Name: Yüksek verimli Gen Etiketleme içinde Trypanosoma brucei (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Öğrenin, Trypanosoma brucei'de yüksek verimli gen etiketleme yöntemiyle protein lokalizasyonu ve fonksiyonunu nasıl incelersiniz. Bu protokol, büyük ölçekli genomik çalışmalar için paralel etiketlemeyi mümkün kılar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SD, Sir Henry Wellcome Bursu [092201/Z/10/Z] tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma, Wellcome Trust'ın Profesör Keith Gull'a verdiği hibeler [WT066839MA][104627/Z/14/Z][108445/Z/15/Z] ile finanse edilmiştir. Yararlı sohbetler ve içgörüler için Profesör Keith Gull'a teşekkür ederiz.

1. 96-kuyu Uzun Primer PCR <ol><li> -80 ° C derin dondurucuda Öncesi donma 96-PCR soğutucu. </li><li> 10 ml&#39;lik bir tüp içinde, ana karışım A hazırlanması: 2100 ul GKD 2 O, 105 | il PCR sınıf DMSO, plaka başına 2.415 | il lik toplam hacim 105 ul 10 mM dNTP, 105 ul pPOT şablonu (25 ng / | il), 9, . </li><li> Kısım 96 gözlü PCR plakanın her oyuğuna 23 ul. </li><li> Her bir P20 12 kanal çok kanallı pipet kullanarak iyi yüklenmiş primerler toplanmış 100 mcM 2 ul ekleyin. Önceden soğutulmuş PCR soğutucu filmin, plaka ile kapatılır ve 80 ° C&#39;de 20 dakika en az dondurmak için izin verir. </li><li> 10 ml&#39;lik bir tüp içinde, ana karışım B hazırlanması: 2.048 ul GKD 2 O, 525 ul 10x tampon, plaka başına 2.626 | il lik toplam hacim için 52.5 ul polimeraz. </li><li> -80 ° C dondurucu plaka ve PCR soğutucusunu çıkarın. </li><li> PCR soğutucusu hala plakalı, dondu üstünde 25 ul Master Mix B ekleyinn Ana Karışım 50 ul toplam reaksiyon hacmi için. Bu sefer kritik olduğunu ve Mix A çözülme önce tamamlanmalıdır. film ile plaka mühür. </li><li> aşağıdaki şekilde termal döngü ayarlayın: 10 dakika boyunca 94 ° C, daha sonra, 7 dakika boyunca 72 ° C&#39;lik bir son uzatma süresi ardından 2 dakika 15 saniye, 30 saniye için 65 ° C, 72 ° C, 94 ° C&#39;de 30 döngü . </li><li> Blok 94 ° C ulaştıktan sonra PCR plaka yükleyin. </li></ol> 96-kuyu Uzun Primer PCR 2. Doğrulama <ol><li> Büyük bir% 1 döküm Tris asetat EDTA (TAE) &#39;de agaroz jel (w / v), 4 x 28 oyuklu tarakla çalışan tampon kuyu 4 satır ile bir jel elde edildi. 12 kanal çok kanallı pipet uçları ile tarak alternatif dişleri aynı hizaya getirin. şeritleri yüklendikten sonra dikkatli bir şekilde çalışan tampon TAE jel daldırın. </li><li> 1. ve 28. sıra her satır yükleyin 1 kb DNA merdiveni. </li><li> Bir P20 12 kanal çok kanallı pipet kullanarak, PCR ürünü dir 2 ul transferiectly jel (Şekil 1A) her şeride. amplıkonları kirlenmesine neden olma olasılığını azaltmak için hızla yapın. <ol><li> (- Şerit 3, A2 - şerit 5 ...... A11 - şerit 23, A12 - şerit 25 A1) ve PCR ürünleri yüklemek jel 1 satır tek numaralı şerit içine PCR plaka satır A PCR ürünleri yüklemek jel 1. satır bile sayılı şeride PCR plaka satır B (B1 - kulvar 4 A2 - şerit 6 ...... B11 - şerit 24, B12 - şerit 26). </li><li> Çift sayılı şeride sayılı kulvarlar ve satır D tek olarak satır C, yukarıda tarif edildiği gibi, aynı kalıp kullanılarak PCR levhanın sıralı C ve D, PCR ürünleri yükleyin. PCR plaka her bir jel üzerine yüklenir kadar bu yükleme modeli devam edin. DNA, yükleme tamponu Bu jel yüklemek için gerekli değildir. </li></ol></li><li> koşu tankına jel yerleştirin ve jel batık kadar tampon çalışan TAE ile deposunu doldurun. 30 dakika boyunca 100 V&#39;ta tutuldu veUV transilluminator kullanarak görselleştirmek. Örnek jel Şekil 1B&#39;ye bakınız. Not: PCR ürünleri birkaç hafta Transfeksiyondan önce -20 ° C&#39;de muhafaza edilebilir </li></ol> 3. 96-çukurlu transfeksiyonu <ol><li> T. kullanın brucei procyclic formu hücre hattı bu prosedür için SMOXP9 10 ve FCS 10% 10 içeren SDM-79 medya büyür. </li><li> Transfeksiyon başına 1 x 10 7 hücre kullanın (1.1 x 10 9 hücrelerinin toplam) N proteinin terminalinden ve transfeksiyon başına 2 x 10 7 hücreleri üzerinde etiketleme (2.2 x 10 9 hücrelerinin toplamı) C terminali üzerindeki etiketleme protein. Transfeksiyondan önce birkaç gün orta log (1.2 x 10 6 -1 x 10 7 hücre / ml), hücrelerin korumak ve 5-8 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir yoğunlukta hücreler transfeksiyon için hasat edilir. </li><li> Transfeksiyon için, dondurulmuş PCR ürünleri, oda sıcaklığında çözülmesine izin verir. </li><li> Bir haem kullanarak hücrelerin sayısıocytometer veya otomatik hücre sayacı. </li><li> 10 dakika boyunca 800 x g&#39;de birden fazla 50 ml tüpler içinde, hücre topağından gerekli sayısı. </li><li> Santrifüj atmak yüzer sonra 10 ml hücrelerin tekrar süspansiyon modifiye cytomix (0,8 mM EGTA, 24 mM KCI, 0.15 mM CaCl2, 10 mM potasyum fosfat tamponu pH 7.6, 25 mM HEPES-KOH pH 7.6, 2.6 mM MgCl2, % 0.5 (a / h) glukoz, tüp başına 100 ug / ml BSA, 1 mM hipoksantin, 144 mM sükroz). tek bir tüp bütün hücre çözüm aktarın ve 10 dakika boyunca 800 x g hızında tekrar döndürür. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, süpernatant atılır ve 5 x 10 7 hücre / ml&#39;lik bir son konsantrasyon için modifiye cytomix 23 ml tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Hücreler eğirme iken, 4 x 24 oyuklu doku kültür plakalarının her bir oyuğuna SDM-79 ortam 1 ml. Plakalar AD Etiket ve plaka yönünü yardımcı olmak için kalıcı bir kalem her tabakta etrafında iyi A1 bir halka çizin. </li><li> Elektroporatör plaka işleyicisi bağlayın. electropora üzerindetor birimi 1500 V gerilim, 100 mikro-saniyeye darbe uzunluğu ve 12 darbe sayısını ve 500 msn darbe aralığını ayarlamak. plaka işleyicisi, bu o Electroporator elektroporasyon plakasının 12 sütun her tek bir darbe uygulamak olmasını sağlar 1&#39;e darbe sayımı ayarlayın. </li><li> P200 12 kanalı çok kanallı pipet kullanarak, 96 oyuklu tek elektroporasyon plakaları, 4 mm bir boşluk PCR plakadan PCR reaksiyonları aktarın. </li><li> Hücreler, döndürülmüştür edilmiş ve 5 x 10 7 hücre / ml (Aşama 3.7) nihai konsantrasyona kadar yeniden süspanse edilir zaman, reaktif hazneye aktarılır. Pipet P200 12 kanalı çok kanallı pipet kullanılarak elektroporasyon plakanın her oyuğuna hücre çözeltisinin 200 ul, pipetleme PCR ürünü ile karıştırın. </li><li> doku kullanarak kısa devreyi önlemek için levhanın üstüne herhangi damlaların çıkarılması. </li><li> elektroporasyon plaka, pos üstüne plaka ambalajında ​​sunulan sızdırmazlık sürünBunu itioning her sütunun üst ve alt kısmında ortaya elektrotlar için delikler bırakmak üzere. filmi rehberlik etmek için kullanılan yükseltilmiş noktaları kapsayan kaçının. </li><li> Plaka işleyicisi içine elektroporasyon plakasını yükleyin ve kapağını kapatın. Electroporator ünitesindeki Basın &#39;Darbe&#39;. </li><li> Elektroporasyondan sonra, hızlı bir şekilde 4 x 24 oyuklu doku kültür plakalarına 96 oyuklu elektroporasyon hücreleri plakadan aktarın. Hücreleri aktarmak için, her uç eksik olan bir P200 12 kanal çok kanallı pipet kullanın gibi kalan 6 ipuçları 24-iyi doku kültürü plakası üzerinde 6 satır ile hizaya söyledi. 24 oyuklu doku kültür plakaları (Şekil 2A) için önceden belirlenmiş bir modelde 96 oyuklu electroporations plakalarda Elektroporasyona tabi tutulan hücreler aktarın. </li><li> P200 pipet uçları hazırlayın - Her 96-kuyu transfeksiyon kaldırıldı her sütun ile 96 ipuçları 2 kutu hazırlamak için. <ol><li> 96-kuyu elektroporasyon plaka üzerinde Transferi kuyuları A1 / A3 / A5 / A7 / A9 / A11 içinSatır B içine 24-iyi doku kültürü plakaları bir satır A, B1 / B3 / B5 / B7 / B9 / B11 plaka, C1 / C3 / C5 / C7 / C9 / C11 satır C içine ve D1 / D3 / D5 / D7 24 plaka 96 oyuklu plaka 6 kuyu her bir grubu transfer edildikten sonra satır D içine / D9 / D11, 96 oyuklu bir plaka içerisinde Kaynaklar akabinde de 24 karşılık gelen kuyu ortamı ile yıkanır çukurlu plaka ve yıkama daha sonra 24 oyuklu plaka oyuklarına geri aktarılmaktadır. </li><li> Satır B içine E1 / E3 / E5 / E7 / E9 / E11 96-kuyu elektroporasyon plaka üzerinde 24 plaka B satır A, F1 / F3 / F5 / F7 / F9 / F11 transferi kuyuları, G1 / G3 / G5 / 96 satır C ve H1 / H3 / H5 / H7 / H9 24 plaka için 96-plaka 6 kuyu her set transfer edildikten sonra sıra D içine / H11, kuyu içine G7 / G9 / G11 eh plaka daha sonra 24 oyuklu plaka karşılık gelen kuyu ortamı ile yıkanır ve yıkama, sonra 24-çukurlu plaka içindeki yuvalara geri aktarılmaktadır. </li><li> 24 plaka Cı satır A, B2 / B4 / B6 / B 96 oyuklu elektroporasyon plaka Aktarım kuyu A2 / A4 / A6 / A8 / A10 / A128 / B10 / B12 sıra B içine, C2 / C4 / C6 / C8 / C10 / C12 sıra C ve 96 6 kuyuların her set transfer edildikten sonra sıra D içine D2 / D4 / D6 / D8 / D10 / D12 içine 24 oyuklu plakaya eh levha, 96 oyuklu bir plaka içerisinde kuyular daha sonra 24 oyuklu plaka karşılık gelen kuyu ortamı ile yıkanır ve yıkama, sonra 24-çukurlu plaka içindeki yuvalara geri aktarılmaktadır. </li><li> Aktarım kuyuları E2 / E4 / E6 / E8 / E10 / E12 24-plaka D satır A 96-kuyu elektroporasyon plaka üzerinde, F2 / F4 / F6 / F8 / F10 / satır B içine F12, G2 / G4 / G6 / satır C içine G8 / G10 / G12 ve H2 / H4 / H6 / H8 / H10 / H12 satır D. içine 24 plaka için 96-plaka 6 kuyu her set transferinden sonra, 96 kuyu eh plaka daha sonra 24 oyuklu plaka karşılık gelen kuyu ortamı ile yıkanır ve yıkama, sonra 24-çukurlu plaka içindeki yuvalara geri aktarılmaktadır. </li></ol></li><li> ters bir faz kontrast mikroskop kullanarak hücreleri kontrol etmek için her sütundan iyi 1 inceleyin. Bir canlı ve ölü hücreleri bir karışımı olacaktırHücre kalıntılarının önemli miktarda. Onlar faz kontrast mikroskobu altında parlak olacak ve hareket edilecektir çünkü canlı hücreler ölü hücrelerden ayırt edilebilir. </li><li> sıkı bir mühür oluşturan bir kapak ile bir temiz plastik bir kutu içinde, 24 kuyucuklu plaklar yerleştirin. 28 ° C inkübatör kutuyu koydu. </li><li> HR 6-8 arasında, daha sonra her bir oyuğa 2x seçici antibiyotiği içeren% 10 FCS ile SDM-79 1 ml. Deneyimlerimize göre, genler, N terminalinden etiketlendikten hücre çizgileri seçici ilacın daha yüksek konsantrasyonlarına karşı dirençlidir. Bu nedenle, N-terminaline etiketleme, örnek olarak Blasticidin kullanılarak mi ve C terminali üzerindeki etiketleme / ml Blasticidin 10 ug bir son konsantrasyon gerektiren blastisidin / 20 ug bir son konsantrasyon gerektirmektedir. Not: Transgenik hücre hatları transfeksiyondan sonra görünür 9-10 gün olacak. </li><li> En az iki kez, taze ilaç ve medya analizden önce geçit. Şekil 2B, tipik bir 96 oyuklu transfe sonuçlarını gösterirN ucundan 96 farklı proteini etiketlenmesi için ction. sağlıklı, ilaca dirençli hücreler içerip içermediğini belirlemek için faz kontrast mikroskobu ile de her değerlendirin. Sağlıklı bir kuyu faz sözleşme mikroskopi parlak ağırlıklı (&lt;% 95) yüksek derecede aktif hücreleri içerir. Epifloresans mikroskobu veya western blot ile sonraki analiz proteini başarıyla etiketli olup olmadığını belirlemek için gereklidir. </li></ol>

<ol><li>Kelly, S., Reed, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics+in+Trypanosoma+brucei%3A+a+collection+of+vectors+for+the+expression+of+tagged+proteins+from+endogenous+and+ectopic+gene+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Functional genomics in Trypanosoma brucei: a collection of vectors for the expression of tagged proteins from endogenous and ectopic gene loci.</a> Mol Biochem Parasitol. 154 (1), 103-109 (2007).</li>
<li>Wirtz, L. E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tightly+regulated+inducible+expression+system+for+conditional+gene+knock-outs+and+dominant-negative+genetics+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 99 (1), 89-101 (1999).</li>
<li>Shi, H., Djikeng, A., Mark, T., Wirtz, L. E., Tschudi, C., Ullu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+interference+in+Trypanosoma+brucei+by+heritable+and+inducible+double-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Genetic interference in Trypanosoma brucei by heritable and inducible double-stranded RNA.</a> RNA. 6 (7), New York, NY. 1069-1076 (2000).</li>
<li>Alsford, S., Turner, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+phenotyping+using+parallel+sequencing+of+RNA+interference+targets+in+the+African+trypanosome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">High-throughput phenotyping using parallel sequencing of RNA interference targets in the African trypanosome.</a> Genome Res. 21 (6), 915-924 (2011).</li>
<li>Alsford, S., Eckert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+decoding+of+antitrypanosomal+drug+efficacy+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-throughput decoding of antitrypanosomal drug efficacy and resistance.</a> Nature. 482 (7384), 232-236 (2012).</li>
<li>Mony, B. M., MacGregor, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+dissection+of+the+quorum+sensing+signalling+pathway+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide dissection of the quorum sensing signalling pathway in Trypanosoma brucei.</a> Nature. 505 (7485), 681-685 (2014).</li>
<li>Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Séraphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration+%3A+Abstract+Nature+Biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration : Abstract Nature Biotechnology.</a> Nature Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li>
<li>Los, G. V., Encell, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HaloTag%3A+A+Novel+Protein+Labeling+Technology+for+Cell+Imaging+and+Protein+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis.</a> ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).</li>
<li>Dean, S., Sunter, J. D., Wheeler, R. J., Hodkinson, I., Gluenz, E., Gull, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolkit+enabling+efficient%2C+scalable+and+reproducible+gene+tagging+in+trypanosomatids%5BTitle%5D)+AND+%22Open+biol%22%5BJournal%5D)">A toolkit enabling efficient, scalable and reproducible gene tagging in trypanosomatids.</a> Open biol. 5 (1), 140197(2015).</li>
<li>Poon, S. K., Peacock, L., Gibson, W., Gull, K., Kelly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+and+optimized+single+marker+system+for+generating+Trypanosoma+brucei+cell+lines+expressing+T7+RNA+polymerase+and+the+tetracycline+repressor%5BTitle%5D)+AND+%22Open+biol%22%5BJournal%5D)">A modular and optimized single marker system for generating Trypanosoma brucei cell lines expressing T7 RNA polymerase and the tetracycline repressor.</a> Open biol. 2 (2), 110037(2012).</li>
<li>Lam, S. S., Martell, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+meth%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature meth. 12 (1), 51-54 (2014).</li>
<li>Shu, X., Lev-Ram, V., Deerinck, T. J., Qi, Y., Ramko, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+tag+for+correlated+light+and+electron+microscopy+of+intact+cells%2C+tissues%2C+and+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms.</a> PLoS biology. , (2011).</li>
<li>Schimanski, B., Nguyen, T. N., Günzl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+tandem+affinity+purification+of+trypanosome+protein+complexes+based+on+a+novel+epitope+combination%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient tandem affinity purification of trypanosome protein complexes based on a novel epitope combination.</a> Eukaryotic Cell. , (2005).</li>
<li>Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+stable+transformation+of+bloodstream+forms+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 153 (2), 220-223 (2007).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Son 5-10 yıl içinde proteomik ve transkriptomik yöntemlerinin duyarlılığı dramatik gelişmeler genler ve bunların ürünlerinin binlerce değerli veriler sağlamıştır. Ancak, araçlar bu proteinlerin fonksiyonu ayak uyduramadı adresi. Bir protein etiketlenmesi işlevini belirlemek için çok sayıda deney kolaylaştırır. Örneğin, bir protein lokalizasyonu ve ko-lokalizasyon çalışmaları kolaylaştırmak için farklı renklerin çeşitli bir floresan protein kaynaştırılabilir. Etiketler Böyle APEX2 veya miniSOG 11,12 olarak elektron mikroskobu, için geliştirilmiş, etiketli protein ultrastrüktürel lokalizasyonu izin verir. Böyle TAP etiketi ve ProtC-TEV-Prota (PTP) olarak biyokimya için Etiketler 7,13 bağlayıcı ortakların belirlenmesi için ya da in vitro biyokimyasal tayinlerde protein ile ilişkili komplekslerin saflaştırma izin etiketleyin. protoc başarısı için kritik olan belirli adımlarPCR Master Mix 1&#39;e DMSO eklenmesi Master Mix 2 Master Mix 2 ticari polimeraz kullanımı ve cytomix elektroporasyon tamponu modifikasyon ilavesinden önce PCR Master Mix 1 dondurma: ol vardır. Deneyimlerimize göre, pozitif olan kaynaklar benzer bir oranını elde etmek için N-terminal etiketleme Transfeksiyonlar için de C ucu etiketleme Transfeksiyonlar için hücreleri iki kat kullanmak gereklidir. tarif edildiği gibi nedenle, tüm adımları yapılmalıdır. Bu teknik böcek procyclic formu tripanosom transfecting zaman başarılı olmak için sadece muhtemeldir. Kan akımı formları ayrıca onlar yüzünden seçici ilaç ilgisi yoktur yoğunluk bağımlı toksisite seçimi sırasında ölme olasılığı, düşük transfeksiyon verimi 14 var. Bu nedenle, önceki protokol kan formu tripanozomlann 9 etiketleme için mevcut en iyi teknolojiyi temsil eder. Ayrıca, trans-olasıdırFection verimlilik belirli bir tripanosom izolatı bağlı olarak değişecektir. Diğer türler ek optimizasyon gerektirebilir - Bu protokol 927 SMOX procyclic formları kullanarak optimize edilmiştir. başarı olasılığını arttırabilir tedbirler şunlardır: PCR amplikonu miktarını artırarak transfeksiyon dahil edilen hücre sayısı artmaktadır. Biz proteinlerin yüzlerce paralel olarak etiketlenmiş edilebilecek bir yöntem mevcut. Bu mevcut büyük veri setlerini tamamlayıcı ve topluma çok değerli bilgiler veren, yerelleştirme ve etkileşimi büyük ölçekli çalışmaları kolaylaştıracaktır. Primer şablonları istek ve plazmidler şablonlar listesinde üzerine mevcuttur edinilebilir: http://www.sdeanresearch.com/

Trypanosoma brucei sığır insan Afrika trypanosomasis ve nagana neden olan bir protozoon bir parazittir. T. brucei nedeniyle yüksek kaliteli genomu, çok sayıda proteomik ve transkriptomiks veri setleri ve iyi gelişmiş moleküler araçlar 1-3 kombinasyonu protein fonksiyonunun analizi için ideal bir organizmadır. Proteomik ve sıralama gelişmeler potansiyel olarak ilginç genlerin 4-6 vurgulamak büyük veri kümelerinde sonuçlandı; Ancak, pek çok gen mevcut veritabanlarında kendileriyle ilişkili çok az bilgi var. Protein fonksiyonel karakterizasyonu yardım etmek için yüksek verimli bir yönteme ihtiyaç duyulmaktadır. etiketli bir proteinin ifade bir proteinin fonksiyonundan içine anlayışlar çokluğu verebilir. Örneğin, bir flüoresan protein veya epitopu ile etiketlenmiş bir proteini PROT hakkında bilgi verir floresan mikroskobu ile lokalize edilebilirEin biyolojik etkisini uygularken olabilir. Seçenek olarak ise, bir musluk 7 ile etiketlenmiş bir protein, HaloTag 8 veya His etiketi biyokimyasal tahlillerde ve etkileşimi ortaklarının tespiti için arıtılabilir. Biz son zamanlarda T. için sağlam bir etiketleme yöntemi geliştirmiştir brucei 9. Bu transfeksiyon için DNA oluşturmak için uzun astar PCR kullanılan ve paralel proteinlerin onlarca etiketleme izin - Mevcut protokollerine büyük bir gelişme. Biz şimdi bir büyüklük sırasına göre procyclic formlarda bu protokolün ölçeklenebilirlik düzeldi. Burada biz, 24 yuvalı plakalar içinde meydana gelen geri kazanım ve seçim ile 96 gözlü plakalara PCR ve transfeksiyon gerçekleştirmek eden bir yöntem sunulmaktadır. Proteinlerin yüzlerce artık paralel olarak etiketlenmiş üzere bu yöntem tüm tripanozom genomunu etiketleme için bir maliyet-etkin ve uygulanabilir bir yöntem sağlar.

<table><tbody><tr><td>Oligonükleotid</td><td>Life teknolojileri</td><td>yalnızca</td><td>tuzdan arındırma (ek arıtma kullanmayın)</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Roche</td><td>Expand HiFi paketine dahildir</td><td>PCR sınıfı</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>olmalıdır herhangi bir saygın</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Expand HiFi polimeraz</td><td>Roche</td><td>11759078001</td><td></td></tr><tr><td>BTX ECM830</td><td>Harvard Aparat Elektroporatörü</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT-200 plaka işleyici</td><td>Harvard Aparatı</td><td>HT-200</td><td>96 oyuklu eletroplate'leri tutar</td></tr><tr><td>MOS 96 ELECTROPLATE 4 mm</td><td>Harvard Aparatı</td><td>45-0452</td><td>96 oyuklu elektroporasyon için elektrolizle</td></tr><tr><td>Blasticidin S Hidroklorür</td><td>Melford</td><td>3513-03-9</td><td></td></tr><tr><td>Higromisin b Altın</td><td>İnvivojen</td><td>ant-hg-1</td><td></td></tr><tr><td>Fleomisin</td><td>Melford</td><td>P0187</td><td></td></tr><tr><td>225 cm TC Şişe, eğimli boyunlu, fenolik kapaklı</td><td>Appletonwoods</td><td>BC006</td><td></td></tr><tr><td>24 kuyulu kültür</td><td>plakaları Appletonwoods</td><td>BC017</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&reg; PCR Soğutucu, 96 kuyulu plakalar ve PCR tüpleri için buzsuz soğuk hava deposu sistemi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z606634-1EA</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu Multiply&reg; Yan etekli PCR plakası</td><td>Sarstedt</td><td>72.1979.203</td><td></td></tr></tbody></table>

yüksek verimli gen etiketleme içinde<em&gt; trypanosoma brucei</em

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Kütle spektrometresi, dizileme ve biyoinformatikteki gelişmeler, potansiyel olarak ilginç genlerin büyük veri kümelerini oluşturmuştur. Bu proteinlerin etiketlenmesi, hücre içindeki lokalizasyonlarını belirleyerek ve etkileşim ortağı tanımlamasını sağlayarak işlevleri hakkında fikir verebilir. Kısa bir süre önce, endojen lokustan etiketli bir proteini eksprese eden Trypanosoma brucei hücre dizileri oluşturmak için hızlı ve ölçeklenebilir bir yöntem yayınladık. Yöntem, uzun primer PCR ile birleştiğinde, her iki terminalde de etiketlenmiş bir proteini kodlamak için bir geni modifiye etmek için kullanılabilen, ürettiğimiz bir plazmide dayanıyordu. Bu, düzinelerce tripanozom proteininin paralel olarak etiketlenmesine izin vererek, ilgilenilen aday genlerin büyük ölçekli doğrulamasını kolaylaştırır. Bu sistem, proteinleri lokalizasyon (bir floresan proteini, epitop etiketi veya elektron mikroskobu etiketi kullanılarak) veya biyokimya (TAP (tandem afinite saflaştırması) etiketi gibi saflaştırma için etiketler kullanarak) etiketlemek için kullanılabilir. Burada, 24 oyuklu plakalarda meydana gelen transgenik tripanozomların geri kazanımı ve seçimi ile 96 oyuklu plakalarda uzun primer PCR ve elektroporasyonu gerçekleştirmek için bir protokol açıklıyoruz. Bu iş akışı ile yüzlerce protein paralel olarak etiketlenebilir; Bu, önceki protokolümüze göre büyük bir iyileştirmedir ve genom ölçeğinde etiketleme artık mümkündür.

Bu temsilci transfeksiyon, primerler TagIT Perl 9 kullanılarak tasarlanmış ve ticari sentezlendi. 96 gözlü PCR yapılmış ve tarif edildiği gibi (Şekil 1A) halinde doğrulandı; Bu örnekte, 95/96 PCR (Şekil 1B) başarılı olmuştur. Bizim tecrübelerimize göre, başarılı bir PCR yol açmaz orijinal astar veya yeniden sentezlenmiş primerler ile ya başarısız tepkileri tekrarı. Amplikonlar elektroporasyon (Şekil 2A) için 96-çukurlu elektroporasyon plakalara aktarılmış ve daha sonra geri kazanımı ve seçim için 24 oyuklu bir kültür plakalarına aktarılmıştır. Seçim oluşmasına izin vermek için yeterli bir süre sonra, kaynaklar daha fazla analiz öncesinde hayatta kalmak için değerlendirildi. Bu örnekte, 88/96 kuyular (% 92) 15 gün sonra seçim pozitif. <img alt = &quot;Şekil 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54342 / 54342fig1.jpg&quot; /&gt; Şekil 1:. PCR doğrulama için agaroz jel 96-PCR plaka PCR ürünleri aktarmak için uzun astar PCR (A) Pattern Doğrulama. (B), N terminalinden 95 genleri etiketleme için temsili bir 96 gözlü PCR doğrulama jeli ve transfeksiyon bir negatif kontrol olarak hareket etme 5 hedefleme homoloji ihtiva eden 1 amplikon. Numuneler% 1 üzerine yüklenmiş (w / v) agaroz jel ve 30 dakika boyunca 100 V çözümlenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54342/54342fig2.jpg" /> Şekil 2: 96 oyuklu elektroporasyon ve seçme 96 oyuklu elektroporasyon topraklarda gelen Elektroporasyona tabi tutulan hücreler aktarılması için (A) Modeli.24 oyuklu doku kültür plakalarına örn. (B) şematik bir 24-yuvalı plakalar içinde bir seçim 15 gün sonra, tipik bir ölü / canlı puanlama gösteriliyor. Yeşil gri sadece ölü hücreleri ile iyi bir temsil, başarılı bir transfeksiyon temsil eder. Bu örnekte, kuyuların 88/96 (% 92) başarılı bir şekilde transfekte parazitler içeriyordu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Bir proteine bir etiket eklemek, onun işlevi hakkında fikir edinmenin güçlü bir yoludur. Burada, yüzlerce Trypanosoma brucei proteinini paralel olarak endojen olarak etiketlemek için bir protokol açıklıyoruz, böylece genom ölçeği etiketlemesi elde edilebilir.

Yüksek verimli Gen Etiketleme içinde<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

Bu yöntemin genel amacı, Trypanosoma brucei'deki proteinleri yüksek kapasiteli bir şekilde etiketlemektir. Bu yöntem, kinetoplastid alanı ile ilgili olarak geniş protein gruplarının lokalizasyonu ve potansiyel fonksiyonları hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, çok sayıda proteinin paralel olarak hızlı ve kolay bir şekilde etiketlenebilmesidir.Bu yöntem lokalizasyon hakkında bilgi sağlayabilse de, diğer etiketler kullanılarak geniş protein kohortlarının etkileşimleri de incelenebilir. Örneğin, bir bio-ID yakınlık haritalama deneyi için BirA etiketi kullanılabilir. Prosedürü, laboratuvarımızdan araştırma asistanı Ross Madden uygulamalı olarak gösterecektir.Bu prosedüre başlamadan önce, 96 kuyucuklu bir PCR soğutucusunu -80 °C dondurucuda önceden dondurun. 10 ml'lik bir tüpte aşağıdakileri birleştirerek Master Mix A'yı hazırlayın: 100 µL distile deiyonize su, 105 µL PCR sınıfı DMSO, 105 µL 10 mM dNTP'ler ve 105 µL pPOT kalıbı.Master Mix A'yı bir reaktif rezervuarına boşaltın ve 96 kuyucuklu bir PCR plakasının her bir kuyucuğuna 23 µL Master Mix A paylaştırın. P20 12 kanallı çok kanallı pipet kullanarak, doldurulmuş her kuyucuğa 2 µL 100 µM havuzlanmış primer ekleyin. Plakayı film ile kapatın.Önceden soğutulmuş PCR soğutucusuna yerleştirin ve -80 °C'de en az 20 dakika boyunca donmaya bırakın. PCR Master Mix A'nın dondurulması, spesifik bir hot start polimeraz kullanıldığında bile etkili bir hot start reaksiyonu sağlamak için kritiktir. Bu durum, tekrarlanabilir ve yüksek verimli bir amplifikasyonla sonuçlanır.PCR plakası dondurucudayken, Master Mix B'yi hazırlayın. Bir 10 milliliter tüp içerisinde şunları birleştirin: 2, 048 microliters distile deiyonize su, 525 microliters 10X tampon ve 52.5 microliters polimeraz; böylece plaka başına toplam hacim 2, 626 microliters olur. PCR plakasını ve PCR soğutucusunu minus 80 degrees Celsius dondurucudan çıkarın.Plaka hala PCR soğutucusundayken, her kuyucuktaki donmuş Master Mix A'nın üzerine, toplam reaksiyon hacmi 50 µL olacak şekilde hızlıca 25 µL Master Mix B ekleyin. Bu işlem zaman açısından kritiktir ve Master Mix A çözülmeden tamamlanmalıdır. Plakayı film ile mühürleyin.Termal döngüleyiciyi şu şekilde ayarlayın: 10 dakika boyunca 94 °C, ardından 30 döngü boyunca 15 saniye 94 °C, 30 saniye 65 °C ve iki dakika 72 °C, son olarak yedi dakikalık 72 °C final uzatma süresi. Blok 94 °C'ye ulaştıktan sonra, PCR plakasını termal döngüleyiciye yerleştirin ve amplifikasyon programını başlatın.Bu prosedüre, Tris-asetat EDTA veya TAE yürütme tamponunda, dört kuyu sırası içeren büyük bir %1'lik agaroz jel hazırlayarak başlayın. Her sıranın birinci ve 28. kuyucuklarına bir kb'lık DNA merdiveni yükleyin. Bir sonraki adım, PCR ürününden iki mikrolitreyi, DNA yükleme tamponu kullanmadan, burada gösterilen düzene göre jelin her bir şeridine doğrudan aktarmaktır.Örneğin, PCR plakasının A ve B satırlarındaki PCR ürünleri, sırasıyla jelin ilk satırındaki tek ve çift numaralı kuyucuklara yüklenir. Amplikonların kontamine olma olasılığını azaltmak için hızlı çalışarak, PCR plakasının A satırındaki PCR ürünlerini jelin ilk satırındaki tek numaralı kuyucuklara yükleyin. Ardından, PCR plakasının B satırındaki PCR ürünlerini jelin ilk satırındaki çift numaralı kuyucuklara yükleyin.PCR plakasının C ve D satırlarındaki PCR ürünlerini aynı düzene göre, C satırını tek numaralı kuyucuklara ve D satırını jelinin ikinci sırasındaki çift numaralı kuyucuklara gelecek şekilde yükleyin. PCR plakasındaki her kuyucuk jele yüklenene kadar bu yükleme düzenine devam edin. Jeli çalıştırma tankına yerleştirin ve tankı, jel tamamen suya gömülene kadar TAE çalıştırma tamponu ile doldurun.30 dakika boyunca 100 volt ile çalıştırın. UV transilüminatör kullanarak görselleştirin. Burada, 96 PCR'dan 95'inin başarılı olduğu temsili bir 96 kuyucuklu PCR doğrulama agaroz jeli gösterilmektedir.Başarısız olan PCR örneği H11'di. Bu prosedürde, Trypanosoma brucei procyklic formu SMOXP9 hücre hattı kullanılmaktadır. Hücreleri protokol metninde açıklandığı şekilde uygun yoğunluğa kadar büyütün ve gereken sayıda hücreyi 10 dakika boyunca 800 ×g'de santrifüj ederek toplayın.Hücreler santrifüj edilirken elektroporasyon hazırlıklarına başlayın. Plaka taşıyıcıyı elektroporatöre bağlayın. Elektroporatör ünitesinde voltajı 1.500 volt, pals süresini 100 mikrosaniye, pals sayısını 12 ve pals aralığını 500 milisaniye olarak ayarlayın.Plaka taşıyıcıda, darbe sayısını bir olarak ayarlayın. P200 12 kanallı çok kanallı pipet kullanarak, PCR reaksiyonlarını PCR plakasından 96 kuyucuklu tek kullanımlık bir elektroporasyon plakasına aktarın. Hücreleri 10 mililitre modifiye cytomix ile yıkayın ve 800 ×g'de 10 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin.Hücreleri, mililitre başına 5 × 10⁷ hücre nihai konsantrasyonu elde edecek şekilde 23 mililitre modifiye cytomix içerisinde yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu bir reaktif rezervuarına aktarın. Elektroporasyon plakasının her bir kuyucuğuna 200 µL hücre çözeltisi pipetleyin ve pipetleme yoluyla PCR ürünü ile karıştırın.Kısa devreleri önlemek için plakanın üzerindeki damlacıkları bir peçete yardımıyla temizleyin. Elektroporasyon plakasının üst kısmına sızdırmazlık filmi uygulayın; filmi, her sütunun üst ve alt kısmındaki elektrot delikleri açıkta kalacak şekilde konumlandırın. Filmi yönlendirmek için kullanılan yükseltilmiş noktaların üzerini kapatmaktan kaçının.Elektroporasyon plakasını plaka işleyiciye yerleştirin ve kapağı kapatın. Elektroporatör ünitesi üzerindeki "pulse" düğmesine basın. Elektroporasyon sonrası hücreler, toparlanma için her kuyucukta bir mililitre SDM-79 medyumu içeren dört adet 24 kuyucuklu doku kültürü plakasına hızla aktarılmalıdır.Kalan altı ucun 24 kuyucuklu doku kültürü plağındaki altı sıra ile hizalanması için, her iki uçtan birinin çıkarıldığı bir P200 12 kanallı çok kanallı pipet kullanın. Hücreler 96 kuyucuklu plaktan 24 kuyucuklu plağa aktarıldıktan sonra, 96 kuyucuklu plaktaki kuyucukları, 24 kuyucuklu plaktaki karşılık gelen kuyucuklardan alınan besiyeri ile yıkayın. Ardından, yıkama sıvısını tekrar 24 kuyucuklu plaktaki kuyucuklara aktarın.Elektropore edilmiş hücreleri, 96 kuyucuklu elektroporasyon plakasından 24 kuyucuklu doku kültürü plakalarına burada gösterilen önceden tanımlanmış düzende aktarın. Örneğin, 96 kuyucuklu plakanın A sırasındaki tek numaralı kuyucuklardaki hücreler Plaka A'nın A sırasına, 96 kuyucuklu plakanın A sırasındaki çift numaralı kuyucuklardaki hücreler ise Plaka C'nin A sırasına aktarılır. Hücrelerin 96 kuyucuklu plakadan 24 kuyucuklu plakaya her aktarım işleminden sonra, 96 kuyucuklu plakadaki kuyucukları, 24 kuyucuklu plakanın ilgili sırasındaki besiyeri ile yıkayın. Ardından, yıkama sıvısını tekrar 24 kuyucuklu plakaya aktarın.Hücrelerin 24 kuyucuklu plakalara aktarılması karmaşık bir işlemdir, ancak ortaya çıkan hücre hatlarını doğru gen ID'si ile takip edebilmeniz gerekir. Hücrelerin sağlıklı kalması için bu adımın hızlıca yapılması kritik öneme sahiptir. Elektropore edilmiş tüm hücreler dört adet 24 kuyucuklu plakaya aktarıldıktan sonra, 24 kuyucuklu plakaları sıkıca kapanan kapaklı temiz bir plastik kutuya yerleştirin. Kutuyu 28 °C'lik bir inkübatöre koyun.Altı ila sekiz saat sonra, her bir kuyucuğa seçici antibiyotik içeren %10 FCS'li 1 mL SDM-79 ekleyin. Transgenik hücre hatları görünür hale gelene kadar 28 °C'de dokuz ila 10 gün inkübe edin. Uç terminale 96 farklı protein etiketlemek için yapılan 96 kuyucuklu transfeksiyondan sonra hücreler, recovery ve seçilim için 24 kuyucuklu doku kültürü plaklarına aktarılır.Ardından, her bir kuyucuk sağlıklı, ilaca dirençli hücreler içerip içermediğini belirlemek için değerlendirilir. Sağlıklı bir kuyucuk, ağırlıklı olarak faz-kontrast mikroskobunda parlak görünen, yüksek aktiviteye sahip hücreler içerir. Bu örnek şemada yeşil, başarılı transfeksiyon gerçekleştirilmiş bir kuyucuğu; gri ise sadece ölü hücrelerin bulunduğu bir kuyucuğu temsil etmektedir.15 günlük seleksiyonun ardından, 96 kuyucuğun 88'i veya %92'si başarıyla transfekte edilmiş parazitler içermektedir. Yöntem uzmanlaşıldığında, hücrelerin sayılmasından elektroporasyon sonrası plakalanmasına kadar geçen süre yaklaşık bir saat olacaktır. Bu prosedür uygulanırken, selektif ilaçların transfeksiyondan altı ila sekiz saat sonra eklenmesi gerektiğini hatırlamak önemlidir.Bu videoyu izledikten sonra, Trypanosoma brucei'de geniş protein kohortlarının nasıl etiketleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

high-throughput-gene-tagging-in-trypanosoma-brucei

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Telomerler kromozom istikrar için çok önemlidir ve telomer G-çıkıntı yapısı, telomeraz aracılı telomer bakımı için önemlidir. Biz son zamanlarda telomer G-çıkıntı yapı tespit etmek için iki yöntem...

Telomer G-çıkıntı Yapısı incelenmesi Trypanosoma brucei</em

Burada, tip I ve tip II olarak kullanmak için bir yöntem...

Genetik Manipülasyon<em&gt; Δku80</emFonksiyonel Genomik Analiz&gt; Suşlarının<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Afrika tripanozomlarındaki glikozom dinamiklerinin, elektron ve floresan mikroskobu gibi geleneksel hücre biyolojisi teknikleriyle incelenmesi zordur.  Dinamik organel davranışını gözlemlemenin bir yolu olarak, canlı parazitlerde gerçek zamanlı glikozom dinamiklerini izlemek için akış sitometrisi ile birlikte bir floresan-organel raportör sistemi kullanılmıştır.

Floresan Proteinleri kullanarak Afrika tripanosom içinde Glycosome Dynamics Monitör

Tripanosomatid patojenlerde benzersiz RNA düzenleme sürecini hedefleyen kimyasalların yüksek verimli taramasına uygulanabilen, oldukça hassas ribozim bazlı bir test bu yazıda açıklanmaktadır. İnhibitörler, RNA düzenleme sürecinin hipoteze dayalı analizi için araçlar olarak ve nihayetinde terapötik olarak kullanılabilir.

Tripanozomlann RNA Düzenleme karşı ilaçlar Tarama için bir Muhabiri olarak RNA Catalyst

Bu el yazması, geç evre enfeksiyonun izlenmesini sağlamak için Afrika tripanozomlarının biyolüminesan bir suşunun kullanımını açıklar ve in vivo canlı görüntülemenin merkezi sinir sistemi içindeki enfeksiyonları gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için nasıl kullanılabileceğini gösterir.

Biyoparlaklık Görüntüleme Afrika Trypanosomiasis Geç Evre Enfeksiyon Algılama için

İn vitro olarak yetiştirilen Afrika tripanozomları, düşük bir oranda antijenik varyasyona uğrar, öyle ki popülasyonlar, baskın bir varyant yüzey glikoprotein (VSG) tipini ifade eden parazitlerden ve küçük bir "anahtarlamalı" varyant popülasyonundan oluşur.  Bu protokol, bu popülasyonları tespit etmek ve ölçmek için hızlı bir yöntemi tanımlar.

Algılama<em&gt; Trypanosoma brucei</emManyetik Aktif Hücre Sorting ve Akış Sitometrisi ile&gt; Varyant Yüzey Glikoprotein Değiştirme

Trypanosoma cruzi Ajan Chagas hastalığının klinik olarak tanınan patoloji aniden geliştirmek uzun ömürlü asemptomatik enfeksiyondan üretir. Aşağıdaki araştırma Protokolü cinsel üst nesneden döl için aktarılan T. cruzi enfeksiyon çözülmeye bir kısa vadede ailesi tabanlı epidemiyolojik çalışma açıklar.

Naive arkadaşları için kadın ve erkek üzerinden Amerikan Tripanozomlar cinsel iletim

Bu yöntem kan trypanosome ayrılma memeli kan hücreleri daha az negatif olmak onların yüzey şarj bağlı olarak değişir. Enfekte kan yerleştirilir ve bir anyon değiştirici sütun tedavi. Bu yöntem, en uygun teşhis için Afrika tripanozomiyasına, immünolojik, biyolojik, biyokimyasal, ilaç ve moleküler biyoloji İncelemeler için saflaştırılmış parazitler sağlar.

Afrika, anyon-değiştiriciler (Diethylaminoethyl-selüloz sütunlar) tarafından kandan da dahil olmak üzere hücre dışı Tripanozomlar arıtma

Burada, CRISPR/Cas9 sistemini kullanarak , Trypanosoma cruzi 'nin ekstrellüler amastigote içine bir gen nakavt tanıtmak için bir protokol açıklanmaktadır. Büyüme fenotipi ya akenik amastigote kültürün hücre sayımı ya da ana hücre istilasından sonra hücreli formları proliferasyonu ile takip edilebilir.

CRISPR/Cas9 sistemi kullanılarak Trypanosoma cruzi 'Nin Amastigote aşamasına doğrudan bir gene Knockout tanıtımı

Chagas hastalığının etken maddesi olan Trypanosoma cruzi'nin üç yaşam döngüsü aşamasında β-galaktosidaz aktivitesini ölçen yüksek verimli bir kolorimetrik tahlil tanımladık. Bu tahlil, tripanosidal bileşikleri kolay, hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde tanımlamak için kullanılabilir.

İn Vitro β-galaktosidaz İfade Eden Parazitleri Kullanarak Trypanosoma cruzi'nin Tüm Yaşam Döngüsü Aşamalarına Karşı İlaç Taraması

PH'ın, Afrika tripanozomlarının kan dolaşımı formunun glikozomlarındaki çevresel ipuçlarına nasıl tepki verdiğini incelemek için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yaklaşım, pH dinamiklerini ölçmek için akış sitometrisi ile birlikte pH'a duyarlı kalıtsal bir protein sensörünü hem zaman seyri tahlili olarak hem de yüksek verimli bir ekran formatında içerir.

Canlı Trypanosoma brucei'de Dinamik Glikozomal pH Değişikliklerinin Ölçülmesi

Öğrenin, Trypanosoma brucei'de yüksek verimli gen etiketleme yöntemiyle protein lokalizasyonu ve fonksiyonunu nasıl incelersiniz. Bu protokol, büyük ölçekli genomik çalışmalar için paralel etiketlemeyi mümkün kılar.

Yüksek verimli Gen Etiketleme içinde

Daha fazla video keşfet