Name: Polarize TIRF Mikroskopi tarafından İzlenen mikroakışkan Akış Hücredeki Gergin Desteklenen Bilayers Tek Proteoliposomes ve tuzak aracılı Fusion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Öğrenin, polarize TIRFM ile mikroakışkan hücrede tek SNARE-aracılı füzyon olaylarını gözlemleme yöntemini. Bu teknik, lipozom ve desteklenen çift tabaka arasındaki membran füzyonunu yüksek zamansal çözünürlükle analiz eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Polarize TIRF mikroskobunun tasarımı ve yapımı için Vladimir Polejaev'e (Yale West Campus Imaging Core) teşekkür ederiz, iki renkli algılama enstrümantasyonu konusunda yardım için David Baddeley'e (Yale Üniversitesi) ve James E. Rothman'a (Yale Üniversitesi) ve Ben O'Shaughnessy'ye (Columbia Üniversitesi) ve grup üyelerine tartışmaları teşvik ettikleri için teşekkür ederiz. EK, Kavli Vakfı'ndan Kavli Nörobilim Burs Ödülü ve NIH hibesi 1R01GM108954 ile desteklenmektedir.

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Burada anlatılan SUV-SBL füzyon deneyinde başarılı bir şekilde uygulanması kaliteli SBLs elde ve tek molekülleri tespit etmek için doğru görüntüleme parametrelerini seçerek, bu tür lipozomlar içine proteinlerin fonksiyonel sulandırma gibi birkaç önemli adımlar, kritik bağlıdır. O başarılı olmak için biraz zaman ve çaba alabilir rağmen tahlil başarıyla uygulandıktan sonra, Giriş bölümünde tartışılan başka in vitro füzyon deneyi bulunmayan füzyon süreci hakkında bilgi bir zenginlik sağlar. oranları, en SUV SBL, y...

Membran füzyon lipidler ve proteinler, sekresyon, gübreleme, gelişme hücre içi kaçakçılığı için gerekli evrensel bir biyolojik süreçtir ve konak organizmalar 1-3 içine virüs girişini sardı. Ekzositoz ile hormonlar ve nöron iletici serbest bırakılması da dahil olmak üzere pek çok hücre içi füzyon reaksiyonları için, iki lipit iki katmanlı sigorta enerji demirli, aynı kökenli çözünür, N-etilmaleimit duyarlı faktörü bağlama proteini reseptörü (SNARE) proteinleri arasında dört sarmal demet oluşumu ile sağlanır vezikül (V-SNARE), sırasıyla, hedef membran (t-SNARE) 4. Sinaptik vezikül ekzositoz en sıkı regüle füzyon reaksiyonudur ve bir aksiyon potansiyeli 1,4,5 geldikten sonra bir milisaniye içinde gerçekleşir. Füzyon gözenek, iki füzyon bölmeleri arasında ilk bağlantı, açık titreşmeye ve yeniden mühürleme ya da geri dönüşümsüz 5-7 genişletmeden önce birden çok kez kapalı olabilir. eski sonuçlargeçici olarak, ikincisi yol açar iken tam füzyon, füzyon &quot;öpücük ve çalıştırın&quot;. Bu iki füzyon modları ve gözenek titremesini düzenleyen mekanizmalar arasındaki dengeyi düzenleyen faktörler de 5,8 anlaşılmamıştır. Snare proteinler ekzositoz için gerekli olan; sinaptik vezikül füzyon nörotoksin 9 ile tuzaklarına ayrılması üzerine kaldırılmıştır. Küçük tek lamelli vesiküller (SUVler) kullanılarak yığın füzyon deneyleri membran füzyon 10 çalıştırmak için yeterli tuzak, sadece gerekli değildir; ancak şu. Bu toplu deneyde, SUV V-tuzak (V-SUV) ile yeniden flüoresan fosfolipid (N katkılı edildi - (7-nitro-2-1,3-benzoksadiazol-4-il) -phosphoethanolamine (NBD-PE) ve ( N -. (lisamin rodamin B sülfonil) -phosphoethanolamine (LR-PE) ve V-SUV NBD-PE Başlangıçta floresans Förster rezonans enerji transferi ile söndürüldü t-tuzak (t-SUV) ihtiva eden etiketlenmemiş veziküller ile (FRET ) LR-PE. laboratuvarda gibiELED v SUV etiketsiz t-SUV ile sigorta, şimdi kombine zarında fluorofor yüzey yoğunluğu azalır ve NBD-PE floresan sonuçlanan artış lipit 10 karıştırma ölçüde bildirir. Toplu tahlil kurmak ve analiz etmek kolay olduğu gibi, yaygın tuzak aracılı füzyon 10-14 mekanizmaları incelemek için kullanılır olmuştur. Ancak, bu düşük duyarlılık ve kötü zaman çözünürlüğü gibi çeşitli sınırlamalar vardır. En önemlisi, bir topluluk ölçü olarak, zor hemifusion ara maddelerin yerleştirme ve füzyon arasındaki ayrım, yanı sıra algılama yaparak tüm olaylar üzerinde bu ortalamalara sonuçları. Bizimki de dahil olmak üzere geçmiş on yılda birkaç grup, üzerinde, tek vezikül düzeyinde 15-27 füzyon olayları izlemek için yeni testlerin geliştirdik. Ha ve arkadaşları bir yüzey üzerine gergin v SUV kullanılan ve ücretsiz t-SUV 18,19 ile füzyon izlenir. Lipid karıştırma lipide bağlı flüoroforların bir çifti arasında FRET kullanılarak izlenmiştir emtoplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi 18 kullanılarak, sırasıyla V- ve t-SUV, içinde yataklı. Daha sonra, Brünger laboratuar lipit içeriği 20,28 karıştırma eş zamanlı saptanması için bir dizin işaretleyici ile birlikte tek bir lipit etiketli türler kullanılabilir. lipit ve içerikleri belirteçleri hem de yüksek, kendini söndürme konsantrasyonlarda dahil edildi; etiketlenmemiş SUV füzyon 20,28 dequenching floresan ile sonuçlanmıştır. Diğerleri t-tuzaklarına 15-17,21-27,29 ile yeniden düzlemsel bilayers v-SUV kaynaşmış. hedefin (içeren t-Snare) iki tabakalı iyi taklit düz bir plazma zarı ile küçük, son derece kavisli veziküllerin fizyolojik füzyon süreci düzlemsel geometrisi. Steinem grubu gözenekli silisyum nitrür alt-tabaka üzerinde süspansiyon haline t-tuzak ile yeniden gözenek kapsayan membranlar kullanılabilmekte ve konfokal lazer tarama mikroskobu 23 kullanılarak tek tek h-SUV ile füzyon tespit edildi. Diğerleri ft-tuzak ile yeniden düzlemsel iki katmanlı, kullanılmış h-SUV bir cam alt-tabaka 15-17,21,22,24-27,29 desteklenir. Desteklenen bilayers (SBLs) kullanarak büyük avantajı mikroakışkanları kullanarak da kullanarak tek olay çözünürlüğü sağlar, ancak TIRF mikroskopi, mükemmel sinyal-gürültü oranı ile ücretsiz v-SUV müdahalesi olmaksızın yerleştirme ve füzyon olayları tespit etmek için kullanılabilir olmasıdır standart uzak alan Epifloresans mikroskobu 24. Bir büyük endişe substrat-iki tabakalı etkileşimleri iki tabakalı kalitesi ve füzyon süreci desteklenen etkiler ve nasıl olduğunu. Erken çalışma, doğrudan bir cam veya kuvars alt tabaka 15-17 desteklenen edildi düzlemsel SBLs kullandı. Bu SBLs yayma ve alt-tabaka t-SUV membran füzyonu, patlama, adsorpsiyon ile yapılmıştır. Kısa bir süre sonra önemli bir T-SNARE bileşenini çıkararak SNAP-25&#39;in bu şekilde hazırlandı SBLs V-SUV yerleştirme füzyon kinetiği indistinguis sonuçlandı ki, gerçekleşmiştirtam t-tuzaklarına 17 kullanılarak elde edilenlerden hable. SNAP-25&#39;in kesinlikle vivo 30,31 füzyon için gerekli olduğundan, bu erken girişimleri fizyolojik alaka soru konulmuştur. Tamm grubu daha iyi desteklenen kontrollü iki tabakalı oluşumunu 21 kullanarak bu zorluğu aştı. Bu t-SUV 21 ile bu tek tabakalı füzyonu tarafından takip SBL protein içermeyen ilk broşürü için Langmuir-Blodgett birikimi kullanılır. Bu SNAP-25&#39;in bağımlı füzyon ile sonuçlanmıştır. Şirketinden Langmuir-Blodgett yöntemleri kullanmaya gerek kalmadan, bir cam alt-tabaka üzerinde desteklenen bir çift-katlı ile bağlantılı potansiyel eserler önlemek için, Karatekin&#39;i ve ark., Çift-katlı ve alt-tabaka 24 ile yumuşak, hidratlanmış poli (etilen glikol) (PEG) yastık kişiye. Bu modifikasyon aynı zamanda SNAP-25&#39;in bağımlı füzyon 24 sonuçlandı. yumuşak bir polimer tabakası üzerinde yastıklı bilayers daha iyi transmembran korumak için malûmProtein hareketlilik ve fonksiyon 32, ve virüsler 33 ile füzyon çalışmalarında kullanılan olmuştu. Buna ek olarak, PEG&#39;lenmiş bilayers-iyileşmek kendini bazı yeteneğini korumak gibi görünüyor ve 34,35 derece sağlamdır. İlk olarak, ticari olarak temin edilebilir, lipid bağlı PEG zincirlerinin bir kısmı, t-SUV zar dahildir. Bu T-SUV patlama ve bir cam alt-tabaka üzerinde düzlemsel bir çift tabakası oluşturur, PEG fırçası düzlemsel iki katmanlı iki broşür içerir. düzlemsel bir iki tabakalı oluşum hidrofilik bir cam yüzeyi üzerine, T-SUV Çevre PEG zincirlerinin yapışma tahrik sayesinde, lipozom patlama ve düzlemsel iki katmanlı oluşum şeklinde kullanılan yağ bileşimine nispeten hassas değildirler. kolesterol büyük miktarlarda dahil edilir, ancak, SUV kohesif özelliklere artan, SUV kendiliğinden patlama olabilir. Bu durumda, ozmotik şok ve çift değerli iyonlar, düzlemsel bir iki tabakalı oluşum 25 yardımcı olarak kullanılabilir. Bu ap olarak, yukarıda da belirtildiği gibiPEG fırçası düzlemsel her iki tarafını da kapsar yaklasımlarında iki tabakalı desteklenir. mikroakışkan akış kanalı bakan fırçası, genellikle, bir PEG tabakası ile kaplanmış olan gelen V-SUV spesifik olmayan yapışmasını önlemeye yardımcı olur. V- ve t-Snare komplekslerinin oluşumu zara yakın etki 36 doğru kademeli olarak zara-uzak N-termini ve gelirleri başlar. v-SUV t-SBL, V ve tayinin koşulları altında durum gibi görünüyor PEG fırçalar, üzerinde çıkıntı t-tuzak N-termini ihtiyacı ile etkileşim için. Fırça yüksekliği PEG&#39;lenmiş lipidlerin yoğunluğu ve PEG bağ uzunluğunun gösterildiği 37,38 değiştirilerek tuzak dışındaki proteinlerin incelemek için adapte edilebilir. Füzyon iki katmanlı proksimal yüzeyleri kaplayan PEG fırçalar başka yararı da meydanda mikron 39 başına 30,000-40,000 integral membran proteinleri ile paketlenir biyolojik membranların kalabalık ortamı taklit olmasıdır. Sadece bu testte PEG zincirleri gibi, Repubiyolojik zarlardan kapsayan lsive protein tabakası füzyonu meydana gelmesi için, iki fosfolipid ikili tabakalar arasındaki temas sağlamak için bir kenara gerekmektedir. bunlar özel avantajlar sunar olarak mikroakışkan akış kanalları, bu deneyde kullanılır. İlk olarak, mikro-akışkan akış t-SBL oluşturulması için daha düzgün yayılması için T-SUV çökelmesini ve sigorta sağlar. İkincisi, küçük kanal hacmi (&lt;1 ul) örnek tüketimini en aza indirir. Üçüncü olarak, gerekli küçük hacimler, tüm deney sürekli akışı altında iletilmesine olanak tanımaktadırlar. Akış zayıf kaldırır, muhtemelen non-spesifik, SBL 16 yapıştırılır v-SUV. Ayrıca, kinetik analiz 17 basitleştirilmesi t-SBL Yukarıda h-SUV, sabit bir yoğunluğa tutar. Son olarak, demirledi kesecikler kolaylıkla akışı 25 tarafından taşınan serbest olanlardan ayırt edilir. Dördüncü olarak, çok sayıda mikroakışkan kanal her biri farklı bir durum tarama aynı lamel kullanılabilir. Bu koşullar Duri karşılaştırılmasına olanak sağlarAynı deney çalıştırmak ng. Benzer bir yaklaşım influenza virüsü ve yastıklı SBLs 33 arasında füzyon incelemek için van Oijen grubu tarafından kullanılmaktadır. TIRF mikroskopi, cam tampon arayüzü çok yakın olan bu moleküllere sınırlandırır floresan uyarma (bir çürüme sabit ~ 100 nm) ile yiten alanın üstel çürüme. Bu, daha uzak olan floresan moleküller katkısını en aza indirir sinyal-gürültü oranını artırır ve 10-40 milisaniye çerçeve pozlama süreleri ile tek bir molekül hassasiyeti sağlar. fani alanı da füzyon üzerine bir sinyal artışına neden olur: SBL içine SUV etiketli lipidler transferi gibi, kendilerini bulmak, ortalama olarak, daha güçlü bir uyarım alanında. floresanstaki bu artış daha büyük lipozomlar için kuvvetlidir. polarize ışık kaybolan alan üretmek için kullanılırsa, ilave özellikler t üzerine floresanstaki değişikliklere katkıdaSBL içine SUV etiket ransfer. Bazı lipid boyalar da gömülü olduğu çift-katlı göre bir tercih edilen ortalama açı ile yönlendirilmiş bir geçiş dipol sahiptir. Polarize ışın farklı iki zarlarında boyalar heyecanlandıracak çünkü bu, onlar SBL karşı SUV olduğunda fluorophores tarafından yayılan floresan miktarında bir fark yaratmaktadır. ikincisi için, dipol yönelimleri düz SBL geometri ile sınırlı olacak, oysa eski için, uyarma kiriş, küresel SUV etrafında odaklı geçiş dipol ile etkileşim olacaktır. Boya zar 29,40 bir lipit, boya geçişi dipol yönelimli paralel SUV daha SBL olduğunda, örneğin, S-polarize (yansıma düzlemine dik polarize) gelen ışık kullanıldığında, uyarım daha etkilidir (örneğin, DII bu veya yaptıkları 41-43 gibi). Böyle bir fluorofor ile katkılı bir SUV loş göründüğünde SBL (Şekil 7, representat üzerine bu rıhtım<html> ) Sonuçları ive. Bir füzyon gözenek açılır ve SUV ve SBL membranlar bağlayan gibi, floresan sondalar SBL nüfuz ve s-polarize kaybolan alanda 25,27,29 tarafından heyecan daha olası hale gelir. Sonuç olarak, füzyon site çevresinde entegre floresans sinyali SBL 27 (Şekil 3 ve Şekil 7) içine SUV boya transferi sırasında büyük oranda artar. SBL aktarılır zaman seyreltilmiş olarak füzyon floresan etiket dequenching olduğunu eşlik değişiklikleri sinyal katkıda ek bir faktör. dequenching katkısı nedeniyle sadece küçük bir kısmı (burada anlatılan deneyde kaybolan alan çürüme ve polarizasyon etkileri ile karşılaştırıldığında genellikle önemsizdir <img alt="denklem 1" src="/files/ftp_upload/54349/54349eq1.jpg" /> ) Lipidlerin etiketlenmiştir. füzyon üzerine sinyal artışı zamanı karşılaştırarak füzyon gözenek özelliklerini anlamak için kullanılabilir,1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54349 / 54349eq2.jpg &quot;/&gt;, bir lipit fiili bırakma süresi lipidler serbestçe geçirgen bir gözenek yoluyla kaçmak için gerekli olan, <img alt="denklem 1" src="/files/ftp_upload/54349/54349eq3.jpg" /> . İki zaman ölçekleri karşılaştırılabilir ise, gözenek lipit akışına çok az direnç sunar sonucuna olacaktır. Gerçek serbest bırakma süresi daha uzun difüzyon ile sınırlı serbest bırakılması için zaman önemli ölçüde ise, ancak, bu lipit salgılamayı geciktiren, bu gözenek titremesi gibi bir işlem işaret eder. Difüzyon sınırlı bırakma zamanı, <img alt="denklem 1" src="/files/ftp_upload/54349/54349eq2.jpg" /> , Fırınlama lipozom ve lipid-yayılma büyüklüğüne bağlıdır; onun tahmini bu iki parametre sayısal gerektirir. Testin tek bir molekülün duyarlılık lipit yayınım her füzyon olayı 26 için SBL onların serbest bırakıldıktan sonra birkaç tek lipit fluorophores takip ölçülebilir sağlar. Her füzyon vezikül büyüklüğü(i) tek bir lipid boyanın yoğunluğu, SUV (ii) tüm flüoroforlar füzyon üzerine SBL aktarılır sonra yerleştirme site çevresinde toplam parlaklıkta meydana gelen değişiklikler (III) bilinen bir etiketleme yoğunluğu birleştirilerek 27 tahmin edilebilir lipitler, ve (iv) lipit alan başına. Üniforma SUV boyutu 44 varsayarak Daha önce de belirtildiği gibi birçok füzyon etkinlikleri için gerçek lipit bırakma süreleri, difüzyon kontrollü salım 27 tarafından beklenenden çok daha yavaş olduğu tespit edildi. Lipid sürümü geriliği varsayarsak titremeyi gözenek nedeniyle, nicel bir model &quot;gözenek açıklık&quot; tahmin edilebilir, zaman kesir gözenek füzyonu 27 boyunca açık kalır. Ne zaman pratik, lipid ve çözünür içeriği etiketleri her ikisini de kullanarak füzyon mekanizmaları test etmek önemlidir. Örneğin, lipit bırakma gibi Snare proteinler Surround ton lipit difüzyon kısıtlanması olarak gözenek titremesi başka süreçler tarafından geciktirilebilir olabilirO gözenek. Bu durumda olsaydı, o zaman, lipit etiket salınmasını önce olur içeriğinin serbest boşluk çözünebilir problar geçişine izin verecek kadar büyük olması gereklidir. yaklaşımı daha temel bir kusur SBL etiketli lipitlerin transferi büyük ölçüde öncesi füzyon şeklini korudu bir kesecik için SBL bağlayan dar bir füzyon gözenek yoluyla gerçekleşir varsayım olabilir. Daha önce lipit bırakma verilerine yalnız 29 dayalı önerdi olarak SBL içine lipid transfer de, bir eşlik eden füzyon gözenek, SBL membran içine SUV son derece hızlı çöküşü hızlı genleşme sonucu olabilir. Her iki lipid İzleme ve içeriği aynı anda bırakın, birçok gözenekler tüm lipit etiketlerini serbest bıraktıktan sonra yeniden mühürlenerek bulundu, ancak kendi çözünür kargo 27 bazı tutuldu. Bu en azından bazı lipozomlar SBL içine lipit boya transferi bir füzyon gözenek yoluyla oluşur birleşmesinden sonra SBL içine çökmeye ve yok olduğunu gösterir. Buna ek olarak, lIPID ve içeriği bırakma lipit sürümü geriliği gözenek 45 çevreleyen Snare protein lipid difüzyon engel teşkil nedeniyle olduğunu olmayan, aynı anda 27 oluştu. Çözünür içeriği serbest izlemek vermedi bir SUV-SBL füzyon protokol daha önce Karatekin ve Rothman 25 tarafından yayımlandı. Burada, daha son gelişmeler dahil lipid yani eşzamanlı izleme ve içerikleri serbest ve SUV, lipit ve füzyon gözenek özellikleri 27 tahmini vardır. Protokol, bir cam lamel 25 bir poli (dimetil siloksan) yapıştırılması ile yapılan mikro-akışkan hücreleri (PDMS) elastomer blok ihtiva eden oluklar hazırlanması için talimatlar ile başlar. Daha sonra, lipid ve içeriği belirteçlerinin her ikisi de V-SUV hazırlanması açıklanmıştır. Bölümler 4 ve 5, VS giriş, mikroakışkan hücre montaj yerinde SBLs şekillendirme ve kusurları ve akışkanlığı kontrol için yönergeler sağlarakış hücreleri füzyon etkinlikleri algılama içine UV&#39;lerinizi. Bölüm 6 Veri analizi için yönergeler sağlar.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Milli-Q (MQ) su</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>J.T. Baker</td><td>3040-05</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 190 Korumalı</td><td>Decon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Fisher Kimyasal</td><td>A416P4</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>AmericanBio</td><td>AB00892</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Kolür (KCl)</td><td>AmericanBio</td><td>AB01915</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>AmericanBio</td><td>AB00490</td><td></td></tr><tr><td>N-[2-hidroksietil] piperazin-N'-[2-etansülfonik asit] (HEPES)</td><td>AmericanBio</td><td>AB00892</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros Organics</td><td>409911000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Buffers</td></tr><tr><td>HEPES-KOH tamponu (pH 7.4)</td><td></td><td></td><td>25 mM HEPES-KOH, 140&nbsp; mM KCl, 100&nbsp; &mu; M EGTA, 1&nbsp; mM DTT</td></tr><tr><td colspan="4"><güçlü>Çözücüler</güçlü></td></tr><tr><td>Kloroform&nbsp;</td><td>J.T. Baker</td><td>9180-01</td><td>cam şişede, DİKKAT, KKD</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>JT Baker</td><td>9070-03</td><td>cam şişede, DİKKAT, PPE</td></tr><tr><td colspan="4">Liposome preparasyonu</td></tr><tr><td>Gastight Hamilton şırınga</td><td>Hamilton</td><td>var. boyutlar</td><td>sadece solentli cam şırınga kullanın (Chlorophorm/ Methanon, 2:1, v/v)</td></tr><tr><td>Cam tüpler Pyrex Vista 11 ml, 16x100 mm vidalı kapak kültür tüpü</td><td>Pyrex&nbsp;</td><td>70825-16</td><td>iyice temizleyin, kloroform</td></tr><tr><td>1-palmitoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfokolin ile durulayın, 16:0-18:1 PC (POPC)</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>850457</td><td>Lipidler, CHCl3 içinde çözülmüş veya kapalı şişelerde lifilize toz halinde gelir. Açıldıktan sonra Aliquot. -20 ° C'de inert atmosfer altında fazladan kurutulmuş lipit filmler olarak saklayın. Stokları -20 ° C'de CHCl3 / MeOH (2: 1, v / v) içinde tutun. açmadan önce RT'ye gelelim</td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl- sn -glisero-3-fosfo-L-serin (sodyum tuzu), 18: 1 PS (DOPS)</td> <td>Avanti Polar Lipids</td><td>840035</td><td>Yukarıdakiyle aynı.</td></tr><tr><td>1-stearoil-2-araşidonoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin, 18: 0-20: 4 PE (SAPE)</td> <td>Avanti Polar Lipidler</td><td>850804</td><td>Yukarıdakiyle aynı.</td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatidilinositol-4,5-bifosfat (Beyin, Domuz) (amonyum tuzu), Beyin PI(4,5)P2</td><td>Avanti Polar Lipidleri</td><td>840046</td><td>Yukarıdakiyle aynı.</td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-(7-nitro-2-1,3-benzoksadiazol-4-il) (amonyum tuzu), 18: 1 NBD PE</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>810145</td><td>Yukarıdakiyle aynı.</td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-[metoksi(polietilen glikol)-2000] (amonyum tuzu), 18:1 PEG2000 PE</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>880130</td><td>Yukarıdakiyle aynı.</td></tr><tr><td>kolesterol (küçükbaş yünü, %>98)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700000</td><td>Yukarıdakiyle aynı.</td></tr><tr><td>DiD' yağı; DiIC18(5) yağı (1,1'-Dioktadesil-3,3,3",3'-Tetrametilindodikarbosiyanin Perklorat)</td> <td>Moleküler Problar</td><td>D-307</td><td></td></tr><tr><td>Rotavapor R-210</td><td>Buchi</td><td>R-210</td><td>kullanılan lipitlerin Tm üzerinde ısı banyosu</td></tr><tr><td>OG n-Oktil-&beta;-D-Glukopiranosid</td><td>Affymetrix</td><td>0311</td><td>-20 ° C'de saklayın; C, Shaker açmadan önce RT'ye gelelim</td></tr><tr><td>- Eppendorf Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyze Diyaliz Kasetleri, 20k MWCO, 3&nbsp; ml</td><td>yaşam teknolojileri</td><td>66003</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Beads SM-2 Adsorbanlar</td><td>Bio-Rad</td><td>1523920</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep&nbsp; Yoğunluk Gradyan Orta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj tüpü, İnce Duvar, Ultra Net, 13.2 & ml, 14 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>41121703</td><td></td></tr><tr><td>Beckman SW41 Ti rotor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuflorhodamineB</td><td>Moleküler Problar</td><td>S-1307</td><td></td></tr><tr><td>Ekono-Sütun&nbsp; Kromatografi Sütunları, 2.5 > 10 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>7372512</td><td></td></tr><tr><td>Sefaroz CL-4B</td><td>GE Sağlık</td><td>17-0150-01</td><td></td></tr><tr><td>SYPRO Turuncu Protein Jel Leke</td><td>Moleküler Probları</td><td>S-6650</td><td>DMSO</td></tr><tr><td colspan="4">PDMS bloğu</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silikon elastomer kiti, PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex cam petri kabı, 150 x 20 mm, kapaklı komple</td><td>Corning</td><td>3160-152</td><td></td></tr><tr><td>Delgeç - Yeniden Kullanılabilir Biyopsi Zımbası, 0,75&nbsp; mm</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>504529</td><td></td></tr><tr><td>Manuel Delik Delme Makinesi&nbsp;</td><td>SYNEO</td><td>MHPM-UNV</td><td></td></tr><tr><td>Matkap .035 x .026 x 1.5 304 SS TiN kaplamalı yuvarlak zımba</td><td>SYNEO</td><td>CR0350265N20R4</td><td>matkap çapı: 0,9 mm, zımba deliği boyutu: 0,74 mm</td></tr><tr><td>Tygon Mikro delikli boru, 0,25 mm İç Çap, 0,76 mm Dış</td> Çap <td>Cole-Parmer</td><td>06419-00</td><td>0,010" İç Çap, 0,030" Dış</td></tr><tr><td>Çap Silikon Boru (0,51 mm İç Çap, 2,1 mm Dış</td> Çap <td>Cole-Parmer</td><td>95802-00</td><td>0,020" İç Çap, 0,083 inç Dış Çap</td></tr><tr><td colspan="4">Kapak camı - temiz oda temizlendi</güçlü></td></tr><tr><td>Schott Nexterion kapak kayma camı D</td><td>Schott</td><td>1472305</td><td></td></tr><tr><td>plazma temizleyici</td><td>Harrick</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">pTIRF kurulumu ve aksesuarları</td></tr><tr><td>IX81 mikroskop gövdesi</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>EM CCD kamera</td><td>Andor</td><td>ixon-ultra-897</td><td></td></tr><tr><td>Termo Plaka, ısıtmalı mikroskop tablası</td><td>Tokai Hit</td><td>MATS-U52RA26</td><td></td></tr><tr><td>1 ml hamilton cam şırınga (4x)</td><td>Hamilton</td><td>81365</td><td></td></tr><tr><td>şırınga pompası</td><td>kd Scientific</td><td>KDS-230</td><td></td></tr></tbody></table>

polarize tirf mikroskopi tarafından İzlenen mikroakışkan akış hücredeki gergin desteklenen bilayers tek proteoliposomes ve tuzak aracılı fusion

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

membran füzyon her yerde sürecinde bir füzyon gözenek açılması iki eski ayrı bölmeleri arasında ilk bağlantı kurar. ekzositoz yoluyla nörotransmiter veya hormon salınımı sırasında, füzyon gözenek geçici açık ve kapalı defalarca düzenleyen kargo bırakma kinetiği yapabilirsiniz. Gözenek dinamikleri de vezikül geri dönüşüm modu belirlemek; Geçici, &quot;kiss-ve-run&quot; füzyon geri dönüşümsüz tekrar mühürleme sonuçları, oysa dilatasyon tam erimesine yol açıyor. Daha iyi gözenek dinamikleri yöneten faktörlerin neler olduğunun anlaşılması için, biz tek bir molekülün duyarlılık ve ~ bir biyokimyasal vitro sistemde iyi tanımlanmış 15 msn zaman çözünürlüğü ile polarize toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi kullanılarak membran füzyon izlemek için bir tahlil geliştirdi. Fusion floresan düzlemsel iki tabakalı rulman t-tuzaklarına ile V-Snare proteinler (v-SUV) içeren küçük tek tabakalı veziküller etiketli, yumuşak bir polimer yastık desteklenen (t-SBL, t-desteklenen iki tabakalı) Izlenir. Tahlil SUV sabit bir yoğunluğa tedarik ederken en az numune tüketimini sağlamak mikroakışkan akış kanalları kullanır. füzyon sırasında SBL için SUV lipit etiket transferi üzerine hızlı sinyal geliştirme istismar lipit boya transferi kinetik izlenir. TIRF mikroskopi duyarlılığı lipit yayınım ve SUV boyutu her füzyon olayı için çıkarılabilir hangi tek floresan lipit etiketleri, izleme sağlar. Lipid boya bırakma süreleri kalıcı olarak açık gözenekler aracılığıyla engelsiz geçiş için beklenenden çok daha uzun olabilir. Lipid sürümü geriliği titremesini gözenek nedeniyle bir gözenek &quot;açıklık&quot;, gözenek füzyonu sırasında açık kalır zaman kısmını kabul, bir modeli kullanarak, tahmin edilebilir. Bir çözünür işaret lipid ve çözünür kargo sürümü aynı anda izlenmesi için SUV kapsüllü edilebilir. Bu tür ölçümler, bazı gözenekler çözünür kargo bir kısmını kaybettikten sonra yeniden mühürlemek olabilir göstermektedir.

SBL Kalite Füzyon deneyi öncesinde SBL kalite ve akışkanlığı kontrol etmek çok önemlidir. mikroakışkan kanal alt cam tarafında floresan belirgin kusurlar olmadan düzgün olmalıdır. Bir hava kabarcığı kanalı olsa geçerse, genellikle SBL görünür izleri bırakır. Böyle büyük ölçekli izleri / kusurları varsa, o kanalı kullanmayın. Bazen SUV alt tabaka üzerine yapışır ama sürekli bir SBL daldı ve oluşturmak için başa...

Burada, tek bir molekül duyarlılık ve ~ 15 msn zaman çözünürlüğü ile polarize TIRFM kullanılarak lipozomlar ve mikroakışkan kanallarda desteklenen iki katmanlı arasındaki tek tuzak aracılı füzyon olayları tespit etmek için bir protokol mevcut. Lipid ve çözünür kargo sürümü aynı anda tespit edilebilir. Lipozom boyutu, lipit yayınım ve füzyon gözenek özellikleri ölçülmüştür.

Polarize TIRF Mikroskopi tarafından İzlenen mikroakışkan Akış Hücredeki Gergin Desteklenen Bilayers Tek Proteoliposomes ve tuzak aracılı Fusion

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

Bu deneyin genel amacı, nöronal ve ekzositozik SNARE proteinlerinin yönlendirdiği bireysel membran füzyon olaylarını gözlemleyerek nörotransmitter ve hormon salınımının temel mekanizmalarını anlamaktır. Bu yöntem, kargonun dinamik bir füzyon poru aracılığıyla nasıl salındığı ve füzyon sonrası porun akıbeti gibi membran füzyon alanıyla ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı; vezikül kenetlenmesi, açılma için füzyon ve kargo salınım kinetiğinin farklı aşamalarının, biyokimyasal olarak tanımlanmış ortamlar içindeki bireysel olaylar için gözlemlenebilmesidir.Bu yöntem ekzositoz hakkında bilgi sağlayabilse de, enfeksiyon sırasında zarflı virüslerin hedef hücre membranlarıyla füzyonu gibi diğer membran füzyon reaksiyonlarına da uygulanabilir. Genellikle, bu yöntemi ilk kez kullanacak kişiler, mikrofabrikasyondan protein saflaştırmaya ve görüntülemeye kadar pek çok farklı adımın uzmanlık gerektirmesi nedeniyle zorluk yaşayabilirler. Başlamak için, standart fotolitografi tekniklerini ve burada gösterilen şablonu kullanarak bir silikon ana kalıp hazırlayın.Ardından, tek kullanımlık plastik bir kaba 100 milliliters PDMS bazı ve 10 milliliters kürl

snare-mediated-fusion-single-proteoliposomes-with-tethered-supported

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Desteklenen düzlemsel bilayers immünolojik sinaps moleküler etkileşimleri modellemek için kullanılabilir güçlü araçlardır. Burada, lipid bilyer üst broşür sinaps oluşumunu modüle ve sinaps oluşumu TIRF mikroskobu kullanarak görselleştirmek için bilinen hücre adezyon proteinleri demirleme için yöntemler göstermektedir.

İmmünolojik Sinapslar ve Kinapse Eğitim Oluşumu için desteklenen Düzlemsel Bilayers

Biz β-galaktosidaz aktive ifadesi ile SNARE-aracılı membran füzyon olaylar rakamlarla bir hücre füzyonu tahlil geliştirdik.

Enzimatik bir hücre füzyon deneyi kullanılarak SNARE-aracılı membran füzyon analizi

Polarizasyon tabanlı Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu (pTIRFM) hücre zarı dinamiklerinin gerçek zamanlı algılama sağlar. Bu makalede, düzenlenmiş Ekzositoz sırasında zar yeniden çalışma için pTIRFM uygulanmasını tarif etmektedir. Teknik doğrudan veya dolaylı membran şekil değişiklikleri içeren hücre biyolojisi diğer işlemler için genellenebilir.

PTIRFM ile görüntüleme Plazma Membran deformasyonlar

Protein fonksiyonelleştirilmiş düzlemsel cam destekli lipid çift katmanlarının hazırlanması, içindeki protein hareketliliğinin belirlenmesi ve protein yoğunluklarının ölçülmesi burada gösterilmiştir. Yüksek uzay-zamansal çözünürlüğe sahip tek çift katmanlı yerleşik florokromların görselleştirilmesine olanak tanıyan, gürültüsü azaltılmış bir Toplam İç Yansıma mikroskobu oluşturmak için bir yol haritası özetlenmiştir.

Planar on Tek Molekül Floresans Mikroskopi bilayers Desteklenen

Bu protokol bırakmak Förster rezonans enerji transferi ve floresan mikroskopi Imaging ömür boyu göre SNARE proteinlerin karmaşık oluşumu nicel görselleştirme için yeni bir yöntem açıklanır.

Hücre içi SNARE mikroskobu Imaging Floresans ömür tarafından kaçakçılığı görüntülenmesi

Mitokondriyal füzyon mitokondriyal dinamiğin altında yatan önemli bir homeostatik reaksiyondur. Burada açıklanan bir in vitro reconstitution sistemi membran tethering çözebilir mitokondriyal iç membran füzyon çalışması, yerleştirme, hemifüzyon, ve gözenek açılması. Hücre zarı sistemlerinin araştırılmasında bu yaklaşımın çok yönlülüğü tartışılmıştır.

Mitokondriyal Membran Dinamiğinin Yeniden İkasini için Model Membran Platformu

Bu protokol, floresan mikroskobu kullanılarak yeniden oluşturulmuş, membrana bağlı sitoiskelet ağlarının dinamiklerini incelemek için desteklenen lipid çift katmanlarının oluşumunu ve hücre iskeleti filamentlerinin ve motor proteinlerin eklenmesini açıklar.

Membrana Bağlı Minimal Aktin Kortekslerinin Desteklenen Lipid Çift Katmanlı Üzerinde Yeniden Sulandırılması

Burada, tek moleküllü toplam iç yansıma floresan (smTIRF) mikroskobu kullanılarak yapay kalabalık lipit membranları üzerindeki tek moleküllerin bağlanma, hareketlilik ve montajını gerçekleştirmek ve analiz etmek için bir protokol sunulmaktadır.

Tek Moleküllü Difüzyon ve Polimer Kalabalık Lipid Membranlara Montaj

Bu protokol, bireysel iyon kanallarını izlemek ve desteklenen lipit membranlarındaki aktivitelerini belirlemek için TIRF mikroskopisinin nasıl kullanılacağını açıklar, böylece yanal membran hareketi ile kanal fonksiyonu arasındaki etkileşimi tanımlar. Membranların nasıl hazırlanacağını, verilerin nasıl kaydedileceğini ve sonuçların nasıl analiz edileceğini açıklar.

Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu Kullanılarak Lipid Çift Katmanlarında Yanal Mobilite ve İyon Kanalı Aktivitesinin Tek Moleküllü Görüntülenmesi

Bu makale, katı destekli lipid çift katmanlarında tek protein izleme için örnekler nasıl oluşturulacağına dair ayrıntılı bir açıklama sunmaktadır. Ayrıca, tek molekül hassasiyeti ve hızlı kare hızına sahip basit bir floresan mikroskobu da açıklar. Son olarak, tek protein yörüngelerinin çıkarılması prosedürünü özetliyoruz.

Lipid çift katmanlarında tek proteinlerin floresan mikroskopisi kullanılarak takibi

Öğrenin, polarize TIRFM ile mikroakışkan hücrede tek SNARE-aracılı füzyon olaylarını gözlemleme yöntemini. Bu teknik, lipozom ve desteklenen çift tabaka arasındaki membran füzyonunu yüksek zamansal çözünürlükle analiz eder.

Polarize TIRF Mikroskopi tarafından İzlenen mikroakışkan Akış Hücredeki Gergin Desteklenen Bilayers Tek Proteoliposomes ve tuzak aracılı Fusion (Video) | JoVE Journal

Polarize TIRF Mikroskopi tarafından İzlenen mikroakışkan Akış Hücredeki Gergin Desteklenen Bilayers Tek Proteoliposomes ve tuzak aracılı Fusion

Daha fazla video keşfet