Ters Kolloidal Kristal Poli (etilen glikol) İskele imalatı: Karaciğer Doku Mühendisliği için Üç boyutlu Hücre Kültürü Platformu

Bu prosedürün genel amacı, karaciğer dokusu mühendisliği uygulamaları için hücre dışı matris kodlamasına sahip PEG tabanlı ters kolloidal kristal iskeleler üretmektir. Karaciğer dokusu mühendisliği, doku mühendisliği ve rejeneratif tıp için heyecan verici bir alandır. Karaciğer hücrelerinin işlevlerini uzun süre korumalarına olanak tanıyan 3B mühendislik iskeleleri oluşturuyoruz.

Bu tekniğin etkileri ilaç testlerine kadar uzanmaktadır; çünkü bu sistemle kültüre edilen karaciğer hücreleri fonksiyonlarını daha uzun süre koruyabilir ve ilaçlara daha iyi yanıt verebilir. Bu yöntem doku mühendisliği konusunda içgörü sağlayabildiği gibi, kök hücre kullananlar gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Prosedürü, laboratuvarımdan lisansüstü öğrencisi Hitomi uygulamalı olarak gösterecektir.

Mikroboncuk kalıplarını hazırlamak için öncelikle, 0,2 mililitre ısıya dayanıklı mikrocentrifuge tüplerinin uçlarını 40 mikrolitre seviyesinden kesin. Kesilen tüplerin üst kısımlarını cam mikroskop lameline yapıştırmak için su geçirmez yapıştırıcı kullanın ve ardından kalıpların çevresini yapıştırın. Sonrasında, bir viyalin içindeki polistiren mikrokürelerin suyunu %70 etanol ile değiştirin.

Küre solüsyonunu bir ultrasonik banyoya yerleştirin ve agregat halindeki küreleri gevşetmek için karışımı 30 watt gücünde üç dakika boyunca sonikasyona tabi tutun. Mikroküreler hazırlandıktan sonra, her bir kalıba 100 µL etanol pipetleyin. Ardından, 200 µL'lik bir pipet ucunun üst kısmından dört milimetreyi kesin ve bu ucu kullanarak kalıba iki kez 25 µL polistiren mikroküre pipetleyin.

Kalıpları sallanan bir çalkalayıcıya yerleştirin ve 120 RPM'ye ayarlayın. Numuneleri gece boyunca çalkalayıcıda bekletin. Ertesi gün, kalıpları mikroskop altına yerleştirin ve kürelerin altıgen şeklinde sıralandığını kontrol edin.

Etanolün oda sıcaklığında iki gece boyunca buharlaşmasını bekleyin. Bu aşamada, polistiren boncukları tavlamak ve 3D iskelenin negatifini oluşturmak için kalıp ve boncuk kompleksini dikkatlice 130 degrees Celsius derecelik bir fırına altı saat süreyle yerleştirin. İlk olarak, bu iki referansta açıklanan yerleşik protokolleri kullanarak polietilen glikol diakrilat makromerlerini sentezleyin.

Ardından, deiyonize su içerisinde %50'lik bir PEGDA çözeltisi hazırlayın ve karışım tamamen çözünene kadar santrifüjleyin. Ekstraselüler matris konjuge iskeleler için, %50'lik PEGDA çözeltisine ek olarak %10 oranında krill yağı PEG NHS ekleyin. Daha sonra, %70'lik etanol içerisinde foto-başlatıcının %20'lik stok çözeltisini hazırlayın.

PEGDA karışımının her mililitresi için 50 µL foto-başlatıcı çözeltisi ekleyin. Ardından, karışımı bir dakika boyunca vorteksleyin. Sonra, kalıpları cam lamellerden ayırın, kafes yapılarını bir spatula yardımıyla dikkatlice dışarı itin ve bunları ayrı 1,5 mL santrifüj tüplerine yerleştirin.

Her tüpe 300 µL PEGDA solüsyonu pipetleyin ve ardından PEGDA solüsyonunun polistiren kafes yapısına sızmasını sağlamak için tüpleri santrifüjleyin. Daha sonra, kafes yapısını cımbızla tüpten çıkarın ve yüzeydeki fazla PEGDA solüsyonunu dikkatlice kurulayın. Kafes yapısını, düz dairesel yüzeyi yukarı bakacak şekilde parafin filmle kaplı cam üzerine yerleştirin.

Ardından, bir UV spot lamba kullanarak iskelesini beş dakika boyunca 365 nanometre ultraviyole ışığa maruz bırakın. Yaklaşık on adet PEGDA polimerize kristal kafesini yeni bir viyale yerleştirin ve 20 mililitre THF ekleyin. Viyalleri orbital bir çalkalayıcıda 300 RPM hızda altı saat boyunca çalkalayın.

Flakonu her bir ila iki saatte bir çıkarın ve polimer içeren çözücüyü taze THF ile değiştirin. Son durulamadan sonra, PS kürelerinin tamamen çözünüp çözünmediğini kontrol etmek için kullanılan THF çözeltisine su ekleyin. Çözelti beyazsa, çözelti şeffaf hale gelene kadar ek durulamalar yapın.

İskeleleri sterilize etmek için, her bir iskele başına iki mililitre %70 etanol içeren 50 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpü hazırlayın ve iskeleleri bir spatula yardımıyla tüpe yerleştirin. İskelelerin bir saat boyunca etanolda bekletilmesine izin verin. Bir saat sonra, etanolü dikkatlice dökün ve yerine eşit hacimde steril PBS ekleyin.

Ardından, hava kabarcıklarını gidermek için iskeleleri santrifüjleyin. Santrifüjlenen iskeleleri dört santigrat derecede saklayın ve çözeltiyi taze PBS ile değiştirmek için her bir ila iki saatte bir dışarı çıkarın. PBS ile birkaç değişim yapıldıktan sonra, kollajen ile kaplanacak iskeleleri çıkarın ve her bir kaplanacak iskele başına bir mililitre tip 1 kollajen içeren bir tüpe yerleştirin.

Ardından, tüpü daha önce olduğu gibi santrifüjleyin ve ardından iskeleleri orbital bir sarsıcıda 30 dakika boyunca 400 RPM'de sallayın. İskeleleri dört derece Celsius'ta gece boyu saklayın. Hepatokarsinoma hücrelerini, 10 mililitre kültür medyumu içeren 100 milimetrelik hücre kültürü kaplarında kültüre edin.

Hücre yoğunluğu kültür yüzeyinin %75 ila %80'ine ulaşana kadar besiyerini her üç günde bir değiştirin. Hücreler hazır olduğunda, iskeleleri düz yüzeyleri yukarı bakacak şekilde dikkatlice 24 kuyucuklu bir plakaya yerleştirin. Ardından, her bir iskeleyi iki mililitre PBS ile durulayın.

PBS'yi aspire edin ve iskelelere iki mililitre büyüme medyumu ekleyin. 30 dakika sonra medyumu uzaklaştırın ve iskelenin bir saat boyunca kurumasına izin verin. Ardından, hepatokarsinom hücrelerini tripsin sindirme yöntemini kullanarak hasat edin.

Hücreler pellete edildikten sonra, süpernatantı uzaklaştırın ve pelletle her 25 microliter için bir milyon hücre olacak şekilde yeniden süspansiyon hazırlayın. Hücre süspansiyonundan 25 microliteri her bir iskeletin üzerine yavaşça pipetleyin. Ardından, plağı kapatın ve gece boyunca inkübatöre yerleştirin.

Ardından, iskeleleri dikkatlice yeni bir 24 kuyucuklu plakaya aktarın ve plakayı inkübatöre geri yerleştirmeden önce her kuyucuğa iki mililitre besiyeri pipetleyin. İskeletin taramalı elektron mikroskobu görüntüsü burada gösterilmiştir. İskelet, çapları ortalama 100 ile 105 mikron arasında olan ve çoğunlukla 35 ile 40 mikron çapındaki komşu gözeneklerle bağlantılar kuran, altıgen sıkı paketlenmiş bir gözenek düzenlemesinden oluşur.

Hepatokarsinom hücreleri ekildiğinde, hücreler tip bir kollajen ile ön kaplamalı iskeleler üzerinde büyümüş ve çoğalmış, ancak kaplamasız iskelelerde sayıca artış göstermemişlerdir. Ayrıca, kollajen kaplı iskelelerdeki hepatokarsinom hücreleri, konsantrasyona bağlı olarak daha yüksek hücre fonksiyonu sergilemiştir. 14. günde, 400 µg/mL kaplamalı ICC iskelelerde kültüre edilen hepatokarsinom hücreleri, kaplamasız iskelede kültüre edilenlere kıyasla üç kattan fazla albümin salgılamıştır.

Bu prosedürü uygularken, kafesteki polistiren kürelerin uygun şekilde düzenlendiğinden emin olmanın önemli olduğunu unutmamak gerekir. Kötü düzenleme, hücre aktivitesini olumsuz etkileyebilecek yetersiz bir ara bağlantıya yol açacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, kaplamalı, hücreleştirilmiş PEG tabanlı ters kolloidal kristal iskelelerin nasıl üretileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

Tetrahidrofuran ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu prosedürü uygularken her zaman çeker ocak kullanımı, eldiven ve koruyucu gözlük takılması gibi önlemler alınmalıdır.