ölçme İn Vitro ATPaz Aktivitesi

Bu prosedürün genel amacı, fonksiyonel karakterizasyon için saflaştırılmış proteinlerin in vitro ATPaz aktivitesini ölçmektir. Bu yöntem, yeni varsayılan ATPazları karakterize etmek, etkili potansiyel aktivatörleri veya inhibitörleri değerlendirmek ve belirli alanların veya kalıntıların ATPaz aktivitesine katkısını belirlemek için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, in vitro ATPaz aktivitesini ölçmek için basit, hassas bir yöntem olması ve kolayca optimize edilebilmesidir.

Metin protokolünde belirtildiği gibi saflaştırılmış protein ile inkübasyon için gerekli tüm reaktiflerin stoklarını hazırlayın. ATP hidroliz reaksiyonunu kurmadan hemen önce 100 milimolar magnezyum klorür ve 100 milimolar ATP'yi bire bir oranında önceden karıştırın. Reaksiyon boyunca düzenli aralıklarla numune toplamak için 1,5 mililitrelik tüpler hazırlayın ve etiketleyin.

Numuneleri sıfır zamanlarında ve 15, 30, 45 ve 60 dakikalık zamanlarda toplamak için tüpler hazırlayın. ATP hidroliz reaksiyonlarından toplanan numuneleri bir ila 50 arasında bir seyreltmede seyreltmek için her tüpe 245 mikrolitre 1x HNG tamponu ekleyin. Ardından, reaksiyonu durdurmak için numuneleri hızlı bir şekilde dondurmak için bir kuru buz ve etanol banyosu hazırlayın.

Kauçuk bir buz kovasına veya başka bir güvenli kapta, birkaç parça kuru buz ekleyin ve kuru buzu kaplayacak kadar %70 ila %100 etanolü dikkatlice dökün. Saflaştırılmış proteini 1X HNG tamponunda seyreltin ve buz üzerinde tutun. 30 mikrolitrelik bir nihai reaksiyon hacmine ulaşmak için önceden hesaplanmış bir hacimde su ekleyerek hazırlanan 0,5 mililitrelik tüplerde ATP hidroliz reaksiyonlarını ayarlayın.

Bunu altı mikrolitre 5X HNG veya başka bir tampon, üç mikrolitre 100 milimolar magnezyum klorür ATP karışımı ve 0.25 ila beş mikromolar protein takip eder. Hiçbir proteinin eklenmediği bir tamponu sadece negatif kontrol koşulu inkübe edin. Daha sonra, reaksiyondan sıfır kez beş mikrolitre çıkarın.

Daha sonra, 245 mikrolitre HNG tamponu içeren hazırlanmış 1.5 mililitrelik tüpte alikotu 50'ye kadar seyreltin. Numuneyi hemen kuru buz etanol banyosunda dondurun. ATP hidrolizinin bir saat boyunca gerçekleşmesine izin vermek için reaksiyonları 37 santigrat derecede inkübe edin.

Her aralıkta, reaksiyondan beş mikrolitrelik alikotu çıkarın ve daha önce olduğu gibi HNG tamponu içeren etiketli numune tüplerine ekleyin. ATP hidroliz reaksiyonunun sonunda, seyreltilmiş numuneleri saklamak için 80 santigrat derecelik bir dondurucuya taşıyın. Tüm numunelerin tamamen donduğundan emin olmak için devam etmeden önce en az 10 dakika bekleyin.

ATP hidroliz reaksiyonu alikotları içeren seyreltilmiş numuneleri oda sıcaklığında her zaman noktasından çözün. Ardından, numuneler ve fosfat standartlarını içeren 96 oyuklu bir plaka hazırlayın. 0.5 mililitrelik bir tüpte, fosfat standardını 800 mikromolar ila 40 mikromolar arasında, standartın 5.5 mikrolitresini 104.5 mikrolitre HNG tamponuna ekleyerek seyreltin.

İyice karıştırın ve bu 40 mikromolar fosfat standardından 100 mikrolitreyi 96 oyuklu plakanın A1 kuyusuna ekleyin. Fosfat standardının bire bir seri seyreltmeleri için B1'den H1'e kadar olan kuyulara 50 mikrolitre HNG tamponu ekleyin. A1 kuyusundan 50 mikrolitre 40 mikromolar fosfatı çıkarın, B1 kuyusundaki 50 mikrolitre tahlil tamponuna ekleyin ve karıştırın.

Daha sonra B1 kuyusundan 50 mikrolitre çıkarın ve C1 kuyusuna ekleyin, G1 kuyusu boyunca seyreltmeye devam edin. Her kuyucuğun aynı hacme sahip olduğundan emin olmak için karıştırdıktan sonra G50 kuyusundan 1 mikrolitre atın. Peki, H1, 40 ila sıfır mikromolar arasında bir fosfat standardı oluşturmak için sadece tampon içermelidir. Daha sonra, her numuneden 50 mikrolitre çift olarak plakaya ekleyin.

Aynı zaman noktasından örnekleri sütunlara dikey olarak ve farklı zaman noktalarından yatay olarak ekleyin. Bu, plaka başına sekiz adede kadar numuneye ve beş zaman noktasına izin verir. Numuneleri ve standartları içeren kuyucukların her birine 100 mikrolitre eklemek için yeterli miktarda malakit yeşil meliptat fosfat tespit reaktifini çıkarmak için steril bir pipet kullanın.

Çok kanallı bir pipet kullanarak kolay pipetleme için algılama reaktifini bir tabağa ekleyin. Fosfat kontaminasyonu meydana gelme olasılığı yüksek olduğundan, algılama reaktifini doğrudan tabağa dökmeyin. Çok kanallı bir pipet kullanarak, her bir oyuğa 100 mikrolitre fosfat algılama reaktifi ekleyin ve son zaman noktasından ilk zaman noktasına kadar sırayla çalışarak, kabarcıklar eklemeden tutarlı sayıda yukarı ve aşağı pipetleyerek dikkatlice karıştırın.

Plakayı oda sıcaklığında 25 dakika veya üreticinin talimatlarına göre bırakın. Sonuçları ölçmek için, bir emicilik mikro plaka okuyucu kullanarak numunelerin 650 nanometrede absorbansını okuyun. Kinetik ve son nokta ATPazların temsili sonuçları gösterilir, burada tip iki sekresyon ATPase / EPSE'nin vahşi tip ve mutant formlarının aktivitesi, uyarıcı bir kardiyolipinin varlığında ve yokluğunda belirlenir.

Burada gösterilen, kinetik kardiyolipin ile uyarılmış bir ATPaz'ın sonuçlarıdır, vahşi tip EPSE ve bir çift lizin mutantı için zaman içinde doğrusal fosfat salınımını gösterir ve sığır serum albümini negatif kontrol olarak işlev görür. Bu veriler, her bir proteinin ATPaz aktivitesini ölçmek ve karşılaştırmak için dakikada salınan fosfat miktarının protein konsantrasyonuna bölünmesi olarak temsil edilebilir. Veriler, iki lizin kalıntısının, K417 ve K419'un, EPSE'nin kardiyolipin ile uyarılan ATPaz aktivitesine katkıda bulunduğunu göstermektedir.

Kardiyolipin stimülasyonu olmadan aynı proteinlerin ATPaz aktivitesinin karşılaştırılması, bu iki lizin kalıntısının EPSE'nin düşük bazal aktivitesine katkıda bulunmadığını, bunun yerine proteinin kardiyolipin tarafından uyarılma kabiliyetine katkıda bulunduğunu göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, saflaştırılmış proteinlerin ATPaz aktivitesinin nasıl hızlı ve doğru bir şekilde ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü denerken, fosfat tespit reaktifinin hassasiyetini dikkate almak önemlidir.

Fosfat kontaminasyonunu önlemek için, tek kullanımlık plastik malzeme ve ultra saf su kullanmanızı ve protein saflaştırmasının ardından boyut dışlama veya iyon değişim kromatografisi yapmanızı öneririz.