Name: Görüntüleme Kalsiyum Drosophila Yumurta Aktifleştirme de (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Öğrenin Drosophila melanogaster yumurta aktivasyonunda kalsiyum dinamiklerini görüntüleme yöntemini. Bu teknik gelişimsel biyolojide yüksek çözünürlüklü kalsiyum dalgalarını incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz bu yazının hazırlanması sırasında yardım için Laura Bampton, Alex Davidson, Richard Parton, Arita Acharya&#39;sına minnettarız; Yumurta aktivasyonu üzerine tartışmalar Mariana Wolfner; Görüntüleme destek Mat Wayland; ve Nan Hu laboratuvarda genel destek için. Bu çalışma TTW Cambridge, ISSF Üniversitesi [hibe sayısı 097.814] tarafından desteklenmiştir.

Not: Aksi belirtilmedikçe oda sıcaklığında tüm adımları uygulayın. 1. Diseksiyon için hazırlanıyor Not: Burada anlatılan adımlar E. Gavis, Princeton Üniversitesi&#39;nden &amp; Weil et ile uyumludur. ark. 18. görüntüleme önce aşağıdaki adımları iki gün uygulayın. <ol><li> Katı gıda yaklaşık 10 ml ihtiva eden bir uçucu şişeye alın ve bir köşede kurutularak maya küçük bir miktar eklemek, 1 g yeterlidir. Not: sinek şişeleri ya da gıda hakkında bilgi &#39;Drosophila Bakım&#39; 19 için bkz. </li><li> maya hidrat 3 damla su - 1 eklenir. </li><li> 45 ° açıyla kenara flakon ayarlayın ve 3 izin - su almak için maya için 5 dk. </li><li> Maya su emici olsa da, (en son ortaya çıkmıştır ki (GCaMP5 olarak da adlandırılır), bir myristoy küvet-VP16GAL4 tahrik UASt- MYR GCaMP5 20 eksprese eden sineklerin bir şişe seçinGCaMP5 arasında yonunun formu) yumurta membrana Geci cepheye ile gürültü oranı yüksek bir sinyal sağlamak için seçilmiştir. </li><li> CO 2 gazı ile şişe içinde sinekler Anesteziyoloji. Islak gıda sinekler kaybetmek olmayacak şekilde ters şişe tutmak için emin olun. </li><li> CO 2 ped üzerine anestezi sinekler İpucu ve sıralama 10-15 kadın ve bir mikroskop altında bir fırça kullanarak 5 erkek. Not: diseksiyon için sağlıklı kadın temin etmek erkekleri kapsayacak şekilde standarttır. </li><li> Adım 1.3 şişe hazır olduğunda, flakon seçilen sinekler ekleyin. sinekler aktif hale gelene kadar şişe yatay tutmak için özen gösterin. </li><li> Yaklaşık 36 saat boyunca 25 ° C&#39;de şişe yerleştirin. </li><li> Şişe veya ıskarta CO 2 pad kalan sinekler dönün. </li></ol> 2. Diseksiyon Drosophila Ovaryumlar Not: Burada tarif edilen adımlar, Weil ve diğerleri ile uyumludur. ark. <s&gt; 18 kadar. <ol><li> 36 saat sonra, CO 2 ile mayalı flakonundan sinekler uyuşturan. </li><li> Flakon içindeki sinekler CO 2 ped üzerine bunları İpucu anestezi sonra bir mikroskop altında bir boya fırçası ile sıralanacak. </li><li> Bir kadın seçin. </li><li> kadın iki yumurtalıklar izole edin. Tam detaylı protokol için Weil bakınız. ark. 18. Özetle: <ol><li> No. 1.5, 22 x 40 mm örtücü kısım üzerine oksijenli halokarbon bir yağ (Seri 95) küçük bir damla koyun. </li><li> Karın anterior forseps ile dişi kavrayın. </li><li> Diseksiyon mikroskobu altında kadın tutarak, yavaşça dişinin posterior kaldırmak için forseps ikinci seti kullanın. </li><li> İkinci forseps posterior doku siliniz. </li><li> Karın posterior anterior ikinci forseps ile karın boşluğuna sıkın. İki opak yumurtalıkların zaman FEMA dışında forseps ayrılmamak gerekirle. </li><li> yağın içine yumurtalıklar dokunun. </li><li> forseps kapalı silerek forseps herhangi bir doku çıkarın. </li><li> bir sinek, üç lamelleri elde etmek için her içeren yumurtalık - Bu adımları (2.4.7 2.4.1) tekrarlayın. </li></ol></li></ol> 3. Ayırma Bireysel Olgun Yumurta <ol><li> Adım 2.4 ilk lamel, 4X ayarlanmış büyütme ile standart bir mikroskop altında, yumurtalık yırtarak iki yumurtalık ayırın. </li><li> herhangi bir yumurta odaları delinme özen tek yumurtalık merkezi haline kapalı forseps bir çift tanıtmak. </li><li> Bir sonraki kapalı forseps yumurtalık merkezine standart bir diseksiyon probu yerleştirin. </li><li> Yavaşça olgun yumurta (evre 14 yumurta odaları) bulunduğu arka kutup, doğru yumurtalık yoluyla diseksiyon prob sürükleyin. </li><li> Tekrar 3.1 adımları - 3,4 2-5 kat yumurtalık ve yumurta sayısı boyutuna bağlı olarak değişir. Not: CO2 ilavesi </sub&gt; tipik önceden yatırılan yumurtalardan daha yükseltilmiş dorsal uzantıları ile büyük görünecek tek bir yumurta birikimi neden olur. Zaten kadın içinde aktif beri Bu yumurta görüntüleme için atılmalıdır. Not: Olgun yumurta yumurtalık bağ dokusu kolayca ayırmak için muhtemeldir. </li><li> Hiçbir olgun yumurta yumurtalık dışında görünür durumdaysa, diseksiyon prob ile alay yavaşça devam ediyor. </li><li> lamel merkezinde bir çizgi 5 - olgun yumurta yumurtalık dışında lamel görünür olduğunda, 3 manevra. Not: En iyi sonucu elde etmek için, yumurta kenarı boyunca yavaşça prob çalıştırın. Not: Bu yumurtayı zarar verebileceği dorsal uzantıları çekerek kaçının. Not: Gelecekteki görüntüleme set-up bağlı olarak maksimum görüntüleme alanı için lamel dik yaklaşık 200 mikron ayrı yumurta hizalayın. </li><li> hizalanmış sonra, f kullanılarak hizalanmış yumurta uzağa sürükleyerek yumurtalık dokusunun geri kalanını kaldırmakorceps. </li><li> Tıbbi silme köşesinde ile dabbing fazla yağı çıkartın. Tıbbi kaybolur temas gibi olgun yumurta silin olgun yumurta dokunmamaya özen gösterin. </li><li> mikroskop altında örnek bulma basitleştirmek için bir işaretleyici ile lamel bir crosshair çizin. </li><li> güvenli bir yerde lamel ayarlayın ve 5 için dinlenmek için lamel hazırlanan yumurta odaları bırakın - 10 dakika. Yumurta yağda yerleşmek için bu izin verir. Numuneler 1 saat sonrası diseksiyonu kadar kullanılabilmektedir. </li><li> onlara yumurtalıkların ile lamelleri geri kalanı için 3.11 - Tekrar 3.1 adımları. </li></ol> 4. Görüntüleme için hazırlanıyor <ol><li> Oda sıcaklığına hazırlanan aktivasyon tamponu 15 getirin. Not: aktivasyon tamponu hipotonik tampon maddesi olup: 3.3 mM NaH 2 PO 4, 16.6 mM KH 2 PO 4, 10 mM NaCI, 50 mM KCI, bir 1 ile pH 6.4&#39;e getirildi, 5% polietilen glikol 8000, 2 mM CaCl2,: NaOH 5 oranı: KOH.Daha fazla bilgi için Mahowald, 1983 15. Aktivasyon tamponu alikoları en fazla 2 hafta içinde C ay boyunca 4 ° C&#39;de -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> Dikkatle görüntüleme tesisine hazırlanan lamelleri, aktivasyon tampon ve cam pipetler taşıyın. Not: Bir geniş alan, konfokal, eğirme disk veya hafif levha mikroskop kullanılabilir. Biz ters bir mikroskop kullanılarak öneririz. Bizim Örnek sonuçlar konfokal mikroskop kullanılarak elde edilmiştir. </li><li> tüm olgun yumurta görüntüleme için uygun bir hedef (burada: 20X 0.7 NA) seçilmelidir. </li><li> Mikroskop sahneye ilk hazır lamel monte edin. Sahnede lamelleri kırmamaya özen gösterin. </li><li> Kalitatif aktivasyon için olgun bir yumurta haznesi ile bir görüş alanı seçin. Görüntü delinmiş yumurta odaları veya zarında blebbing olanlar etmeyin. Not: adımlar 4.6 için - 4.7, yazılım komutları mikroskop ve üreticiye bağlı olarak değişir. </li><li> Set görüntüleme para(- 580 ila 500 nm) standart GFP uyarılma (488 nm) ve emisyon metre. Ayrıca olgun yumurta ve yerinden yağ görselleştirmek ve yönlendirmek amacıyla bir aydınlık alan görünümü kurdu. </li><li> Tam Z-yığını olgun yumurta görünür düşük Z-düzlemini seçin ve ayarlayın adım başı 40 mikron yaklaşık 2 mikron için alınacak. Z-yığını edinimi arasında hiçbir gecikme yok yani parametreleri ayarlayın. Yaklaşık 30 dakika boyunca yakalamak için zaman serisi ayarlayın. </li></ol> 5. Görüntüleme Ex Vivo Yumurta Aktivasyon <ol><li> görüntü yakalama başlatın. </li><li> 2 tam Z-yığınlar elde edilecek - 1 bekleyin. Bu aktivasyon öncesinde olgun yumurta gösterir. </li><li> Bir cam pipet içine aktivasyon tampon yaklaşık 300 ul çekin. </li><li> olgun yumurta görüntülü doğrudan yukarıda kadar lamel üzerinde 45 ° &#39;lik açıyla aktivasyon tampon içeren cam pipet ucu konumlandırma, yavaş yavaş ışın yoluna pipet hareket ettirin. Cam pipet gerekirBu yağ, 2 cm - 1 olabilir. </li><li> cam pipet en fazla 5 saniye içinde aktivasyon tamponu 2 damla - 1 eklenir. Bu yağ yerinden gerekir. aşırı aktivasyon tampon ekleyerek veya olgun yumurta değiştirmesine neden olabilir cam pipet ile yumurta dokunmaktan kaçının. Bu amaç ve lamel arasındaki immersiyon oluşturmak için odak düzlemi veya hava kabarcıkları bir değişiklik neden olabilir pipet ile lamel dokunmamaya özen gösterin. </li><li> görüntü alımı sırasında aktivasyon tampon ekleyerek iken, yağ aktivasyon tampon yerinden edilmiş olmasını sağlamak için parlak alan kanalı kontrol. Not: Bu ilk nedeni ışın yolu kırma pipet bir gölge olarak görünür ama aynı zamanda küçük yağ damlacıkları görünümünü neden olacaktır. Bazı yağ damlacıkları deneysel sonuçları ve görüntü kalitesini etkiler olgun yumurta ile ilişkili kalabilir. </li><li> 5 - Yağ aktivasyon tampon tekrar ilk ilavesiyle yerinden değilse 5.4 adımları0,6. </li><li> Yağ başarıyla yerinden sonra, zaman serisi tamamlanana kadar çalışmasına izin verin. Not: aktivasyonu oosit şişlik, bazı yumurta odaları aktivasyon tampon ilavesi üzerine odak düzlemi veya görüş alanının dışında önemli ölçüde hareket edecektir nedeniyle. Bu durumda, satın durdurmak ve bir sonraki lamel monte edin. </li><li> görüntü sırası alımını tamamlandıktan sonra, verileri kaydetmek. </li></ol> 6. Post-satın alma Görüntü İşleme <ol><li> Fiji (http://fiji.sc/Downloads#Fiji) veya eşdeğer görüntü işleme yazılımı kullanarak veri seti açın ve analiz için ilgili dosyaları seçin. </li><li> elde edilen verilerin bir projeksiyon oluşturmak için seçin: Image&gt; Yığınlar&gt; Z proje. </li><li> Bir başlangıç ​​Z-dilim ve bir stop Z-dilim, genellikle bütün bölümünü seçin. tipik &#39;Maksimum Şiddeti&#39; olarak ayarlanmış bir projeksiyon türü seçin. dizi için seçilen ayarları uygulamak için onay kutusu &#39;Tüm Zamanların Çerçeveler&#39; kontrol edin. </li><li> EğerBirden fazla floresan kanal kompozit yapmak, renkler arasındaki hareketi sağlamak için Kanallar aracını kullanın ya da görüntü gri tonlama yapmak, görüntülenmiştir edilmiştir. Resim Seç&gt; Renkler&gt; Kanallar aracı. </li><li> Görüntü parlaklığını ayarlamak basıp Görüntü kontrast&gt;&gt; Parlaklık / Kontrast ayarlama için. </li><li> tek bir görüntü vermek için, ilgili çerçeve ve Dosya&gt; Farklı Kaydet&gt; JPEG, ya da herhangi bir tercih edilen biçimine zaman ölçeği kaydırıcıyı hareket ettirin. </li><li> Verilen dosya için bir konum ve başlık seçin, ardından kaydedin. görüntüleme yazılımından kare hızını Not resmin üzerine bir zaman damgası vermek için gerekli olacaktır. </li><li> bir film olarak zaman serisini vermek için seçin: Dosya&gt; Farklı Kaydet&gt; AVI, sonra (~ saniyede 7 kare) kare hızını seçin. </li><li> Verilen dosya için bir konum ve başlık seçin, ardından kaydedin. </li><li> Fiji formatında düzeltilmiş dosyayı kaydetmek için, Dosya&gt; Kaydet. </li></ol>

<ol><li>Stricker, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+biology+of+calcium+signaling+during+fertilization+and+egg+activation+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative biology of calcium signaling during fertilization and egg activation in animals.</a> Dev Biol. 211 (2), 157-176 (1999).</li>
<li>Horner, V. L., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitioning+from+egg+to+embryo%3A+triggers+and+mechanisms+of+egg+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Transitioning from egg to embryo: triggers and mechanisms of egg activation.</a> Dev Dyn. 237 (3), 527-544 (2008).</li>
<li>Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+free+calcium+wave+traverses+the+activating+egg+of+the+medaka%2C+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes.</a> J Chem Biol. 76 (2), 448-466 (1978).</li>
<li>Fujiwara, T., Nakada, K., Shirakawa, H., Miyazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+inositol+trisphosphate-induced+calcium+release+mechanism+during+maturation+of+hamster+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of inositol trisphosphate-induced calcium release mechanism during maturation of hamster oocytes.</a> Dev Biol. 156 (1), 69-79 (1993).</li>
<li>Hafner, M., Petzelt, C., Nobiling, R., Pawley, J. B., Kramp, D., Schatten, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wave+of+free+calcium+at+fertilization+in+the+sea+urchin+egg+visualized+with+fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Wave of free calcium at fertilization in the sea urchin egg visualized with fura-2.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 9 (3), 271-277 (1988).</li>
<li>Fontanilla, R. A., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+sperm-induced+calcium+wave+in+Xenopus+eggs+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Characterization of the sperm-induced calcium wave in Xenopus eggs using confocal microscopy.</a> Biophys J. 75 (4), 2079-2087 (1998).</li>
<li>Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+Ca2%2B+indicators%3A+using+genetics+and+molecular+design+to+understand+complex+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology.</a> J Physiol. 578, (Pt 1) 55-67 (2007).</li>
<li>Douglass, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDouglass%2C+A+%22New+Techniques+in+Systems+Neuroscience%22">New Techniques in Systems Neuroscience</a>. , Springer. (2015).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Chen, T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Wang, J., Wong, A., Flores, J., Vosshall, L., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112 (2), 271-282 (2003).</li>
<li>Kaneuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+waves+occur+as+Drosophila+oocytes+activate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Calcium waves occur as Drosophila oocytes activate.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 791-796 (2015).</li>
<li>York-Andersen, A. H., Parton, R. M., Bi, C. J., Bromley, C. L., Davis, I., Weil, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+and+rapid+calcium+wave+at+egg+activation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">A single and rapid calcium wave at egg activation in Drosophila.</a> Biol Open. 4 (4), 553-560 (2015).</li>
<li>Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+activation+of+Drosophila+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro activation of Drosophila eggs.</a> Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).</li>
<li>Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+meiotic+divisions+in+Drosophila+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes.</a> Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).</li>
<li>Horner, V. L., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stimulation+by+osmotic+and+hydrostatic+pressure+activates+Drosophila+oocytes+in+vitro+in+a+calcium-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical stimulation by osmotic and hydrostatic pressure activates Drosophila oocytes in vitro in a calcium-dependent manner.</a> Dev Biol. 316 (1), 100-109 (2008).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> J Vis Exp. (60), (2012).</li>
<li>Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila Maintenance. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22JoVE+Science+Education+Database%22">JoVE Science Education Database</a>. , JoVE. Cambridge, MA. (2016).</li>
<li>Melom, J. E., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+a+NCKX+Eliminates+Glial+Microdomain+Calcium+Oscillations+and+Enhances+Seizure+Susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mutation of a NCKX Eliminates Glial Microdomain Calcium Oscillations and Enhances Seizure Susceptibility.</a> J Neurosci. 33 (3), 1169-1178 (2013).</li>
<li>Munro, E., Nance, J., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+flows+powered+by+asymmetrical+contraction+transport+PAR+proteins+to+establish+and+maintain+anterior-posterior+polarity+in+the+early+C.+elegans+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Cortical flows powered by asymmetrical contraction transport PAR proteins to establish and maintain anterior-posterior polarity in the early C. elegans embryo.</a> Dev Cell. 7 (3), 413-424 (2004).</li>
<li>Maruyama, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGG-3+regulates+cell-surface+and+cortex+rearrangements+during+egg+activation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">EGG-3 regulates cell-surface and cortex rearrangements during egg activation in Caenorhabditis elegans.</a> Curr Biol. 17 (18), 1555-1560 (2007).</li>
<li>Wong, G. K., Woods, M. A., Szymczak, R. K., Gavlik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+normal+actin+cytoskeletal+reorganization+affects+cell+cycle+time+in+fertilized+sea+urchin+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Disruption of normal actin cytoskeletal reorganization affects cell cycle time in fertilized sea urchin eggs.</a> Mol Biol Cell. 15, 23(2004).</li>
<li>Horner, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+calcipressin+sarah+is+required+for+several+aspects+of+egg+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The Drosophila calcipressin sarah is required for several aspects of egg activation.</a> Curr Biol. 16 (14), 1441-1446 (2006).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu protokoldeki ilk kritik adım, olgun yumurtaların zarar görmeden izole edilmesidir. Bu, diseksiyon probu ile yumurtaların gentil manevrası ile elde edilebilir. Uygulama, bu manipülasyonun yumurtalara zarar vermeden gerçekleştirilmesini sağlayacaktır. İkinci önemli adım, yağdaki olgun yumurtaya aktivasyon tamponu uygulandığında numune kaybının önlenmesidir. Aktivasyon tamponunun uygulanması yavaş ve lamel ile temas etmeden yapılmalıdır. Mikroskop kurulumu numuneye kolay erişime izin vermiyorsa bu adım zor olabilir. Mikroskobun sıcaklık inkübatörü gibi aksiller kısımlarının hareket ettirilmesi tavsiye edilir. 
Yumurta aktivasyonundaCa2+ yerine floresan etiketli diğer faktörleri görselleştirmek için bu protokolde değişiklikler yapılabilir. Daha genel olarak, Drosophila gelişiminin farklı aşamaları veya farklı bir tampon eklemenin sonuçları bu protokol kullanılarak analiz edilebilir. 
Mikroskoptaki ayarlar numuneden gelen sinyali görselleştirmek için uygun değilse sorun giderme gerekebilir. Bu, lazer gücünü artırarak veya azaltarak, yakalama aralığını değiştirerek ve Z-yığını parametrelerini ayarlayarak başarılabilir. Diğer bir sorun, aktivasyon tamponunun eklenmesiyle yumurtaların sürekli olarak görüş alanının dışına çıkması olabilir. Bu düzenli olarak gerçekleşirse, olgun yumurtaların 15 ila 20 dakika gibi daha uzun bir süre lamellere yerleşmesine izin verin. Daha yüksek viskoziteli bir yağ kullanmanın, yağın aktivasyon tamponu ile yer değiştirmesini değiştireceğine dikkat edin. 
Burada sunulan bu teknik, objektifin çalışma mesafesi, olgun yumurtaların dehidrasyonu ve olgun yumurtaları zarar görmeden diseksiyon yeteneği ile sınırlıdır. Bununla birlikte, olgun oositin yetişkin dişiden geçtiği ve biriktirildiği in vivo görüntüleme yöntemleriyle karşılaştırıldığında 13, yöntemimiz daha fazla uzamsal çözünürlük, olgun yumurtayı aktivasyondan önce fiziksel olarak manipüle etme seçeneği ve döllenme olmadan yumurta aktivasyonunun rolünü test etme yeteneği sağlar. 
Yumurta aktivasyonunda hücresel bileşenler için raportör yapılarının test edilmesi veCa2+ dalgasının mutant arka planlarda 14,24 görselleştirilmesi de dahil olmak üzere, bu tekniğin gelecekteki birçok potansiyel uygulaması vardır. Deneysel ve genetik araçlarla birlikte, burada sunulan ex vivo yumurta aktivasyon testi, evrensel olarak korunmuşCa2+ dalgasının tetikleyici, yayılma ve aşağı akış etkilerinin incelenmesini sağlar.

Yumurta (oosit) aktivasyonu A hücre içi Ca değişim 2+ konsantrasyon tüm çalışılan organizmaların 1,2 korunmuş bir bileşenidir. Bu olay, hücre döngüsü yeniden başlatılması ve depolanan mRNA çevirisi de dahil olmak üzere, Ca 2 + -bağımlı süreçler, geniş bir yelpazede başlatır. Nedeniyle hücre içi Ca 2 + konsantrasyonlarda geçici değişiklikler görselleştirme Ca 2+ için bu şartı, anahtar ilgi olmuştur. Tarihsel olarak, Model canlılar kendi yumurta büyüklüğüne ve durumuna bağlı olarak yumurta aktivasyonu üzerinde çalışmalar için seçildi. Çeşitli görselleştirme yaklaşımlar da dahil olmak üzere, bu sistemlerde 2 + konsantrasyonları takip ve hücre içi Ca değişiklikleri ölçmek için kullanılmıştır: Medaka balık 3 photoprotein aequorin; Böyle Fura-2 deniz kestanesi ve hamster 4,5 gibi ca 2+ duyarlı floresan boyalar; ve kalsiyum-yeşil 1-dekstran Xenopus 6. Üretim ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (Geçiş) iyileştirilmesi vivo 7 Ca 2 + dinamiklerini görselleştirmek için yeteneği dönüştürdü. Bu genetik yapılar belirli dokularda ifade ve invaziv doku hazırlıkları 8 ihtiyacını sınırlamak vardır. GCaMPs nedeniyle yüksek Ca 2 + afinite çok etkili olmuştur Geçiş yeşil flüoresan proteini (GFP) merkezli sınıf, sinyal-gürültü oranı ve kapasite 9-11 özelleştirilmesi için. Ca + 2 varlığında, GCaMP kompleksi, kalmodulin Ca 2+ bağlanması ile başlayan yapısal bir dizi değişiklik maruz GFP bileşen 9 artmış floresan yoğunluğu ile sonuçlanır. GCaMPs yoğun hücre içi Kalsiyum 12 değişiklikleri görselleştirmek için Drosophila nöronlar üzerindeki araştırmalarda kullanılmıştır. son UygOlgun Drosophila yumurta 2+ Ca görselleştirmek için GCaMP teknoloji yumurta aktivasyonu 13,14 tek bir geçici Ca 2 + dalga ortaya koymuştur. Ca 2 + dalga bir ex vivo aktivasyon tahlil 13,14 kullanarak in vivo 13 yumurtlama sırasında ya da daha yüksek büyütmede düşük büyütme görülebilir. Ex vivo deneyde, tek tek, olgun oosit överlerden izole edildi ve hipotonik bir solüsyon kullanılarak çalıştırılır, in vivo aktive 15-17 olaylarını özetlemek gösterilmiştir aktivasyon tamponu olarak anılacaktır. Bu ex vivo deney farmakolojik bozulma, fiziksel manipülasyonlar ve genetik mutantlar dahil olmak üzere farklı deneysel koşullar altında Ca 2 + dalganın kolay yüksek çözünürlüklü görselleştirme sağlar. Bu makale ex vivo aktivasyonu ve th için olgun Drosophila yumurta hazırlanmasını göstermektedirGCaMP kullanarak Ca 2 + dalga görselleştirmek için kullanılan e sonraki mikroskopi. Bu yaklaşım Ca 2 + dalganın başlaması ve kontrolünü test etmek ve alt sonuçlarını araştırmak için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Kuru aktif maya</td><td>Fleischman' s</td> <td># 2192</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td>Çeşitli çalışacak</td></tr><tr><td>Lamba</td><td>Mircotec Fiber optik</td><td>MF0-90</td><td>Çeşitli çalışacak</td></tr><tr><td>Tıbbi mendiller</td><td>Kimberly-Clark Corporation KLEW3020</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Marker kalem</td><td>Stabilo</td><td>841/46</td><td>OHPen evrensel, siyah - çoğu kırtasiye mağazasında mevcuttur. Süper İnce Genişlik 0,4 mm</td></tr><tr><td>CO2 ped</td><td>& Genesee Scientific</td><td>59-114 (789060 Dutscher)</td><td></td></tr><tr><td>Kapak kayması, No. 1.5, 22 x 50 mm,</td><td>Uluslararası- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm</td><td>, Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Halokarbon yağı, seri 95</td><td>Halocarbon Products Corp.</td><td>Avrupa'daki Distribütör:</td><td></td></tr> <tr><td>Solvadis (GMBH)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Oil 10 S</td><td>VWR Chemicals</td><td>24627.188</td><td>Halokarbon yağı yerine kullanılabilir, seri 95</td></tr><tr><td>Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11252-00</td><td>Bu aletlerin temiz olması gerekirken, otoklav kullanımına gerek yoktur, etanol yeterli olacaktır.</td></tr><tr><td>Prob</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>10140-01</td><td></td></tr><tr><td>Cam pipet</td><td>Fisherbrand,FB50251</td><td></td> <td>Pasteur Pipetler, cam, fişsiz, 150 mm uzunluk&nbsp;</td></tr><tr><td>Flakon</td><td>Regina Industries</td><td>P1014</td><td>GPPS&nbsp; 80 mm x 25 mm</td></tr></tbody></table>

görüntüleme kalsiyum<em&gt; drosophila</em&gt; yumurta aktifleştirme de

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Yumurta aktivasyonu, döllenmiş yumurtanın mayoz bölünmeyi tamamlamasına ve embriyonik gelişimi başlatmasına izin vermek için bir dizi olay içeren evrensel bir süreçtir. İncelenen tüm organizmalarda korunan yumurta aktivasyonunun bir yönü, genellikle 'Ca2 + dalgası' olarak adlandırılan hücre içi kalsiyum konsantrasyonundaki (Ca2 +) bir değişikliktir. Ca2+ dalgasının salınım hızı ve sayısı türler arasında farklılık gösterse de, hücre içi Ca2 + 'daki değişim, embriyonik gelişim için gerekli olayların meydana gelmesinde anahtardır. Bu değişiklikler arasında hücre döngüsünün yeniden başlaması, mRNA regülasyonu, kortikal granül ekzositozu ve hücre iskeletinin yeniden düzenlenmesi yer alır.
Olgun Drosophila yumurtasında, döllenmeden önce dişi yumurta kanalında aktivasyon meydana gelir ve bir dizi Ca2 + 'ya bağlı olayı başlatır. Burada Drosophila'daki Ca2+ dalgasını görüntülemek için bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşım, Ca2+ dalgasının mekanizmasını ve bununla ilişkili aşağı akış değişikliklerini sorgulamak için manipüle edilebilir bir model sistemi sağlar.

Burada ex vivo aktivasyonu için olgun Drosophila yumurta nasıl hazırlanacağını göstermiştir. 2+ dinamikleri yumurta aktivasyonu Ca bir GECI sağlayacak görüntüleme ve embriyonik gelişim başlangıcı (Şekil 1) ifade yumurta. GCaMP bağlı özellikle miristoil grubunun varlığı sonuçları hafif niteliksel farklılıklar 13 14 sahip olabilir, kullanılan not edilmelidir. Ayrıca aktin polimerizasyon inhibitörünün eklenmesiyle yumurta aktivasyonu sırasında fonksiyonel aktin rol göstermiştir, cytochalasin D, aktivasyon tampon (Şekil 2) 14. Yumurta aktivasyonu hücre iskeletinin için bir gereklilik korunur. C. elegans, gübreleme sonrasında iskelet parçaları ilk asimetrik bölünme 21,22 için tek hücreli embriyo hazırlamak için yeniden düzenlenir. cytoskele deniz kestanesi olarak, bozulmaaktivasyon aşağıdaki tal yeniden organizasyon kasılma halka oluşumunu 23 önleyerek hücre döngüsünü etkilediği gösterilmiştir. Ca 2 + dalga ve Drosophila yumurta aktivasyonu onun aşağı fonksiyonunu aracılık aktin rolü tam olarak aydınlatılamamıştır gerekmektedir. Drosophila olarak, Ca2 + ve dalga aktin hücre iskeletinin co-görselleştirme bu ex vivo aktivasyon tahlili kullanılarak elde edilebilir. Birden fazla kanal Zaman serisi elde edilebilir ve hücre içi Ca 2+ dinamikleri oosit (Şekil 3) aktin organizasyonu değişiklikleri ile uyumlu olabilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig1.jpg" /> Şekil 1:. Ex vivo Drosophila Yumurta Aktivasyon Süresi serisinde Tek Ca 2+ Dalga a aşağıdaki UASt- myrGCaMP5 ifade Drosophila yumurta olgunaktivasyon tamponu (AH) ve Ayrıca bu yöntem. Sitoplazmik Ca + 2 artış yaklaşık 1.5 mm / sn arasında bir ortalama hız ile arka kutup (B) ve düzende (BF) de kaynaklanır. dalga başlatılması tipik olarak aktivasyon tamponu ilave 3 dakika içinde görülmektedir. Aktivasyondan sonra, olgun yumurta hücre içi kalsiyum seviyeleri seviyeleri (G, H) etkinleştirme öncesi geri döner. tamamlayıcı filmi 1 (toplam süresi 33 dk) bakınız. Ölçek çubukları 50 mikron =. Maksimum projeksiyon 40 mikron =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig2.jpg" /> Şekil 2: Aktivasyon Tampon bozan Ca Sitokalasin D ilavesi2+ dalga yayılımı. Ex vivo zaman serileri 10 ug / ml sitokalasin D nihai konsantrasyon (AH) ihtiva eden aktivasyon tamponu ilave edildikten sonra UASt- myrGCaMP5 ifade Drosophila yumurta olgunlaşması. Ca 2 + dalga arka kutup (A) başlatılır iken, o tehlikeye ve yumurta (F) anterior bulmuyor (beyaz ok başları dalga ön göstermek). Daha başka Ca 2+ değişiklikleri), 30 dakika boyunca gözlenmiştir. tamamlayıcı filmi 2 (toplam süresi 30 dk) bakınız. Ölçek çubukları 50 mikron =. Maksimum projeksiyon 40 mikron =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54311/54311fig3.jpg" /> Şekil 3: E&#39;de Aktin ve Ca 2+ Co-görselleştirmeex vivo Drosophila. Zaman serisinde gg Aktivasyon UASt- myrGCaMP5 (Mavi) ve UASP -F-Tractin.tdTomato (Eflatun) aktivasyon tamponu aşağıdaki ek (AH) ifade Drosophila yumurta olgun. Ca 2 + dalga arka kutup başlatır ve Şekil olarak kurtarır 1. Aktin, beyaz ok ucu (H vs A) zamanla değişiyor gibi görünüyor. Olgun yumurta merkezinde Ca 2 + sinyal tespiti olmaması görüntü yakalama sırasında numunenin hareketine bağlıdır. Ölçek çubukları 50 mikron =. Maksimum projeksiyon 40 mikron =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Bu makalede, Drosophila yumurta aktivasyonu sırasında 2+ Ca görselleştirmek için uyarlanabilir ex vivo protokolü açıklanır.

Görüntüleme Kalsiyum<em&gt; Drosophila</em&gt; Yumurta Aktifleştirme de

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

Bu prosedürün genel amacı, Drosophila melanogaster'de yumurta aktivasyonu sırasında kalsiyumu görselleştirmektir. Bu yöntem, yumurta aktivasyonu sırasında kalsiyumun kaynağı, dinamiği ve alt akış rolleri gibi gelişimsel biyolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, daha yüksek uzamsal çözünürlüğe izin vermesi, aktivasyon öncesinde olgun yumurtanın fiziksel olarak manipüle edilebilmesi ve döllenme olmaksızın yumurta aktivasyonunun rolünün test edilebilmesidir.Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, olgun yumurtaları hasar vermeden izole etmekte ve aktivasyon tamponunu örneği kaybetmeden olgun yumurtaya uygulamakta zorlanacaklardır. Bu prosedüre başlamak için, diseksiyon mikroskobunun büyütmesini 4X olarak ayarlayın. İlk lamel üzerinde, yumurta odacıklarını delmemeye dikkat ederek, kapalı bir pens ve diseksiyon probu ile oviduktu yırtıp iki ovaryumu birbirinden ayırın.Ardından, kapalı forsepslerin yanına, ovaryumun merkezine standart bir diseksiyon probu yerleştirin. Olgun yumurtaların bulunduğu arka kutba doğru, diseksiyon probunu ovaryum boyunca nazikçe sürükleyin. Olgun yumurtalar ovaryumun dışında, lamel üzerinde görünür hale geldiğinde, merkezde üç ila beş tanesini bir hat üzerinde hizalayın.Ardından, yumurtalık dokusunun geri kalanını, hizalanmış yumurtalardan uzaklaştırarak temizleyin. Daha sonra, tıbbi bir silgiyle tampon yaparak fazla yağı alın. Numuneyi mikroskop altında konumlandırmak için lamel üzerine bir marker ile artı işareti çizin.Bundan sonra, yumurtaların yağ içerisinde çökelmesini sağlamak için hazırlanan yumurta odalarını lameli üzerinde beş ila 10 dakika dinlenmeye bırakın. Hazırlanan lamelleri, oda sıcaklığındaki aktivasyon tamponunu ve cam pipetleri görüntüleme tesisine götürün. Olgun yumurtanın tamamını görüntülemek için uygun bir objektif seçin.Ardından, hazırlanan ilk lameli mikroskop tablasına yerleştirin. Sonra, aktivasyon için olgun bir yumurta odasının görüş alanını seçin. Görüntüleme parametrelerini standart GFP eksitasyon ve emisyonuna göre ayarlayın.Bundan sonra, olgun yumurtayı ve yer değiştirmiş yağı görselleştirmek ve yönlendirmek için parlak alan görüntüsü ayarlayın. Şimdi, olgun yumurtaların göründüğü en düşük Z-düzlemini seçin. Ardından, her adımda 2 µm olacak şekilde 40 µm boyunca tam bir Z-yığını (Z-stack) alınması için ayar yapın.Ardından, görüntüleri 30 dakika boyunca yakalamak için zaman serisini ayarlayın. Bu prosedürde, görüntü yakalamayı başlatın ve aktivasyon öncesindeki olgun yumurtayı göstermek için bir veya iki tam Z-yığını edinin. Daha sonra, cam bir pipete yaklaşık 300 microliter aktivasyon tamponu çekin.Aktivasyon tamponu içeren cam pipetin ucunu lamelin üzerinde 45 derecelik bir açıyla konumlandırın ve pipeti, görüntülenen olgun yumurtanın tam üzerine gelene kadar yavaşça ışın yoluna doğru hareket ettirin. Yağı uzaklaştırmak için beş saniyeden kısa bir sürede bir ila iki damla aktivasyon tamponu ekleyin. Bir ila iki damla aktivasyon tamponu ekleme işlemi doğru açıyla, nazikçe ve hızlı bir şekilde yapılmalıdır.Görüntü alımı sırasında aktivasyon tamponu eklerken, yağın yer değiştirdiğinden emin olmak için parlak alan kanalını kontrol edin. Yağ başarıyla yer değiştirdikten sonra, zaman serisinin tamamlanana kadar çalışmasına izin verin. Edinilen verilerin bir projeksiyonunu oluşturmak için, tüm kesit için bir başlangıç Z-dilimi ve bir bitiş Z-dilimi seçin.Ardından, örneğin maksimum yoğunluk gibi bir projeksiyon tipi seçin. Sonra, seçilen ayarları tüm seriye uygulamak için Tüm zaman çerçeveleri onay kutusunu işaretleyin. Görüntü parlaklığını ve kontrastını ayarlamak için Görüntü'yü, ardından Ayarla'yı ve ardından Parlaklık/Kontrast'ı seçin.Zaman serisini bir film olarak dışa aktarmak için Dosya'yı, ardından Farklı Kaydet'i ve son olarak AVI'yi seçin. Daha sonra, kare hızını belirleyin. Burada, aktivasyon tamponu eklenmesinin ardından genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum indikatörü eksprese eden ex vivo olgun bir Drosophila yumurtasının zaman serisi gösterilmektedir.Sitoplazmik kalsiyum artışı posterior kutupta başlar ve ardından saniyede yaklaşık 1,5 mikrometre ortalama hızla yayılır. Dalganın başlatılması, aktivasyon tamponu ilavesinden sonra genellikle üç dakika içinde gözlemlenir. Aktivasyonu takiben, olgun yumurtanın hücre içi kalsiyum seviyeleri normale döner.Drosophila'da, kalsiyum dalgasının ve aktin hücre iskeletinin eş zamanlı görselleştirilmesi, bu ex vivo aktivasyon deneyi kullanılarak gerçekleştirilebilir. Beyaz ok uçlarıyla belirtildiği üzere, aktinin zamanla değiştiği görülmektedir. Olgun yumurtanın merkezinde kalsiyum sinyalinin tespit edilememesi, görüntü yakalama sırasında örneğin hareket etmesinden kaynaklanmaktadır.Bu tekniğin tamamı, doğru şekilde uygulandığı takdirde, ustalaşıldıktan sonra bir saatten kısa sürede tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, yumurta odacıklarını hareket ettirirken ve görüntüleme parametrelerini ayarlarken acele etmemeniz gerektiğini unutmamak önemlidir. Bu prosedür, yumurta aktivasyonu sırasında floresanla işaretlenmiş diğer proteinlerin, organellerin veya kalsiyum indikatörlerinin görselleştirilmesine uyarlanabilir.Bu, kalsiyum kaynağına ve aşağı akış etkilerine ilişkin soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

imaging-calcium-in-drosophila-at-egg-activation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz yaşam antennal lobda koku uyarılmış kalsiyum yanıtları ölçmek ve analiz etmek için kurulmuş bir tekniği...

Koku-uyarılmış Cevaplarının Kalsiyum Görüntüleme Drosophila Antennal Lob

Bu videoda, GCaMP kullanılarak Drosophila nöronlarında in vivo kalsiyum görüntüleme açıklanmaktadır. Öne çıkan protokol klibi, bir koku alma koşullandırma deneyi sırasında mantar vücut nöronlarından GCaMP floresansındaki değişikliklerin nasıl kaydedileceğini gösterir.

Drosophila In Vivo Kalsiyum Görüntüleme: Nöronal Aktivitenin Fonksiyonel Görüntülenmesi İçin Bir Yöntem

Bu video, genetik olarak kodlanmış floresan raportör proteinleri kullanarak Caenorhabditis elegans gibi davranan bireysel nöronlarda kalsiyum görüntüleme tekniğini göstermektedir. Hücre içi kalsiyum seviyelerini nöronal aktivite ve yumurtlama sırasındaki davranış değişiklikleri ile ilişkilendirmek için solucan hareketinin görüntülenmesinde ve nöronlardan gelen raportör floresan oranlarının ölçülmesinde yer alan adımları ana hatlarıyla belirtir.

Caenorhabditis elegans'ta Yumurtlama Davranışını Düzenleyen Bireysel Nöronlarda Kalsiyum Görüntüleme

Bu videoda, sineklerde sinaptik olarak lokalize kalsiyum sensörleri kullanılarak in vivo kalsiyum görüntüleme yöntemi gösterilmektedir. Sinekleri mikroskopi için hazırlamak, koku alma koşullandırması yapmak ve koku kaynaklı kalsiyum akışını görselleştirmek için adımları ana hatlarıyla belirtir.

In vivo (İn canlı) Drosophila melanogaster'de Sinaptik Lokalize Kalsiyum Sensörleri Kullanılarak Kalsiyum Görüntüleme

Kaynak: Ishimoto, H. et. al., Drosophila'da endokrin sinyalizasyona beyin tepkilerini görselleştirmek için ex vivo kalsiyum görüntüleme. J. Vis. Uzm.  (2018) Bu video, çalışmak için kalsiyum görüntülemeyi göstermektedirDrosophila nöropeptitlere beyin tepkileri. Floresan kalsiyum indikatörünü eksprese eden nöronlar, hücre içi kalsiyum dinamiklerini ve sinyal moleküllerine fonksiyonel tepkileri ortaya çıkarır.

Drosophila Beyninin Nöropeptitlere Tepkilerini İncelemek için Ex Vivo Kalsiyum Görüntüleme

Bu kağıt için ex vivo kalsiyum düşsel Drosophila beyin protokolünü açıklar. Bu yöntemde, doğal veya sentetik bileşikler beyindeki belli nöronlar etkinleştirmek için yeteneklerini test için tampon uygulanabilir.

Ex Vivo Endokrin Drosophila içinde sinyal beyin yanıt-e doğru görüntülenmesi için kalsiyum görüntüleme

Burada drosophila öğrenme ve bellek bağlamında pre-ve/ veya postsinaptik kalsiyum görselleştirilebilen bir protokol sayılmaktadır. Sinapti lokalize kalsiyum sensörleri kullanılarak yapılan in vivo kalsiyum görüntüleme, bu tür bir assosiyatif öğrenmenin altında yatan sinaptik plastisitenin belirlenebileceği klasik koku alma koşullandırma paradigması ile birleştirilir.

Drosophila melanogaster Öğrenme Kaynaklı Sinaptik Plastisite Vivo Optik Kalsiyum Görüntüleme

Burada, Drosophila embriyo proteini ve RNA'nın toplanmasından ön gömülmesine ve gömülmesine, immünoboyamaya ve mRNA in situ hibridizasyonuna kadar tespiti ve lokalizasyonu için bir protokol tarif ediyoruz.

Erken Drosophila Embriyosunda İmmünohistokimya ve RNA In-situ Dağılımı için Bir Protokol

Burada, epileptiform aktiviteleri izlemek için GCaMP6 eksprese eden yetişkin Drosophila'da ex vivo kalsiyum görüntüleme için bir protokol sunuyoruz. Protokol, ex vivo kalsiyum görüntüleme yoluyla yetişkin Drosophila'daki iktal olayları araştırmak için değerli bir araç sağlar ve hücresel seviyelerde epilepsinin potansiyel mekanizmalarının araştırılmasına olanak tanır.

Ex Vivo (Canlı Canlı) Drosophila Epilepsi Modeli için Kalsiyum Görüntüleme

Burada, model nematod C. elegans'ın germ hattında eksprese edilen genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum raportörü kullanarak döllenme ve erken embriyogenez sırasında kalsiyumu görselleştirmek için protokoller ve araçlar sunuyoruz.

C. elegans'ta Döllenme ve Erken Gelişim Sırasında Kalsiyum Geçişlerinin İn Vivo Olarak Görüntülenmesi

İmmobilizasyon için topikal bir doku yapıştırıcısı kullanarak bir Drosophila larva koku alma nöronu için kalsiyum görüntüleme protokolleri sunuyoruz. Bu yöntem stabiliteyi artırarak güvenilir in-vivo ve ex-vivo deneyleri kolaylaştırır. Özel R komut dosyaları kalsiyum sinyallerini analiz ederek ayrıntılı nörofizyolojik araştırmalar için etkili bir platform sağlar.

Üçüncü Dönem Drosophila melanogaster Larvasında Bir Koku Alma Devresi Nöronunun İn-vivo ve Ex-vivo Kalsiyum Görüntülemesi

Öğrenin Drosophila melanogaster yumurta aktivasyonunda kalsiyum dinamiklerini görüntüleme yöntemini. Bu teknik gelişimsel biyolojide yüksek çözünürlüklü kalsiyum dalgalarını incelemek için kullanılır.

Görüntüleme Kalsiyum

Daha fazla video keşfet