içinde Microengineered İnsan Bağırsak Villi Oturma mikrobiyomu Co-kültür, bir Gut-on-a-Chip mikroakışkan Aygıt

Bu protokolün bu genel amacı, peristalsis benzeri hareketler altında insan bağırsak hücrelerinin villus büyümesini göstermek ve bir çip üzerinde bağırsak mikroakışkan cihazında akış sağlamak ve bu hücrelerin canlı bağırsak mikrobiyomu ile nasıl birlikte kültürleneceğini göstermektir. Dolayısıyla bu yöntem, hastalık mekanizmasını tanımlamak ve yeni ilaç bileşiklerinin etkinliğini ve toksisitesini doğrulamak için gastroenteroloji, klinik mikrobiyoloji ve farmasötik bilimler alanındaki temel sorulara yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, araştırmacıların mikrofizyolojik bir sistem kullanarak insan canlı bağırsağının canlı ve işlevsel mikrobiyom sonrası ekosistemini in vitro olarak kurabilmeleridir.

Bu tekniğin etkileri ülseratif kolit veya Crohn hastalığı gibi hastalıklara kadar uzanabilir, çünkü konakçı hücrelerin mikrobiyom ile stabil ko-kültürü bu hastalıkların karmaşıklıklarını taklit edebilir. Bu yöntem, bağırsak mikrobiyomu ile bağırsaktaki bağışıklık sistemi arasındaki karmaşık etkileşimler hakkında bir fikir verebilse de, cilt, genital yolunuz veya ağız boşluğu gibi konakçı mikrop etkileşimlerinin olduğu diğer organ sistemlerine de uygulanabilir. Başlamak için, ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi çip üzerinde bağırsak mikroakışkan cihazını hazırlayın.

Cihaz, esnek, gözenekli bir PDMS membranı ile ayrılmış iki paralel mikro kanal içeren şeffaf, gaz geçirgen bir silikon polimerden oluşur. Kanalların her iki tarafında, döngüsel mekanik gerinim uygulamak için kullanılabilen vakum odaları bulunur. Kanallardan% 70 etanol akıtmak için bir mililitrelik bir şırınga kullanarak cihazı sterilize edin.

Ardından, cihazı gece boyunca 60 derece kuru fırında kurutun. Ertesi gün, çip üzerindeki bağırsak mikro sistemini, bağlı hortumuyla birlikte 40 dakika boyunca aynı anda UV ışığına ve ozona maruz bırakın. Biyogüvenlik kabininin UV ışığı altında 15 dakika kalarak cihazı soğutun.

Daha sonra, 100 mikrolitre hücre dışı matris kodlama solüsyonunu bir mililitrelik bir şırıngaya yükleyin ve cihazın üst mikro kanalına dağıtın. Alt mikro kanalı da kaplamak için bu işlemi tekrarlayın. Tüm kurulumu bir saat boyunca 37 derece nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatöre yerleştirin.

İnkübasyon sırasında, gazdan arındırılmış tam kültür ortamı, bir dakika boyunca 50 mililitrelik bir filtrasyon sisteminde 0.45 mikronluk bir filtreden geçirilerek önceden ısıtılır. Ortamdaki kabarcıkları veya çözünmüş gazı temizlemek için filtrelenmiş ortama bir dakika boyunca hafifçe vurun. Daha sonra, gazdan arındırılmış, tam ortamı iki adet üç mililitrelik tek kullanımlık şırıngaya aktarın ve şırıngaları bir saat inkübe edin.

Daha sonra, şırıngaları çip üzerindeki bağırsağın üst ve alt mikro kanallarına bağlayın ve tam ortamı hafif bir darbeyle üst ve alt mikro kanallara akıtarak kodlama çözeltisini yıkayın. Ardından, çipi gece boyunca 37 santigrat derece ve %5 CO2'de inkübe ederken, gazı alınmış, tam hücre kültürü ortamını cihazın üst mikro kanalına akıtmak için bir şırınga pompası kullanın. Hücreleri önce 10 mililitre kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS ile durulayarak Caco-2 bağırsak epitel hücreleri içeren tamamen birleşik bir T75 şişesini hasat edin.

Ardından, PBS'yi aspire edin ve durulamayı iki kez daha tekrarlayın. Daha sonra, bir mililitre% 0.05 Tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve şişeyi 37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. Ayrıldıktan sonra, 10 mililitre önceden ısıtılmış tam hücre kültürü ortamı ekleyin ve hücre süspansiyonunu bir santrifüj tüpüne aktarmadan önce üç ila beş kez yukarı ve aşağı pipetleyin.

Hücre süspansiyonunu aşağı doğru döndürün. Daha sonra, süpernatanı çıkarın ve hücreleri önceden ısıtılmış tam ortamda santimetre kare başına 150.000 hücrede yeniden askıya alın. 500 mikrolitre hücre süspansiyonunu, 25 gauge, 5/8 inçlik bir iğne ile donatılmış bir mililitrelik tek kullanımlık şırıngaya çekin.

Ardından, 100 mikrolitre hücre süspansiyonunu çıkış borusundan üst mikro kanala dağıtın. Ardından, bağlayıcı klipsler kullanarak üst ve alt mikro kanallara bağlı tüm giriş ve çıkışları sıkıştırın. Bağırsak epitel hücrelerinin gözenekli zarın yüzeyine yapışmasını sağlamak için tüm kurulumu bir saat boyunca inkübe edin.

Ardından, kelepçeleri çıkarın ve üst kanal borusunu bir şırınga pompasına yerleştirilmiş bir kültür ortamı dolu şırıngaya bağlayın. Hücreler sağlam bir tek tabakadan gelene kadar kültür ortamının üst mikrokanala akışını saatte 30 mikrolitre olarak devam ettirin. Hücreler bir tek tabaka oluşturduktan sonra, alt kanalı ikinci şırıngaya bağlayın ve kültür ortamını saatte 30 mikrolitrelik aynı akış hızında hem üst lümene hem de alt kılcal mikro kanallara perfüze edin.

Çipte peristaltizm benzeri bir hareket oluşturmak için önce vakum pompasını açın. Cihazın vakum odalarını paslanmaz çelik konektörlü bir boru ile vakum kontrol cihazına bağlayın. Ardından, denetleyiciyi, 0,15 Hertz'lik bir frekansta ortalama hücre suşunun %10'u olan döngüsel bir işaret germe hareketi sağlayacak şekilde ayarlayın ve ardından başlat'a tıklayın.

Villus büyümesini indüklemek için mekanik deformasyonların varlığında en az 80 saat boyunca akan kültür ortamını hem üst hem de alt mikrokanallara tutun. 50/50 oranında Otoklavlanmış Laktobasil MRS Suyu ve Güçlendirilmiş Clostridial Medium karışımı hazırlayın. Ardından, dondurularak kurutulmuş bir probiyotik bakteri karışımını karışımın 10 mililitresinde yeniden süspanse edin.

Karışımın optik yoğunluğunu 600 nanometrede ölçün ve nihai hücre yoğunluğunu yaklaşık 0.2 optik yoğunluk birimine ayarlayın. Ayarlanmış mikrobiyal hücre süspansiyonunun üç mililitresini tek kullanımlık 10 mililitrelik steril tüplere alın. Alikotları anaerobik bir kaba koyun ve kabın içine iki paket anaerobik gaz üreten poşet ekleyin.

Kap kapağını sıkıca kapatın ve kap kurulumunu gece boyunca bir inkübatörde sallamadan inkübe edin. Daha sonra, gazdan arındırılmış antibiyotik içermeyen hücre kültürü ortamı hazırlayın ve üç mililitrelik tek kullanımlık şırıngalara yükleyin. Mikro mühendislik ürünü villuslar içeren çip üzerinde bağırsak cihazını biyogüvenlik kabinine aktarın.

Cihazın üst ve alt mikro kanallarına bağlı şırıngaları çıkarın ve bunları gazdan arındırılmış antibiyotik içermeyen hücre kültürü ortamı içeren şırıngalarla değiştirin. Bitirdikten sonra, cihazı tekrar CO2 inkübatörüne yerleştirin. Ardından, mikrobiyomu yerleştirmeden önce antibiyotik içermeyen kültür ortamını 12 saat boyunca cihaza akıtın.

Daha sonra, önceden kültürlenmiş probiyotik bakteri hücre karışımını döndürün. Süpernatanı aspire edin, ardından antibiyotik içermeyen DMEM'deki bakterileri yeniden askıya alın. Bu hücre süspansiyonunun yaklaşık 100 mikrolitresini 25 gauge, 5/8 inçlik bir iğneye bağlı bir mililitrelik şırıngaya yükleyin.

Bakterileri, daha önce mikropsuz bağırsak villusunu içeren mikrokanalın lümen tarafına infüze edin. Hortumu sıkıştırarak mikrobiyal hücrelerin bağırsak villusunun apikal yüzeyine bir buçuk saat boyunca akış olmadan yapışmasına izin verin. Daha sonra, önceden ısıtılmış antibiyotik içermeyen kültür ortamını, döngüsel ritmik deformasyonlarla saatte 40 mikrolitre hızla hem üst hem de alt mikro kanallara perfüze edin.

Bu ko-kültür protokolü, intervillöz boşlukta birden fazla probiyotik bakteri türünün stabil kolonizasyonuna izin verir. Canlı bakteri mikro kolonileri, ko-kültürde iki haftaya kadar korunabilir. Burada gösterilen, hem GFP etiketli E.coli hem de bağırsak villuslarından oluşan farklı bir ko-kültürdür.

Yüksek güçlü büyütme, 72 saatlik zaman noktasında bakteri mikro kolonilerinin konumunu açıkça gösterir. Bu prosedürü denerken, kültürün erken aşamalarında epitel hücresi tek tabakasına zarar vermemek için kültür ortamını mikroakışkan kanallara nazikçe ve yavaşça enjekte etmeyi unutmamak önemlidir. Bu yönteme dayanarak, insan bağışıklık hücreleri ile bir ko-kültür yöntemi, mikrobiyomun bağışıklık sistemine nasıl çapraz konuşabileceği ve homeostaz optimum bağırsak sağlığı üzerindeki etkileri açısından da bazı ipuçları verebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, insan bağırsağının mikro ortamının nasıl yeniden oluşturulacağını iyi anlamalı ve mikrobiyom ile insan bağırsak villusu arasındaki ko-kültürü in vitro olarak göstermelisiniz. Patojenik bakteri ve insan hücreleri ile çalışmak son derece tehlikelidir, bu nedenle biyogüvenlik kabini içinde çalışmayı unutmayın.