Willis Fare Çemberi Ayırma Protokolü

Bu diseksiyon prosedürünün genel amacı, fare serebrovaskülatürünün büyük damarlarının incelenmesini kolaylaştırmak için Willis'in murin çemberini izole etmektir. Bu yöntem, Alzheimer hastalığı ve serebral ameloid anjiyopati gibi serebral damarları etkileyen çeşitli hastalıklarda serebrovasküler gen ekspresyonu çalışmasındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, büyük damarların, damar yapısını değiştirmeden hızlı ve kolay bir şekilde izole edilebilmesidir.

Göğüs kafesinin hemen altında ölümcül anestezi uygulanmış bir farenin karın duvarında ve peritonunda dört santimetre uzunluğunda bir kesi yapmak için İris makası kullanarak başlayın. Daha sonra, diyaframda birkaç milimetre uzunluğunda bir kesi yapın ve plevral boşluğu ortaya çıkarmak için göğüs kafesinin tüm uzunluğu boyunca kesiye devam edin. Sternumu kaldırın ve ucu bir kanama durdurucu ile sıkıştırın, kanama durdurucu boynuna dayayın.

Ardından, sternumu kalbe bağlayan yağ dokusunu dikkatlice kesin. Şimdi 15 gauge bir füzyon iğnesini sol ventrikülden kalbin tepesine geçirin ve perfüzat için bir çıkış oluşturmak üzere karaciğer loblarından birini kesmek için makas kullanın. Hayvanı yaklaşık on dakika boyunca dakikada 2,5 mililitre pompa hızında 25 ila 50 mililitre PBS ile perfüze edin.

Kan PBS ile değiştirildiği için karaciğer ağartılmalıdır. Karaciğerden gelen sıvı tamamen berrak olduğunda, perfüzyonu durdurun. Beyni izole etmek için, boyundan buruna kadar cilt boyunca orta hat kesisi yapmak için İris makası kullanın.

Kafatasını ortaya çıkarmak ve kalan kas ve yağ dokusunu çıkarmak için cildi İris makasıyla kesin. Ardından, İris makasının uçlarını foramen magnumun bir tarafına yerleştirin ve uçları kafatasının iç yüzeyi boyunca dış işitsel meatusa dikkatlice kaydırın. Foramen magnumun diğer tarafında da benzer bir kesi yapın, ardından sagital sütürün başlangıcına kadar interparietal kemiğin iç yüzeyi boyunca bir orta hat kesimi yapın.

Kapalı İris makasını sagital dikişte gözlerin arasındaki ön kemiğe yerleştirin ve kafatasını ikiye bölmek için bıçakları açın. Forseps kullanarak, koku soğancıklarını kavrayın ve beynin ventral yüzeyindeki sinir bağlantılarını kesmek için İris makasını kullanın. Sonra beyni 60 milimetrelik bir buz gibi soğuk PBS Petri kabına daldırın.

Willis'in çemberini izole etmek için, çanağı diseksiyon mikroskobu altında bir buz torbasına aktarın ve Willis'in çemberini görselleştirmek için beyni sırt yüzeyine çevirin. Koku alma loblarının tabanındaki ön serebral arterleri kavramak için küçük forsepsleri kullanın ve arterleri damar sürekliliğinden ayırmak için baskı uygulayın. Orta serebral arterleri de aynı şekilde kesin.

Daha sonra orta serebral arterleri kavramak için forsepsin keskin uçlarını kullanın ve arka iletişim arterlerinin başlangıcını yukarı kaldırın ve her iki arter setini de beyinden ayırın. Daha sonra, ön arterleri kaldırın ve ön dorsal yönde optik kiazma üzerine nazikçe çekin. Üst ve arka serebellar arterleri aynı şekilde çıkarın, ardından baziler arterin yer değiştirmesini izleyin.

Son olarak, Willis'in tüm çemberini buz gibi PBS içeren 60 milimetrelik bir Petri kabına nazikçe aktarmak için forsepsleri kullanın ve kalan beyin dokusunu dikkatlice çıkarmak için iki forseps kullanarak damarları küçük pimlerle yerine sabitleyin. Willis'in çemberi tek parça halinde çıkmalı ve damar sisteminde artık kan kalmaması nedeniyle biraz şeffaf olmalıdır. Willis'in temiz çemberi, Düz Kas Aktini, Düz Kas-Miyozin Ağır Zincir ve Smoothelin gibi vasküler düz kas hücresi belirteçlerini spesifik olarak ifade etmelidir.

Buna karşılık, miyelin oligodendrosit glikoproteini veya mikrotübül ile ilişkili protein 2 gibi nöronal belirteçler, Willis'in çemberinde sadece zar zor tespit edilebilir olmalıdır. Ayrıca, Willis nöral dokusunun daire dışı içindeki endotel belirteci E-Selectin'in ekspresyonu, muhtemelen bir beyin-kılcal ağın varlığını yansıtan Willis örnekleri çemberi için elde edilene çok benzer. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa iki saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü denerken, fare beyin damarlarının çok ince olduğunu ve kolayca kırıldığını unutmamak önemlidir. Bu nedenle, tüm yapının tek parça halinde hasat edilmesini sağlamak için diseksiyon acele etmeden çok dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, inflamatuar sinir hastalığı alanındaki araştırmacıların, Alzheimer'ın fare modelinde serebral vasküler bozukluğu ve serebral amiloid anjiyopati gibi ilgili hastalıkları keşfetmelerinin yolunu açıyor.

Bu videoyu izledikten sonra, Willis'in çemberini bir fareden nasıl izole edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.