Yüksek verimli Gen Etiketleme içinde

Bu yöntemin genel amacı, Trypanosoma brucei'deki proteinleri yüksek kapasiteli bir şekilde etiketlemektir. Bu yöntem, kinetoplastid alanı ile ilgili olarak geniş protein gruplarının lokalizasyonu ve potansiyel fonksiyonları hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, çok sayıda proteinin paralel olarak hızlı ve kolay bir şekilde etiketlenebilmesidir.

Bu yöntem lokalizasyon hakkında bilgi sağlayabilse de, diğer etiketler kullanılarak geniş protein kohortlarının etkileşimleri de incelenebilir. Örneğin, bir bio-ID yakınlık haritalama deneyi için BirA etiketi kullanılabilir. Prosedürü, laboratuvarımızdan araştırma asistanı Ross Madden uygulamalı olarak gösterecektir.

Bu prosedüre başlamadan önce, 96 kuyucuklu bir PCR soğutucusunu -80 °C dondurucuda önceden dondurun. 10 ml'lik bir tüpte aşağıdakileri birleştirerek Master Mix A'yı hazırlayın: 100 µL distile deiyonize su, 105 µL PCR sınıfı DMSO, 105 µL 10 mM dNTP'ler ve 105 µL pPOT kalıbı.

Master Mix A'yı bir reaktif rezervuarına boşaltın ve 96 kuyucuklu bir PCR plakasının her bir kuyucuğuna 23 µL Master Mix A paylaştırın. P20 12 kanallı çok kanallı pipet kullanarak, doldurulmuş her kuyucuğa 2 µL 100 µM havuzlanmış primer ekleyin. Plakayı film ile kapatın.

Önceden soğutulmuş PCR soğutucusuna yerleştirin ve -80 °C'de en az 20 dakika boyunca donmaya bırakın. PCR Master Mix A'nın dondurulması, spesifik bir hot start polimeraz kullanıldığında bile etkili bir hot start reaksiyonu sağlamak için kritiktir. Bu durum, tekrarlanabilir ve yüksek verimli bir amplifikasyonla sonuçlanır.

PCR plakası dondurucudayken, Master Mix B'yi hazırlayın. Bir 10 milliliter tüp içerisinde şunları birleştirin: 2, 048 microliters distile deiyonize su, 525 microliters 10X tampon ve 52.5 microliters polimeraz; böylece plaka başına toplam hacim 2, 626 microliters olur. PCR plakasını ve PCR soğutucusunu minus 80 degrees Celsius dondurucudan çıkarın.

Plaka hala PCR soğutucusundayken, her kuyucuktaki donmuş Master Mix A'nın üzerine, toplam reaksiyon hacmi 50 µL olacak şekilde hızlıca 25 µL Master Mix B ekleyin. Bu işlem zaman açısından kritiktir ve Master Mix A çözülmeden tamamlanmalıdır. Plakayı film ile mühürleyin.

Termal döngüleyiciyi şu şekilde ayarlayın: 10 dakika boyunca 94 °C, ardından 30 döngü boyunca 15 saniye 94 °C, 30 saniye 65 °C ve iki dakika 72 °C, son olarak yedi dakikalık 72 °C final uzatma süresi. Blok 94 °C'ye ulaştıktan sonra, PCR plakasını termal döngüleyiciye yerleştirin ve amplifikasyon programını başlatın.

Bu prosedüre, Tris-asetat EDTA veya TAE yürütme tamponunda, dört kuyu sırası içeren büyük bir %1'lik agaroz jel hazırlayarak başlayın. Her sıranın birinci ve 28. kuyucuklarına bir kb'lık DNA merdiveni yükleyin. Bir sonraki adım, PCR ürününden iki mikrolitreyi, DNA yükleme tamponu kullanmadan, burada gösterilen düzene göre jelin her bir şeridine doğrudan aktarmaktır.

Örneğin, PCR plakasının A ve B satırlarındaki PCR ürünleri, sırasıyla jelin ilk satırındaki tek ve çift numaralı kuyucuklara yüklenir. Amplikonların kontamine olma olasılığını azaltmak için hızlı çalışarak, PCR plakasının A satırındaki PCR ürünlerini jelin ilk satırındaki tek numaralı kuyucuklara yükleyin. Ardından, PCR plakasının B satırındaki PCR ürünlerini jelin ilk satırındaki çift numaralı kuyucuklara yükleyin.

PCR plakasının C ve D satırlarındaki PCR ürünlerini aynı düzene göre, C satırını tek numaralı kuyucuklara ve D satırını jelinin ikinci sırasındaki çift numaralı kuyucuklara gelecek şekilde yükleyin. PCR plakasındaki her kuyucuk jele yüklenene kadar bu yükleme düzenine devam edin. Jeli çalıştırma tankına yerleştirin ve tankı, jel tamamen suya gömülene kadar TAE çalıştırma tamponu ile doldurun.

30 dakika boyunca 100 volt ile çalıştırın. UV transilüminatör kullanarak görselleştirin. Burada, 96 PCR'dan 95'inin başarılı olduğu temsili bir 96 kuyucuklu PCR doğrulama agaroz jeli gösterilmektedir.

Başarısız olan PCR örneği H11'di. Bu prosedürde, Trypanosoma brucei procyklic formu SMOXP9 hücre hattı kullanılmaktadır. Hücreleri protokol metninde açıklandığı şekilde uygun yoğunluğa kadar büyütün ve gereken sayıda hücreyi 10 dakika boyunca 800 ×g'de santrifüj ederek toplayın.

Hücreler santrifüj edilirken elektroporasyon hazırlıklarına başlayın. Plaka taşıyıcıyı elektroporatöre bağlayın. Elektroporatör ünitesinde voltajı 1.500 volt, pals süresini 100 mikrosaniye, pals sayısını 12 ve pals aralığını 500 milisaniye olarak ayarlayın.

Plaka taşıyıcıda, darbe sayısını bir olarak ayarlayın. P200 12 kanallı çok kanallı pipet kullanarak, PCR reaksiyonlarını PCR plakasından 96 kuyucuklu tek kullanımlık bir elektroporasyon plakasına aktarın. Hücreleri 10 mililitre modifiye cytomix ile yıkayın ve 800 ×g'de 10 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin.

Hücreleri, mililitre başına 5 × 10⁷ hücre nihai konsantrasyonu elde edecek şekilde 23 mililitre modifiye cytomix içerisinde yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu bir reaktif rezervuarına aktarın. Elektroporasyon plakasının her bir kuyucuğuna 200 µL hücre çözeltisi pipetleyin ve pipetleme yoluyla PCR ürünü ile karıştırın.

Kısa devreleri önlemek için plakanın üzerindeki damlacıkları bir peçete yardımıyla temizleyin. Elektroporasyon plakasının üst kısmına sızdırmazlık filmi uygulayın; filmi, her sütunun üst ve alt kısmındaki elektrot delikleri açıkta kalacak şekilde konumlandırın. Filmi yönlendirmek için kullanılan yükseltilmiş noktaların üzerini kapatmaktan kaçının.

Elektroporasyon plakasını plaka işleyiciye yerleştirin ve kapağı kapatın. Elektroporatör ünitesi üzerindeki "pulse" düğmesine basın. Elektroporasyon sonrası hücreler, toparlanma için her kuyucukta bir mililitre SDM-79 medyumu içeren dört adet 24 kuyucuklu doku kültürü plakasına hızla aktarılmalıdır.

Kalan altı ucun 24 kuyucuklu doku kültürü plağındaki altı sıra ile hizalanması için, her iki uçtan birinin çıkarıldığı bir P200 12 kanallı çok kanallı pipet kullanın. Hücreler 96 kuyucuklu plaktan 24 kuyucuklu plağa aktarıldıktan sonra, 96 kuyucuklu plaktaki kuyucukları, 24 kuyucuklu plaktaki karşılık gelen kuyucuklardan alınan besiyeri ile yıkayın. Ardından, yıkama sıvısını tekrar 24 kuyucuklu plaktaki kuyucuklara aktarın.

Elektropore edilmiş hücreleri, 96 kuyucuklu elektroporasyon plakasından 24 kuyucuklu doku kültürü plakalarına burada gösterilen önceden tanımlanmış düzende aktarın. Örneğin, 96 kuyucuklu plakanın A sırasındaki tek numaralı kuyucuklardaki hücreler Plaka A'nın A sırasına, 96 kuyucuklu plakanın A sırasındaki çift numaralı kuyucuklardaki hücreler ise Plaka C'nin A sırasına aktarılır. Hücrelerin 96 kuyucuklu plakadan 24 kuyucuklu plakaya her aktarım işleminden sonra, 96 kuyucuklu plakadaki kuyucukları, 24 kuyucuklu plakanın ilgili sırasındaki besiyeri ile yıkayın. Ardından, yıkama sıvısını tekrar 24 kuyucuklu plakaya aktarın.

Hücrelerin 24 kuyucuklu plakalara aktarılması karmaşık bir işlemdir, ancak ortaya çıkan hücre hatlarını doğru gen ID'si ile takip edebilmeniz gerekir. Hücrelerin sağlıklı kalması için bu adımın hızlıca yapılması kritik öneme sahiptir. Elektropore edilmiş tüm hücreler dört adet 24 kuyucuklu plakaya aktarıldıktan sonra, 24 kuyucuklu plakaları sıkıca kapanan kapaklı temiz bir plastik kutuya yerleştirin. Kutuyu 28 °C'lik bir inkübatöre koyun.

Altı ila sekiz saat sonra, her bir kuyucuğa seçici antibiyotik içeren %10 FCS'li 1 mL SDM-79 ekleyin. Transgenik hücre hatları görünür hale gelene kadar 28 °C'de dokuz ila 10 gün inkübe edin. Uç terminale 96 farklı protein etiketlemek için yapılan 96 kuyucuklu transfeksiyondan sonra hücreler, recovery ve seçilim için 24 kuyucuklu doku kültürü plaklarına aktarılır.

Ardından, her bir kuyucuk sağlıklı, ilaca dirençli hücreler içerip içermediğini belirlemek için değerlendirilir. Sağlıklı bir kuyucuk, ağırlıklı olarak faz-kontrast mikroskobunda parlak görünen, yüksek aktiviteye sahip hücreler içerir. Bu örnek şemada yeşil, başarılı transfeksiyon gerçekleştirilmiş bir kuyucuğu; gri ise sadece ölü hücrelerin bulunduğu bir kuyucuğu temsil etmektedir.

15 günlük seleksiyonun ardından, 96 kuyucuğun 88'i veya %92'si başarıyla transfekte edilmiş parazitler içermektedir. Yöntem uzmanlaşıldığında, hücrelerin sayılmasından elektroporasyon sonrası plakalanmasına kadar geçen süre yaklaşık bir saat olacaktır. Bu prosedür uygulanırken, selektif ilaçların transfeksiyondan altı ila sekiz saat sonra eklenmesi gerektiğini hatırlamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, Trypanosoma brucei'de geniş protein kohortlarının nasıl etiketleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.