Ekstraksiyon ve Topraklarda Mikrobiyal Fosfolipid Yağ Asitleri Analizi

Bu laboratuvar protokolünün genel amacı, fosfolipid yağ asitlerinin tanımlanması yoluyla toprak mikrobiyal topluluklarının yapısı hakkında bilgi sağlamaktır. Bu yöntem, arazi yönetimi değişikliklerine veya doğal bozulmaya karşı toprak mikrobiyal tepkisini karakterize etmek gibi bilimdeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, çok çeşitli toprak tiplerine uygulanabilen, takip etmesi kolay, sağlam bir protokol olmasıdır.

Bu yüzden, bu protokolü gösteren, araştırma okulumuzdaki bir teknisyen olan Katelyn Pretzlaff olacak. Ekstraksiyona başlamak için, metin protokolünde açıklandığı gibi 5.0 molar potasyum hidroksit ve 0.15 molar sitrat tamponu hazırlayın. 250 mikrolitre stok çözeltisini 25 mililitre kloroform içinde seyrelterek 19: 0 nonadekonoat vekil standardını günlük olarak hazırlayın.

Bu, 23 numunelik bir parti için yeterli vekil standart sağlar. Numune santrifüj tüpüne 0,5 mililitre 19:0 vekil standart çözelti ekleyin. Toprak numunesi üzerinde Bligh ve Dyer ekstraksiyonunu gerçekleştirmek için 2.0 mililitre sitrat tamponu, ardından 2.5 mililitre kloroform ve ardından 5.0 mililitre metanol ekleyin.

Numuneyi PTFE kaplı bir kapakla kapatın ve 30 saniye boyunca girdap yapın. Ardından, iki saat boyunca uçtan uca bir çalkalayıcıya yerleştirin. İki saat sonra, numuneyi kapak takılıyken 15 dakika boyunca 226 kez G'de santrifüjleyin.

Süpernatanı bir Pasteur pipeti ile çekin ve etiketli 45 mililitrelik bir cam şişeye aktarın. Her numuneye ikinci bir tur Bligh ve Dyer özütleyici ekleyin ve çalkalama ve santrifüjleme adımlarını tekrarlayın. Süpernatanı bir Pasteur pipeti ile çekin ve aynı etiketli 45 mililitrelik cam şişeye aktarın.

Daha sonra, süpernatanı içeren etiketli 45 mililitrelik cam şişeye 5.0 mililitre kloroform ve 5.0 mililitre sitrat tamponu ekleyin. Beyaz PTFE kaplı bir kapakla kapatın ve cam şişeyi 30 saniye boyunca girdaplayın. 45 mililitrelik şişenin üst sulu fazını dikkatlice vakumlayın.

Alt organik fazı etiketli 15 mililitrelik bir şişeye pipetleyin. Oksidasyonu önlemek için oda sıcaklığında sıkıştırılmış nitrojen altına 15 mililitrelik bir şişe partisi yerleştirin. Kloroformu yavaşça buharlaştırın, nitrojen akışını şişedeki sıvının yüzeyini karıştıracak şekilde ayarlayın, ancak şişenin kenarlarına tırmanmayın.

PTFE kaplı bir kapağı vidalayın ve numuneleri alüminyum folyoya sarılmış olarak eksi 20 santigrat derecede dondurucuda saklayın. Yeni katı faz ekstraksiyonu veya SPE sütunlarını gerektiği gibi etiketleyin. Cam tankın üzerine tıkaçlı bir SPE sütun tutucusu yerleştirin ve etiketli sütunları tıkaçlara yerleştirin.

Her sütunu 5 mililitre aseton ekleyerek ve akmasına izin vererek koşullandırın. Ardından, iki adet 5 mililitre kloroform ekleyin. İkinci kloroform yıkamanın, yaklaşık 1 mililitre üzerine çıkana kadar dışarı akmasına izin verin ve ardından musluğu kapatın.

Şişeye 0,5 mililitre kloroform ekleyerek ve hafifçe girdaplayarak numuneyi yeniden çözün. Yeniden çözünmüş numuneyi bir Pastüer pipet kullanarak SPE kolonuna aktarın. Lipid örneğini doğrudan kolonun ortasına yerleştirin ve çözücünün tanka tamamen akmasına izin verin.

Her sütuna 5 mililitre kloroform ekleyerek nötr lipitleri elute edin. Çözücünün tanka tamamen boşalmasına izin verin. Her sütuna 5 mililitre aseton ekleyerek glikolipidleri elute edin ve çözücünün toplama tankına tamamen akmasını sağlayın.

Kolon sehpasını tanktan çıkarın ve tankı bir vakum aparatı ile boşaltın. Temiz ve etiketli santrifüj tüplü rafı tanka yerleştirin ve tankın üzerindeki kolon sehpasını değiştirin. Yukarıdaki etiketli sütun, aşağıdaki etiketli santrifüj tüpü ile aynı hizada olmalıdır.

Her sütuna 5 mililitre metanol ekleyerek fosfolipidleri santrifüj tüplerine boşaltın. SPE kolonlarını atmadan önce çeker ocakta kurumasını bekleyin. Fosfolipid fraksiyonlarını sıkıştırılmış nitrojen altında oda sıcaklığında kurutun.

Tüpleri nitrojenle temizledikten sonra, PTFE kaplı kapakları vidalayın ve numuneleri alüminyum folyoya sarılmış olarak eksi 20 santigrat derecede dondurucuda saklayın. 37 santigrat dereceye ayarlanmış sıcak su banyosunu açın. Numuneleri dondurucudan çıkarın ve numunelerin oda sıcaklığına gelmesine izin verin.

Her numuneye 0,5 mililitre kloroform ve 0,5 mililitre metanol ekleyin, ardından 1,0 mililitre matanolik potasyum hidroksit ekleyin. Tüpleri PTFE kaplı kapaklarla sıkıca kapatın ve karıştırmak için döndürün. Mühürlü numuneleri 30 dakika boyunca 37 santigrat derecelik bir banyoya yerleştirin.

Su seviyesinin, numune sıvısının seviyesinin en az bir ila iki milimetre üzerinde olduğundan emin olun. Numuneler su banyosundayken, küçük cam şişeleri numune kimlikleri ile etiketleyin. 30 dakika sonra numuneleri çıkarın ve soğumaya bırakın.

Ardından, her numuneye 2.0 mililitre heksan ekleyin ve karıştırmak için döndürün. Ardından, her numuneye 0,2 mililitre 1,0 molar asetik asit ekleyin ve tekrar döndürün. Faz ayrımı görünür hale gelmelidir.

Fazı kırmak için her numuneye 2.0 mililitre damıtılmış su ekleyin. Numuneleri 30 saniye girdapladıktan sonra, numuneleri iki dakika boyunca 226 kez G'de santrifüjleyin. Kısa bir Pasteur pipeti kullanarak, üst fazı temiz, etiketli, 10 mililitrelik şişelere aktarın.

Düşük sulu fazların hiçbirini aktarmamaya dikkat edin. Her numune santrifüj tüpüne 2.0 mililitre heksan ekleyin ve döndürün. Numuneleri 30 saniye boyunca vorteksleyin ve ardından daha önce olduğu gibi santrifüjleyin.

Kısa bir Pasteur pipeti kullanarak, üst fazı tekrar etiketli 10 mililitrelik cam şişelere ekleyin. Etiketli 10 mililitrelik cam şişelerdeki çözücüyü oda sıcaklığında nitrojen altında buharlaştırın. PTFE kaplı kapakları vidalayın ve numuneleri alüminyum folyoya sarın.

Numuneleri, metin protokolünde açıklandığı gibi gaz kromatografisi analizine devam etmeye hazır olana kadar eksi 20 santigrat derecede dondurucuda saklayın. Bir numunenin bir alev iyonizasyon detektörü kullanılarak kılcal gaz kromatografisine tabi tutulmasından elde edilen temsili bir kromatogram burada gösterilmektedir. PLFA'lar için dakika cinsinden bekletme süreleri parantez içinde belirtilmiştir.

Tüm PLFA'lardan gelen yanıtlar, bir gram toprak başına nanomol cinsinden toplam PLFA biyokütlesini elde etmek için toplanabilir. Farklı PLFA gruplarının nispi dağılımı da hesaplanabilir ve topraklar arasında karşılaştırılabilir. Sonuçlar, yaşlı ağaçların altında bulunan birinci bölgedeki toprak için daha büyük toplam PLFA'ları ve ardından ikinci bölgedeki orta yaşlı ağaçların altındaki toprağı göstermektedir.

Ve son olarak, üçüncü bölgedeki en genç ağaçların altındaki toprak. En genç bölgede nispeten daha doymuş PLFA'lar bulunurken, en eski bölgede daha fazla doymamış PLFA'lar bulunur. PLFA sonuçları, burada gösterildiği gibi metrik olmayan, çok boyutlu ölçeklendirme koordinasyonu gibi çok değişkenli koordinasyon teknikleri kullanılarak daha fazla analiz edilebilir.

En genç bölge, PLFA mikrobiyal topluluk bileşiminde örtüşme gösteren eski iki bölgeden çok net bir şekilde ayrılır. Her bir eksen tarafından açıklanan PLFA topluluk verilerindeki varyasyon miktarı parantez içinde yer almaktadır. Bu tekniğe hakim olduktan sonra, bir kişinin dört gün boyunca 20 numuneyi işlemesi mümkündür.

Bu protokolü denerken, lipitlerin oksidasyona özellikle duyarlı olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu nedenle, numuneleri karanlıkta ve nitrojen altında saklamak gibi hava ve ışık maruziyetinden korumak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, fosfolipid yağ asitlerini üç aşamalı bir işlem, lipid ekstraksiyonu, lipid fraksiyonasyonu ve lipid metilasyonu yoluyla tanımlayarak toprak mikrobiyal topluluklarının yapısını nasıl ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.