Yüksek verimli Gen Etiketleme içinde Trypanosoma brucei

Bu yöntemin genel amacı, Trypansoma brucei'deki proteinleri yüksek verimli bir şekilde etiketlemektir. Bu yöntem, kinetoplacid alanındaki büyük protein kohortlarının lokalizasyonu ve potansiyel işlevi hakkındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, çok sayıda proteinin paralel olarak hızlı ve kolay bir şekilde etiketlenebilmesidir.

Bu yöntem lokalizasyon hakkında fikir verebilse de, büyük protein kohortlarının etkileşimleri diğer etiketler kullanılarak da araştırılabilir. Örneğin, bir biyo-kimlik yakınlık haritalama deneyi için BirA etiketi. Prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan bir araştırma görevlisi olan Ross Madden olacak.

Bu prosedüre başlamadan önce, eksi 80 santigrat derece dondurucuda 96 oyuklu bir PCR soğutucusunu önceden dondurun. Aşağıdakileri 10 mililitrelik bir tüpte birleştirerek Master Mix A'yı hazırlayın. 2, 100 mikrolitre damıtılmış deiyonize su, 105 mikrolitre PCR dereceli DMSO, 105 mikrolitre 10 milimolar dNTP ve 105 mikrolitre pPOT şablonu.

Master Mix A'yı bir reaktif rezervuarına dökün ve 23 oyuklu bir PCR plakasının her bir oyuğuna 96 mikrolitre Master Mix A'yı alın. P20 12 kanallı çok kanallı bir pipet kullanarak, yüklenen her kuyucuğa iki mikrolitre 100 mikromolar havuzlanmış astar ekleyin. Plakayı filmle kapatın.

Önceden soğutulmuş PCR soğutucusuna yerleştirin ve eksi 20 santigrat derecede en az 80 dakika donmasına izin verin. PCR Master Mix A'nın dondurulması, belirli bir sıcak başlatma polimeraz kullanıldığında bile verimli bir sıcak başlatma reaksiyonu sağlamak için kritik öneme sahiptir. Bu, tekrarlanabilir ve yüksek verimli bir amplifikasyona yol açar.

PCR plakası dondurucudayken, Master Mix B'yi hazırlayın. Aşağıdakileri 10 mililitrelik bir tüpte birleştirin. 2.048 mikrolitre damıtılmış deiyonize su, 525 mikrolitre 10X tampon ve 52.5 mikrolitre polimeraz, plaka başına toplam 2.626 mikrolitre hacim. PCR plakasını ve PCR soğutucusunu eksi 80 santigrat derece dondurucudan çıkarın.

Plaka hala PCR soğutucusunda iken, toplam 25 mikrolitrelik bir reaksiyon hacmi için her bir oyukta donmuş Master Mix A'nın üzerine hızlı bir şekilde 50 mikrolitre Master Mix B ekleyin. Bu zaman açısından kritiktir ve Master Mix A çözülmeden önce tamamlanmalıdır. Plakayı filmle kapatın.

Termal döngüleyiciyi aşağıdaki gibi ayarlayın. 10 dakika boyunca 94 santigrat derece, daha sonra, 15 saniye boyunca 94 santigrat derece, 30 saniye boyunca 65 santigrat derece ve iki dakika boyunca 72 santigrat derece 30 döngü ve ardından yedi dakika boyunca 72 santigrat derece son uzatma periyodu. Blok 94 santigrat dereceye ulaştıktan sonra, PCR plakasını termal döngüleyiciye yükleyin ve amplifikasyon programını başlatın.

Bu prosedüre, Tris-asetat EDTA veya TAE çalışma tamponunda dört sıra kuyucuk ile büyük bir %1 agaroz jeli hazırlayarak başlayın. Her sıranın birinci ve 28. kuyularına bir kb'lık bir DNA merdiveni yükleyin. Bir sonraki adım, burada gösterilen modeli izleyerek, iki mikrolitre PCR ürününü, DNA yükleme tamponu olmadan doğrudan jelin her bir şeridine aktarmaktır.

Örneğin, PCR plakasının A ve B Sıralarından gelen PCR ürünleri, jelin ilk sırasının sırasıyla tek sayılı ve çift sayılı şeritlerine yüklenir. Amplikonları kontamine etme olasılığını azaltmak için hızlı bir şekilde çalışarak, PCR plakasını A Satırından PCR ürünlerini jelin ilk sırasının tek sayılı şeritlerine yükleyin. Ardından, PCR plakanın B Satırındaki PCR ürünlerini jelin ilk sırasının çift sayılı şeritlerine yükleyin.

PCR ürünlerini, aynı modeli kullanarak PCR plakasının C ve D Satırlarından, C Satırı tek sayılı şeritlere ve D Satırı, jelin ikinci sırasının çift sayılı şeritlerine gelecek şekilde yükleyin. PCR plakasının her bir oyuğu jel üzerine yüklenene kadar bu yükleme modeline devam edin. Jeli çalışan tanka yerleştirin ve jel suya batırılana kadar tankı TAE çalışma tamponu ile doldurun.

30 dakika boyunca 100 voltta çalıştırın. Bir UV transilluminatörü kullanarak görselleştirin. Burada, 96 PCR'den 95'inin başarılı olduğu temsili bir 96 oyuklu PCR validasyonu agaroz jeli gösterilmektedir.

Başarısız PCR H11 idi. Bu prosedür Trypansoma brucei, prosiklik form, hücre hattı SMOXP9 kullanır. Hücreleri protokol metninde açıklandığı gibi uygun yoğunluğa büyütün ve 10 dakika boyunca 800 kez G'de santrifüjleme ile gerekli sayıda hücreyi hasat edin.

Hücreler santrifüjlenirken elektroporasyon için kuruluma başlayın. Plaka işleyiciyi elektroporatöre bağlayın. Elektroporatör ünitesinde voltajı 1.500 volta, darbe uzunluğunu 100 mikrosaniyeye, darbe sayısını 12'ye ve darbe aralığını 500 milisaniyeye ayarlayın.

Plaka işleyicide nabız sayısını bire ayarlayın. P200 12 kanallı çok kanallı bir pipet kullanarak, PCR reaksiyonlarını PCR plakasından 96 oyuklu tek kullanımlık bir elektroporasyon plakasına aktarın. Hücreleri 10 mililitre modifiye cytomix içinde yıkayın ve 10 dakika boyunca 800 kez G'de tekrar santrifüjleyin.

Hücreleri, mililitre başına beş kez 10 ila yedinci hücrelerin nihai konsantrasyonu için 23 mililitre modifiye cytomix içinde yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu bir reaktif rezervuarına aktarın. Elektroporasyon plakasının her bir oyuğuna 200 mikrolitre hücre solüsyonu pipetleyin ve pipetleme yoluyla PCR ürünü ile karıştırın.

Kısa devreleri önlemek için plakanın üst kısmındaki damlacıkları çıkarmak için bir kağıt mendil kullanın. Elektroporasyon plakasının üst kısmına sızdırmazlık filmi uygulayın ve her sütunun üstünde ve altında elektrotlar için delikler açıkta kalacak şekilde konumlandırın. Filmi yönlendirmek için kullanılan yükseltilmiş noktaları kapatmaktan kaçının.

Elektroporasyon plakasını plaka tutucuya yükleyin ve kapağı kapatın. Elektroporatör ünitesindeki "darbeye" basın. Elektroporasyondan sonra, hücreler, geri kazanım için oyuk başına bir mililitre SDM-79 ortamı içeren dört adet 24 oyuklu doku kültürü plakasına hızlı bir şekilde aktarılmalıdır.

Kalan altı uç, 24 oyuklu bir doku kültürü plakasındaki altı sıra ile aynı hizada olacak şekilde, diğer tüm uçları eksik olan bir P200 12 kanallı çok kanallı pipet kullanın. Hücreler 96 oyuklu plakadan 24 oyuklu plakaya aktarıldıktan sonra, 96 oyuklu plakadaki kuyucukları 24 oyuklu plakadaki karşılık gelen oyuklardan gelen ortamla yıkayın. Ardından, yıkamayı 24 oyuklu plakadaki kuyucuklara geri aktarın.

Elektroporasyonlu hücreleri 96 oyuklu elektroporasyon plakasından 24 oyuklu doku kültürü plakalarına burada gösterilen önceden tanımlanmış modelde aktarın. Örneğin, 96 oyuklu plakanın Satır A'daki tek sayılı kuyucuklarından gelen hücreler Levha A'nın Satır A'sına aktarılırken, 96 oyuklu plakadan Satır A'nın çift sayılı kuyucuklarından gelen hücreler Levha C'nin Satır A'sına aktarılır. 96 oyuklu plakadaki kuyuları, 24 oyuklu plakanın karşılık gelen sırasından orta ile yıkayın. Ardından, yıkamayı 24 oyuklu plakaya geri aktarın.

Hücrelerin 24 oyuklu plakalara aktarılması kafa karıştırıcıdır, ancak elde edilen hücre dizilerini doğru gene kadar izleyebilmeniz gerekir ID.It hücreleri sağlıklı tutmak için bu adımı hızlı bir şekilde yapmak çok önemlidir. Tüm elektroporasyonlu hücreler dört adet 24 oyuklu plakaya aktarıldıktan sonra, 24 oyuklu plakaları sıkı bir sızdırmazlık sağlayan bir kapaklı temiz bir plastik kutuya yerleştirin. Kutuyu 28 derecelik bir inkübatöre koyun.

Altı ila sekiz saat sonra, seçici antibiyotik içeren% 10 FCS ile her bir kuyucuğa bir mililitre SDM-79 ekleyin. Transgenik hücre hatları görünür hale gelene kadar dokuz ila 10 gün boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin. Uç terminalde 96 farklı proteini etiketlemek için 96 oyuklu bir transfeksiyondan sonra, hücreler geri kazanım ve seçim için 24 oyuklu doku kültürü plakalarına aktarılır.

Her kuyucuk daha sonra sağlıklı, ilaca dirençli hücreler içerip içermediğini belirlemek için değerlendirilir. Sağlıklı bir kuyu, faz kontrast mikroskobunda parlak olan, ağırlıklı olarak yüksek derecede aktif hücreler içerir. Bu örnek şematikte yeşil, başarılı transfeksiyona sahip bir kuyuyu temsil eder ve gri, yalnızca ölü hücrelere sahip bir kuyuyu temsil eder.

96 kuyudan 88'i veya kuyuların% 92'si, 15 günlük seçimden sonra başarıyla transfekte edilmiş parazitler içerir. Bir kez ustalaştıktan sonra, hücrelerin sayılmasından elektroporasyondan sonra kaplanmasına kadar yaklaşık bir saat sürecektir. Bu prosedürü denerken, seçici ilaçları transfeksiyondan altı ila sekiz saat sonra eklemeyi unutmamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, Trypansoma brucei'de büyük protein kohortlarını nasıl etiketleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.