içinde Microengineered İnsan Bağırsak Villi Oturma mikrobiyomu Co-kültür, bir Gut-on-a-Chip mikroakışkan Aygıt

Bu protokolün genel amacı, bir bağırsak-çip (gut-on-a-chip) mikroakışkan cihazında, peristaltik benzeri hareketler ve akış altında insan intestinal hücrelerinin villus büyümesini göstermek ve bu hücrelerin canlı bağırsak mikrobiyomu ile nasıl birlikte kültüre edileceğini ortaya koymaktır. Bu yöntem; hastalık mekanizmalarının belirlenmesi ve yeni ilaç bileşiklerinin etkinliğinin ve toksisitesinin doğrulanması amacıyla gastroenteroloji, klinik mikrobiyoloji ve farmasötik bilimler alanındaki temel sorulara yanıt olmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, araştırmacıların bir mikrofizyolojik sistem kullanarak, insan canlı bağırsağının yaşayabilir ve fonksiyonel post-mikrobiyom ekosistemini in vitro ortamda kurabilmeleridir.

Konak hücrelerin mikrobiyomla kararlı bir şekilde birlikte kültüre edilmesi bu hastalıkların karmaşıklığını taklit edebildiği için, bu tekniğin etkileri ülseratif kolit veya Crohn hastalığı gibi hastalıklara kadar uzanabilir. Bu yöntem, bağırsak mikrobiyomu ile bağırsaktaki bağışıklık sistemi arasındaki karmaşık etkileşimlere dair bir içgörü sağlayabilse de, deri, genital kanal veya ağız boşluğu gibi konak-mikrop etkileşimlerinin olduğu diğer organ sistemlerine de uygulanabilir. Başlamak için, beraberindeki metin protokolünde açıklandığı şekilde bağırsak-on-a-chip mikroakışkan cihazını hazırlayın.

Cihaz, esnek ve gözenekli bir PDMS membran ile ayrılmış iki paralel mikrokanal içeren şeffaf, gaz geçirgen bir silikon polimerden oluşur. Kanalların her iki yanında, döngüsel mekanik gerinim uygulamak için kullanılabilecek vakum odaları bulunur. Kanallardan %70 etanol akıtmak için bir mililitrelik bir şırınga kullanarak cihazı sterilize edin.

Ardından, cihazı 60 °C'lik bir kurutma fırınında gece boyunca kurutun. Ertesi gün, bağırsak-çip (gut-on-a-chip) mikro sistemini, bağlı tüpleriyle birlikte, 40 dakika boyunca eş zamanlı olarak UV ışığına ve ozona maruz bırakın. Cihazı, bir biyogüvenlik kabininin UV ışığı altında 15 dakika boyunca soğutun.

Ardından, 100 µL hücre dışı matris kodlama çözeltisini bir mL'lik bir şırıngaya yükleyin ve cihazın üst mikrokanalına aktarın. Alt mikrokanalı da kaplamak için bu işlemi tekrarlayın. Tüm düzeneği bir saat boyunca 37 °C sıcaklıktaki nemlendirilmiş %5CO2 inkübatörüne yerleştirin.

İnkübasyon sırasında, önceden ısıtılmış tam kültür ortamını 50 mililitrelik bir filtrasyon sisteminde 0,45 mikronluk bir filtreden bir dakika boyunca geçirerek gazdan arındırın. Ortamdaki kabarcıkları veya çözünmüş gazları gidermek için filtrelenmiş ortamın üzerine bir dakika boyunca nazikçe vurun. Ardından, gazı alınmış tam ortamı iki adet üç mililitrelik tek kullanımlık şırıngaya aktarın ve şırıngaları bir saat boyunca inkübe edin.

Ardından, şırıngaları gut-on-a-chip cihazının üst ve alt mikrokanallarına bağlayın ve üst ile alt mikrokanallara nazik darbelerle komple besiyeri akıtarak kodlama solüsyonunu yıkayın. Daha sonra, çipi gece boyunca 37 °C ve %5 CO2 ortamında inkübe ederken, gazı alınmış komple hücre kültür besiyerini bir şırınga pompası kullanarak cihazın üst mikrokanalına akıtın. Caco-2 intestinal epitel hücreleri içeren tam konfluansla dolmuş bir T75 flaskını, önce hücreleri 10 mL kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS ile durulayarak hasat edin.

Ardından, PBS'yi aspire edin ve durulama işlemini iki kez daha tekrarlayın. Sonra, bir mililitre %0,05 Trypsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve flaskı 37 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin. Hücreler ayrıldığında, 10 mililitre önceden ısıtılmış tam hücre kültürü medyumu ekleyin ve hücre süspansiyonunu bir santrifüj tüpüne aktarmadan önce pipetle üç ila beş kez aşağı yukarı çekerek karıştırın.

Hücre süspansiyonunu santrifüjleyerek çöktürün. Ardından, süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri önceden ısıtılmış kompleli ortamda santimetrekare başına 150.000 hücre olacak şekilde yeniden süspande edin. Hücre süspansiyonundan 500 µL miktarını, 25-gauge, 5/8-inç iğne takılmış bir mililitrelik tek kullanımlık bir şırıngaya çekin.

Ardından, hücre süspansiyonunun 100 µL'sini çıkış borusu aracılığıyla üst mikrokanala aktarın. Sonrasında, üst ve alt mikrokanallara bağlı tüm giriş ve çıkışları mandal klipsler kullanarak kapatın. Bağırsak epitel hücrelerinin gözenekli membranın yüzeyine tutunmasını sağlamak için tüm düzeneği bir saat boyunca inkübe edin.

Ardından, klempleri çıkarın ve üst kanal borusunu, bir şırınga pompasına yerleştirilmiş kültür ortamı dolu bir şırıngaya bağlayın. Hücreler sağlam bir monotabaka oluşturana kadar, üst mikrokanala saatte 30 µL hızında kültür ortamı akışını yeniden başlatın. Hücreler monotabaka oluşturduğunda, alt kanalı ikinci şırıngaya bağlayın ve hem üst lümen hem de alt kapiller mikrokanallara saatte 30 µL aynı akış hızında kültür ortamı perfüze edin.

Çipte peristaltik benzeri bir hareket oluşturmak için öncelikle vakum pompasını çalıştırın. Cihazın vakum odalarını, paslanmaz çelik konnektörlü tüpler aracılığıyla vakum kontrolörüne bağlayın. Ardından, kontrolörü ortalama hücre geriniminin %10'u oranında, 0.15 Hertz frekansında döngüsel bir sinüs germe hareketi sağlayacak şekilde ayarlayın ve başlat'a tıklayın.

Villus büyümesini teşvik etmek için mekanik deformasyonlar eşliğinde, hem üst hem de alt mikrokanallara kültür ortamı akışını en az 80 saat boyunca sürdürün. Otoklavlanmış Lactobacilli MRS Broth ve Reinforced Clostridial Medium'dan %50/50 oranında bir karışım hazırlayın. Ardından, dondurularak kurutulmuş probiyotik bakteri karışımını 10 ml'lik bu karışım içerisinde yeniden süspande edin.

Karışımın optik yoğunluğunu 600 nanometrede ölçün ve nihai hücre yoğunluğunu yaklaşık 0,2 optik yoğunluk birimine ayarlayın. Ayarlanmış mikrobiyal hücre süspansiyonundan üç mililitrelik porsiyonları tek kullanımlık 10 mililitrelik steril tüplere paylaştırın. Porsiyonları anaerobik bir kaba yerleştirin ve kabın içine iki paket anaerobik gaz üreten saşe ekleyin.

Konteyner kapağını sıkıca kapatın ve konteyner düzeneğini sallamadan bir inkübatörde gece boyunca inkübe edin. Ardından, gazı alınmış antibiyotiksiz hücre kültürü besiyeri hazırlayın ve bunu üç mililitrelik tek kullanımlık şırıngalara doldurun. Mikro-mühendislik ürünü villusları içeren gut-on-a-chip cihazını biyogüvenlik kabinine aktarın.

Cihazın üst ve alt mikrokanallarına bağlı olan şırıngaları çıkarın ve bunları gazı alınmış antibiyotiksiz hücre kültür besiyeri içeren şırıngalarla değiştirin. İşlem tamamlandığında, cihazı tekrar CO2 inkübatörüne yerleştirin. Ardından, mikrobiyomu yerleştirmeden önce antibiyotiksiz kültür besiyerini 12 saat boyunca cihazdan akıtın.

Ardından, önceden kültürlenmiş probiyotik bakteriyel hücre karışımını santrifüjle çöktürün. Süpernatantı aspire edin, ardından bakterileri antibiyotiksiz DMEM içinde yeniden süspanse edin. Bu hücre süspansiyonundan yaklaşık 100 µL'yi, 25-gauge, 5/8-inç iğne takılı bir mililitrelik şırıngaya yükleyin.

Bakterileri, daha önce mikrop içermeyen bağırsak villuslarının bulunduğu mikrokanalın lümen tarafına infüze edin. Boruları kıstırarak akışı durdurun ve mikrobiyal hücrelerin bağırsak villuslarının apikal yüzeyine yapışması için bir buçuk saat bekleyin. Ardından, önceden ısıtılmış antibiyotiksiz kültür ortamını, döngüsel ritmik deformasyonlar eşliğinde, hem üst hem de alt mikrokanallara saatte 40 µL hızla perfüze edin.

Bu ko-kültür protokolü, intervillöz boşlukta birden fazla probiyotik bakteri türünün stabil kolonizasyonuna olanak tanır. Canlı bakteriyel mikro-koloniler, ko-kültürde iki haftaya kadar korunabilir. Burada, hem GFP işaretli E.coli hem de intestinal villi içeren farklı bir ko-kültür gösterilmektedir.

Yüksek güçlü büyütme, 72. saatteki bakteriyel mikro kolonilerin konumunu net bir şekilde göstermektedir. Bu prosedürü uygularken, kültürün erken aşamalarında epitel hücre tek tabakasının zarar görmesini önlemek için kültür ortamının mikroakışkan kanallara nazikçe ve yavaşça enjekte edilmesini hatırlamak önemlidir. Bu yönteme dayanarak, insan bağışıklık hücreleri ile yapılan bir ko-kültür yöntemi, mikrobiyomun bağışıklık sistemiyle nasıl etkileşime girebileceği ve intestinal sağlığın optimum homeostazı üzerindeki etkileri konusunda da bazı ipuçları sağlayabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, insan bağırsağının mikro çevresinin nasıl yeniden oluşturulacağı ve mikrobiyom ile insan bağırsak villuslarının in vitro ko-kültürünün nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Patojenik bakteriler ve insan hücreleri ile çalışmak son derece tehlikelidir, bu nedenle biyogüvenlik kabini içinde çalışmayı unutmayın.