Name: Kanser hücre istilası ve Uydu Tümör oluşumu keşfedin Kültür Testi Üç Boyutlu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Keşfedin kanser hücre istilasını ve uydu tümör oluşumunu 3D kültür sistemi kullanarak. Bu yöntem, kollajen ve fibrin jel içinde hücreleri gömerek tümör biyolojisi araştırmalarında invazyon davranışlarını incelemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prostat Kanseri Kanada (SG ve CJD'ye # D2014-4 hibesi) ve Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (SG'ye # MOP-111069 hibe) tarafından finanse edilen çalışma. Editoryal yardım için Dr. Richard Poulin'e ve teknik yardım için Bayan Chanel Dupont'a teşekkür ederiz.

NOT: insan ve hayvan kanser hücreleri satın alınabilir veya lütfen bize sağlanan beri yok etik dikkate. Yapma 1. Kollajen Fiş (Sözde birincil Tümör) <ol><li> Bir kollajen dağılımını hazırlayın. Daha önce 17 ya da satın bildirdiği gibi ben de ayıklanır ve sterilize edilebilir sıçan kuyruğu tendonları (RTT) den kollajen yazın. (Beşi 2 dakika çalışır yüksek hız) üniform bir karışımı için dondurularak kurutulmuştur RTT kollajen (0.02 N, asetik asit içinde 3.25-3.50 mg / ml), bir karıştırıcı kullanılarak dağıtılır. </li><li> Hasat (tripsin-EDTA, genellikle) ve hemasitometre kullanarak canlı hücreleri saymak için tripan mavisi dışlama kullanın. İstenilen hücre yoğunluğu (fiş başına 5 x 10 4 hücreler) ayarlayın. </li><li> Steril koşullar altında tüm çözümler (NaOH, fetal sığır serumu, DMEM 5x, NaHCO3) Bileşen (Tablo 1) Hazırlama ve buz üzerinde soğutulmuş tutun. Not: çeşitli çözümler eklenme sırası hücreleri ozmotik veya asidik şokları önlemek için önemlidir. </li><li> Olabildiğince hızlı bir şekilde son kolajen çözeltisi (5 mi) içine hücre dispersiyonu (1.25 x 10 6 hücre) uygulayın. Hava kabarcıklarını önlemek ve daha sonra hızlı bir şekilde 96 oyuklu plakanın her bir hazır kullanımlı çözeltisi 200 ul dağıtma ise (aşağı yukarı pipetleme) tarafından iyice karıştırın. Yavaşça hava kabarcıklarını çıkarmak için hücre kültürü kaput çalışma alanı yüzeyinde çoklu plaka grev ve kuyuların içinde eşit çözüm yaymak için. </li><li> Tüm oyuklara doldurduktan sonra inkübatör içine saklamak, (bu adım 96 oyuklu plaka başına yaklaşık 15-20 dakika sürer). </li><li> gece boyunca 2 saat 37 ° C&#39;de inkübe plakası. Kollajen jelasyon (yani, fibrillogenesis), 30 dakika içinde meydana gelir. Bir gecelik inkübasyondan gerçekleştirmek için kültür kültür ortamı (100 uL / ​​oyuk) ilave edin. </li></ol> Fibrin Gel 2. İlk Katman <ol><li> Fibrinojen solüsyonu hazırlanması. Not: fibrin jel aynı parti, ideal daha tekrarlanabilir Resul için kullanılmalıdırts, fibrin jel oluşumu, ticari dondurularak kurutulmuş fibrinojen farklı yükleri arasında değişebilir. <ol><li> Her zaman taze hazırlanmış fibrinojen çözümü kullanın. Hidrat kristal oluşumunu önlemek için, şişeyi açarken, oda sıcaklığına kadar dondurularak kurutuldu fibrinojen getirin. </li><li> Kademeli önceden ısıtılmış (37 ° C), Ca2 + ile Hank&#39;in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) / 3 mg / ml çalışma konsantrasyonunda Mg2 + (en az son hacminin% 15 fazlalık hazırlanması düşünülebilir gerekli fibrinojeni çözülür : örneğin, 5 ml çözelti için 5.75 ml 17.25 mg) verdi. <ol><li> fibrinojen parçaları çözmek için ilk başta önceden ısıtılmış HBSS damla damla ekleyin. beher bir spatula ile büyük parçaları yıkmak. zaman ve karıştırma işleminin kolaylaştırılması için zaman beher çalkalayın. İşlem sırasında bir karıştırıcı plaka kullanmayın. yukarı ve aşağı süspansiyon pipetleme kalan tozu eritin. </li></ol></li><li> Steri ise ılık fibrinojen çözüm tutun0.22 um&#39;lik bir filtreden geçirilerek çözelti lizing. Not: HBSS yeterince sıcak değil veya fibrinojen tamamen çözülmüş değilse, çözüm filtreyi tıkayabilir. Varsa, fibrinojen konsantrasyonunu azaltmak ve böylece fibrin pıhtı sertliği olabilir, bir veya iki kez filtreyi değiştirin. </li><li> Bir alternatif prosedür olarak, son hacmi ayarlarken hazır kullanım fibrinojen çözeltisi içine ilgi hücreleri (örneğin, endotel hücreleri) süspanse edin. </li></ol></li><li> Trombin Çözümleri hazırlanması. <ol><li> GKD 2 O (50 NIH birim / mi) içinde bir stok çözelti hazırlayın, daha sonra bir 0.22 mikron filtre kullanılarak sterilize edin. </li><li> bir fibrinojen / trombin oranı ≥1 kullanın: 0.0075 (h / h), fibrin jel oluşturmak için. </li></ol></li><li> Fibrin Jel oluşturuluyor. <ol><li> Steril fibrinojen tutmak ve tüm sonraki adımlar boyunca buz üzerinde stok solüsyonları trombin. fibrin jel 24 oyuklu plakalar içinde oluşturmak üzere izin verilir. </li><li> Derhal bindirme inciHer bir E yüzeyi de hava kabarcığı oluşumunu engelleyerek fibrinojen solüsyonu (200 ul / oyuk). Bir seferde 6 kuyu işleyin. </li><li> fibrinojen çözüm tamamen kuyu yüzeyini kaplayan sonra, bir 45 ° açıyla plaka yatırmak ve iyi merkezi haline trombini bırakarak ilk kuyuya trombin çözeltisi 1.5 ul ekleyin ve sonra yavaşça için yatay plaka girdap 1-2 sn. <ol><li> Laminer akış kaputu (5-10 dk) jelleşme / pıhtılaşma işlemi tamamlanıncaya kadar altında stabil pozisyonda plaka bırakın (Not: polimerizasyon işlemi inkübatör plaka taşıyarak, örneğin, rahatsız edilmemelidir). </li></ol></li><li> İlk altı kuyu polimerize sonra tüm kuyular işlendikten kadar, önümüzdeki altı kuyuları için aynı diziyi (yani 3 Önceki adımlar) tekrarlayın. </li></ol></li></ol> Fibrin Gel ve sandviç Kollajen Plug 3. İkinci Kat <ol><li> seçenekA: (hemen Kollajen Tak Kullanarak). <ol><li> fibrin jel ilk kat ince plaka eğerek bütün kuyularda polimerize emin olun. kolajen fişleri transferini kolaylaştırmak için (fibrin jeller ihtiva eden), 24 oyuklu bir plaka ile yan kollajen jel fişler yan ihtiva eden 96 oyuklu plaka koyun. </li><li> kolajen fişleri ihtiva eden plakanın her oyuğuna HBSS bir damla ekleyin. </li><li> İnce (bir kolu olarak kullanılır) bir şırınga üzerine monte iğne veya (video) bir mikro-kaşık kullanarak iyi her kollajen fişini çıkartın. kollajen fiş de kuyuya merkezli ve kısırlık bakımlı olduğundan emin yaparken, bir veya iki mikro-kaşık kullanarak ilk fibrin jel tabakası üzerine her kollajen fiş aktarın. </li><li> fibrinojen çözeltisi, ikinci tabaka ile daha önce oluşan fibrin jel Yerleşimi (300 ul / oyuk) ve 2.3 de tarif edildiği gibi en az 1 tutarak, trombin tanıtmak. seferinde 0.0075 oranı altı kuyu bir sekans &lt;/ Li&gt; </ol></li><li> (Büyüme Faktörü-azaltılmış Bodrum Membran (GFRBM) ince bir tabaka ile Kollajen Tak Kaplama) Seçenek B. <ol><li> Serin, tüm Hazırlanan çözümler ve aletleri önceden ve GFRBM donmuş alikotları beri işlenmesi sırasında (örneğin, pipet, ipuçları, test tüpleri), 4 ° C&#39;de veya buz üzerinde saklayın (üreticinin talimatlarına uyun) çözülme sırasında aşırı ısınma oranına çok duyarlı . </li><li> plaka oyuklarından ayrılmasından sonra, saf GRFBM çözeltisi 100 ul buz ihtiva eden bir 1.5-ml santrifüj tüpü içinde 2 dakika boyunca her kollajen fiş ıslatın. </li><li> Daha önce açıklandığı gibi sağlanması, iyi merkezli iken ilk fibrin tabakası üzerine her kaplanmış fişi aktarın. 5 dakika GRFBM bir jel oluşturmak için izin vermek için 37 ° C&#39;de eklenti ihtiva inkübe edin. Adım 3.1.4 olarak ikinci fibrin katmanı ekleyin. </li></ol></li></ol> 4. Hücre Kültürü Ortamı koşullar <ol><li> (Kültür ortamı ile de 4 her dolum00 ul). Kültür ortamları ve takviyeleri hücre çizgisi ve deneysel koşullara bağlı olarak seçilir. </li><li> 100 kallikrein önleyici birim (KIU) / ml&#39;lik bir son konsantrasyonda kültür ortamına aprotinin bir antifibrinolitik ekleyin. NOT: test edilen hücre hattı için kullanılan şartlar altında, bir hücre kültürü inkübatöründe plakaları saklayın. </li><li> Her gün taze ortam ile kültürler doldurun veya deneysel şemasına göre ve aprotinin ekleyin. Taze orta eklemeden önce biraz (30-35 ° açıyla) plaka yatırın ve dikkatle sürekli gözlem altında klimalı ortam aspirasyon sırasında kuyunun kenarına pipet eğin. </li></ol>

<ol><li>Alizadeh, A. M., Shiri, S., Farsinejad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis+review%3A+from+bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Tumour+Biol%22%5BJournal%5D)">Metastasis review: from bench to bedside.</a> Tumour Biol. 35 (9), 8483-8523 (2014).</li>
<li>Roudsari, L. C., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+influence+of+angiogenesis+in+in+vitro+cancer+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Studying the influence of angiogenesis in in vitro cancer model systems.</a> Adv Drug Deliv Rev. , (2016).</li>
<li>Bill, R., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relevance+of+EMT+in+breast+cancer+metastasis%3A+Correlation+or+causality%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The relevance of EMT in breast cancer metastasis: Correlation or causality.</a> FEBS Lett. 589 (14), 1577-1587 (2015).</li>
<li>Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Three-Dimensional+%283D%29+Models+in+Cancer+Research%3A+an+Update%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">In Vitro Three-Dimensional (3D) Models in Cancer Research: an Update.</a> Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).</li>
<li>Obenauf, A. C., Massagué, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surviving+at+a+Distance+Organ-Specific+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cancer%22%5BJournal%5D)">Surviving at a Distance Organ-Specific Metastasis.</a> Trends Cancer. 1 (1), 76-91 (2015).</li>
<li>Sykes, J. A. Separation of Tumor Cells from Fibroblasts. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSykes%2C+JA+%22Human+Tumor+Cells+In+Vitro%22">Human Tumor Cells In Vitro</a>. Fogh, J. 1, Chapter 1 1-22 (1975).</li>
<li>Lang, S. H., Stark, M., Collins, A., Paul, A. B., Stower, M. J., Maitland, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+Prostate+Epithelial+Morphogenesis+in+Response+to+Stroma+and+Three-Dimensional+Matrigel+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Experimental Prostate Epithelial Morphogenesis in Response to Stroma and Three-Dimensional Matrigel Culture.</a> Cell Growth Differ. 12 (12), 631-640 (2001).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+Oncogenesis+of+MCF-10A+Mammary+Epithelial+Acini+Grown+In+Three-Dimensional+Basement+Membrane+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and Oncogenesis of MCF-10A Mammary Epithelial Acini Grown In Three-Dimensional Basement Membrane Cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li>
<li>Shaw, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor cell invasion assays.</a> Methods Mol. Biol. 294, 97-105 (2005).</li>
<li>Nelson, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Dynamic+Reciprocity%3A+Engineering+Three-Dimensional+Culture+Models+of+Breast+Architecture%2C+Function%2C+and+Neoplastic+Transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Modeling Dynamic Reciprocity: Engineering Three-Dimensional Culture Models of Breast Architecture, Function, and Neoplastic Transformation.</a> Semin Cancer Biol. 15 (5), 342-352 (2005).</li>
<li>Hedlund, T. E., Duke, R. C., Miller, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Spheroid+Cultures+of+Human+Prostate+Cancer+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Spheroid Cultures of Human Prostate Cancer Cell Lines.</a> Prostate. 41 (3), 154-165 (1999).</li>
<li>Le, V. M., Lang, M. D., Shi, W. B., Liu, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Collagen-Based+Multicellular+Tumor+Spheroid+Model+for+Evaluation+of+the+Efficiency+of+Nanoparticle+Drug+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Artif.+Cells+Nanomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A Collagen-Based Multicellular Tumor Spheroid Model for Evaluation of the Efficiency of Nanoparticle Drug Delivery.</a> Artif. Cells Nanomed Biotechnol. 15, 1-5 (2014).</li>
<li>Neto, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Hanging+Spherical+Drop+System+for+the+Generation+of+Cellular+Spheroids+and+High+Throughput+Combinatorial+Drug+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">A Novel Hanging Spherical Drop System for the Generation of Cellular Spheroids and High Throughput Combinatorial Drug Screening.</a> Biomater Sci. 3 (4), 581-585 (2015).</li>
<li>Janvier, R., Sourla, A., Koutsilieris, M., Doillon, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+Fibroblasts+are+Required+for+PC-3+Human+Prostate+Cancer+Cells+to+Produce+Capillary-like+Formation+of+Endothelial+Cells+in+a+Three-dimensional+Co-culture+System%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Stromal Fibroblasts are Required for PC-3 Human Prostate Cancer Cells to Produce Capillary-like Formation of Endothelial Cells in a Three-dimensional Co-culture System.</a> Anticancer Res. 17 (3A), 1551-1557 (1997).</li>
<li>Doillon, C. J., Gagnon, E., Paradis, R., Koutsilieris, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+Culture+System+as+a+Model+for+Studying+Cancer+Cell+Invasion+Capacity+and+Anticancer+Drug+Sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional Culture System as a Model for Studying Cancer Cell Invasion Capacity and Anticancer Drug Sensitivity.</a> Anticancer Res. 24 (4), 2169-2177 (2004).</li>
<li>Gobeil, S., Zhu, X., Doillon, C. J., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genome-Wide+shRNA+Screen+Identifies+GAS1+as+a+Novel+Melanoma+Metastasis+Suppressor+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A Genome-Wide shRNA Screen Identifies GAS1 as a Novel Melanoma Metastasis Suppressor Gene.</a> Genes Dev. 22 (21), 2932-2940 (2008).</li>
<li>Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+Of+Ready-To-Use%2C+Storable+And+Reconstituted+Type+I+Collagen+From+Rat+Tail+Tendon+For+Tissue+Engineering+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation Of Ready-To-Use, Storable And Reconstituted Type I Collagen From Rat Tail Tendon For Tissue Engineering Applications.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2007).</li>
<li>Horie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Human+Lung+Cancer-associated+Fibroblasts+in+Three-dimensional+In+Vitro+Co-culture+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Characterization of Human Lung Cancer-associated Fibroblasts in Three-dimensional In Vitro Co-culture Model.</a> Biochem Biophys Res Commun. 423 (1), 158-163 (2012).</li>
<li>Banyard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Genes+Regulating+Migration+and+Invasion+Using+a+New+Model+of+Metastatic+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Identification of Genes Regulating Migration and Invasion Using a New Model of Metastatic Prostate Cancer.</a> BMC Cancer. 30 (14), 387(2014).</li>
<li>Palumbo, J. S., Degen, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinogen+and+Tumor+Cell+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Fibrinogen and Tumor Cell Metastasis.</a> Haemostasis. 31, Suppl. 1 11-15 (2001).</li>
<li>Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Stroma%2C+Tumor+Blood+Vessels%2C+and+Antiangiogenesis+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+J%22%5BJournal%5D)">Tumor Stroma, Tumor Blood Vessels, and Antiangiogenesis Therapy.</a> Cancer J. 21 (4), 237-243 (2015).</li>
<li>Luoto, K. R., Kumareswaran, R., Bristow, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Hypoxia+as+a+Driving+Force+in+Genetic+Instability%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Integr%22%5BJournal%5D)">Tumor Hypoxia as a Driving Force in Genetic Instability.</a> Genome Integr. 4 (1), 5(2013).</li>
<li>Das, V., Bruzzese, F., Konečný, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajdúch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiologically+Relevant+In+Vitro+Tumor+Models+for+Drug+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Pathophysiologically Relevant In Vitro Tumor Models for Drug Screening.</a> Drug Discov Today. 20 (7), 848-855 (2015).</li>
<li>Longati, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Pancreatic+Carcinoma+Spheroids+Induce+a+Matrix-rich%2C+Chemoresistant+Phenotype+Offering+a+Better+Model+for+Drug+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">3D Pancreatic Carcinoma Spheroids Induce a Matrix-rich, Chemoresistant Phenotype Offering a Better Model for Drug Testing.</a> BMC Cancer. 13 (95), (2013).</li>
<li>Tan, P. H., Chia, S. S., Toh, S. L., Goh, J. C., Nathanm, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+Spatial+Configuration+of+Tumour+Cells+Confers+Resistance+to+Chemotherapy+Independent+of+Drug+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional Spatial Configuration of Tumour Cells Confers Resistance to Chemotherapy Independent of Drug Delivery.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2013).</li>
<li>Koutsilieris, M., Reyes-Moreno, C., Choki, I., Sourla, A., Doillon, C., Pavlidis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+Cytotoxicity+of+Human+MCF-7+and+MDA-MB+231+Breast+Cancer+Cells+is+Altered+by+Osteoblast-Derived+Growth+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy Cytotoxicity of Human MCF-7 and MDA-MB 231 Breast Cancer Cells is Altered by Osteoblast-Derived Growth Factors.</a> Mol Med. 5 (2), 86-97 (1999).</li>
<li>Lang, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biphasic+Response+of+Cell+Invasion+to+Matrix+Stiffness+in+Three-Dimensional+Biopolymer+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Biphasic Response of Cell Invasion to Matrix Stiffness in Three-Dimensional Biopolymer Networks.</a> Acta Biomater. 13, 61-67 (2015).</li>
</ol>

Yazarların herhangi bir açıklaması yoktur.

önemli bir teknik dipnot olarak, bir boşluk, merkezi ve periferik jeller arasındaki ara yüzeyde mevcut olması gereklidir. Aksi takdirde, / göç fibrin jel işgal hücrelerin kapasitesini azaltabilir. Trombin uygun seyreltilmiş edilmemiş ise, kollajen ve fibrin jel arasındaki boşluk kültür ilk 24 saat içinde meydana gelebilir. Kollajen jel neden olabilir test edilen hücre hattı, böylece, her iki jeller arasındaki oluşturmak için göreceli olarak büyük bir alan neden kültür sırasında sözleşme olması da mümkündür. Stromal hücr...

Kanser hücre işgali / göç ve sonraki metastaz kurulması temel ve biyomedikal özelliklerini inceleyen yoğun araştırma 1,2 konusudur. Metastaz kanser nihai aşamasıdır ve klinik yönetim belirsizliğini koruyor. Hücresel ve moleküler düzeyde metastaz daha iyi anlaşılması daha etkin tedavilerin 3 gelişmesini sağlayacaktır. Metastatik hücrelerin çeşitli özellikleri kendi stemness ve göç içinde ve primer tümörün 5&#39;ten işgal etmeye bir geçiş durumu (örneğin, epiteloid-mezenkimal geçiş) elde etmek için potansiyeli de dahil olmak üzere in vitro 4 keşfedilebilir. Neredeyse kan / lenfatik dolaşımı katkısını hariç çünkü Ancak, işgali / metastaz süreçlerinde in vitro değerlendirilmesi bir meydan okuma olmuştur. kollajen jel tümör fragmanları gömmek organotipik kültürlerinin Previou bilgisisinsi kanser saldırganlık izlemek için kullanılmaktadır. Tümörlerin karmaşıklığı korunmuş olsa da (örneğin, kanserli olmayan hücrelerin varlığı), tümör fragmanları örnekleme varyasyonuna, sınırlı orta difüzyon maruz ve stromal hücrelerinin 6 aşırı büyümesi için vardır. Alternatif bir yöntem, üç boyutlu (3D) hücre ortamı taklit eden hücre dışı matris (ECM) bileşenleri içinde mevcut kanser hücrelerinin büyüyen oluşur. kollajen jel ve / veya bir bazal membran türetilen matriks içinde meme kanseri hücre çizgilerinin proliferasyonu 3D hücre kültürünün en iyi karakterize örnekleri arasındadır. Belirli bir 3D hücre kültür ortamları kullanılarak standart koşullar altında yetiştirilen göğüs kanseri hücreleri için gözlemlenen dağınık düzeneği meme asinüs ve boru şeklindeki yapılar 7-10 kendiliğinden oluşumuna ters çevrilebilir. Ayrıca, adenokarsinom kanser hücrelerinden türetilen çok-hücreli tümör parçacıklarının oluşumunun (başka teknikler kullanılarak toplanmışÖrneğin, şu anda en yaygın olarak kullanılan 3D hücre kültürü tahlil 11-13 oluşturmaktadır) gömme ağar, sferoidler yüzen, damla asılı. Bununla birlikte, bu deney, parçacıklarının oluşturabilen kanseri hücre çizgilerinin sınırlı dizi ve bu koşullarda hücrelerin çalışma süresinin kısalığı ile sınırlıdır. Bu görsel teknik olarak, bu tarifnamede ilgi kanser hücrelerinin alternatif olarak bir bazal membran türetilmiş matris ile kaplanabilir sözde primer tümörün in vitro oluşumunu sağlamak için, bir kollajen jel gömülü gelişmiş bir 3D hücre kültürü analizinde getirmektedir. Oluştuktan sonra, psödo-primer tümör sonra kanser hücrelerinin, iki matris bölme arasında bir arayüz çapraz sağlayan bir hücresel olmayan matris (mevcut durumda fibrin jel) içinde sandviç (Şekil 1 e bakınız). İlginç bir şekilde, agresif kanser hücreleri ile sözde primer tümörden kaynaklanan sekonder tümör benzeri yapılar görünürfibrin jel. Bu 3 boyutlu bir kültür sistemi, örneğin, anti-kanser ilaçları, gen ifadesi ve hücre-hücre ve / veya hücre-ECM etkileşimleri 14-16 için araştırmak için gerekli esnekliği sunmaktadır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54322/54322fig1.jpg" /> Şekil 1:.. Yöntem bakış kanser çalışmaları için bir model olarak 3D hücre kültür sistemi oluşturmak için yöntemin şematik özeti <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54322/54322fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<table><tbody><tr><td>Dondurularak kurutulmuş kollajen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7661</td>, <td>sıçan kuyruğu tendonundan (çözünür dispersiyon) veya ev yapımı (bkz. Rajan et al., ref. #14)</td></tr><tr><td>Fibrinojen (dondurularak kurutulmuş)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>F8630</td><td>Tip I-S, &ge ile %65 - 85 protein; proteinin %75'i pıhtılaşabilir</td></tr><tr><td>Trombin</td><td>EMD Kimyasallar A.Ş.</td><td>605157</td><td>&nbsp; Gibbstown, New Jersey; NIH birimleri/mg kuru ağırlık&nbsp;</td></tr><tr><td>Büyüme faktörü azaltılmış Matrigel&nbsp;</td><td>Corning</td><td>356234</td><td>Daha önce BD Biosciences</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6279&nbsp;</td><td>&nbsp; 5 - 10T IU / ml'de çözelti (Tripsin İnhibitör Birimi) &nbsp;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Mikro kaşıklar</td><td>Fisher Scientific</td><td>2140115</td><td>Fisherbrand Handi-Hold Microspatula</td></tr><tr><td>96 oyuklu plaka, yuvarlak taban</td><td>Sarstedt</td><td>3925500</td><td></td></tr><tr><td>24 kuyulu plaka</td><td>Sarstedt</td><td>3922</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's Medium</td><td>Sigma Chemical, Co.</td><td>D5546</td><td>DMEM</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>VWR</td><td>CAA15-701</td><td>FBS, Kanada menşeli.</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Sigma Kimya, Co.</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Çile' s Dengeli Tuz Çözeltisi&nbsp;</td><td>Sigma Kimya A.Ş.</td><td>H8264</td><td>HBSS</td></tr></tbody></table> Serisi

kanser hücre istilası ve uydu tümör oluşumu keşfedin kültür testi Üç boyutlu

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

mono tabakaları memeli hücre kültürü çok çeşitli fizyolojik ve moleküler süreçleri incelemek için kullanılır. Ancak, artan hücrelerin incelemek için bu yaklaşım, genellikle istenmeyen eserler üretir. Bu nedenle, genellikle hücre-dışı matris bileşenlerini kullanarak üç boyutlu (3D) bir ortamda, hücre kültürü, in vivo bağlı doku veya organ nativ yakından benzerlik için ilginç bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır. Bir fibrin jel yapılmış bir sözde primer macrospherical tümör ve (ii) bir çevresel hücresiz bölme bir kollajen jel hareket gömülü kanser hücrelerini ihtiva eden bir merkez bölme iki bölme, yani: (i) ile 3 boyutlu bir hücre kültür sistemi geliştirmiştir örneğin, merkezi kullanılandan farklı bir hücre dışı matris bileşeni, burada kanser hücrelerinin göç (yayılma ön) ve / veya ikincil veya uydu tümörler temsil mikroküresel tümörler oluşturabilir. periferal bölme uydu tümör oluşumuoldukça bu 3D kültür sistemi benzersiz kılan doğal tümör hücrelerinin bilinen saldırganlık veya metastatik kökenli korelasyon. Bu hücre kültürü Kanserin hücre istilası ve motilite, hücre-hücre üstü matris etkileşimlerini ve anti-kanser ilaç özelliklerini değerlendirmek için bir yöntem olarak değerlendirilmesi için kabul edilebilir.

Daha önce de belirtildiği gibi, bu 3D hücre kültürü deneyinde ilginç bir özelliği, kanser hücreleri sadece bitişik fibrin jel kolajen fiş göç değil, aynı zamanda, ikincil tümörlerin (örneğin, uydu, tümör benzeri yapılar) tesis olup olmasıdır. Bu, doğrudan doğruya, özellikle uzun bir çalışma mesafesi kondansatör (Şekil 2) ile birlikte, jel kalınlığı boyunca düşük ve yüksek büyütmelerde bir ters faz kontrast mikroskop ile gözlenebilir. Farklı deney düzenekleri <su...

Kanser hücreleri bir kollajen jele gömülür ve daha sonra uydu tümörlerinin invazivliği ve oluşumunun izlenebileceği bir 3D kültür sistemi oluşturmak için bir aselüler fibrin jeli içine sıkıştırılır.

Kanser hücre istilası ve Uydu Tümör oluşumu keşfedin Kültür Testi Üç Boyutlu

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Bu prosedürün genel amacı, uydu tümör istilasını ve oluşumunu izlemek için bir 3D kültür sistemi oluşturmak amacıyla, kolajen gömülü kanser hücrelerini bir fibrin jeli arasına yerleştirmektir. 3D görüntüleme sistemimiz, kanser hücresi apoptozu veya migrasyonu sırasında çeşitli hücrelerin ve birçok temel varyantın araştırılması veya anti-kanser hücre kaybının etkinliğinin değerlendirilmesi için yeni yollar sunabilir. Bu 3D hücre kültürü modelinin çekici bir özelliği, hücre dışı matris konsantrasyonunu değiştirme veya 3D sistemin kurulumu için başka bir hücre dışı matris kullanma yeteneğidir.Prosedürü Marie-France Cote, laboratuvarımın araştırma asistanı ve gözetimim altındaki lisansüstü öğrencisi Audrey Turcotte uygulamalı olarak gösterecekler. Kolajeni tekdüze şekilde dağıtmak için, dondurularak kurutulmuş sıçan kuyruk tendonu tip 1 kolajenini yüksek hız ayarında beş kez iki dakika boyunca karıştırarak başlayın.Kolajen dahil edilirken, ilgili tümör hücrelerini uygun enzimle ayırma çözeltisi kullanarak hasat edin. Ardından, sayım için Trypan blue dışlama yöntemini uygulayın. Ayrıştırılan hücreleri DMEM içerisinde tıkaç başına 50, 000 hücre konsantrasyonuna seyreltin.Kolajen hazır olduğunda, hücreleri homojen bir şekilde dağıtmak için pipetleme yöntemiyle kolajen çözeltisine hızlıca 1.250.000 hücre ekleyin. Tek hücre süspansiyonunun 200 mikrolitresini derhal 96 kuyucuklu bir plakadaki her bir kuyucuğa paylaştırın. Hava kabarcıklarını gidermek ve çözeltiyi kuyucuklar içinde eşit şekilde dağıtmak için her eklemeden sonra plakayı çalışma alanı yüzeyine hafifçe vurun.Tüm hücreler eklendiğinde, plakayı en az iki saat boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin; hücreler gece boyunca kültüre edilecekse, ilk iki saatin ardından her kuyuya 100 µL kültür medyumu ekleyin. İlk fibrin jel tabakasını hazırlamak için, hidrat kristali oluşumunu önlemek amacıyla şişeyi açmadan önce dondurularak kurutulmuş fibrinojeni oda sıcaklığına getirin. Ardından fibrinojeni bir cam behere aktarın ve fibrinojen fragmanlarını çözmek için tozun üzerine damla damla 37 °C HBSS ekleyin.Ardından, karışımı kolaylaştırmak için beherle zaman zaman uygun şekilde çalkalayarak, daha büyük protein parçalarını bir spatula yardımıyla parçalayın. Kalan proteini çözmek için süspansiyonu birkaç kez pipetleyin ve çözeltiyi 22 mikronluk bir filtreden geçirerek sterilize edin. Ardından, hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek, 24 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğunun yüzeyini hemen 200 mikrolitre fibrinogen ile kaplayın.Tüm kuyucuklar tamamen kaplandıktan sonra, plakayı 45 derecelik bir açıyla eğin, ardından bir kuyucuğun merkezine 1,5 µL trombin çözeltisi damlatın ve plakayı yatay olarak bir ila iki saniye boyunca nazikçe çalkalayın. Beş kuyucuğu daha aynı şekilde trombin ile işledikten sonra, çözeltiler jelleşene kadar plakayı bir laminar akış kabininde beş ila 10 dakika boyunca sabit yatay konumda bekletin. Kollajen tıkanın hemen yerleştirilmesi için, fibrin jellerinin tamamen polimerize olduğunu doğrulamak amacıyla plakayı dikkatlice eğin.Ardından, kollajen jel tıkaçlarının bulunduğu 96 kuyucuklu plakayı 24 kuyucuklu fibrin jel plakasının yanına yerleştirin ve her bir kollajen tıkaç kuyucuğuna bir damla HBSS ekleyin. Daha sonra, bir mikro kaşık kullanarak, her bir kollajen tıkacı 24 kuyucuklu plaktaki ilk fibrin jel katmanlarının merkezine transfer edin. Tüm tıkaçlar transfer edildiğinde, her bir kuyucuğa 300 microliters fibrinojen çözeltisi ve ardından az önce gösterildiği gibi 2.25 microliters trombin ekleyin.Kolajen tıpaları yerleştirmeden önce ince bir büyüme faktörü azaltılmış bazal membran tabakası ile kaplamak için, her bir tıpayı buz üzerinde, 100 µL saf büyüme faktörü azaltılmış bazal membran içeren 1,5 ml'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. İki dakika boyunca beklettikten sonra, kaplanmış tek bir kolajen tıpayı her bir fibrin tabakasının merkezine aktarın ve büyüme faktörü azaltılmış bazal membranın katılaşması için tıpaları 37 °C'de beş dakika inkübe edin. Ardından, az önce gösterildiği gibi ikinci fibrin tabakasını ekleyin.Jeller tamamen polimerize olduğunda, her bir kuyucuğu uygun kültür ortamı ve takviyeleriyle 400 µL doldurun. Ardından, kuyucuklara bir antifibrinolitik ajan ekleyin. Ve 3D kültürleri, test edilen tümör hücre hattı için uygun koşullar altında inkübe edin.Uygun hücre besleme günlerinde, plakayı 30 ila 35 derecelik bir açıyla eğik tutun ve jelleri bozmadan ortamı aspire etmek için bir pipeti her kuyucuğun duvarına yaslayın. Ardından, her jel kültürüne 400 µL taze hücre kültür ortamı ve Antifibrinolitik ajan ekleyin. Bu 3D hücre kültürü testi, ikincil tümörlerin oluşumu için kanser hücrelerinin kollajen tıkaçtan komşu fibrin jele göçünün doğrudan görselleştirilmesine olanak tanıyarak, bilinen metastatik hücrelerin davranışlarının, metastaz yapmayan veya zayıf metastatik hücrelerin davranışlarıyla karşılaştırılmasını sağlar.Örneğin, bu deneyde, metastatik B16 F10 hücre hattını içeren fibrin jel boyunca rastgele dağılmış çok sayıda uydu tümör gözlenirken, düşük metastatik kapasiteye sahip B16 F0 hücre hattı için hiçbir uydu tümör görülmemiştir. Buna karşılık, düşük metastatik ancak lokal olarak oldukça invaziv olan bu murin meme bezi karsinoma hücreleri, fibrin jel içerisinde radyal olarak genişleyen bir migrasyon önü oluşturur. 14 günlük kültürün ardından, meme bezi karsinoma hücreleri migrasyon önünden uzaklaşarak meme bezi yapılarına çok benzeyen yıldız şeklinde yapılar oluştururlar.Kemoterapötik ajanlar, kemoterapötik ajanın tetiklediği kanser hücresi apoptozu olaylarındaki artışla eş zamanlı olarak artan miktarda DNA fragmantasyonunun gözlemlendiği bu temsili deneyde olduğu gibi, gömülü kanser hücreleri üzerinde test edilebilir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik yaklaşık altı saatte tamamlanabilir veya başlangıç kolajen tıkaç inkübasyon süresine bağlı olarak iki güne yayılabilir.Bu prosedürü uygularken, merkezi ve periferik jeller arasındaki arayüzde boşluk oluşumunu önlemek önemlidir; çünkü bu boşluklar kanser hücrelerinin fibrin jelini istila etme yeteneğini azaltabilir. Bu prosedürün ardından, ilgilenilen genlerin ve proteinlerin diferansiyel ekspresyonunu belirlemek için uydu kolonilerde, kollajen tıkaçlarda veya kanser hücrelerinde metalografik veya proteomik analizler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, kanser biyolojisi alanındaki araştırmacıların çeşitli kanser hücre hatlarında migrasyon, apoptoz, metastatik baskılayıcı gen ekspresyonu ve anjiyogenez süreçlerini keşfetmelerine yol açmıştır.Bu videoyu izledikten sonra, kanser hücrelerinin bir kolajen jele nasıl gömüleceğini ve invazivliği ve satelit tümör oluşumunu izlemek için bunların bir fibrin jel arasına nasıl yerleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.

three-dimensional-culture-assay-to-explore-cancer-cell-invasiveness

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Kantitatif büyüme faktörü (TGF)-β indüklenen 3 boyutlu kolajen jel işgali dönüştürme ölçmek için bir test tarif edilir. Bu testte, meme kanseri gelişiminin farklı aşamaları temsil hücre hatlarının MCF10A serisi, yararlanır. Bu yöntem, diğer hücre hatları ile birlikte kullanılmak üzere ve diğer potansiyel aktivatörleri veya işgali inhibitörleri araştırmak için kullanılmış olabilir kabul edilebilir.

TGF-β-kaynaklı Invasion Tedbir Sfero Testi

Bu video, meme kanseri hücrelerini bir 3B bazal membran protein matrisinde büyütmek için ayrıntılı bir metodoloji sağlar ve çevredeki ortama hücre istilasının değerlendirilmesinde 3B kültürün potansiyelini örneklendirir.

3D Kültür Bazal Membran Deneyi: Hücre İstilasını İncelemek için 3D Bazal Membran Protein Matrisi Üzerinde Kanser Hücrelerinin Kültürlenmesi

Bu videoda, üç boyutlu bir tümör sferoidi ve T hücresi ko-kültürü oluşturmak için bir yöntem gösterilmektedir. Tümör sferoidleri içeren mikrokuyucuklara sahip bir agaroz dökümü hazırlanır, ardından T hücrelerinin eklenmesi takip edilir. İnkübasyondan sonra, bu kurulum, kontrollü bir üç boyutlu ortamda T hücrelerinin tümör sferoidleri ile etkileşiminin incelenmesine izin verir.

Tümör Sferoidlerinde Sızan T Hücrelerinin Üç Boyutlu Ko-Kültür Modeli

Bu makalede, floresan daha düzeltme ve 3D-hücre kültürleri canlı görüntüleme için kullanılabilir kollajen etiketlemek için bir yöntem sunar. Ayrıca 3D ortamlarda kültür hücrelerinin endojen iskelet proteinleri görselleştirmek için optimize edilmiş bir protokol sağlar.

3D İnvaziv Kanser Hücrelerinin Sitoskeletal Örgütü ortaya

Bir tekrar oluşturulmuş temel membran üzerinde meme epitelyum hücreleri üç boyutlu kültür iyi huylu meme in vivo mimari özetlemek için, iyi huylu göğüs ve fenotipten malin fenotipi ayırt etmek için yararlı bir yöntemdir. Önemli olarak, bu sistem, diğer dokularda invaziv karsinomları incelemek için uygulanabilir.

Üç Boyutlu Kültürler: Meme hücrelerinin malign Dönüşüm vs Normal Asiner Mimari Eğitim için Bir Aracı

Bu makalede, meme kanseri hücre istilasını ölçmek için üç boyutlu (3D) tahlillerin kullanımı için ayrıntılı yöntemler sağlar. Özellikle, biz hücreleri istila oluşur membran bütünlüğünün kaybı incelemek için bu tür deneyleri kurmak için gerekli prosedürleri, ölçümlerini ve veri analizi gibi yöntemleri tartışmak.

Üç boyutlu (3D) Modeli Kullanılarak Meme Kanseri Hücre invazivliğinin Kantitasyonu

Burada, kanser hücresi davranışının çok hücreli etkileşimlerini ve hücre dışı matrise bağlı modülasyonunu araştırmak için yararlı olan üç boyutlu ko-kültür için bir protokol sunuyoruz. Bu deneysel modelde, kanser hücreleri, insan kanseriyle ilişkili fibroblastlarla gömülü kollajen jelleri üzerinde kültürlenir.

Tümör-stromal Etkileşim için üç boyutlu Co-kültür Modeli

Çevredeki normal dokuların invazyonu, malign tümörlerin tanımlayıcı bir özelliğidir. Burada, bir dizi ileri insan kanseri modeliyle örneklenmiş doğal bir 3D biyomatrise basit, yarı otomatik bir mikro plaka istila testi sunuyoruz.

Üç boyutlu (3D) Tümör Sfero Yayılması deneyindeki

Bu yöntem, kanser hücresinin sferoidlerden çevredeki bir 3B matrise invazyonunu değerlendirir.  Sferoidler, asılı damla kültürü yöntemi ile üretilir ve daha sonra bazal membran malzemeleri ve tip I kollajenden oluşan bir matrise gömülür.  Spheroidlerin istilası daha sonra izlenir.

Bir Kanseri Hücre Sfero Testi 3D ortamda Invasion Değerlendirmek için

Mesane kanseri istila yönetim süreçleri biyomarker ve terapötik geliştirme fırsatları temsil eder. Burada hangi 3-b kültür tümör pulcuklarının, hızlandırılmış görüntüleme ve confocal mikroskobu birleştirmek bir mesane kanseri istila modeli mevcut. Bu teknik invaziv işlem özelliklerini tanımlamak için ve terapötik ajanlar süzmek için yararlıdır.

3-b hücre kültür sistemi istila eğitim ve Mesane kanserinde tedavi değerlendirmek için

Sunulan yaklaşım aynı anda 3D spheroid tahliller ve T-hücre sitotoksisite kanser hücresi invazyonu değerlendirir. Spheroids bir iskele-free agarose multi-microwell döküm oluşturulur. Eş-kültür ve tip I kollajen matris gömme kanser hücresi invazyonu ve T-hücre aracılı sitotoksisite izlemek için izin veren aynı cihaz içinde gerçekleştirilir.

3D Kültürde Kanser Hücre İstilası ve T-Hücre Sitotoksisitesi İzleme

Keşfedin kanser hücre istilasını ve uydu tümör oluşumunu 3D kültür sistemi kullanarak. Bu yöntem, kollajen ve fibrin jel içinde hücreleri gömerek tümör biyolojisi araştırmalarında invazyon davranışlarını incelemeyi sağlar.

Kanser hücre istilası ve Uydu Tümör oluşumu keşfedin Kültür Testi Üç Boyutlu

Daha fazla video keşfet