Name: Rekabetçi Nakli Hematopoetik Kök Hücre Fitness değerlendirin (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Öğrenin rekabetçi kemik iliği nakli deneyiyle farelerde hematopoietik kök hücre fitness değerlendirmesi. Bu yöntem hücre sıralama gerektirmeden kök hücre işlevini in vivo analiz etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz prosedürlerin rakam tasarımı ve gösteri yardım için Roxann Hetu-Arbour müteşekkiriz. Laboratuvarda Araştırma Cole Vakfı Geçiş ödülü tarafından desteklenen, Discovery hayır verin. Doğa Bilimleri ve Kanada&#39;nın (NSERC) Mühendislik Araştırma Konseyi ve Kanada Yenilik Vakfı (CFI Liderler Fonu hayır. 31377 hibe) 419226-2012. Santé (FRQS) - KMH Fonds de recherche du Québec için chercheur-BOURSIER konumundadır olduğunu.

Bu protokol açıklanan tüm prosedürler kurumsal hayvan etik komitesi tarafından onaylanmış ve Hayvan Bakımı yönergelere Kanada Konseyi izleyin edilmiştir. Not: Steril / spesifik patojen free konut koşulları sağlamak için, biyolojik güvenlik kabini veya laminer akış kaputu içinde canlı farelerin doğrudan kullanım ile ilgili tüm işlemleri yürütmek. Temizleyin veya sterilize kafesleri, kısıtlayıcı cihazlar, konut malzemeleri, uygun hayvanlara verilen yemi ve su. enjeksiyonlar için ve kan alma için, sadece steril, tek kullanımlık iğneler kullanın. Aseptik teknik greft hazırlanması sırasında çok önemlidir. Alıcı 1. Farelerin hazırlanması <ol><li> Zamanla periferik kan ve kemik iliği sulandırma bireysel takiplerinde etkinleştirmek için kulak çentikler (ya da yerel hayvan etik kurulu 8 tarafından onaylanmış başka bir yöntemle) ile alıcı fareler tanımlayın. Nakil sonrası izlem için fareler tartılır. Bize(Az 25 g), 7 ila 12 hafta eski e alıcı fareler. Not: Verilen örnekte, CD45.1 + CD45.2 + alıcı fareler congenic B6.SJL fareler ile C57BL / 6 fareler geçerek evinde yetiştirildi. </li><li> hematopoetik aktivite yok etmek için 450 rad iki doz ile alıcı fareler ışın tedavisi. İlk doz transplantasyondan önceki gün ve transplantasyon öncesi ikinci 1-2 saat verin. Not: X-ışını veya gama ışınları hem uygun tesislerin doluluk durumuna bağlı olarak kullanılabilir. </li></ol> Verici ve Rakip kemik iliği hücrelerinin 2. Hazırlık <ol><li> Donör (testi ve kontrolü; CD45.2 +) Euthanize ve rakip (CD45.1 +; B6.SJL), boyunları kırılarak ya da yerel hayvan etik komitesi tarafından onaylanmış yöntemler kullanılarak takip CO 2 boğulma tarafından fareler. </li><li> Boş bir petri veya steril gazlı bez üzerine, açık geniş sırtlarında, bacaklar fareler yerleştirin i (temiz iş yüzeyi tutmak için)Bir biyolojik güvenlik kabini nside. % 70 etanol /% 30 H deri ve kürk Islak 2 O (hac / hac). </li><li> Bir cerrahi bıçak veya keskin bir makas ile ayak kesti. bacak boyunca cildi açın ve tırtıklı forseps kullanarak cilt çekmeye kesin. aşırı kas kesip. </li><li> Bacak kemiği çekerek ve bir karşı güç olarak pelvis kemikleri karşı makas bıçakları kullanarak femur yerinden. tibia ayırın ve dizkapağı gelen femur ve kas ve tendonların artıklarını temizleyin. 6-yuvalı doku kültürü plakasında 2-3 ml steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde kemik yerleştirin. </li><li> Steril PBS 5 ml kemikleri temizlenerek kemik iliği hücreleri toplamak. <ol><li> forseps ile yavaşça kemik tutun ve kemik bir ucuna bir dolu 1 ml şırınga bağlanmış bir 25 G iğne yerleştirin. pistonu ve 15 ml konik bir tüp içinde hücreleri toplamak. Kemik merkezi beyaz kadar gerektiği gibi tekrarlayın. </li></ol></li><li> iğne geçen tekrarlı hücreleri ayırmaktek bir hücre süspansiyonu elde etmek. kabarcıklar ve aşırı kuvvet kaçının. Not: Bu adımda, hücre canlılığını geliştirmek için biraz daha büyük bir iğne (22 g) kullanın. </li><li> homojen bir hücre süspansiyonu sağlamak ve enkaz ve kümeleri kaldırmak için 70 mikron naylon süzgeç vasıtasıyla hücrelere geçerler. </li><li> Bir hemasitometre kullanarak hücre sayımı için bir numuneyi çıkarın. 4 ° C&#39;de 5 dakika 200 x g&#39;de kalan hücre süspansiyonu santrifüj. Steril PBS (10 8 hücre / ml) içinde gerekli olan hücre yoğunluğu yeniden ayarlayın. hücreleri buz üzerinde tutun. </li></ol> 3. Donör Hücre HSC Benzerleri oluşturulması <ol><li> Flow sitometri boyama için alt polistiren tüp yuvarlak bir 5 ml&#39;lik 3 x 10 6 hücre (30 ul) eşdeğer aktarın. (2.5 ug / ml&#39;lik bir nihai konsantrasyonda (PBS,% 0.1 büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) ve 1 mM EDTA ile takviye edilmiş) boyama bileşiği içinde sulandırılmış) özel olmayan renklenme engelleme CD16 / CD32 karşı işaretlenmemiş antikora eşit hacim. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe. </li><li> boyama tamponu içinde hazırlanmış 90 ul florokrom-konjuge antikor ana karışımı ekleyin: biyotinlenmiş Lineage kokteyl (B220, CD3e, CD11b, GR1, Ter119), Sca1, CD117, CD135, CD150. ışıktan koruyarak 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Not: Uygun seyreltmeler antikorun her lot için belirlenmelidir. Bu çalışmada kullanılan dilüsyonları için Malzemelerin tabloya bakınız. </li><li> bağlanmamış antikorların çıkarılması için 4 ° C&#39;de 5 dakika 200 x g&#39;de hücreleri, girdap ve santrifüj 2 mi lekeleme tampon maddesi ekleyin. hafifçe vurarak süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet süzün. </li><li> Lekeleme tampon maddesi içinde seyreltilmiş 10 ul florokrom-eşlenik streptavidin ekleyin (Malzeme Tablo). ışıktan koruyarak 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. bağlanmamış streptavidin kaldırmak için adım 3.3 olarak yıkayın. </li><li> En az altı dedektör 9 ile debi sitometresinde hücre örnekleri edinin. Lin sıklığını belirlemek - Sca1 + CD117 + CD135 - CD150 <suAnaliz şablon kullanılarak her numune p&gt; + hücreleri (HSClerin tahmin edilen) Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, daha önce 10,11 rapor etmiştir. Not: Bu nüfus içinde fonksiyonel HKH&#39;lerin sıklığı 1/3 ve 1/5 2,12 arasında olduğu tahmin edilebilir. </li><li> (Tipik olarak, bu örnekte, rakip B6.SJL CD45.1 +) temel olarak altında ve Şekil 2&#39;de ayrıntılı olarak, bir örnek kullanarak, tüm örnekler 11 tahmini HSC eşdeğerleri oluşturulması. <ol><li> aşağıdaki formüller kullanılarak gerekli hücrelerin sayısını hesaplayın: #transplanted HSC / alıcının = 5 x 10 5 hücre X tahmin HSC frekansı (başlangıç ​​numune için belirlenen bu sayı vahşi tipli C57BL / 6 fareleri için, genellikle 75 ila 125) 10-12. Not: Şekil 2&#39;de, Örnek A için, sonuç 139 HKH&#39;lerin olduğunu. (Diğer örnekler için Şekil 2&#39;de örneğin Örnek B) toplam sayısı nakledilen hücrelerin = # transekili HKH&#39;lerin / HSC frekansı. Not: Şekil 2, örnek B, sonuç 197.826 (ya da yaklaşık olarak 2 x 10 5) toplam kemik iliği hücreleri. </li></ol></li><li> Yukarıda elde edilen sonuçları kullanarak, her numune için, nakil alıcısına başına gereken hücrelerin toplam sayıları hesaplayın. Not: Bu sayı temel örneği (rakip) için 5 x 10 5 olmalıdır. <ol><li> alıcı farelerin sayısı adım 3.7 elde çarpın ve şırınga ölü hacim telafi etmek için en azından iki ilave fareler için yeterli hücre ekleyin. </li></ol></li><li> Adım 3.6 hesaplanan ve steril PBS kullanarak enjeksiyon başına 200 ul nihai ses seviyesini ayarlamak olarak 1 HSC eşdeğer oranda (örneğin, CD45.1 +) rakip ve 1 test hücreleri (CD45.2 +) karıştırın. Not: Beş alıcı farelerin bir grup önerilen hacminin büyümesine, dolayısıyla 3.5 x 10 6 rakip kemik iliği hücreleri ihtiva eden, en az 1.4 mi, olduğu (ya da olur için973, Şekil 2&#39;de Örnek A) için tahmin edilen HSC hücreleri, test hücre eşdeğer sayısı (Şekil 2&#39;de, Örnek B eşdeğeri) 197.826 x 7 = 1.384.782 kemik iliği hücreleri olabilir. </li></ol> 4. Kemik İliği Nakilleri <ol><li> Kan damarlarının genişlemesine sağlamak ve lateral kuyruk daha görünür damarları yapmak için kırmızı ısı lambası ile adım 1.2 ışınlanmış alıcı fareler ısıtın. </li><li> 27 G iğne (veya daha küçük) ile donatılmış bir 1 ml tüberkülin şırıngası hazırlayın. Aspire (3 alıcı fareler için) hazırlanan hücre süspansiyonu, yaklaşık 750 ul. şırınga içinde hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olun. </li><li> frenleyici bir cihaz içine fare yerleştirin. kuyruk inceleyin ve kuyruk her iki tarafında açıkça görülebilir olmalıdır yanal kuyruk venleri arayın. etanol ile enjeksiyon bölgesini silin. Yukarı konik iğneyi deriye paralel ve pistonu hafifçe bastırın. Enjeksiyon kolay olmalıdır. kuvvet yeniden isequired iğne ven değil. Not: Eski fareler damar daha zor bulma yapabilir kalın bir deri var. İğne ven değilse, ilk enjeksiyon yerinde iğne proksimal takın. </li><li> İğneyi çıkarın ve kanamayı durdurmak için birkaç saniye için steril gazlı bez ile enjeksiyon bölgesini basın. Temiz bir kafesin içine fare aktarın. Not: İğne çok sıkıcı hale gelebilir, bundan sonra üç enjeksiyon, aynı şırınga ve iğne kullanın. </li><li> Nakil sonrası takipte, ilk beş gün boyunca fareler rehydrate steril PBS subkutan 1 ml enjekte edilir. (; Opsiyonel gerekirse) enfeksiyonları önlemek için içme suyu antibiyotik ekleyin. İlk üç hafta boyunca her iki ya da üç gün fareler tartılır ve fazla% 15-20 oranında kendi nakil öncesi vücut kilo kaybı (ya da yerel hayvan etik komitesi tarafından belirlenir) olan fareler euthanize. </li></ol> Periferik Kan 5. Analizi <ol><li> bir damla kan toplayın (approx. EDTA tüpleri içine 50-100 ul). <ol><li> Mandibular ven kan toplamak için, çene kemiği altında bulunan tüysüz noktaya yakın yüz cilt delmek ve kan 13 damla almak için toplama tüp yerleştirmek için bir neşter veya 22 G iğne kullanın. çok soyundan sulandırma takip etmek nakilden sonra 4, 8, 12 ve 16 haftalarda kan toplayın. </li></ol></li><li> Aşama 5.1.1 toplanan kan damla 1 ml taze hazırlanmış RT alyuvar lisiz tamponu (9 kısım 0.16 M NH4CI + 1 kısım 0.17 M Tris-HCI, pH 7.65) ilave. 5 ml flow sitometri için uygun yuvarlak dipli polistiren tüp karıştırın ve transfer örnek. Oda sıcaklığında 4 dakika bekletin. </li><li> buz soğukluğunda PBS 4 hacim ekleyin. uçtan uca çevirerek karıştırın ve buz üzerinde hemen aktarın. 4 ° C&#39;de 200 x g&#39;de santrifüjleyin 10 dakika. </li><li> hafifçe vurarak süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet süzün. Süpernatant berrak ve kırmızı olmalıdır. kısaca tampon ve vorteks boyama 2 ml ekleyin. 200 XGA santrifüjleyin 5 dakikaT, 4 ° C. </li><li> hafifçe vurarak süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet süzün. </li><li> CD45.1, CD45.2, CD3e, CD19, GR1: adımlara 3.3 3.1 ayrıntılı genel protokolünü kullanarak flow sitometri boyama ve aşağıdaki ana karışımı için antikorlar ile devam edin. </li><li> En az altı dedektör 9 ile debi sitometresinde hücre örnekleri edinin. Şekil 3&#39;te verilen analiz şablon kullanılarak her numune her bir soy (CD19 + B lenfositleri, CD3e + T lenfositleri, GR1 parlak granülositler) ve 10,11 geçme donor kaynaklı hücrelerin sıklığını belirler. </li></ol> Kemik İliği Sulandırma 6. Analizi <ol><li> bölüm 2. Leke master karışımı için adımlar 3.3 3.1 ayrıntılı genel protokolünü kullanarak flow sitometri analizi için hücreleri ve aşağıdaki antikorlar ayrıntılı olarak kemik iliği hücreleri toplamak: Lineage kokteyl, Sca1, CD117, CD135, CD150, CD45.1 , CD45.2. lin AlgılamaAşama 3.4 de tarif edildiği gibi florokrom-eşlenik streptavidin kullanılarak EAGE kokteyl antikorlar. </li><li> En az sekiz dedektör 9 ile debi sitometresinde hücre örnekleri edinin. Sadece altı varsa CD135 + hücreleri dahil edileceği gibi, kalıtsal aynı kanala CD135 ekleyin. Donör kaynaklı Lin sıklığını belirlemek - Sca1 + CD117 + CD135 - Şekil 4 ve 10 geçme olarak sağlanan analiz şablon kullanılarak her numunede CD150 + HSC hücreleri. </li></ol>

<ol><li>Li, H. W., Sykes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+in+haematopoietic+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts in haematopoietic cell transplantation.</a> Nat Rev Immunol. 12 (6), 403-416 (2012).</li>
<li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li>
<li>Kim, I., He, S., Yilmaz, O. H., Kiel, M. J., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+purification+of+fetal+liver+hematopoietic+stem+cells+using+SLAM+family+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enhanced purification of fetal liver hematopoietic stem cells using SLAM family receptors.</a> Blood. 108 (2), 737-744 (2006).</li>
<li>Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+analysis+of+murine+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells.</a> Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).</li>
<li>Rossi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Less+Is+More%3A+Unveiling+the+Functional+Core+of+Hematopoietic+Stem+Cells+through+Knockout+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Less Is More: Unveiling the Functional Core of Hematopoietic Stem Cells through Knockout Mice.</a> Cell Stem Cell. 11 (3), 302-317 (2012).</li>
<li>Till, J. E., McCulloch, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+measurement+of+the+radiation+sensitivity+of+normal+mouse+bone+marrow+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells.</a> Radiat Res. 14, 213-222 (1961).</li>
<li>Shen, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+Ly-5+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cloning of Ly-5 cDNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (21), 7360-7363 (1985).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+GM+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Identification of GM mice.</a> Laboratory Animals. 37 (suppl 1), 33-35 (2003).</li>
<li>Rundberg Nilsson, A., Bryder, D., Pronk, C. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+determination+of+rare+populations+by+flow+cytometry%3A+A+hematopoietic+stem+cell+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Frequency determination of rare populations by flow cytometry: A hematopoietic stem cell perspective.</a> Cytometry Part A. 83A (8), 721-727 (2013).</li>
<li>Abidin, B. M., Owusu Kwarteng, E., Heinonen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frizzled-6+Regulates+Hematopoietic+Stem%2FProgenitor+Cell+Survival+and+Self-Renewal%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Frizzled-6 Regulates Hematopoietic Stem/Progenitor Cell Survival and Self-Renewal.</a> J Immunol. 195 (5), 2168-2176 (2015).</li>
<li>Heinonen, K. M., Vanegas, J. R., Lew, D., Krosl, J., Perreault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt4+enhances+murine+hematopoietic+progenitor+cell+expansion+through+a+planar+cell+polarity-like+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Wnt4 enhances murine hematopoietic progenitor cell expansion through a planar cell polarity-like pathway.</a> PLoS One. 6 (4), e19279(2011).</li>
<li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+markers+resolve+functionally+distinct+subpopulations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li>
<li>Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+simple%2C+and+humane+method+for+submandibular+bleeding+of+mice+using+a+lancet%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet.</a> Lab Anim (NY). 34 (9), 39-43 (2005).</li>
<li>Santaguida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JunB+protects+against+myeloid+malignancies+by+limiting+hematopoietic+stem+cell+proliferation+and+differentiation+without+affecting+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">JunB protects against myeloid malignancies by limiting hematopoietic stem cell proliferation and differentiation without affecting self-renewal.</a> Cancer Cell. 15 (4), 341-352 (2009).</li>
<li>Czechowicz, A., Kraft, D., Weissman, I. L., Bhattacharya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transplantation+via+antibody-based+clearance+of+hematopoietic+stem+cell+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Efficient transplantation via antibody-based clearance of hematopoietic stem cell niches.</a> Science. 318 (5854), 1296-1299 (2007).</li>
<li>Zhang, C. C., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+hematopoietic+stem+cells+change+their+surface+phenotype+during+ex+vivo+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Murine hematopoietic stem cells change their surface phenotype during ex vivo expansion.</a> Blood. 105 (11), 4314-4320 (2005).</li>
<li>Benveniste, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermediate-Term+Hematopoietic+Stem+Cells+with+Extended+but+Time-Limited+Reconstitution+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Intermediate-Term Hematopoietic Stem Cells with Extended but Time-Limited Reconstitution Potential.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 48-58 (2010).</li>
<li>Fazekasde St Groth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evaluation+of+limiting+dilution+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">The evaluation of limiting dilution assays.</a> J Immunol Methods. 49 (2), R11-R23 (1982).</li>
<li>Louis, I., Heinonen, K. M., Chagraoui, J., Vainio, S., Sauvageau, G., Perreault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signaling+protein+Wnt4+enhances+thymopoiesis+and+expands+multipotent+hematopoietic+progenitors+through+beta-catenin-independent+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The signaling protein Wnt4 enhances thymopoiesis and expands multipotent hematopoietic progenitors through beta-catenin-independent signaling.</a> Immunity. 29 (1), 57-67 (2008).</li>
<li>Cui, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+protocol+for+total+body+irradiation+for+allogeneic+bone+marrow+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice.</a> Bone Marrow Transplant. 30 (12), 843-849 (2002).</li>
<li>Benz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+Stem+Cell+Subtypes+Expand+Differentially+during+Development+and+Display+Distinct+Lymphopoietic+Programs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic Stem Cell Subtypes Expand Differentially during Development and Display Distinct Lymphopoietic Programs.</a> Cell Stem Cell. 10 (3), 273-283 (2012).</li>
<li>Eppert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+gene+expression+programs+influence+clinical+outcome+in+human+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Stem cell gene expression programs influence clinical outcome in human leukemia.</a> Nat Med. 17 (9), 1086-1093 (2011).</li>
<li>McIntosh, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonirradiated+NOD%2CB6.SCID+Il2rgamma-%2F-+Kit%28W41%2FW41%29+%28NBSGW%29+mice+support+multilineage+engraftment+of+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rgamma-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells.</a> Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Burada açıklanan protokol bilinen rakip HKH&#39;lerin karşı donör (test) HKH&#39;lerin göreceli uygunluğunu değerlendirmek için tasarlanmıştır. Yarışmanın durum (kök hücre fitness ılımlı düşüşler tespit etmek için daha büyük olasılıkla) tahlil göreceli hassasiyetini arttırır ve ışınlama ve enjeksiyonu etkinliğinin için bir iç teknik kontrol sağlar. Bununla birlikte, HSC spor mutlak ölçü olarak kullanılmamalıdır; Rekabetçi sulandırma bir azalma otomatik HKH&#39;lerin rekabet yokluğunda iyi bir performans olmaz anlamına g...

Hematopoiezis yaralanma, radyasyon ve hücre ölümü ile kaybolmuş kan hücrelerinin doldurulmasını sağlayan bir rejeneratif bir süreçtir. Bu işlem, büyük ölçüde Yetişkin kemik iliğinde bulunan hematopoietik kök hücreler (HSC) ile sağlanmaktadır. Buna ek olarak, hematopoietik kök hücreler, otoimmün bozukluklar, hematolojik malignanlıklar ve immün yetmezliği 1 terapötik amaçlar için kullanılabilir. daha iyi çoğalma genişlemesi ve ulaşmak ve nakli sonrasında alıcı kemik iliğini aşılamak için kendi yeteneği dahil olmak üzere, HSC işlevini düzenleyen mekanizmaları anlamak için bir ihtiyaç vardır. Son çalışmalar, ileriye yönelik olarak, yaklaşık% 50 saflıkta 2-4 yetişkin HSClerin ve fetal HSClerin ettirecek SLAM aile üyeleri CD150 ve CD48 dahil olmak üzere birçok hücre yüzey belirteçleri, rapor olmakla birlikte, işlevsel HSCler altın standart ölçmek için bir in vivo deney, repopulating kalır kan c yeniden kurmak için yeteneklerini belirlemekIşınlanan ev 5 ell üretimi. In vivo klonal repopulating tahlil başlangıçta kadar ve McCulloch 6 tarafından geliştirilen ve o zamandan beri rafine ve genişletilmiştir. Başlangıçta tanımlandığı gibi, HKH&#39;lerin kendini yenileme ve farklılaşma yoluyla yaşam boyu kan hücresi üretimini sağlamak. Işınlanan alıcıya HKH&#39;lerin transferi Böylece ABD değerlendirmek sağlar: farklı kan hücre soylarının analizi ile (T lenfositler, B lenfositler, granülositler, monositler) ve seri transplantasyonu ile kendini yenileme kapasitelerini ayırt etme yeteneği. Tahlil genellikle HKH&#39;lerin iki nüfusun işlevselliği ve / veya miktar karşılaştırılması yer alacağı, örneğin, tedavi veya HKH&#39;lerin bakım veya genişleme etkileyebilecek değişik faktörlerin ile işlenmemiş olan farklı genotipleri veya hücre iki farelerin gelen hücreler kültür. Donör kimerizm, veya transfer donör HKH&#39;lerin t katkısıO kan hücresi üretimi daha sonra hücre yüzeyi markerleri veya alıcı ya da ev sahibi donör hücreleri ayırt edecek başka yöntemler kullanılarak periferik kan akış sitometri analizi ve kemik iliği ile tespit edilebilir. En yaygın olarak kullanılan belirteçler kesinlikle aşağıda verilen örnekler için seçtiğiniz gen Ptprc veya CD45 lökosit antijen 7 için iki alleldir. klonal repopulation tahlil rekabetçi ya da rekabetçi olmayan olabilir. bir rekabetçi olmayan bir ortamda, kontrol ve test HSC hücreleri ayrı bir alıcı farelere aktarıldı ve her hücre tipi için sonuç birbirinden bağımsız olacaktır. Rekabetçi bir ortamda, test ve kontrol hem HKH&#39;lerin işlevi rakip HKH&#39;lerin bir nüfusa karşı ölçülür. Burada açıklanan protokol rekabetçi bir ortam kullanır, ancak, aynı zamanda, rekabetçi olmayan durumlar için uyarlanabilir. Her iki yaklaşımın da avantajları ve sınırlamaları var ve biz detaylı olarak bunları karşılaştırmak olacaktırtartışma. Biz de nakledilen HKH&#39;lerin sayısında hakkaniyeti sağlamak için farklı yaklaşımlar tarif seyreltme deneyi (LDA) sınırlayarak HKH&#39;lerin ölçülmesi için tahlil adapte ve sonuçların yorumlanması için başarılı ve başarısız nakli hem de örnekler sunmak nasıl açıklar.

<table><tbody><tr><td>K2EDTA'lı mikrotainer tüpler</td><td>BD Biosciences</td><td>365974</td><td></td></tr><tr><td>20 G iğne</td><td>BD Şırınga</td><td></td><td>Mandibular venden kan örneklemesi için</td></tr><tr><td>LabQuake Shaker rotisserie</td><td>Thermo&nbsp; Bilimsel</td><td>C415110</td><td></td></tr><tr><td>Saflaştırılmış anti-fare CD16 / CD32 (klon 2.4G2, Fc Blok)</td> <td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>2.50 & mu; g / ml</td></tr><tr><td>Pe-Cy7-konjuge anti-fare CD3e (klon 145-2C11)</td> <td>eBioscience</td><td>25-0031</td><td>0.25 & mu; g / ml</td></tr><tr><td>PE konjuge anti-fare CD19 (klon 1D3)</td> <td>eBioscience</td><td>12-0193</td><td>0.25 & mu; g / ml</td></tr><tr><td>APC-eFluor780 (APC-Cy7 eşdeğeri) konjuge anti-fare GR1 (klon RB6-8C5)</td> <td>eBioscience</td><td>47-5931</td><td>0.25 & mu; g / ml</td></tr><tr><td>FITC-eşlenik anti-fare CD45.1 (klon A20)</td> <td>eBioscience</td><td>11-0453</td><td>2.50 & mu; g/ml</td></tr><tr><td>eFluor450-konjuge anti-fare CD45.2 (klon 104)</td><td>eBioscience</td><td>48-0454</td><td>1.00 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Biyotinile anti-insan/fare CD45R (B220) (klon RA3-6B2)</td><td>eBioscience</td><td>13-0452</td><td>1.25 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Biyotinile anti-fare CD3e (klon 145-2C11)</td><td>eBioscience</td><td>13-0031</td><td>1.25 &mu; g / ml</td></tr><tr><td>Biyotinile anti-fare CD11b (klon M1 / 70)</td> <td>eBioscience</td><td>13-0112</td><td>1.25 & mu; g / ml</td></tr><tr><td>Biyotinile anti-fare GR1 (klon RB6-8C5)</td> <td>eBioscience</td><td>13-5931</td><td>1.25 & mu; g/ml</td></tr><tr><td>Biyotinile anti-fare TER119 (klon TER119)</td><td>eBioscience</td><td>13-5921</td><td>0.625 &mu; g / ml</td></tr><tr><td>V500 streptavidin</td><td>BD Biosciences</td><td>56149</td><td>0.5 & mu; g / ml</td></tr><tr><td>PE konjuge anti-fare CD117 (klon 2B8)</td> <td>BD Biosciences</td><td>553355</td><td>0.25 & mu; g/ml</td></tr><tr><td>PE-Cy7-konjuge anti-fare Ly6A/E (Sca1) (klon D7)</td><td>BD Biosciences</td><td>558162</td><td>0.25 &mu; g / ml</td></tr><tr><td>PerCP-eFluor710-konjuge anti-fare CD135 (klon A2F10)</td> <td>eBioscience</td><td>46-1351</td><td>0.5 & mu; g/ml</td></tr><tr><td>Alexa fluor 647-konjuge anti-fare CD150 (klon TC15-12F12.2)</td><td>Biolegend</td><td></td><td>115918 0.625 &mu; g/ml
BD Biosciences ve eBioscience aynı klonu taşımaz:</td></tr><tr><td>27 G iğneli 1 ml tüberkülin şırıngası</td><td>BD Şırınga</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>25 G iğneli 1 ml tüberkülin şırıngası</td><td>BD Şırınga</td><td>309626</td><td></td></tr><tr><td>70 & mu; m hücre süzgeci</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr></tbody></table>

rekabetçi nakli hematopoetik kök hücre fitness değerlendirin

Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness

Hematopoetik kök hücrenin (HSC) altın standart tanımı, ışınlanmış bir alıcıya transfer edildiğinde, alıcının ömrü boyunca kan hücresi üretimini yeniden kurma yeteneğine sahip olacak bir hücredir. Bu protokol, iki farklı genotipe sahip farelerden alınan kemik iliği gibi iki farklı hücre popülasyonunun HSC kapasitelerini karşılaştırmak için fonksiyonel bir testin nasıl kurulacağını ve alıcı farelerin akış sitometrisi ile nasıl analiz edileceğini açıklar. Protokol, standardizasyon için hücre sıralama yerine HSC eşdeğerlerini kullanır ve her iki yaklaşımın avantajlarını ve dezavantajlarını tartışır. Seri nakiller, sınırlayıcı seyreltme deneyleri, hedef arama deneyleri ve rekabetçi olmayan nakiller dahil olmak üzere temel protokolün farklı varyasyonlarını, bu çeşitli yaklaşımların avantajları ve tercih edilen kullanımları da dahil olmak üzere daha fazla tartışıyoruz. Bu tahliller, HSC fonksiyonunun incelenmesi için merkezidir ve sadece biyolojinin temel HSC içsel yönlerinin araştırılması için değil, aynı zamanda kemik iliği nakli ve kültürde HSC genişlemesi için klinik öncesi tahlillerin geliştirilmesi için de kullanılabilir.

(Ayrıca aşağıda açıklanmıştır) ikincil nakli dahil rekabetçi nakli ayarı, genel bir açıklama Şekil 1&#39;de bulunabilir. Transplantasyon öncesi kemik iliği HKH&#39;lerin için temsili bir analiz Şekil 2&#39;de bulunabilir. Daha detaylı bilgi çiftler dışlanması ve ölü hücreler başka yerde 9 bulunabilir. 3 ve 4, sırasıyla periferal kan, kemik iliği içi...

Bu protokol, hücre sıralama yoluyla kök hücrelerin önceden saflaştırılması olmadan hematopoietik kök/progenitör hücre fonksiyonunu incelemek için rekabetçi fare kemik iliği nakli deneyleri kurmak için adım adım yönergeler sağlar.

Rekabetçi Nakli Hematopoetik Kök Hücre Fitness değerlendirin

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to ...

Bu deneyin genel amacı, rekabetçi transplant analizi kullanarak kemik iliği hematopoetik kök hücrelerinin in vivo uygunluğunu belirlemektir. Bu yöntem, kök hücre biyolojisi ve hematopoetik hücre transplantasyonu alanında, çeşitli manipülasyonların transplant sonrası kök hücre self-yenilenmesi üzerindeki etkisine dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, sınırlı sayıda hayvan gerektirmesi ve hücre ayıklama işlemi içermemesidir.Bu yöntem kök hücre fonksiyonları hakkında bilgi sağlayabilse de, karışık kemik iliği kimeralarının kullanımı sayesinde immünoloji gibi diğer alanlarda da faydalı olabilir. Bu tekniğin 1960'larda gerçekleştirilen ilk geliştirme çalışmaları, kök hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların insanlarda ve farelerde hematopoetik kök hücrelerin kimliğini ve fonksiyonunu keşfetmelerinin yolunu açmıştır. Prosedür, laboratuvarda yüksek lisans öğrencisi olan Roxanne Hetu-Arbour ve doktora öğrencisi Edward Owusu Kwarteng tarafından gösterilecektir.Fareyi biyolojik güvenlik kabini içindeki bir cerrahi platforma yerleştirerek başlayın ve deri ile kürkü %70 etanol ile nemlendirin. Ardından, bir arka ayağı tutun ve deriyi bacak bo

competitive-transplants-to-evaluate-hematopoietic-stem-cell-fitness

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu el yazması, transdüksiyon-transplantasyon fare modelleri oluşturmak için kullanılan metodolojinin bir tanımını sağlar. Kemik iliği nakli yapılırken kaçınılması gereken teknik hataların ayrıntılı bir açıklaması yapılır. Yüksek viral titre, transfeksiyon / transdüksiyon ve ışınlamanın önemi hakkında net bir anlayış kazanılmalıdır.

Myeloproliferatif tümörün İletimi-Transplantasyon Fare Modeli

Miktar donör türetilmiş hücre engraftment kök hücre transplantasyonu hastalarında Hemoglobinopati sonra izlemek için gereklidir. Akış Sitometresi tabanlı cep sıralama, koloni oluşumu tahlil ve ataları erythroid yerde farklılaşma ve sonraki analizi kısa tandem tekrarlar yayılması değerlendirmek için kullanılabilir bir arada.

Hematopoetik kök hücre transplantasyonu Hemoglobinopati olan hastalar için sonra kalan donör Erythroid progenitör hücre algılama

Hematopoetik kök hücre transplantasyonu (HKHT) genetiği hematopoetik hücrelerin kötü huylu potansiyelini değerlendirmek için nasıl kullanılacağını açıklar. HKHT çeşitli malign hematopoetik hücrelerin vivo içinde değerlendirmek için hem de Roman terapiler değerlendirmek için büyük bir kohort myelodisplastik sendrom (MDS) veya lösemi ile farelerin üreten yararlıdır.

Hematopoetik kök hücre transplantasyonu myelodisplastik sendromu kökeni değerlendirmek için kullanımı

Bu iletişim kuralının amacı insan dışı primat CD34 izole etmektir+ hücreleri astarlanmalıdır kemik iliği, gen-lentiviral vektörler ile bu hücreleri değiştirme ve otolog ana bilgisayar içine infüzyon için bir ürün hazırlamak için gelen. Toplam iletişim kuralı yaklaşık 48 saat uzunluğudur.

Hazırlık ve Nonhuman primat hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin gen modifikasyonu

Hematopoetik kök ve ata hücrelerinin (HSPC) CRISPR/Cas9 sistemi tarafından hematopoetik sisteme özgü gen modifikasyonları ile fare model sistemlerini hızla geliştirmek için yüksek verimli genom düzenlemesi için protokoller tanımlanmıştır.

Hastalık Modellerinde Hematopoetik Hücrelerin İncelemi için Lentiviral CRISPR/Cas9-Aracılı Genom Düzenleme

Burada ex vivo kültürlü hematopoetik kök hücreler ve T hücrelerinde mitokondriyal kitle ve membran potansiyelini ölçmek için güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır.

Hematopoetik Kök Hücrelerde ve T-Hücrelerinde Mitokondriyal Kitle ve Membran Potansiyelinin Akış Sitometrisi ile Ölçülmesi

Kemik iliği naklinin (BMT) üç yöntemini tarif ediyoruz: toplam vücut ışınlamalı BMT, korumalı ışınlamalı BMT ve fare modellerinde klonal hematopoez çalışması için ön koşullandırması olmayan BMT yöntemi (benimseyen BMT).

Klonal Hematopoez Çalışması İçin Farelerde Kemik İliği Nakli İşlemleri

Bu protokol, bol miktarda yağ asidi, kolesterol, daha düşük sitokin konsantrasyonları ve hipoksi kullanarak kemik iliği mikroçevrimini taklit ederek sessiz insan hematopoetik kök hücrelerinin in vitro olarak korunmasını sağlar.

Sessiz İnsan Hematopoetik Kök Hücrelerini Korumak İçin Bir Kültür Yöntemi

Bu protokol, gen düzenlenmiş hücreler de dahil olmak üzere birkaç hematopoietik veya lösemik kök hücrenin murin ksenogreft modellerinde intrafemoral enjeksiyonunu tanımlar, bu da sadece hücrelerin hızlı ve güvenli bir şekilde nakledilmesini sağlamakla kalmaz, aynı zamanda kemik iliğinin seri analizlerini de sağlar.

Canlı fareler kullanılarak yapılan basitleştirilmiş intrafemoral enjeksiyonlar, sürekli kemik iliği analizine izin verir

İntrafemoral enjeksiyonlar, hücreleri doğrudan kemik iliği boşluğuna yerleştirerek az sayıda hematopoietik kök ve progenitör hücrenin (HSPC'ler) aşılanmasına izin verir. Burada, insan HSPC'lerinin immün yetmezliği olan farelere intrafemoral enjeksiyonunun deneysel bir protokolünü açıklıyoruz.

İnsan Hematopoietik Kök ve Progenitör Hücrelerinin İmmün Kuvvetlenmiş Farelere İntrafemoral Enjeksiyonu 

Burada, hematopoietik kök ve progenitör hücrelerin anormal proliferatif kapasitesi için çok önemli olan aday genleri tanımlamak için CRISPR / Cas9 teknolojisini Hücre Sayma Kiti-8 (CCK-8) testi ile entegre eden bir protokol sunuyoruz.

Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerin Anormal Büyüme ile İlgili Genlerinin CRISPR/Cas9 Teknolojisi ile Hücre Sayımı ile Birleştirilerek Değerlendirilmesi

Öğrenin rekabetçi kemik iliği nakli deneyiyle farelerde hematopoietik kök hücre fitness değerlendirmesi. Bu yöntem hücre sıralama gerektirmeden kök hücre işlevini in vivo analiz etmenizi sağlar.

Rekabetçi Nakli Hematopoetik Kök Hücre Fitness değerlendirin

Daha fazla video keşfet