuyucuğundan 50 µL atın. 40'tan sıfır µM'ye kadar fosfat standardı oluşturmak için H1 kuyucuğu yalnızca tampon içermelidir. Sonrasında, her bir örnekten 50 µL'yi duplike olarak plakaya ekleyin.Aynı zaman noktasına ait örnekleri sütunlara dikey olarak, farklı zaman noktalarına ait örnekleri ise yatay olarak ekleyin. Bu yöntem, plaka başına sekiz örneğe ve beş zaman noktasına kadar olanak tanır. Örnek ve standart içeren her bir kuyucuğa 100 µL eklemek için steril bir pipet kullanarak yeterli miktarda malakit yeşili meliptat fosfat deteksiyon reaktifi alın.Çok kanallı pipetle kolayca pipetlemek için tespit reaktifini bir kaba ekleyin. Fosfat kontaminasyonu oluşma ihtimali nedeniyle tespit reaktifini doğrudan plakaya dökmeyin. Çok kanallı pipet kullanarak, her kuyucuğa 100 µL fosfat tespit reaktifi ekleyin ve son zaman noktasından ilk zaman noktasına doğru sırayla çalışarak, hava kabarcığı oluşturmadan tutarlı sayıda yukarı-aşağı pipetleme yaparak dikkatlice karıştırın.Plakayı 25 dakika boyunca veya üreticinin talimatlarına göre oda sıcaklığında bekletin. Sonuçları nicelleştirmek için, bir absorbans mikroplak okuyucu kullanarak örneklerin absorbansını 650 nanometrede okuyun; burada, tip iki sekresyon ATPase/EPSE'nin vahşi tip ve mutant formlarının aktivitesinin, stimülan kardiyolipin varlığında ve yokluğunda belirlendiği kinetik ve uç nokta ATPazlarının temsili sonuçları gösterilmiştir.Burada, yabani tip EPSE ve çift lizin mutantı için zamanla doğrusal fosfat salınımını gösteren, kinetik kardiyolipinle stimüle edilmiş ATPase sonuçları sunulmaktadır; negatif kontrol olarak sığır serum albümini kullanılmıştır. Her bir proteinin ATPase aktivitesini miktarlandırmak ve karşılaştırmak amacıyla, bu veriler dakika başına salınan fosfat miktarının protein konsantrasyonuna bölünmesi şeklinde temsil edilebilir. Veriler, K417 ve K419 olmak üzere iki lizin kalıntısının, EPSE'nin kardiyolipinle stimüle edilen ATPase aktivitesine katkıda bulunduğunu göstermektedir.Aynı proteinlerin kardiyolipin stimülasyonu olmadan gerçekleştirilen ATPase aktivite karşılaştırmaları, bu iki lizin kalıntısının EPSE'nin düşük bazal aktivitesine değil, proteinin kardiyolipin tarafından stimüle edilme yeteneğine katkıda bulunduğunu göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, saflaştırılmış proteinlerin ATPase aktivitesini nasıl hızlı ve doğru bir şekilde kantite edeceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürü uygularken, fosfat tespit reaktifinin hassasiyetini göz önünde bulundurmak önemlidir.Fosfat kontaminasyonunu önlemek için, tek kullanımlık plastik malzemeler ve ultra saf su kullanmanızı ve protein saflaştırmasının ardından boyut dışlama veya iyon değişim kromatografisi gerçekleştirmenizi öneririz.

measuring-in-vitro-atpase-activity-for-enzymatic-characterization

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Asetat kinaz aktivitesinin belirlenmesi için bir yöntem açıklanmıştır. Bu testte, asetat oluşturan yönde asetat kinaz enzim aktivitesi ve kinetiği farklı fosforilasyonunu alıcıları belirlemek için doğrudan bir tepki kullanır. Ayrıca, bu yöntem diğer asetil fosfat ya da asetil-CoA kullanan enzimler assaying için kullanılabilir.

Enzim Asetat Kinaz Asetat oluşturan Faaliyet Doğrudan Algılama

Solunum ve oksidatif fosforilasyon ile ve hücre canlılığı üzerindeki ilişkili mitokondriyal fonksiyonları üzerinde, protein kinaz C (PKC), izozimlerinin aktivasyon etkisi tarif edilmektedir. Yaklaşım seçici olarak mitokondriyal işlev ve hücre enerji durumunu belirlemek için birincil hücre kültürü deneyleri ve çeşitli PKC izozimleri overexpress için adenoviral teknik uyum sağlar.

Böbrek Hücreleri aşırı eksprese eden protein kinaz C izozimlerinin Mitokondriyal Fonksiyonlar ve Hücre Canlılık Değerlendirilmesi

Bu videoda, radyoaktif işaretli nükleotidler kullanarak pirofosfokinaz aktivitesini belirlemek için ince tabaka kromatografisi tabanlı bir enzim testi gösterilmektedir. Yöntem, nükleotid sentezi ve fosfotransfer reaksiyonları hakkında bilgi sağlar.

İnce Tabaka Kromatografisine Dayalı Enzim Aktivitesi Deneyi: İnce Tabaka Kromatografisi Kullanılarak İn Vitro Pirofosfokinaz Aktivitesini Belirleme Tekniği

Bu video, sentetik 4-Metilumbelliferil substratlar kullanılarak numunelerde α-galaktosidaz A ve asit α-glukozidaz için enzim aktivitesinin in vitro ölçümünü göstermektedir.

α-Galaktosidaz A ve Asit α-Glukozidaz Enzim Aktivitesinin İn Vitro Ölçümü

Xenopus oositlerindeki enzimlerin heterolog ekspresyonu ve atomik absorpsiyon spektrofotometrisi ile tek tek hücrelere Rb+ veya Li+ alımını ölçerek K+-karşı taşıyıcı P-tipi ATPazların aktivitesini ölçmek için bir yöntem açıklıyoruz. Yöntem, karmaşık kinetik çalışmaları kolaylaştıran radyoizotop akı deneylerine hassas ve güvenli bir alternatiftir.

Na, K ve H, K-ATPaz bölgesindeki tarafından Katyon Taşıma Ölçüm<em&gt; Xenopus</emAtomik Absorpsiyon Spektrofotometresi ile&gt; Oosit: Radyoizotop Tahliller Alternatif Bir

Burada, ATP'ye bağımlı nükleozom kaymasını katalize etme, 2) nükleozom substratlarıyla etkileşime girme ve 3) ATP'yi nükleozom veya DNA'ya bağımlı bir şekilde hidrolize etme yetenekleri için ATP'ye bağımlı kromatin yeniden modelleme enzimlerini karakterize etmek için kullanılabilecek biyokimyasal tahlilleri açıklıyoruz.

ATP-bağımlı Kromatin Tadilat Enzimler Faaliyetlerinin Analizi için biyokimyasal Tahliller

Mevcut rapor, Leishmania hücre ekstraktları kullanılarak fosfatidiletanolamin metiltransferaz aktivitesini ölçmek için in vitro enzimatik bir testi açıklamaktadır. Bu tahlil, bir radyoaktif metil grubunun S- [Metil-3H] adenosil-L-metiyoninden endojen fosfatidiletanolamin üzerine transferine dayanmaktadır.

Vitro Tahlil Fosfatidiletanolamin Metiltransferaz Aktivite Tedbir

Protein kinazlar, inter-ve intraselüler sinyal iletimi için kritik olan, oldukça gelişen sinyalleme enzimleri ve iskeletleridir. Radyoaktif işaretli adenosin trifosfatın ([γ- 32 P] ATP) kinaz aktivitesini ölçmek için bir protokol sunuyoruz, bu hücresel sinyal düzenlenmesinin aydınlatılmasına yardımcı olan güvenilir bir yöntemdir.

Protein Kinaz Aktivitesini Radyoaktif Etiketli ATP ile Tahlil

Önceden klinik test için "yetim" ilaçların farmakolojik chaperones tekrarlanabilir, hızlı ve verimli olarak adlandırılan yeni bir sınıf yapmak için bir talep var. Biz uygun hastalar için hem de roman farmakolojik refakatçi uyuşturucu ekran basit, yüksek standart ve çok yönlü hücre kültür tabanlı tahlil geliştirilmiştir.

Vitro Enzim ölçüm Test farmakolojik refakatçi yanıt Fabry ve Pompe hastalığı için

Burada, histidin öğesini pyrophosphokinase enzimler arındırıcı ve ince tabaka Kromatografi radiolabelled yüzeylerde ve ürünler için enzimatik aktivite içinde vitrotahlil kullanan bir yöntem açıklanmaktadır. Enzim etkinliği tahlil herhangi bir kinaz, nükleotit cyclase veya nükleotid trifosfat hidroliz olan mekanizma içerir fosfor-devret tepki genel olarak geçerlidir.

Bir arınma ve In Vitro etkinliği tahlil için (p) ppGpp sentetaz Clostridium difficile üzerinden

Bir nikotinamid adenin dinükleotid (NADH)-birleştirilmiş ATPaz tsay küçük molekül miyozin inhibitörleri yarı yüksek iş lenme taraması için adapte edilmiştir. Bu kinetik teşbit, kuyu başına sadece 20 μL toplam reaksiyon hacmine sahip 384 kuyulu bir mikroplaka formatında çalıştırılır. Platform hemen hemen tüm ADP üreten enzimler için geçerli olmalıdır.

Küçük Molekül Inhibitörlerinin Taranması için NADH-Coupled ATPase Tsay'ın Yarı-Yüksek İş-İşLenme Adaptasyonu

Öğrenin, saflaştırılmış proteinlerin in vitro ATPaz aktivitesini ölçme yöntemini. Bu teknik, yeni ATPazların fonksiyonel karakterizasyonu ve potansiyel aktivatör ya da inhibitörlerin değerlendirilmesi için kullanılır.

ölçme

Daha fazla video keşfet