Of Bilgisayar İzleme tarafından Analiz Edilmiş Olfaktor Davranışlar Drosophila Dört kadranda olfactometer içinde

Bu kurulumun genel amacı, sağlanan otomatik bir sinek izleme yazılımı komut dosyası kullanarak dört kadranlı bir olfaktometrede sineklerin koku alma davranışlarını analiz etmektir. Bu yöntem, koku alma sinir sistemlerinin dış dünyayı nasıl algıladığı ve beynin davranışsal kararları nasıl çözdüğü ve yönlendirdiği ile ilgili temel soruların ele alınmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, çok yönlü ve sağlam olması ve büyük bir deneysel alanda sinek popülasyonu tarafından koku alma tepkilerinin tekrar test edilmesine izin vermesidir.

Bu protokol için, plastik bir dış kap, cam iç kap ve özel yapım bir PTFE kapak ekinden oluşan beş koku odası hazırlayın. Ek parça, merkezi kısmı çıkarılmış ve iki adet takılı tek yönlü valf bulunan orijinal bir kap kapağıdır. Solvent kontrolleri için koku verici odalardan dördünü ve bir test koku vericisi için bir odayı kullanın.

Her haznenin temiz olduğundan emin olun ve ardından bir mililitre çözücü veya koku maddesi seyreltmesi içeren bir koku kabı yükleyin. Ardından, kabın plastik haznedeki konumunu kontrol edin ve herhangi bir sıvının dökülmediğinden emin olun. Sızıntıları önlemek için vidalı kapağı ve PTFE ek parçasındaki bir O-ringi kullanarak kapağı sabitleyin.

Sinekleri standart mısır unu ortamında destekleyin. Standart bir şişeye 30 erkek ve 30 dişi koyun ve yumurtaların oda sıcaklığında beş gün boyunca bırakılmasına izin verin. Bu tür şişelerden yeni kapatılmış sinekleri toplayın.

Her deneysel kohort için, kısa karbondioksit anestezisi altında 25 erkek ve 25 dişi sinek toplayın ve kohortun iki ila dört gün boyunca standart sinek ortamında yaşlanmasına izin verin. Deneyden 40 ila 42 saat önce, kohortu yiyeceksiz nem için yaklaşık 10 mililitre yüzde bir agaroz jeli içeren bir şişeye aktarın. Açlık, tüm hareketin artmasına yardımcı olur ve sineklerin% 90'ından fazlası açlık sürecinden sağ çıkmalıdır.

Zayıf bir genotipte meydana gelebilecek olan %10'dan fazla ölürse, deneydeki tüm sinekler için bir günlük açlık kullanmayı deneyin. En az beş dakika önceden sıcaklık kontrol cihazını açın ve 25 santigrat dereceye ayarlayın. Ardından, koku verici odalarını plastik bir tüp aracılığıyla arenaya bağlayın.

Elektronik bir akış ölçer kullanarak arenanın her çeyreğindeki hava akış hızını kontrol edin. Kontrol ve kokulu hava akımlarının her ikisinin de dakikada 100 mililitre hızında çalıştığından emin olun. Sinekler hava akışına karşı çok hassastır ve her kadran için hava akışının her deneyden önce doğrulanması çok önemlidir.

Şimdi, arenayı ve cam plakaları %70 etanol kullanarak temizleyin. Tüm parçaları iki ila üç kez silin ve devam etmeden önce tamamen kurumasını bekleyin. Ardından, cam plakaları arenaya kelepçeleyin.

Ardından, sinekleri anestezi olmadan arenaya aktarın. Yerçekimini kullanarak, cam plakalardan birindeki delikten girmelerine izin verin ve ardından deliği dairesel bir ağ ile kapatın. Şimdi, sinek yüklü arenayı ışık geçirmez odaya yerleştirin.

Ardından, dört kontrol hava akımını her bir arena köşesine bağlayın. Odanın kapısını kapatın ve sineklerin 10 ila 15 dakika boyunca yeni ortama alışmasına izin verin. Alışma döneminden sonra, sineklerin dört kontrol hava akımına maruz kaldığı beş ila 10 dakikalık bir kontrol deneyi yapın.

Artık verileri hemen analiz etmek çok önemlidir. Sinekler arenada eşit olarak dağılmamışsa, arena sıfırlanmalıdır. Kontrol sineklerinin davranışını sadece temiz hava için test etmek çok önemlidir.

Bu, tüm arka plan koşullarının normal olduğunu hızlı bir şekilde doğrulayacaktır. Sızan ışık, sıcaklık dengesizliği, eğimli arena veya koku kirliliği sorunlara neden olabilir. Gerekirse, sinekleri atın ve arenayı tekrar temizleyin.

Koku verici bir kontaminasyondan şüpheleniliyorsa, tüm boruları değiştirin. Hayvanlar dört kadrandan herhangi birini tercih etmeyene kadar kontrol testini yeni kohortlarla tekrarlamaya devam edin. Ardından, üç bir vana kullanarak test koku haznesini kuruluma bağlayın veya boruyu yeniden bağlayın ve beş ila 10 dakika boyunca bir test deneyi yapın.

Daha uzun deneysel kayıtlar için, izleme programını her 20 dakikada bir hızlı bir şekilde durdurun ve yeniden başlatın, aksi takdirde veri dosyaları çok büyük olacaktır. Testler arasında sinekleri atın, arenayı ve cam plakaları %70 etanol ile temizleyin ve bağlantı tüplerini değiştirin. Sistemi sürekli olarak yıkamak için kuru hava akışını devam ettirin.

Verimlilik için, koşular sırasında temizlik yapılabilmesi için iki arenaya sahip olmak iyidir. Aynı gün içinde birkaç deney yanlışsa, sistemde önceki bir çalıştırmadan kalma koku kalmadığından emin olmak için çok dikkatli olun. Bu normalde düşük konsantrasyonlarda koku verici veya CO2 ile ilgili bir sorun değildir, ancak yüksek konsantrasyonlu uyaranlar için deney çalışmaları arasında 24 saate kadar bir boşluk gerekebilir.

Veri analizi için, verileri bir Matlab formatına dönüştürmek için sağlanan özel yapım Matlab rutinini kullanın. İzleme yazılımı tarafından gerçek zamanlı olarak yapılan ham veri dosyasını yükleyin ve arenanın dış hatlarını takip eden uzaysal bir maske oluşturun. Gürültüyü temsil ettikleri için arenanın dışında kalan tüm veri noktalarını kaldırmak için maskeyi ham verilere uygulayın.

Ardından, üç saniyeden daha uzun süre saniyede 0,163 santimetreden daha az hareket eden tüm veri noktalarını kaldırın. Bu verilerin gürültü veya hareket etmeyen sinekler olması muhtemeldir. Şimdi, kalan veri noktalarını, hepsini kayıt dönemleri boyunca çizerek görselleştirin.

Veriler aynı zamanda tek yörüngeler olarak da görülebilir. Koku sınırları, sinek davranış verilerine dayanarak hızlı bir şekilde tahmin edilebilir. Ardından, çekim indeksini hesaplayın ve metin protokolünde açıklandığı gibi istatistiksel testler yapın.

Davranışsal cihazda 25 erkek ve 25 dişi sinek test edildi. Kuru havaya tepki olarak, sinekler herhangi bir kadran tercihi olmadan tüm arenayı keşfetti. Çizgi, bir sineğin izlenen yörüngesini gösterir.

Elma sirkesi sol üst kadran hava akımına girdiğinde, sineklerin çoğu bu koku kadranına çekildi. Sol üst kadranda itici bir koku maddesi, %10 etil propiyonat eklendiğinde, bu kadrandan kaçınıldı. Bu çeyreğin çekici endeksi 0.68 puan aldı.

Çekici bir indeks, koku alma tepkisi ölçümünde en yaygın kullanılan indekstir. Sıfırın üstünde veya altında bir değer, çekim veya itme olduğunu gösterir. Senaryo, denemeler arasındaki arena pozisyonundaki küçük değişiklikleri telafi etti.

Gürültü veya hareket etmeyen sinekler olabilecek veri noktaları kaldırıldı. Test herhangi bir süre boyunca çalıştırılabilirken, koku alışkanlığını ve diğer fenomenleri takdir etmek için kohortun hareketlerindeki değişiklikleri 10 saniyelik bölmeler boyunca görüntülemek ilginçtir. Bu videoyu izledikten sonra, dört alanlı bir tahlilde koku alma davranışlarını nasıl etkili bir şekilde çalıştıracağınızı ve analiz edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

Bir kez ustalaştıktan sonra, her koku alma deneyi yaklaşık bir saat içinde tamamlanabilir ve bir gün boyunca rutin olarak dört ila altı deney yaparız.