Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) ve Taze ve Dondurulmuş Rat Beyin Dokusu gelen Fos-ifade nöronlar Gen İfadesi Analizi
27 Ağustos 2016
Burada taze ve dondurulmuş hem de beyin dokusundan nöronal topluluklarından Fos-ifade moleküler değişiklikler incelemek için bir Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) protokol mevcut. dondurulmuş doku kullanımı değerli hayvan deneklerin kullanımını maksimize için birden fazla seans boyunca birçok beyin bölgelerinin FACS izolasyonu sağlar.
Bu prosedürün genel amacı, Fos eksprese eden nöronları, daha sonraki floresan aktive edilmiş hücre sıralaması veya FACS için taze veya donmuş yetişkin sıçan beyin dokusundan ayırmaktır. Bu yöntem, davranışsal olarak aktive edilmiş nöronların benzersiz moleküler nöroadaptasyonunu tanımlamak için ilgilenilen nöronal hücreleri izole etmek için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, donmuş doku kullanımına izin vererek, hücrelerin farklı günlerde birden fazla beyin bölgesinden izole edilmesini kolaylaştırmasıdır.
Bu taze beyin dokusunu işlemek için, ilgilenilen beyin bölgelerini içeren bir ila iki milimetre koronal dilimleri kesmek için buz gibi soğuk bir beyin dilimleme matrisinin yuvalarına iki veya daha fazla önceden soğutulmuş tıraş bıçağı yerleştirin ve bölümleri kesilirken soğutulmuş bir cam plakaya yerleştirin. İlk olarak, ilgilenilen beyin bölgesini inceleyin, diğer alanları atın ve beyaz maddeyi çıkarın. Dokuyu dondurmak için, numuneleri bir mikrotüpe aktarın ve daha sonraki işlemlere kadar negatif 80 santigrat derecede saklamak için tüpü 20 saniye boyunca negatif 40 santigrat derece izopentan içine daldırın.
Dokuyu kıymak için, numuneleri bir ila iki damla Tampon A çözeltisiyle kaplamadan önce numunelerin soğuk bir cam plaka üzerinde en fazla bir dakika çözülmesine izin verin. Daha sonra, bir tıraş bıçağını plakaya tamamen dikey tutarak, dokuyu her ortogonal yönde 100 kez kıyın. Dokuyu iyice kıymak için, dokuyu Tampon A ile ıslak tutmak ve belirtilen kıyma sürelerini ve yönünü takip etmek çok önemlidir.
Doku diseksiyonu sırasında beyaz cevherin çoğunun uzaklaştırılması ve kıyma verimliliğini artırmak ve hücrelerin sağlığını korumak için dokuyu Tampon A ile kaplı tutmak çok önemlidir. Doku iyice işlendiğinde, parçaları bir mililitre soğuk Tampon A içeren bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için tıraş bıçağını kullanın ve kıyılmış dokuyu solüsyona batırmak için tüpü üç ila beş kez ters çevirin. Doku parçalarını tek hücreli süspansiyona ayırmak için, numuneleri santrifüjleme ile peletleyin.
Süpernatanı atın. Ardından, mikrotüpün iç duvarından aşağı doğru bir mililitre soğuk, taze çözülmüş enzim solüsyonu yavaşça ekleyin. Ve kıyılmış doku parçalarını dağıtmak için her bir peletin tamamını hemen aspire etmek ve dört kez dağıtmak için büyük bir uç çaplı pipet kullanın.
Ardından, peletlerin tüp tabanlarına yapışmasını önlemek için mikrotüpü hızlı bir şekilde ters çevirin ve numuneyi dört santigrat derecede 30 dakika boyunca uçtan uca karıştırarak inkübe edin. Sindirimin sonunda, tüpü tekrar santrifüjleyin ve hücrelere 0.6 mililitre soğuk Tampon A ekleyin. Aynı pipet ucunu kullanarak, peletleri hemen aspire edin ve beş kez dağıtın.
Ardından, 1,3 milimetrelik bir cam pipet seçin ve numuneleri 10 kez nazikçe ezmek için kullanın. Döküntülerin ve ayrışmamış hücrelerin tüpün dibine çökmesini sağlamak için numuneyi iki dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Ardından, süpernatanı 15 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.
Ardından, kalan pelete 600 mikrolitre Tampon A çözeltisi ekleyin ve numuneyi 10 kez daha ezmek için 0,8 milimetre çapında bir pipet kullanın. Dokuların az önce gösterildiği gibi yerleşmesine izin verdikten sonra, süpernatanı ilk hücre süspansiyonu ile birleştirin ve pelete 600 mikrolitre daha tampon ekleyin. Ardından, numuneyi ezmek için 0,4 milimetrelik bir pipet kullanın ve dokuların yerleşmesini sağlamak için tüpü iki dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.
Protokoldeki mekanik öğütme adımlarının takip edilmesi başarılı bir sıralama için önemlidir. Daha sonra, süpernatanı ayrışmış hücrelerle bir araya getirin. Ardından, numuneye 600 mikrolitre Tampon A ekleyin ve 0,4 milimetrelik pipet öğütme işlemini üç kez daha tekrarlayın.
Hücrelerin yerleşmesine izin vermek için tüpleri iki dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Ve sonra, süpernatanı ikinci bir 15 mililitrelik tüpte toplayın. En küçük cam pipeti kullanarak öğütme işlemini üç kez daha tekrarlayın, sonraki sıralama için hücrelerin verimini önemli ölçüde artırır.
Tüm süpernatantlar toplandıktan sonra, buz üzerindeki dört mirotüpe 800 mikrolitre negatif 20 santigrat derece %100 etanol ekleyin. Daha sonra, toplanan süpernatanın ilk tüpünden 800 mikrolitre hücreyi, ilk iki etanol tüpünün her birine ve ikinci süpernatan tüpünden 800 mikrolitre hücreyi, son iki etanol tüpünün her birine aktarın. Numuneleri karıştırmak için tüpleri ters çevirin.
Ardından, numuneleri her beş dakikada bir ters çevirerek karıştırarak 15 dakika boyunca buzun üzerine koyun. Kuluçka sonunda hücreleri santrifüjleyin. Ardından, mikrotüpün yalnızca duvarına dokunarak, her bir süpernatantın son 50 mikrolitresi hariç tümünü yavaşça çıkarmak için bir mikropipet kullanın.
İki farklı hücre süzgeci çifti kullanarak iki hücre süspansiyonunun her birini ayrı ayrı filtreleyin. Hücreler daha sonra ilgilenilen hücre belirteçlerine karşı antikorlarla etiketlenmeye ve akış sitometrisi ile sıralanmaya hazırdır. Taze ve donmuş beyin dokusu örneklerinin analizi, benzer büyüklük ve tanecikliliğe sahip küçük homojen nöronal hücre popülasyonlarının varlığını ortaya koymaktadır.
Küçük homojen popülasyonlar, herhangi bir hücre agregatını dışlamak için kapılanabilir ve nöronlar, NeuN ve DAPI pozitiflikleri ile tanımlanabilir. Hem taze hem de donmuş doku örneklerinde, NeuN mRNA seviyeleri NeuN pozitif popülasyonlarda NeuN negatif popülasyonlara göre önemli ölçüde daha yüksektir. Buna karşılık, glial ve olidogodendrosit hücre markörü mRNA seviyeleri, NeuN-negatif popülasyonda NeuN-pozitif popülasyondan daha yüksektir.
NeuN negatif popülasyonda daha yüksek mikrojiyal hücre marker mRNA seviyelerinde benzer bir eğilim gözlenir, ancak bu istatistiksel olarak anlamlı değildi. Ayrıca, Fos mRNA seviyeleri, Fos pozitif nöronlarda Fos negatif nöronlara göre daha yüksektir, taze dokudan Fos pozitif nöronlarda üç kat Fos mRNA artışı ve donmuş dokudan Fos pozitif nöronlarda on bir kat Fos mRNA artışı, hem taze hem de donmuş doku koşulları altında akışla sıralanmış hücrelerden ilgilenilen spesifik genleri tanımlama yönteminin geçerliliğini doğrular. Bu prosedürü denerken, kritik hücre lizisi önleme adımlarını takip etmeyi unutmamak önemlidir.
Bu prosedürü takiben, daha fazla aşağı akış moleküler analizi için ilgilenilen hücre alt kümelerini izole etmek için floresanla aktive edilmiş hücre sınıflandırması gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Dondurulmuş doku kullanılması, numunelerin ayrı günlerde sıralanmasına olanak tanır, bu da uzun ve karmaşık doku toplama ve hazırlama prosedürlerini içeren deneyler için kritik öneme sahiptir. Bu teknik, akış sitometrisine göre sıralama için birkaç ay veya yıl boyunca saklanan ölüm sonrası donmuş insan beyni örneklerini hazırlamak için de kullanılabilir.
Bu teknik, sinirbilim alanındaki araştırmacıların, Fos eksprese eden nöronların veya diğer immün olarak işaretlenmiş vahşi tip hücrelerin davranışının altında yatan moleküler mekanizmaları keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, nöronların veya ilgilenilen hücre türlerinin floresan ile aktive edilmiş hücre sıralaması için hücreleri taze veya donmuş sıçan beyin dokusundan nasıl ayıracağınızı iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, hem taze hem de dondurulmuş beyin dokularındaki Fos eksprese eden nöronal topluluklardaki moleküler değişiklikleri analiz etmek için Floresan Aktive Hücre Ayırma (FACS) protokolünü sunmaktadır. Dondurulmuş doku kullanabilme yeteneği, birden fazla oturum boyunca nöronal hücrelerin izole edilme verimliliğini artırır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Nörobiyoloji
Arka Plan
- Fos eksprese eden nöronlar, nöroadaptasyonların incelenmesi için önemlidir.
- FACS, spesifik nöronal popülasyonların hassas bir şekilde izole edilmesine olanak tanır.
- Dondurulmuş dokuların kullanımı, hayvan deneklerin kullanımını optimize edebilir.
- Bu nöronlardaki moleküler değişikliklerin anlaşılması, davranışlar hakkında içgörüler sağlayabilir.
Çalışmanın Amacı
- Fos eksprese eden nöronları beyin dokusundan ayırmak için.
- Aktive olmuş nöronlardaki moleküler nöroadaptasyonların incelenmesini kolaylaştırmak için.
- Birden fazla oturum boyunca hücre izolasyon verimliliğini artırmak için.
Kullanılan Yöntemler
- Taze veya dondurulmuş yetişkin sıçan beyin dokusunun hazırlanması.
- Beyin dokusunu dilimlemek için ön soğutmalı jilet kullanımı.
- İstenmeyen bölgeler ayıklanırken spesifik beyin bölgelerinin diseksiyonu.
- Uzun süreli saklama ve işlem için doku örneklerinin dondurulması.
Ana Sonuçlar
- Beyin dokusundan Fos eksprese eden nöronların başarılı bir şekilde disosyasyonuna olanak sağlanmıştır.
- Dondurulmuş dokunun FACS için kullanımının uygulanabilirliği gösterilmiştir.
- Birden fazla beyin bölgesinden hücre izole etme yeteneği geliştirilmiştir.
- Nöronal moleküler değişikliklerin incelenmesi için güvenilir bir yöntem sunulmuştur.
Sonuçlar
- FACS protokolü, Fos eksprese eden nöronların incelenmesinde etkilidir.
- Dondurulmuş doku kullanımı, hayvan deneklerin kullanımını maksimize eder.
- Bu yöntem, nöronal adaptasyonların anlaşılmasını geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yürütücü Endüstriyel Uygunluk
Bu protokol, biyofarma Ar-Ge ekiplerinin hem taze hem de dondurulmuş sıçan beyin dokusundan Fos eksprese eden nöronal toplulukları izole etmelerine olanak tanıyarak nöropsikiyatrik ilaç keşfinde hedef doğrulamayı destekler. Taze ve dondurulmuş örnekler arasında eşdeğer verim ve moleküler sadakat gösteren bu yöntem, karmaşık davranışsal paradigmalar uygulanmış değerli hayvan modellerinin kullanım alanını genişletir. Bu durum, davranışsal olarak aktive edilmiş nöronların daha yüksek kapasiteli moleküler profillemesini kolaylaştırarak hedef etkileşimi ve yolak modülasyon çalışmalarıyla ilgili öngörü güvenilirliğini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sindeki Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Öğrenilmiş davranışlarla bağlantılı, moleküler olarak tanımlanmış nöronal toplulukların izole edilerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Sıralanmış popülasyonların NeuN, GFAP, Oligo2 ve Iba1 marker ekspresyonu aracılığıyla fenotipik olarak doğrulanmasıyla biyolojik risk azaltımını destekler.
- Öngörücü Değer: Sıralanmış Fos-pozitif nöronlarda Fos mRNA kantifikasyonuna imkan tanıyarak hedef güvenilirliğini artırır; gözlemlenen 3 katlık (taze) ve 11 katlık (dondurulmuş) artışlar transkripsiyonel özgünlüğü doğrulamaktadır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analize Hazırlık: Antikor etiketleme ve FACS için uygun, disosiye edilmiş tek hücre süspansiyonları hazırlar; böylece nöronal ve glial alt kümelerin standardize edilmiş izolasyonuna olanak tanır.
- Tekrarlanabilirlik: Taze ve dondurulmuş doku koşullarında, boyut ve granülariteye dayalı olarak homojen nöronal popülasyonların tutarlı şekilde kapılanabileceğini (gating) gösterir.
- Ölçeklenebilirlik: Verimi artırmak için birden fazla tritürasyon adımından elde edilen süpernatantların birleştirilmesine izin vererek, sınırlı örnek girişlerinden yapılacak aşağı akış moleküler analizlerini destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlişki: Nöropsikiyatrik bozukluklarda translasyonel biyobelirteç keşfi ile uyumlu olarak, aktive olmuş nöronlardaki moleküler nöroadaptasyonların incelenmesi için hastalıkla ilişkili bir sistem sağlar.
- Preklinik Süreklilik: -80°C'de 21 güne kadar saklanan dondurulmuş dokuların kullanımına olanak tanıyarak, kapsamlı davranışsal deneylerden elde edilen örneklerin toplu olarak işlenmesini sağlar.
- Risk Ayarlı İlerleme: Deneysel tekrarlar boyunca, davranışsal olarak tanımlanmış nöronal alt kümelerde hedef etkileşiminin moleküler profillenmesine izin vererek "devam/dur" kararlarını destekler.
İş Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hipotez testinden öncü bileşik tanımlamaya kadar olan keşif sürecine entegre edilerek, hedef seçimi ve etki mekanizması çalışmalarına temel oluşturacak şekilde, davranışsal olarak aktive olmuş nöronların moleküler profillenmesini sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Nöronal aktivasyon durumlarının aşağı akış gen ekspresyon analizleri için Fos eksprese eden nöronların izole edilerek yolak aydınlatılmasını destekler.
- Tarama: FACS aracılığıyla kantitatif çıktılar sağlayan analize hazır hücre süspansiyonları sunarak taze ve dondurulmuş doku işlem verimliliğinin karşılaştırılmasına olanak tanır.
- Analitik: Sıralama saflığını ve fenotipik kimliği doğrulamak için Fos mRNA seviyeleri ve soy belirteci ekspresyonu (NeuN, GFAP, Oligo2, Iba1) dahil olmak üzere ölçülebilir okumalar oluşturur.
- Translasyonel Araştırma: İnsan nöropsikolojik endofenotiplerini modelleyen nöronal toplulukların moleküler profillendirmesini sağlayarak preklinik doğrulamayla bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Biyobankalanmış dondurulmuş dokular için yeniden kullanılabilir bir kapasite oluşturarak, veri verimini maksimize etmek ve hayvan kullanımını azaltmak amacıyla tek deneklerden birden fazla FACS oturumu yapılmasına imkan sağlar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Davranışsal aktivasyonu belirlenmiş nöronal popülasyonlardaki moleküler imzalarla ilişkilendirerek hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Taze ve dondurulmuş girdilere uygulanabilen tutarlı disosiyasyon ve sıralama iş akışları aracılığıyla tekrarlanabilirliği ve standardizasyonu geliştirir.
- Stratejik Değer: Derhal işlem gerektirmeden karmaşık davranışsal çalışmalardan boylamsal örnekleme yapılmasına olanak tanıyarak sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Davranışsal olarak ilgili devrelerdeki hedef modülasyonuna dair moleküler kanıtlar sağlayarak riske göre ayarlanmış önceliklendirme sürecine bilgi sunar.
Uygulama Hususları
- Hücre canlılığını ve ayıklama doğruluğunu korumak için nöral doku disosiasyonu, enzimatik sindirim ve akış sitometrisi konusunda uzmanlık gerektirir.
- FACS cihazlarına, soğuk oda imkanlarına ve sonraki gen ekspresyon analizleri için RNA koruma araçlarına erişime bağlıdır.
- Tutarlı doku işleme ve marker paneli uyumu için nörobilim ve moleküler biyoloji grupları arasında ekipler arası standartlaştırma gerektirir.
- İnsan postmortem dokusuna adaptasyon kaynak materyal tarafından desteklenmektedir, ancak uzun süre dondurulmuş örneklerde epitop stabilitesinin ve RNA bütünlüğünün doğrulanması gereklidir.
- Pratik sınırlamalar arasında, protokolde vurgulandığı üzere, verimi maksimize etmek ve hücre kümeleşmesini önlemek için titiz mekanik tritürasyon gerekliliği yer almaktadır.
