Ters Kolloidal Kristal Poli (etilen glikol) İskele imalatı: Karaciğer Doku Mühendisliği için Üç boyutlu Hücre Kültürü Platformu

Bu prosedürün genel amacı, karaciğer dokusu mühendisliği uygulamaları için kodlayan hücre dışı bir matris ile PEG bazlı ters çevrilmiş kolloidal kristal iskeleler üretmektir. Karaciğer doku mühendisliği, doku mühendisliği ve rejeneratif tıp için heyecan verici bir alandır. Karaciğer hücresinin işlevini uzun süre sürdürmesini sağlayan 3D mühendislik iskelesi oluşturuyoruz.

Bu tekniğin etkileri, bu sistemle kültürlenen karaciğer hücrelerinin işlevlerini daha uzun süre koruyabilmesi ve ilaca daha iyi yanıt verebilmesi nedeniyle ilaç testine kadar uzanır. Bu yöntem doku mühendisliği hakkında bilgi sağlayabilse de, kök hücre kullananlar gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Hitomi olacak.

Mikro boncuk kalıplarını hazırlamak için önce 0,2 mililitrelik kaynamaya dayanıklı mikrosantrifüj tüplerinden uçları 40 mikrolitre seviyesinde kesin. Kesilen tüplerin üst kısımlarını cam mikroskop kapak kızaklarına yapıştırmak için su geçirmez yapıştırıcı kullanın ve ardından kalıpların etrafına yapıştırın. Daha sonra, polistiren mikroküreciklerden oluşan bir şişedeki suyu% 70 etanol ile değiştirin.

Küre çözeltisini ultrasonik bir banyoya yerleştirin ve toplanan küreleri gevşetmek için karışımı üç dakika boyunca 30 watt'ta sonikleştirin. Mikro küreler hazırlandıktan sonra, kalıpların her birine 100 mikrolitre etanol pipetleyin. Ardından, 200 mikrolitrelik bir pipet ucunun üstünden dört milimetre kesin ve 25 mikrolitre polistiren mikrokürecikleri kalıba iki kez pipetlemek için kullanın.

Kalıpları sallanan bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin ve 120 RPM'ye ayarlayın. Numuneleri gece boyunca çalkalayıcı üzerinde bekletin. Ertesi gün kalıpları mikroskop altına yerleştirin ve kürelerin altıgen olarak sıralandığını kontrol edin.

Etanolün iki gece oda sıcaklığında buharlaşmasına izin verin. Bu sırada, polistiren boncukları tavlamak ve 3D iskelenin negatifini oluşturmak için kalıp ve boncuk kompleksini altı saat boyunca 130 santigrat derece fırına dikkatlice yerleştirin. İlk olarak, bu iki referansta açıklandığı gibi yerleşik protokolleri kullanarak polietilen glikol diakrilat makromerlerini sentezleyin.

Daha sonra, deiyonize suda %50'lik bir PEGDA çözeltisi hazırlayın ve karışımı tamamen eriyene kadar santrifüjleyin. Hücre dışı matrisli konjuge iskeleler için, %50 PEGDA çözeltisine %10 krill yağı PEG NHS ekleyin. Ardından, %70 etanol içinde foto başlatıcının %20'lik bir stok çözeltisini hazırlayın.

PEGDA karışımının her mililitresi için 50 mikrolitre foto başlatıcı solüsyon ekleyin. Ardından, karışımı bir dakika boyunca girdaplayın. Daha sonra, kalıpları cam slaytlardan soyun, bir spatula kullanarak kafesleri dikkatlice dışarı itin ve ayrı 1,5 mililitrelik santrifüj tüplerine yerleştirin.

Her tüpe 300 mikrolitre PEGDA solüsyonu pipetleyin ve ardından PEGDA solüsyonunun polistiren kafese sızmasına izin vermek için tüpleri santrifüjleyin. Daha sonra, cımbız kullanarak kafesi tüpten çıkarın ve yüzeydeki fazla PEGDA çözeltisini dikkatlice kurulayın. Kafesi, düz, dairesel yüzeyi yukarı bakacak şekilde parafin film kaplı camın üzerine yerleştirin.

Ardından, bir UV spot lambası kullanarak iskeleyi beş dakika boyunca 365 nanometre ultraviyole ışığa maruz bırakın. Yeni bir şişeye yaklaşık on PEGDA polimerize kristal kafes yerleştirin ve 20 mililitre THF ekleyin. Şişeleri altı saat boyunca 300 RPM'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde çalkalayın.

Şişeyi her bir ila iki saatte bir çıkarın ve polimer içeren çözücüyü taze THF ile değiştirin. Son durulamadan sonra, PS kürelerinin tamamen çözülüp çözülmediğini kontrol etmek için kullanılan THF çözeltisine su ekleyin. Çözelti beyazsa, çözelti şeffaf hale gelene kadar ek durulama yapın.

İskeleleri sterilize etmek için, iskele başına iki mililitre% 70 etanol içeren 50 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpü hazırlayın ve iskeleleri bir spatula kullanarak tüpe yerleştirin. İskelelerin bir saat etanolde ıslanmasına izin verin. Bir saat sonra, etanolü dikkatlice dökün ve eşit hacimde steril PBS ile değiştirin.

Ardından, kabarcıkları gidermek için iskeleleri santrifüjleyin. Santrifüj iskelelerini dört santigrat derecede saklayın ve çözeltiyi taze PBS ile değiştirmek için her bir ila iki saatte bir çıkarın. PBS'de birkaç değişiklik yaptıktan sonra, kollajen ile kaplanacak iskeleleri çıkarın ve kaplanacak iskele başına bir mililitre kollajen tip bir içeren bir tüpe yerleştirin.

Daha sonra, tüpü daha önce olduğu gibi santrifüjleyin ve ardından iskeleleri bir orbital çalkalayıcı üzerinde 400 RPM'de 30 dakika sallayın. İskeleleri gece boyunca dört santigrat derecede saklayın. 10 mililitre kültür ortamı ile 100 milimetre hücre kültürü kaplarında kültür hepatokarsinom hücreleri.

Hücre yoğunluğu kültür yüzeyinin% 75 ila 80'ine ulaşana kadar ortamı her üç günde bir değiştirin. Hücreler hazır olduğunda, iskeleleri düz yüzeyi yukarı bakacak şekilde 24 oyuklu bir plakaya dikkatlice yerleştirin. Ardından, her iskeleyi iki mililitre PBS ile durulayın.

PBS'yi aspire edin ve iskelelere iki mililitre büyüme ortamı ekleyin. 30 dakika sonra ortamı çıkarın ve iskelenin bir saat kurumasını bekleyin. Daha sonra, tripsin sindirim yöntemini kullanarak hepatokarsinom hücrelerini hasat edin.

Hücreleri peletledikten sonra, süpernatanı çıkarın ve peleti 25 mikrolitrede bir milyon hücre olacak şekilde yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunun 25 mikrolitresini doğrudan her bir iskelenin üzerine yavaşça pipetleyin. Ardından plakayı örtün ve gece boyunca inkübatöre koyun.

Daha sonra, iskeleleri dikkatlice 24 oyuklu yeni bir plakaya aktarın ve plakayı inkübatöre geri koymadan önce her bir oyuğa iki mililitre ortam pipetleyin. İskelenin taramalı elektron mikroskobu burada gösterilmiştir. Çapı ortalama 100 ila 105 mikron olan altıgen, en yakın paketlenmiş gözenek düzenlemesinden oluşur ve bu, çoğunlukla 35 ila 40 mikron çapında olan komşu gözeneklerle ara bağlantılar oluşturur.

Hepatokarsinom hücreleri ile tohumlandığında, hücreler kollajen tip bir ile önceden kaplanmış ancak çıplak iskelelerde sayıca genişlemeyen iskeleler üzerinde büyür ve çoğalır. Ek olarak, kollajen kaplı iskeleler üzerindeki hepatokarinoma hücreleri, konsantrasyona bağlı bir şekilde daha fazla hücre fonksiyonu göstermiştir. 14. günde, mililitre başına 400 mikrogram kaplı ICC iskelelerinde kültürlenen hepatokarsinom hücreleri, çıplak iskelede kültürlenenlere göre albümin miktarının üç katından fazla salgıladı.

Bu prosedürü denerken, kafes içindeki polistiren kürelerin düzgün bir şekilde düzenlendiğinden emin olmayı unutmamak önemlidir. Kötü düzenleme, hücre aktivitesini olumsuz yönde etkileyebilecek zayıf ara bağlantıya yol açacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, bir kaplama ile celciated PEG bazlı ters kolloidal kristal iskelelerin nasıl imal edileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Tetrahidrofuran ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken çeker ocakta çalıştırmak, eldiven ve gözlük takmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.