Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) ve Taze ve Dondurulmuş Rat Beyin Dokusu gelen Fos-ifade nöronlar Gen İfadesi Analizi
August 27th, 2016
Burada taze ve dondurulmuş hem de beyin dokusundan nöronal topluluklarından Fos-ifade moleküler değişiklikler incelemek için bir Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) protokol mevcut. dondurulmuş doku kullanımı değerli hayvan deneklerin kullanımını maksimize için birden fazla seans boyunca birçok beyin bölgelerinin FACS izolasyonu sağlar.
Bu prosedürün genel amacı, Fos eksprese eden nöronları, daha sonraki floresan aktive edilmiş hücre sıralaması veya FACS için taze veya donmuş yetişkin sıçan beyin dokusundan ayırmaktır. Bu yöntem, davranışsal olarak aktive edilmiş nöronların benzersiz moleküler nöroadaptasyonunu tanımlamak için ilgilenilen nöronal hücreleri izole etmek için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, donmuş doku kullanımına izin vererek, hücrelerin farklı günlerde birden fazla beyin bölgesinden izole edilmesini kolaylaştırmasıdır.
Bu taze beyin dokusunu işlemek için, ilgilenilen beyin bölgelerini içeren bir ila iki milimetre koronal dilimleri kesmek için buz gibi soğuk bir beyin dilimleme matrisinin yuvalarına iki veya daha fazla önceden soğutulmuş tıraş bıçağı yerleştirin ve bölümleri kesilirken soğutulmuş bir cam plakaya yerleştirin. İlk olarak, ilgilenilen beyin bölgesini inceleyin, diğer alanları atın ve beyaz maddeyi çıkarın. Dokuyu dondurmak için, numuneleri bir mikrotüpe aktarın ve daha sonraki işlemlere kadar negatif 80 santigrat derecede saklamak için tüpü 20 saniye boyunca negatif 40 santigrat derece izopentan içine daldırın.
Dokuyu kıymak için, numuneleri bir ila iki damla Tampon A çözeltisiyle kaplamadan önce numunelerin soğuk bir cam plaka üzerinde en fazla bir dakika çözülmesine izin verin. Daha sonra, bir tıraş bıçağını plakaya tamamen dikey tutarak, dokuyu her ortogonal yönde 100 kez kıyın. Dokuyu iyice kıymak için, dokuyu Tampon A ile ıslak tutmak ve belirtilen kıyma sürelerini ve yönünü takip etmek çok önemlidir.
Doku diseksiyonu sırasında beyaz cevherin çoğunun uzaklaştırılması ve kıyma verimliliğini artırmak ve hücrelerin sağlığını korumak için dokuyu Tampon A ile kaplı tutmak çok önemlidir. Doku iyice işlendiğinde, parçaları bir mililitre soğuk Tampon A içeren bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için tıraş bıçağını kullanın ve kıyılmış dokuyu solüsyona batırmak için tüpü üç ila beş kez ters çevirin. Doku parçalarını tek hücreli süspansiyona ayırmak için, numuneleri santrifüjleme ile peletleyin.
Süpernatanı atın. Ardından, mikrotüpün iç duvarından aşağı doğru bir mililitre soğuk, taze çözülmüş enzim solüsyonu yavaşça ekleyin. Ve kıyılmış doku parçalarını dağıtmak için her bir peletin tamamını hemen aspire etmek ve dört kez dağıtmak için büyük bir uç çaplı pipet kullanın.
Ardından, peletlerin tüp tabanlarına yapışmasını önlemek için mikrotüpü hızlı bir şekilde ters çevirin ve numuneyi dört santigrat derecede 30 dakika boyunca uçtan uca karıştırarak inkübe edin. Sindirimin sonunda, tüpü tekrar santrifüjleyin ve hücrelere 0.6 mililitre soğuk Tampon A ekleyin. Aynı pipet ucunu kullanarak, peletleri hemen aspire edin ve beş kez dağıtın.
Ardından, 1,3 milimetrelik bir cam pipet seçin ve numuneleri 10 kez nazikçe ezmek için kullanın. Döküntülerin ve ayrışmamış hücrelerin tüpün dibine çökmesini sağlamak için numuneyi iki dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Ardından, süpernatanı 15 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.
Ardından, kalan pelete 600 mikrolitre Tampon A çözeltisi ekleyin ve numuneyi 10 kez daha ezmek için 0,8 milimetre çapında bir pipet kullanın. Dokuların az önce gösterildiği gibi yerleşmesine izin verdikten sonra, süpernatanı ilk hücre süspansiyonu ile birleştirin ve pelete 600 mikrolitre daha tampon ekleyin. Ardından, numuneyi ezmek için 0,4 milimetrelik bir pipet kullanın ve dokuların yerleşmesini sağlamak için tüpü iki dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.
Protokoldeki mekanik öğütme adımlarının takip edilmesi başarılı bir sıralama için önemlidir. Daha sonra, süpernatanı ayrışmış hücrelerle bir araya getirin. Ardından, numuneye 600 mikrolitre Tampon A ekleyin ve 0,4 milimetrelik pipet öğütme işlemini üç kez daha tekrarlayın.
Hücrelerin yerleşmesine izin vermek için tüpleri iki dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Ve sonra, süpernatanı ikinci bir 15 mililitrelik tüpte toplayın. En küçük cam pipeti kullanarak öğütme işlemini üç kez daha tekrarlayın, sonraki sıralama için hücrelerin verimini önemli ölçüde artırır.
Tüm süpernatantlar toplandıktan sonra, buz üzerindeki dört mirotüpe 800 mikrolitre negatif 20 santigrat derece %100 etanol ekleyin. Daha sonra, toplanan süpernatanın ilk tüpünden 800 mikrolitre hücreyi, ilk iki etanol tüpünün her birine ve ikinci süpernatan tüpünden 800 mikrolitre hücreyi, son iki etanol tüpünün her birine aktarın. Numuneleri karıştırmak için tüpleri ters çevirin.
Ardından, numuneleri her beş dakikada bir ters çevirerek karıştırarak 15 dakika boyunca buzun üzerine koyun. Kuluçka sonunda hücreleri santrifüjleyin. Ardından, mikrotüpün yalnızca duvarına dokunarak, her bir süpernatantın son 50 mikrolitresi hariç tümünü yavaşça çıkarmak için bir mikropipet kullanın.
İki farklı hücre süzgeci çifti kullanarak iki hücre süspansiyonunun her birini ayrı ayrı filtreleyin. Hücreler daha sonra ilgilenilen hücre belirteçlerine karşı antikorlarla etiketlenmeye ve akış sitometrisi ile sıralanmaya hazırdır. Taze ve donmuş beyin dokusu örneklerinin analizi, benzer büyüklük ve tanecikliliğe sahip küçük homojen nöronal hücre popülasyonlarının varlığını ortaya koymaktadır.
Küçük homojen popülasyonlar, herhangi bir hücre agregatını dışlamak için kapılanabilir ve nöronlar, NeuN ve DAPI pozitiflikleri ile tanımlanabilir. Hem taze hem de donmuş doku örneklerinde, NeuN mRNA seviyeleri NeuN pozitif popülasyonlarda NeuN negatif popülasyonlara göre önemli ölçüde daha yüksektir. Buna karşılık, glial ve olidogodendrosit hücre markörü mRNA seviyeleri, NeuN-negatif popülasyonda NeuN-pozitif popülasyondan daha yüksektir.
NeuN negatif popülasyonda daha yüksek mikrojiyal hücre marker mRNA seviyelerinde benzer bir eğilim gözlenir, ancak bu istatistiksel olarak anlamlı değildi. Ayrıca, Fos mRNA seviyeleri, Fos pozitif nöronlarda Fos negatif nöronlara göre daha yüksektir, taze dokudan Fos pozitif nöronlarda üç kat Fos mRNA artışı ve donmuş dokudan Fos pozitif nöronlarda on bir kat Fos mRNA artışı, hem taze hem de donmuş doku koşulları altında akışla sıralanmış hücrelerden ilgilenilen spesifik genleri tanımlama yönteminin geçerliliğini doğrular. Bu prosedürü denerken, kritik hücre lizisi önleme adımlarını takip etmeyi unutmamak önemlidir.
Bu prosedürü takiben, daha fazla aşağı akış moleküler analizi için ilgilenilen hücre alt kümelerini izole etmek için floresanla aktive edilmiş hücre sınıflandırması gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Dondurulmuş doku kullanılması, numunelerin ayrı günlerde sıralanmasına olanak tanır, bu da uzun ve karmaşık doku toplama ve hazırlama prosedürlerini içeren deneyler için kritik öneme sahiptir. Bu teknik, akış sitometrisine göre sıralama için birkaç ay veya yıl boyunca saklanan ölüm sonrası donmuş insan beyni örneklerini hazırlamak için de kullanılabilir.
Bu teknik, sinirbilim alanındaki araştırmacıların, Fos eksprese eden nöronların veya diğer immün olarak işaretlenmiş vahşi tip hücrelerin davranışının altında yatan moleküler mekanizmaları keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, nöronların veya ilgilenilen hücre türlerinin floresan ile aktive edilmiş hücre sıralaması için hücreleri taze veya donmuş sıçan beyin dokusundan nasıl ayıracağınızı iyi anlamış olmalısınız.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, Fos eksprese eden nöronel toplulukların moleküler değişimlerini analiz etmek için Floresan Aktive Edilmiş Hücre Ayırma (FACS) protokolünü sunmaktadır. Dondurulmuş doku kullanma kabiliyeti, nöronal hücrelerin birden fazla oturum boyunca izole edilme verimliliğini artırır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Nörobiyoloji
Arka Plan
- Fos eksprese eden nöronlar, sinir adaptasyonlarını incelemek için önemlidir.
- FACS, spesifik nöronel popülasyonların kesin izolasyonunu sağlar.
- Dondurulmuş doku kullanmak, hayvan deneklerinin kullanımını optimize edebilir.
- Bu nöronlardaki moleküler değişimleri anlamak, davranış hakkında içgörüler sağlayabilir.
Çalışmanın Amacı
- Fos eksprese eden nöronları beyin dokusundan ayırmak.
- Aktifleşmiş nöronlarda moleküler sinir adaptasyonlarının incelenmesini kolaylaştırmak.
- Birden fazla oturum boyunca hücre izolasyonunun verimliliğini artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Taze veya dondurulmuş yetişkin sıçan beyin dokusunun hazırlanması.
- Beyin dokusunu dilimlemek için önceden soğutulmuş jiletlerin kullanılması.
- İstenmeyen alanları atarken belirli beyin bölgelerinin ayrılması.
- Uzun süreli depolama ve işleme için doku örneklerinin dondurulması.
Ana Sonuçlar
- Beyin dokusundan Fos eksprese eden nöronların başarılı bir şekilde ayrılması.
- FACS için dondurulmuş dokunun kullanılmasının uygulanabilirliğinin gösterilmesi.
- Birden fazla beyin bölgesinden hücre izole etme kabiliyetinin artırılması.
- Nöronal moleküler değişimleri incelemek için güvenilir bir yöntem sağlanması.
Sonuçlar
- FACS protokolü, Fos eksprese eden nöronları incelemek için etkilidir.
- Dondurulmuş doku kullanımı, hayvan deneklerinin kullanımını en üst düzeye çıkarır.
- Bu yöntem, nöronal adaptasyonların anlaşılmasında ilerlemeye katkıda bulunabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma R&D teams to isolate Fos-expressing neuronal ensembles from both fresh and frozen rat brain tissue, supporting target validation in neuropsychiatric drug discovery. By demonstrating equivalent yields and molecular fidelity between fresh and frozen samples, the method extends the utility of valuable animal models subjected to complex behavioral paradigms. This facilitates higher-throughput molecular profiling of behaviorally activated neurons, improving predictive confidence in target engagement and pathway modulation studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating molecularly defined neuronal ensembles linked to learned behaviors.
- Operational Value: Supports biological de-risking through phenotypic confirmation of sorted populations via NeuN, GFAP, Oligo2, and Iba1 marker expression.
- Predictive Value: Enhances target confidence by enabling Fos mRNA quantification in sorted Fos-positive neurons, with observed 3-fold (fresh) and 11-fold (frozen) increases validating transcriptional specificity.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares dissociated single-cell suspensions suitable for antibody labeling and FACS, enabling standardized isolation of neuronal and glial subsets.
- Reproducibility: Demonstrates consistent gating of homogeneous neuronal populations based on size and granularity across fresh and frozen tissue conditions.
- Scalability: Allows pooling of supernatants from multiple trituration steps to increase yield, supporting downstream molecular analysis from limited sample inputs.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Provides a disease-relevant system for studying molecular neuroadaptations in activated neurons, aligning with translational biomarker discovery in neuropsychiatric disorders.
- Preclinical Continuity: Enables use of frozen tissue stored up to 21 days at -80°C, allowing batch processing of samples from extended behavioral experiments.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by permitting molecular profiling of target engagement in behaviorally defined neuronal subsets across experimental replicates.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, enabling molecular profiling of behaviorally activated neurons to inform target selection and mechanism of action studies.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by isolating Fos-expressing neurons for downstream gene expression analysis of neuronal activation states.
- Screening: Delivers assay-ready cell suspensions with quantitative outputs via FACS, enabling comparison of fresh versus frozen tissue processing efficiency.
- Analytics: Generates measurable readouts including Fos mRNA levels and lineage marker expression (NeuN, GFAP, Oligo2, Iba1) to validate sorting purity and phenotypic identity.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by enabling molecular profiling of neuronal ensembles that model human neuropsychological endophenotypes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for biobanked frozen tissue, allowing multiple FACS sessions from single subjects to maximize data yield and reduce animal use.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by linking behavioral activation to molecular signatures in defined neuronal populations.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through consistent dissociation and sorting workflows applicable to fresh and frozen inputs.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling longitudinal sampling from complex behavioral studies without requiring immediate processing.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by providing molecular evidence of target modulation in behaviorally relevant circuits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neural tissue dissociation, enzymatic digestion, and flow cytometry to maintain cell viability and sorting fidelity.
- Dependent on access to FACS instrumentation, cold-room facilities, and RNA preservation tools for downstream gene expression analysis.
- Necessitates cross-team standardization between neuroscience and molecular biology groups for consistent tissue handling and marker panel alignment.
- Adaptation to human postmortem tissue is supported by source material, though validation of epitope stability and RNA integrity in long-term frozen samples is required.
- Practical limitations include the need for meticulous mechanical trituration to maximize yield and prevent cell clumping, as emphasized in the protocol.
