Hücresel Termal Etkileri İncelemek İçin Kültür Hücrelerini Isıtma İçin Sürekli Dalga Tribün Lazeri

Bu prosedürün genel amacı, kültürlenmiş hücreleri hassas sıcaklık ve zaman kontrolü ile ısıtarak in vitro termal doza bağlı hücre biyolojik tepkilerini incelemektir. Bu yöntem, retinal lazer tedavisi çalışması gibi hipertermiye hücre veya doku tepkilerini araştıran alanlarda önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, hücrelerin hızlı bir şekilde ısıtılması ve ısıtma süresi üzerinde hassas bir kontroldür, bu da deneyler sırasında yüksek tekrarlanabilir bir termal maruziyete izin verir.

Bu yöntem, kültürlenmiş retina pigment epitel hücrelerinin termal lazer ışınlamasına verdiği tepkiler hakkında fikir verebilse de, kanser hücreleri gibi diğer modellere de uygulanabilir. Bu yöntem için ilk olarak melanin içeren hücreleri görünür lazer ışığı ile ısıtırken aklımıza geldi. Bununla birlikte, bu, pigmentasyondaki farklılıklar nedeniyle değişen sıcaklık profillerine neden oldu.

Prosedüre başlamak için, temiz bir tezgah üzerinde ayarlanabilir bir metal laboratuvar standına bir sıcak plaka yerleştirin. Sıcak plakayı 39 santigrat dereceye ayarlayın. Çekirdek çapı 365 mikrometre olan 0,22 NA fiberi standın yatay koluna sabitleyin.

Metal kolu sıcak plakanın üzerine yerleştirin ve standı, fiber ucu sıcak plakanın 12 santimetre üzerinde olacak şekilde ayarlayın. 1.94 mikrometre 20 watt Thulium lazeri 365 nanometre bir miliwatt hedefleme ışını ile fiber uca bağlayın. Sıcak plakanın üzerine 30 milimetre çapında bir kültür kabı yerleştirin.

Çanağın çevresini sıcak plaka yüzeyinde dikkatlice izleyin ve ardından kabı çıkarın. Hedefleme ışınını açın ve sıcak plaka üzerindeki ışın noktasının merkezi izlenen daireyle eşleşene kadar standı ayarlayın. Ardından nişan alma ışınını kapatın.

Sıcaklık kalibrasyon prosedürüne başlamak için, 20 gauge iğnenin ucunu bir Bunsen brülörü ile ısıtın. Isıtılmış iğne ucuyla, yaklaşık 300 mikrometre çapında delikler açmak için 30 milimetre çapındaki kültür kabını dibe yakın 90 derece aralıklarla dört noktadan delin. Deliklerin üzerine elektrik bandı yerleştirin.

Her deliği kaplayan banttan yaklaşık 200 mikrometre çapında bir delik açmak için ince bir iğne kullanın. Kültür kabının alt tarafında, her bir delik çifti arasına 180 derece aralıklarla bir çizgi çizin. Çizgilerin kesişme noktasından başlayarak, 21 ölçüm noktasını belirlemek için her çizgi boyunca her üç milimetrede bir radyal olarak işaretleyin.

Ardından, tabağa önceden 37 santigrat dereceye kadar ısıtılmış tam olarak 1,2 mililitre taze kültür ortamı yerleştirin. Çanağı örtün ve çanağı sıcak plaka üzerindeki izlenen daireye yerleştirin. Lazer kontrol bilgisayarına 200 mikrometre çapında bir termokupl bağlayın ve sıcaklık kalibrasyon protokolünü açın.

Termokupl'u tabaktaki deliklerden birine yerleştirin, böylece uç tabağın dibinde, işaretin bulunduğu yerlerden birinde olur. Termokuplun ucunun tabağın dibine ölçülen hassasiyette temas edip etmediğini kontrol etmek çok önemlidir çünkü sıcaklık derinliğe göre değişebilir. Kültür ortamının 37 santigrat derecede stabilize olmasını bekleyin.

Ardından Thulium lazeri açın ve lazer gücünü istenen başlangıç seviyesine ayarlayın. Ön ısıtma sürelerinin 140 ve sekiz saniye olarak ayarlandığını doğrulayın ve ardından ön ısıtma ışınlama sırasını başlatın. Sesli bir bip sesiyle işaret edildiği gibi 140 saniye sonra, kültür kabının kapağını hemen çıkarın.

Ön ısıtma bitene ve 10 saniyelik ışınlama gerçekleşene kadar bekleyin. Sonra hemen tabağı örtün. Bu şekilde 21 işaret konumundaki sıcaklığı ölçün.

Bu prosedürü, lazer güç aralığını kapsayan üç watt güç aralıklarında her biri üç kez gerçekleştirin. Bitirdikten sonra thulium lazeri kapatın. Sıcaklık verilerini dışa aktarın ve analiz edin.

Deneyden önce, 30 çaplı kültür kaplarında kültür kiralama pigment epitel hücreleri bulunur. Hücre kültürlerini %5 karbondioksit atmosferinde 37 santigrat derecede tutun ve canlı hücre görüntüleme sistemi kullanarak kontrol edin. Işınlamadan bir saat önce, her tabaktaki kültür ortamını tam olarak 1.2 mililitre taze kültür ortamı ile değiştirin.

Kültürleri kuluçka makinesine geri koyun. Işınlama istasyonunun hazır olduğunu ve sıcak plakanın 39 santigrat dereceye ayarlandığını doğrulayın. Işınlamaya başlamaya hazır olduğunuzda, thulium lazeri istenen güçte başlatın.

Deney protokolünü açın ve ön ısıtma sürelerinin 140 ve sekiz saniye olarak ayarlandığını doğrulayın. Bir RPE hücre kültürünü, sıcak plaka üzerindeki işaretli konuma kapalı bir tabağa yerleştirin ve hemen 140 ve sekiz saniyelik ön ısıtma ışınlama dizisini başlatın. 140 saniye ön ısıtmadan sonra bulaşık kapağını çıkarın.

Ön ısıtma bitene ve 10 saniyelik ışınlama gerçekleşene kadar bekleyin. Hemen tabağı örtün, yedi saniye bekleyin ve ardından tabağı inkübatöre geri koyun. Artan lazer gücü seviyelerinde ek numuneleri ışınlayın.

Bitirdiğinizde, thulium lazeri kapatın. Hücre canlılığı değerlendirmesine başlamak için, ışınlanmış hücreleri PBS ile yıkayın. Canlı apoptotik ve nekrotik hücreleri ayırt edebilen bir kit edinin.

Daha sonra düşük ışıkta, 500 mikrolitre bağlayıcı tamponu 25 mikrolitre etidyum homodimer-3, FITC annexin ve Hoechst 33342 ile birleştirin. Hücreleri bu boyama solüsyonunda oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Daha sonra hücreleri 1X bağlayıcı tampon ile iki kez yıkayın.

Bağlayıcı tamponu PBS ile değiştirin ve hücreyi DAPI, FITC ve TRITC filtrelerine sahip bir floresan mikroskobu sahnesine yerleştirin. Mikroskop ışık yolunu oküler lense ayarlayın ve DAPI filtresini seçin. Aydınlatma ışığını açın ve 4X objektif lensi ile odak düzlemini bulun.

Mikroskop kamerasına giden ışık yolunu ayarlayın. Görüntüyü ortalamak ve odaklamak için mikroskop görüntüleme yazılımını kullanın. DAPI filtresini kullanarak görüntü alma parametrelerini tanımlayın.

Odaklama işlemini ve görüntü elde etme kurulumunu FITC ve TRITC filtreleriyle tekrarlayın. Ardından, görüntüleme yazılımını kullanarak çanak boyunca üç filtre setiyle birden fazla görüntü elde edin ve bunları tüm kültür kabının tek bir görüntüsünde birleştirin. Apoptoz ve hücre ölümü için sıcaklık eşiklerini belirlemek için analitik yazılım kullanın.

Bir hücre kültürü kabının merkezindeki maksimum sıcaklık artışı ile lazer gücü arasındaki oransal ilişki, açıklanan termal kalibrasyon prosedürü ile belirlendi. Hücre kültürü kabı boyunca maksimum sıcaklık dağılımı daha sonra bir Gauss fonksiyonuna uygun hale getirildi. Işınlamayı takiben üç boyama paterni gözlendi.

43 santigrat derece veya altındaki sıcaklıklara maruz kalan kültürlerde canlılık değişikliği gözlenmedi. Apoptoz ilk olarak 47 santigrat derecede ışınlamadan üç saat sonra gözlendi. Hücre ölümü, 51 santigrat derece ve daha yüksek bir sıcaklıktan üç saat sonra gözlendi.

Apoptoz ve hücre ölümü için ortalama eşik sıcaklıkları daha sonra ölü ve apoptotik alanların ölçülen yarıçaplarının ortalaması, sıcaklık dağılımını tanımlayan Gauss fonksiyonuna uygulanarak belirlendi. Bu işlemi takiben farklı lazer profilleri, spot boyutları ve ışınlama süreleri gibi birçok farklı koşulda ışınlama yapılabilir. Bu, hücresel düzeyde bireysel zamanlanmış sıcaklık nedenleriyle ilgili soruların anlaşılmasına ve araştırılmasına yardımcı olabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, sıcaklık ve zaman üzerinde iyi bir kontrol ile hücre kültürünü nasıl ısıtacağınızı iyi anlamış olmalısınız. Bu, farklı termal ışınlama koşullarına biyolojik tepkileri inceleme olasılıklarına dayanabilir. Lazerlerle çalışmanın gözleriniz ve cildiniz için çok tehlikeli olabileceğini unutmayın.

Lazer ışınlama güvenliği eğitimi hakkında bilgi sahibi olun. Bu prosedürü gerçekleştirirken daima uygun koruyucu gözlük, laboratuvar önlüğü ve eldiven giyin.