Bir ve İki Boyutlu Kültürlerde Elektrik ve Manyetik Alanlar Kullanan Nöronların Harici Uyarımı

Tek boyutlu ve iki boyutlu kültürlerin elektrik ve manyetik stimülasyonu için bu protokolün genel amacı, nöronal kültürleri, içgörü ve önemli parametreleri çıkarabileceğimiz beyin stimülasyonu için indirgenmiş bir model olarak verimli bir şekilde kullanmaktır. Elektrik stimülasyon protokolümüzü tek boyutlu kültürlerle kullanmak, nöronun farklı bölmelerindeki kronaksi ve reobaz gibi nöral uyarma ile ilgili spesifik parametreleri ölçmemizi sağlar. Manyetik stimülasyon tekniği, manyetik ve elektrik alanlarının nöronal kültürler üzerindeki etkisini karşılaştırmamızı sağlar.

Bu model aynı zamanda beyin bozukluklarını daha iyi teşhis etmemizi ve tedavi etmemizi sağlar. Herhangi bir tasarım modelinde, hatta tek boyutlu ağlarda bile, model nöronal ağları kültürlemek için etkili ve kolay bir yöntem öneriyoruz. Daha sonra, nöronun farklı bölümlerinden gelen katkıları ayırmak ve gözlemlemek için bu ağlara göre elektrik ve zamanla değişen manyetik alanları yönlendirebiliriz.

Bu tekniğin temel avantajı, nöronal stimülasyon için doğru parametrelerin kapsamlı ve kapsamlı bir şekilde araştırılmasını sağlayan insan denekler veya hayvan modelleri gerektirmemesidir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Yuri Burnishev ve laboratuvarda doktora öğrencisi olan Ami Eisen olacak. Başlamak için, kısmen bir biyolojik reddetme tabakası ile önceden kaplanmış cam lameller üzerine nöral hücreleri tohumlayarak desenli nöronal kültürler hazırlayın.

Bunu yapmak için 25 milimetre lamelleri temizleyin. Ve bir Püskürtme Makinesi kullanarak, lamel biyolojik olarak reddedilen bir tabaka ile kaplayın. Kaplama stabilitesini sağlayan altı ila 10 angstrom arasında ince bir krom filmden ve kaplamayı tiyol reaktivitesi ile sağlayan 30 angstrom kalınlığında bir altın tabakadan oluşan bir katman oluşturmak için biriktirme işlemi için parametrelere ayarlayın.

İşlem tamamlandıktan sonra, lamel Püskürtme Makinesinden çıkarın ve elde edilen kaplamayı inceleyin. Ardından, bir çizici kalemin mürekkep ucunu keskin bir metal aşındırma iğnesi ile değiştirerek değiştirilmiş bir kalem çizici sistemini monte edin. Aşındırma sırasında sağlam ve yüksek sürtünmeli bir yüzey sağlamak için sert bir plakaya yapıştırılmış bir kauçuk tabakayı çiziciye yerleştirin.

Ardından, çizici üzerinde sağlanan düğmelere basarak sayfanın konumunu ayarlayın. Kauçuk tabaka yerine oturduktan sonra, yüzeyine küçük bir damla su pipetleyin ve önceden kaplanmış lamel damlanın üzerine yerleştirin. Ardından, çiziciyi kullanarak, istenen desenleri oluşturmak için 200 mikrometre kalınlığında çizgiler oluşturarak tekrar tekrar çizerek metal katmanları aşındırın.

Elektrik stimülasyonundan önce, tohumlanmış lamel bir görüntüleme odasına yerleştirin. Hücreleri sabit yönde bir elektrik alanı ile uyarmak için, 11 milimetre ile ayrılmış ve 13 milimetre lameller üzerine kaplanmış kültürün zıt taraflarında bulunan iki paralel elektrot kullanın. Ardından, kültür görüntüleme odasını ve eşleşen elektrot tutucusunu, tel elektrotlar hücre dışı ortama daldırılacak ve kültürün bir milimetre üzerine yerleştirilecek şekilde monte edin.

Ardından, tek elektrot çiftini, jeneratörden gelen sinyali yükselten işlemsel amplifikatöre takın. % 50 görev döngüsü ve 22 volt genlik ile tek bir bipolar kare dalga darbesi uygulayın. Elektrotlarda meydana gelebilecek elektrolizi önlemek için DC bileşeni olmayan bir bipolar dalga kullanın.

Etkili stimülasyonu sağlamak, ancak hücre hasarını önlemek için 10 mikrosaniyeden dört milisaniyeye kadar süren nabzı uygulayın. Hücreleri değişen yöndeki elektrik alanlarıyla uyarmak için iki dikey elektrot çifti kullanın. İki elektrot çiftinin yanı sıra güç ve izleme terminallerinin birbirinden tamamen elektriksel olarak izole edildiğinden ve topraktan yüzdüğünden emin olun.

Elektrik alan yönünü değiştirmek için, iki elektrot çiftine uygulanan voltajın genliğini değiştirin. Ardından, vektör toplama ile ortaya çıkan alanın yoğunluğunu ve yönünü belirleyin. Sabit genlikli bir dönen alan oluşturmak için, bir elektrot çiftine sinüs dalgası uygularken diğer çifti bir kosinüs dalgası ile besleyin.

Manyetik stimülasyona başlamak için, mikroskop altında dairesel şekilli bir desende büyütülen bir nöronal kültür yerleştirin. Ticari olarak temin edilebilen standart bir dairesel manyetik stimülasyon bobini ve destekleyici bir stimülatör kullanarak kültürü uyarın. Standart olmayan manyetik alan yoğunluklarına sahip kültürleri uyarmak için, özel yapım bir manyetik stimülasyon bobinini özel yapım stimülatörüne bağlayın.

Ardından, bir lazer işaretçi yardımıyla, başarılı bir stimülasyonu sağlamak için kültürün merkezini bobinin merkezine hizalayın. Bobin konumlarını, kültürün merkezinin yaklaşık beş milimetre üzerinde kalacak şekilde ayarlayın. Stimülasyon bobini uygun şekilde yerleştirildikten sonra, stimülatörü beş kilovolta kadar bir potansiyele yükleyin.

Daha sonra, yüksek akım, yüksek voltaj anahtarı kullanarak, kültürlenmiş nöronların aktivitesini uyaran manyetik bir darbe oluşturmak için yüksek voltajlı akımı stimülasyon bobininden boşaltın. Son olarak, nöronal kültürle aynı konuma bir toplama bobini monte edin ve üretilen manyetik alanın yoğunluğunu ölçün. Bu şema, iki çift elektrota farklı genliklerde voltaj darbeleri uygulayarak, elektrik alanlarının kültürü manuel olarak döndürmeye gerek kalmadan her açıya yönlendirilebileceğini göstermektedir.

Burada, farklı uygulanan voltajlarda elektrik stimülasyonlu kalsiyum geçişlerinin örnek kayıtları verilmiştir. Sabit bir elektrik alanı süresi uygulanırken, ateşlenen ve elektrik alanına yanıt veren nöronların sayısı, voltajın genliğinin bir fonksiyonu olarak kümülatif bir Gauss dağılımı gösterir. Ve bu, bu protokolü kullanırken elde edilen bir güç-süre eğrisi örneğidir.

Manyetik alana yanıt veren halka kültürleri için, stimülasyonun başarı oranı kültür yarıçapı ile birlikte artar. Bu grafik, halka boyutu ile manyetik alan kuvveti arasındaki ilişkiyi göstermektedir. Kültürlerin en başarılı uyarılmaları, deneysel olarak erişilebilir fazın alanı ile yüksek olasılık bölgesi arasındaki örtüşmede yatmaktadır.

Bir kez ustalaştıktan sonra, tek boyutlu kültürlerin hazırlanması üç ila dört saat içinde gerçekleştirilebilir. Elektrik ve manyetik stimülasyon gerçekleştirirken, stimülasyon adımından kültürün tam olarak geri kazanılmasına izin vermeyi ve tüm ekipmanın elektrikli zemine göre yüzdüğünden emin olmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü izleyerek, beynin farklı bölgelerinden nöronların kültürlenmesi, örneğin kortikal nöronların istatistiklerinin ölçülmesi gibi diğer sorular ele alınabilir.

Başka bir olasılık, herhangi bir hastalık modeli nöronun parametrelerini ölçmektir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, etkili ve güvenli beyin stimülasyonu için gereken güç ve sürelerin optimizasyonunun yolunu açabilir. Bu videoyu izledikten sonra, istenen herhangi bir nöronal kültür modelinin nasıl oluşturulacağını iyi anlamalı ve nöronların elektromanyetik alanlarla etkileşimlerinin incelenmesi için bunları elektriksel veya manyetik olarak uyarabilmelisiniz.