Name: Böbrek Bağışıklık Hücreleri Güvenilir ve Yüksek Verimlilik Ekstraksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Öğrenin böbrek bağışıklık hücrelerini güvenilir ve ekonomik bir yöntemle izole etmeyi. Bu teknik çok renkli akış sitometrisi için canlı tek hücre süspansiyonları sağlar ve böbrek immünbiyolojisi araştırmalarında değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Diyaliz Klinikleri A.Ş.'den bir Araştırma Bursu ve Missouri Üniversitesi Araştırma Kurulu Bursu tarafından desteklenmektedir.

gerçekleştirilen tüm protokol adımları gözden ve Missouri Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Üniversitesi (ACUC) tarafından onaylanmıştır. herhangi bir yaşta herhangi bir teorik kemirgen deneyleri için de kullanılabilir, ancak bu protokol için, 15 haftalık, erkek C57BL / 6 fareleri kullanılmıştır. Bu bir hayatta olmayan cerrahi olduğu için, ötenazi kan kaybından ve bilateral pnömotoraks ile sağlanır. Böbrekler 1. perfüzyon Not: kalp, karaciğer ve böbrek gibi organların Perfüzyon verilerin yorumlanması ile engel olabilir kanı temizler. Mümkünse Bu nedenle, biz her zaman organlar serpmek. <ol><li> o hareketsiz kadar (3 ml / dak) indüksiyon odası, bir izofluran fare yerleştirin. Sonra, odanın dışında fare kaldırmak diseksiyon masaya dorsal yattı ve fare burun üzerinde izofluran koni yerleştirin ve regülatör ile 1.5 ml / dk hızında izofluran itin. </li><li> ayak tutam tepk kontrolhayvan anestezi cerrahi uçağı elde etti ise cımbız ile e değerlendirmek. tuzlu su ile ventral karın temizleyin ve makas ile karın kesip açmak ve farenin sol tarafına (cerrahi alanı dışında kalan) karın organları itin. </li><li> ile inferior vena kava kan toplayın 25 gauge 1 cc şırınga iğne sabit ve 0.5M EDTA 10 ul içeren bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp ekleyin. Not: Kan Toplama isteğe bağlıdır. Plazma biyokimyasal ölçümler için de kullanılabilir. Lökositler akış sitometri deneyleri için kullanılabilmektedir. </li><li> makas kullanarak, sağ atriyum küçük bir kesim sonraki adımda kan ve PBS karışımı izin yapmak. </li><li> 50 cc şırınga alın ve buz soğukluğunda PBS (20-30 cc) ile doldurun. Sonra, bir şırınga için 21-25 G iğne takılır (forseps ile yavaşça kalp tutarken) tepe noktası, sol ventrikül delinerek yavaş boyunca fosfat tamponlu tuz, pH 7.4 (PBS) ile sol ventrikül serpmek1-2 dk. Not: Kalp hemen perfüzyon ilk birkaç mililitre üzerine blanches. Bu perfüzyon vena kava yoluyla venöz dönüş yoluyla karaciğer kanı drene olduğunu gösterir gibi, haşlama için karaciğer gözlemleyin. Buna ek olarak, bu sağ ventrikül patlağı gösterir gibi akciğer infüzyon sırasında genişleyen değil emin olun. akciğerler genişletmek için olsaydı, biraz geri sol ventrikül içine iğne çekilme ve perfüzyon devam edin. elde edilir ötanazi kadar ilk kesi alınan zaman az 2 dk </li></ol> Böbrekler 2. Diseksiyon <ol><li> perfüzyon tamamlandıktan sonra, ekleri (kan damarları, yağ ve adrenal bezler) ve tüketim sağ böbrek incelemek için makas ve forseps kullanabilir. </li><li> Yavaşça kesme ve forseps ile diseksiyon ile böbrek kaplayan kapsülü kaldırın. böbrek tartılır. Not: böbrek Tartı isteğe bağlıdır. Bununla birlikte, bazı deneylerBöbrek boyutu / doku gramı başına hücre verimi normalize etmek için kullanılabilmektedir ağırlık değişikliği ile sonuçlanabilir. </li><li> böbrek Tartıldıktan sonra,% 0.5 FBS ihtiva eden RPMI-1640 içinde 1 ml koyun veya lekelenme tampon çözeltisi sitometrisi (50 ml konik vidalı kapaklı tüp) akar ve daha sonra kullanılmak kadar buz üzerinde tüp yerleştirin. Not: açıklaması kolaylığı, biz boyama tampon çözelti flow sitometri bağışıklık hücrelerinin izolasyonu kalan anlatacağız için. Her iki böbrek veya böbrek 1 + 1/3 Rd (isteğe bağlı) alt deneylere bağlı olarak kullanılabilmesine rağmen ek olarak, tek bir böbrekten bağışıklık hücrelerinin izolasyonu anlatacağız. Böbrek 1/3 üçüncü protein / RNA deneyler için dondurulmuş olabilir ve 1/3 rd immünohistokimya veya transmisyon elektron mikroskobu için tamponlar içinde yerleştirilebilir. </li></ol> Böbrekler 3. Homojenizasyon <ol><li> örnek tanımlama bilgileri içeren bir 5-80 ml kapasiteli homojenizasyon çanta Etiket,iç süzgeci (STR) kaldırmak ve atın. buz Sitometrisi lekeleme tampon maddesi çözeltisi, 5 ml torbayı doldurmak tampona böbrek aktarın. İkinci numune veya işleme ihtiyaç daha fazla örnek için bu işlemi tekrarlayın. </li><li> bir yarım Akış Sitometri lekeleme tampon maddesi çözeltisi içine daldırılmış böbrek, diğer yarısı ise sadece üzerine katlanır, böylece, devre homojenleştirme torba katlayın. </li><li> Doku homojenleştirici açın ve hızlı (ayar) rpm olarak ayarlayın. alt kenarına yakın raket karşı karşıya böbrek katlanmış homojenizasyon çantası yerleştirin ama çanta alt uç kürekler alt sınırının altında kayan olmadığından emin olun. <ol><li> 2 kürek olduğu gibi aynı zamanda ikinci örnek işleyin. 120 sn olarak süreyi seçin. kürekler böbrekler homojenize için ileri ve geri hareket gözlemleyin. Not: Bu arada, bu kesinti ilk iki işlem sırasında örnekleri 2 fazla böbrek (veya başka doku) hazırlamak için kullanılabilir. </li></ol&gt; </li><li> homojenizasyon birinci seti ile tamamladıktan sonra, buz torbaları aktarmak ve böylece bir sonraki numune seti ve doku homojenleştirici yükleyin. Görme böbrekler yeterince homojenize ve hiçbir büyük parçalar görünür olduğundan emin olun. Not: Genellikle, hızlı rpm&#39;de doku homojenleştiricisi içinde 2 dakika böbrek için yeterlidir. </li><li> buz üzerinde 50 ml konik tüp içine 100 mikron hücre süzgeç yerleştirin. Sonra, hücre süzgecinden tamamen üzerinde Homojenat pipetle. 4 ° C de 1 dakika 50 xg bir taban santrifüj ayarlamak ve santrifüj örnekleri yükleyin. Not: Santrifüj Tüm homojenat (ihtiva eden hücreler) bir hücre süzgecinden geçirildi olduğunu garanti eder. </li><li> santrifüj tüpleri çıkarın ve buz üzerinde geri koyun. Hücre süzgeçler atın ve Homojenat tutun. eşit miktarda ekleyin (~ 6 mi) üniform bir hücre süspansiyonu yapmak için hücre peleti / yüzer tabakanın ve pipet ve aşağı yukarı birkaç kez 1 x RBC parçalama tamponu. visuaLly hemen süspansiyon azalma kırmızı rengin bazı gözlemleyin. Maksimum RBC parçalama elde etmek için 5 dakika boyunca buz üzerinde tüpler bırakın. Not: Araştırmacı böbrek perfüzyon ve daha az hücre manipülasyonu istenen emindir ise RBC parçalama adım atlanabilir. Biz RBC lizis hücre süspansiyonu tabi değil tarafından böbrek hücre veriminde önemli bir artış gözlemledik. </li><li> 5 dakika bir hücre tanesinin oluşturulması için 500 x g&#39;de, 4 ° C olarak ayarlandı santrifüj tüpleri dönerler. Adımlar 3.6 ve 3.7 sırasında koloidal silika (Percoll) tabanlı yoğunluk gradyan santrifüj hazırlamak Not:. <ol><li> alt polipropilen tüpler yuvarlak 10 ml alın ve ilgili örnek numaraları ile onları etiketlemek ve bir tüp rafa koyun. Not: Aşağıdaki 4 böbrek örnekleri için yeterli yoğunluk gradyan reaktifler yapmak açıklamaktadır. </li><li> Sitometrisi Boyama Tampon çözeltisi 7 ml alın ve bir 15 ml konik tüp içine pipetle. 2 M sükroz, 1 ml ilave edilir0.25 M sukroz hazırlar. </li><li> Sonra, başka bir 15 ml konik tüp içine yoğunluk gradyan reaktif ve pipet bunu 7.2 ml alır. % 72 yoğunluk gradyan reaktif ve doğrudan 0.25 M sükroz hazırlamak Sitometrisi lekeleme tampon maddesi çözeltisi 1.55 mi, 2 M sukroz, 1.25 ml ilave edilir. </li><li> Pipet her bir örnek için bir yuvarlak dipli polipropilen tüpe% 72 yoğunluk gradyan ayıracı 1 ml. </li></ol></li></ol> 4. dereceli santrifüj <ol><li> Adım 3.7 sonra tüpleri almak ve yavaşça tek bir hareketle yavaşça süpernatant süzün ve ayrıca tüp baş aşağı tutulurken oluşturan sıvının bir sonraki damla süzün. Not: Bu adım verimleri varyasyon oluşturmak için yeterli yoğunluk gradiyenti değiştirebilirsiniz aşırı sıvı geride bırakarak beri önemlidir. Tüp dik geri ayarlandığında, ~ sıvı 200-300 ul hücre pelet ile kalır. </li><li> Pipet ve yavaşça ama kuvvetlice hücre pelet üzerine 0.25 M sükroz 1 ml yukarı pipet ve Brin aşağıg muntazam süspansiyonuna hücreleri. Sonra,% 36 yoğunluk gradyan maddesi oluşturmak için hücreleri karıştırmak için şiddetle pipetle bir kez daha 1 ml% 72 yoğunluk gradyan reaktifi (3.7.4) hücre süspansiyonu ekleyin ve. </li><li> polipropilen Pasteur (transfer) pipet içine% 72 yoğunluk gradyan reaktif 1 ml alın. ampul bile basınç, yavaşça hücre süspansiyonu altına Pasteur pipeti (% 36 yoğunluk gradyan reaktif) eklemek ve bir oluşturmak için% 72 yoğunluk gradyan reaktifi boşaltın (ucunda sıvı sütunu tutar ve kabarcık oluşumunu engeller) farklı ağır tabaka. </li><li> yavaşça numune tüpleri almak ve bu aşama için, oda sıcaklığında bir santrifüj içine yerleştirin. 500 x g&#39;de 20-30 dakika süreyle Spin. </li><li> Bu arada, gelen örnek tanıtıcı ile alt santrifüj tüpleri yuvarlak polipropilen başka iki takım hazırlamak. </li><li> Adım 4.4 tamamlandıktan sonra, en az çalkalanarak yavaşça polipropilen tüpler içeren örneği kaldırmak ve aşağı ayarlayınTüp raf. </li><li> İlk örnek tüp ve ilgili boş tüp Pick up. Bir polipropilen Pasteur pipeti ile nazikçe ama iyice ölçülen emme ile üst &quot;önemsiz katmanı&quot; veya &quot;yapışkan malzeme&quot; kaldırmak ve boş yuvarlak dipli santrifüj tüpüne koyun. <ol><li> (Kırmızımtırak bir renk [kırmızı kan hücreleri] off-beyaz görünebilir) ulaşıldığında &quot;buffy coat&quot; kadar degrade üst kısmını kaldırarak devam edin. ~ 3 mm yükseklik &quot;buffy coat&quot; ulaşılır ise emiş durdurun. Not: Bu malzeme tamamen emme devam etmeden önce degrade üst kısmından gitti olduğundan emin olun. </li></ol></li><li> taze Pasteur pipet ve taze bir yuvarlak dipli santrifüj tüpü alın ve yavaşça buffy coat çıkarın. Hücrelerin en toplanmış ve uygun numune tanımlayıcı ile 2. yeni yuvarlak dipli tüpe eklenir sağlamak için, buffy coat altında 5 mm - 3 emme devam ediyor. </li><li> 1-2 ml o Eklef Sitometrisi Boyama Tampon 2. tüp çözüm ve yukarı ve aşağı pipetleme ile iyice karıştırın. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de hücreleri dönerler. Sitometrisi Boyama Tampon çözeltisi ile 2. yıkama adım isteğe bağlıdır. Sitometrisi Boyama Tampon çözeltisinin 500 ul ve yeniden süspanse hemasitometre kullanarak hücreleri saymak geçin. </li></ol> 5. İsteğe bağlı (Hücre Etiketleme) <ol><li> hücrelerin aynı sayıda, her numune Aliqout. 10 6 hücre başına 0.5 ug (anti-CD16 / CD32 FcR) bir seyreltme bloke antikor ilave edin ve 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. </li><li> önce gerçek deneyler, araştırmacı tarafından birbirleri ile iyi çalışması için belirlenir (uygun fluorophores konjuge) primer antikorlar istenen kokteyl ekleyin. 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Hücrelerin PBS ile yıkayın. Not: Bu yazının böbrek bağışıklık hücre etiketleme gösteri için, T-ly kullanılanmphocyte ve makrofaj / dendritik hücre paneli. BV421, Anti-Foxp3 (Clone: ​​FJK-16&#39;lar) APC, Anti-CD127 (Klon: A7R34): T-lenfosit paneli tamir edilebilir Canlılık Leke FVS510, anti-CD45 (30-F11 klonu) oluşuyordu PE / Cy7, anti CD44 (Klon: IM7) PerCP / Cy5.5, anti-CD4 (klon: RM4-5) APC-Cy7, anti-CD8 (Klon: 53-6,7) BV785. BV421, Anti-Ly6G (Klon: 1A8) FITC, anti-CD11 b (Klon: M1 / ​​70) PerCP-Cy5.5, Anti: makrofaj paneli tamir edilebilir Canlılık Leke FVS510, anti-CD45 (30-F11 klonu) oluşuyordu F4 / 80 (Klon: BM8) APC, anti-CD11c (Klon: N418) BV785. </li><li> Fixable Canlılık Leke ekleyin ve 5 dakika boyunca tezgah üstünde bırakın. Fixable Canlılık Stain fazlalığını ortadan kaldırmak için Sitometrisi Boyama Tampon çözeltisi ile hücreleri yıkayın. </li><li> Sabitleme / Permeabilization reaktif ekleyin ve 4 ºC de gece inkübe edin. permeabilizasyon çözeltisi içinde yıkanır. </li><li> hücre içi leke, 10 dakika süreyle, anti-CD16 / 32 FCR ile tekrar engeller. hücre içi lekeleri ekleyin ve 20-30 dakika inkübe edilir. pe yıkayın 2xrmeabilization çözeltisi. </li><li> FACS makine 3,9 ile Sitometrisi Boyama Tampon çözümü ve çalışma örneklerinde süspanse. </li></ol>

<ol><li>Ascon, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+characterization+of+kidney-infiltrating+lymphocytes+in+renal+ischemia+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional characterization of kidney-infiltrating lymphocytes in renal ischemia reperfusion injury.</a> J. Immunol. 177 (5), 3380-3387 (2006).</li>
<li>Ascon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+ischemia-reperfusion+leads+to+long+term+infiltration+of+activated+and+effector-memory+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Renal ischemia-reperfusion leads to long term infiltration of activated and effector-memory T lymphocytes.</a> Kidney Int. 75 (5), 526-535 (2009).</li>
<li>Belliere, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+macrophage+subtypes+influence+the+progression+of+rhabdomyolysis-induced+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 26 (6), 1363-1377 (2015).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagenase+digestion+down-regulates+the+density+of+CD27+on+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Collagenase digestion down-regulates the density of CD27 on lymphocytes.</a> J. Immunol. Methods. 413, 57-61 (2014).</li>
<li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+dendritic+cells+are+the+predominant+TNF-secreting+cell+in+early+renal+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Resident dendritic cells are the predominant TNF-secreting cell in early renal ischemia-reperfusion injury.</a> Kidney Int. 71 (7), 619-628 (2007).</li>
<li>Hickey, F. B., Martin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+kidney+disease+and+immune+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Diabetic kidney disease and immune modulation.</a> Curr. Opin. Pharmacol. , (2013).</li>
<li>Kawakami, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+renal+mononuclear+phagocytes+comprise+five+discrete+populations+with+distinct+phenotypes+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Resident renal mononuclear phagocytes comprise five discrete populations with distinct phenotypes and functions.</a> J. Immunol. 191 (6), 3358-3372 (2013).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+glomeruli+from+mice%3A+A+practical+approach+for+beginners%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Ther.+Med%22%5BJournal%5D)">Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners.</a> Exp. Ther. Med. 5 (5), 1322-1326 (2013).</li>
<li>Picot, J., Guerin, C. L., Le Van, K. C., Boulanger, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+retrospective%2C+fundamentals+and+recent+instrumentation%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: retrospective, fundamentals and recent instrumentation.</a> Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).</li>
<li>Ricardo, S. D., van, G. H., Eddy, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+diversity+in+renal+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Macrophage diversity in renal injury and repair.</a> J. Clin. Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).</li>
<li>Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Herrera-Acosta, J., Johnson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+immunocompetent+cells+in+nonimmune+renal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Role of immunocompetent cells in nonimmune renal diseases.</a> Kidney Int. 59 (5), 1626-1640 (2001).</li>
<li>Vielhauer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+renal+recruitment+of+macrophages+and+T+cells+in+mice+lacking+the+duffy+antigen%2Freceptor+for+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Efficient renal recruitment of macrophages and T cells in mice lacking the duffy antigen/receptor for chemokines.</a> Am. J. Pathol. 175 (1), 119-131 (2009).</li>
<li>Weisheit, C. K., Engel, D. R., Kurts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+Cells+and+Macrophages%3A+Sentinels+in+the+Kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Dendritic Cells and Macrophages: Sentinels in the Kidney.</a> Clin. J. Am. Soc. Nephrol. , (2015).</li>
<li>Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagenase+lot+selection+and+purification+for+adipose+tissue+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion.</a> Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).</li>
<li>Yamamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deterioration+and+variability+of+highly+purified+collagenase+blends+used+in+clinical+islet+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation.</a> Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).</li>
<li>Zhou, J., Nagarkatti, P., Zhong, Y., Nagarkatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+modulation+by+chondroitin+sulfate+and+its+degraded+disaccharide+product+in+the+development+of+an+experimental+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Immune modulation by chondroitin sulfate and its degraded disaccharide product in the development of an experimental model of multiple sclerosis.</a> J. Neuroimmunol. 223 (1-2), 55-64 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Biz burada güvenilir ve verimli bir şekilde böbrek bağışıklık hücreleri elde etmek için bir metodoloji sunduk. Yaygın olarak kullanılan kolajenaz sindirimi aşama (doku mekanik tahrip) başlıca modifikasyonu yaklaşık 30 dk tasarruf sağlar ve uygun bir bağışıklık hücreleri, çok sayıda yalıtım 4 Böbrek örnekleri için iki saatten az sürer. Ayrıca, bizim araştırma sorusu bağlı olarak, şimdi tek bir böbrek kullanmak bağışıklık hücre izolasyonu için (diğer böbrek Western lekeleri, PCR ile immünhistokimya ve mRNA analizi ile pro...

Bağışıklık sistemi aktivasyonu çoklu böbrek hastalıkları ve patofizyolojik süreçlerde 6,10,11,13 oluşur. aktif bir araştırma için potansiyel alanlar, bağışıklık sistemi aktivasyonu için çeşitli tetikleyiciler kapsayan, çeşitli hücre türleri dahil, belirli bir hastalık ortamda sitokin / kemokin desen gibi, belirli bir ilaç tarafından bahsedilen işlemlerin tümünü modülasyonu iskemi-reperfüzyon olarak, Örnek vermek gerekirse, yaralanma (akut böbrek hasarı için bir model), (6 hafta sonra) 5 tamir veya fibrozis dönem boyunca sürekli bir kaç saat içinde hematopoietik hücreleri ya da CD45 + hücrelerinden oluşan bağışıklık hücreleri veya kemik iliği içinde bir artış vardır, 12. Bu bağışıklık hücreleri, tamir 5,12 işlemini düzenlemek için pro-enflamatuar ve anti-inflamatuar sitokinler ve kemokinler, hem salgılar. Şu anda, tek bir hücre süspansiyonu hücre popülasyonlarının etiket aynı anda birden fazla fluorophores kullanma yeteneği reklamla arttıdört beş lazerler ile makinelerin sitometri, modern akış havalandırma. Bu büyük ölçüde onların fonksiyonel durumu 3,7 dayalı hücre popülasyonlarının ayrımcılık yeteneği ekledi. F4 / 80, düşük CD11b yüksek Ly6b yüksek CD206, düşük, en az 3 fazla flüoroforlar canlı hücreler, CD45 + (lökositler) ve Ly6G- (nötrofiller) ve bulunmaktadır kapısı aynı numune hacmi içindeki gerekli olacaktır Örneğin, doğru bir makrofaj etiket Bu çok mümkün yeni akış sitometrelerinde 3 beraberdir. Ancak, sitokin salgılanması, hücre proliferasyonu, sitotoksisite, makrofaj aktivasyonu ve lenfositlerin ve monositlerin çeşitli alt kümeleri sayısı ölçümü için alt deneyler sadece kaliteli (canlı hücreleri, tekli), fakat hücrelerinin yeterli sayılarda gerekmektedir. Böbrek bağışıklık sistemi adaptif ve bileşenleri ve birden fazla hücre tipleri 1,7,13 hem oluşur. Örneğin farelerde, iki çocuk(1.4 x 10 6 hücre) ve bunların yaklaşık% 5-15 (1,400-4,200) izole edilmiş toplam böbrek bağışıklık hücrelerinin Neys birlikte 2-17% içerdiği rapor edilmiştir (28,000-266,000) CD45 + hücreleri, CD4 + hücreleri 1 olan , 5,12. Bu CD4 + hücrelerinin küçük bir yüzdesi (% 5-15, 70-630) FoxP3 + hücreleri (Şekil 1) 1 vardır. Nedeniyle (bu durumda CD45 + CD4 + FoxP3 + hücrelerinde) hücrelerin yüzdelerinde, bu adım adım azalmalar, ilgi konusu zaman hücre popülasyonuna 100 ° sadece hücreler tarafından temsil edilmektedir. CD45 + CD4 + FoxP3 + hücrelerinin az sayıda zorunludur toplam hücrelerin çok sayıda izole edilir ve hücreler, sitokin salgılama tahlillerinde alt-çalışmalar için iyi kalitede olmasını sağlar. Ayrıca, subpopülasyonunun ölçülebilir deneyleri gerçekleştirmek için yeterince yüksek sayıda temsil edilmemektedir çünkü 2-3 farelerin böbrek birleştirmek gerekebilir. Bu nedenle, böbrek mononükleer hücre popülasyonlarının güvenilir ve etkin izolasyon damızlık için arzu ediliry böbrek hastalıkları ile ilişkili immünolojik spektrum. Geleneksel olarak, böbrek mononükleer hücrelerin izolasyonu için, araştırmacılar, bu DNase 1 1,5,12 içeren kolajenaz 1A veya II gibi enzimatik sindirim çeşitli kullandık. İyi kollajenazlar uygun konsantrasyon ve inkübasyon 4,14,15 süresince titrasyonu zorunludur, lot numaraları ve imalat şirketi tarafından değişir enzimatik etkinliğe sahip olduğu bilinmektedir. Buna ek olarak, kollajenaz ile sindirim küçük parçalar halinde böbrek kıyma zaman ekler, reaksiyonun durdurulması için EDTA inkübasyon için ısıtılmış (37 ° C) banyo ve ek süre böbrek parçalarının inkübasyon gerektirmektedir. Buna ek olarak, daha az steril hücre kültürü ihtiyaç duyan bir alt işlemler için elde edilebilir. Daha da önemlisi, ilgili araştırmacı ve tüm değişkenlere bağlı olarak, bu laboratuarlar arasında veri ve yorumlanması değişkenlik yol açar. Son zamanlarda, ilemekanik doku bozucular / homojenizatör 16 geliştirilmesi, kolajenaz sindirimi aşama tamamen kaçınılması ve böbrekler 2 basit bir mekanik bozulma ile değiştirilir. Bu yazıda, gündelik bağışıklık hücre ekstraksiyon için böbrek bağışıklık hücrelerinin izolasyonu için basit ama etkili bir yöntem ortaya koymaktadır. Önemli olarak, bu teknik, örneğin karaciğer ve beyin 16 gibi diğer yumuşak ve lifsiz dokular adapte edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Mide 80 Biomaster laboratuvar sistemi</td><td>Seward</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mide 80 Klasik çantalar</td><td>Seward</td><td>BA6040/STR</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XFR Santrifüj</td><td>Termo Bilimsel</td><td></td><td>Veya muadili ekipman&nbsp;</td></tr><tr><td>Hemositometre Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>63514-11</td><td></td></tr><tr><td>Analitik akış sitometresi</td><td>BD LSR-X20 Fortessa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll ve nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P1644</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s fosfat tamponlu salin 1x (DPBS)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Polipropilen tüpler, kapaksız</td><td>Becton Dickinson</td><td>352002</td><td></td></tr><tr><td>Sabitlenebilir Canlılık Lekesi</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>FVS510,&nbsp; 564406</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD16/32 (Klon: 93)</td><td>EBioscience</td><td>14-0161</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45 (klon: 30-F11)&nbsp; BV421 ve nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>103133/4</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Foxp3 (Klon: FJK-16S) APC</td><td>EBioscience</td><td>17-5773</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD127 (Klon: A7R34) PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>135013/4</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD44 (Klon: IM7) PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>103031/2</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 (Klon: RM4-5) APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>100413/4</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8 (Klon: 53-6.7) BV785</td><td>Biolegend</td><td>100749/50</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ly6G (Klon: 1A8) FITC</td><td>Biolegend</td><td>127605/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11b (Klon: M1/70) PerCP-CY5.5</td><td>Biolegend</td><td>101227/8</td><td></td></tr><tr><td>Anti-F4/80 (Klon: BM8) APC</td><td>Biolegend</td><td>123115/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11c (Klon: N418) BV785</td><td>Biolegend</td><td>117335/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD301 (Klon: LOM-14) PE-CY7</td><td>Biyoefsane</td><td>145705/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD26 (Klon: H194-112) PE</td><td>Biyoefsane</td><td>137803/4</td><td></td></tr><tr><td>100 & mu; M filtresi&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Tüpler 50 ml</td><td>Fisher</td><td></td><td>Veya muadili ekipmanlar&nbsp;</td></tr><tr><td>Fisherbrand Tüpler 15 ml</td><td>Fisher</td><td></td><td>Veya muadili ekipmanlar&nbsp;</td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Fisher kimyasal</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipeti ince uçlu</td><td>Samco Scientific</td><td>232</td><td>Veya eşdeğer ekipman&nbsp;</td></tr><tr><td>Akış Sitometresi Boyama Tampon Çözeltisi</td><td>EBioscience</td><td>00-4222-26</td><td>Veya eşdeğer ekipman&nbsp;</td></tr><tr><td>1x RBC Lizis Tamponu</td><td>EBioscience</td><td>00-4333-57</td><td>Veya eşdeğer ekipman&nbsp;</td></tr></tbody></table>

böbrek bağışıklık hücreleri güvenilir ve yüksek verimlilik ekstraksiyon



Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells

Bağışıklık sistemi aktivasyonu çoklu böbrek hastalıklarında ve patofizyolojik süreçlerde gerçekleşir. Bağışıklık sistemi hem adaptif hem de doğuştan gelen bileşenlerden ve çoklu hücre tiplerinden oluşur. Bazen, ilgilenilen hücre tipi, böbrekten izole edilen çok sayıda toplam hücre arasında çok düşük sayılarda bulunur. Bu nedenle, böbrek mononükleer hücre popülasyonlarının güvenilir ve verimli bir şekilde izole edilmesi, böbrek hastalıkları ile ilişkili immünolojik problemlerin incelenmesi açısından önemlidir. Geleneksel olarak, böbrek mononükleer hücrelerinin doku izolasyonu, değişen sayıda canlı bağışıklık hücresi veren farklı kollajenaz / DNA çeşitleri ve güçleri kullanılarak enzimatik sindirimler yoluyla gerçekleştirilmiştir. Son zamanlarda, tek hücre izolasyonu için mekanik doku bozucuların geliştirilmesiyle, kollajenaz sindirim basamağından kaçınılmakta ve fareden ekstraksiyondan sonra böbreklerin basit bir mekanik bozulması ile değiştirilmektedir. Burada, her gün bağışıklık hücresi ekstraksiyonları için böbrek mononükleer hücrelerinin izolasyonu için basit ama etkili bir yöntem gösteriyoruz. Ayrıca, böbrekteki bağışıklık hücrelerinin alt küme analizinin bir örneğini gösteriyoruz. Daha da önemlisi, bu teknik karaciğer ve beyin gibi diğer yumuşak ve lifli olmayan dokulara uyarlanabilir.

çalıştırılabilir panel sayısı güvenilir böbrekler üzerinden elde edilebilir bağışıklık hücrelerinin sayısına bağlıdır. Bu yazıda, 2 panel, T-lenfositlerinin için ve makrofajlar / dendritik hücreler için bir çalıştırma yeteneğini göstermek. T-lenfosit panelinde, ilk forward scatter (FSC) ve yan dağılım (SSC) şekline bakmak ve Şekil 1 (sol üst nokta arsa) &#39;de gösterildiği gibi ilgi nüfusu tasvir. Daha sonra, bir canlılık markör bu durumda bir tamir edilebilir canlılığı...

Böbrek bağışıklık hücrelerinin izolasyonu için güvenilir ve verimli teknikler, sonraki uygulamalar için gereklidir. Bu, az sayıda böbrek bağışıklık hücresinin yüzey antikoru etiketlemesini gerektirir. Burada, görünüşte bu amaca ulaşan böbrek bağışıklık hücrelerinin izolasyonu için özlü bir yöntem açıklıyoruz.

Böbrek Bağışıklık Hücreleri Güvenilir ve Yüksek Verimlilik Ekstraksiyon

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes.  The immune system consists of both adaptive and innate ...

Bu böbrek bağışıklık hücresi izolasyon protokolünün genel amacı, çok renkli akış sitometrisi kullanılarak yapılacak alt analizler için yeterli sayıda canlı tek hücreli böbrek bağışıklık hücresi süspansiyonu elde etmektir. Bu tekniğin kollajenaz sindirimine kıyasla temel avantajı, alt deneysel analizler için çok sayıda böbrek bağışıklık hücresini güvenilir ve düşük maliyetli bir şekilde izole edebilme yeteneğidir. Bu yöntem, böbrek immünobiyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Örneğin, belirli bir böbrek hastalığında hangi böbrek immün hücre alt kümesinin sitokin veya kemokin salınımını düzenlediği gibi. Bu yöntem, böbrekten immün hücrelerin izolasyonu için gösterilmiştir. Bununla birlikte, karaciğer veya beyin gibi diğer sistemlerden hücreleri izole etmek için kolaylıkla uyarlanabilir.Bugün, böbrek immün hücrelerinin toplama prosedürünüle göstereceğiz. Prosedür, laboratuvarımdan araştırma uzmanı Alex Meuth tarafından uygulamalı olarak gösterilecektir. Ayak parmağı sıkıştırma yöntemine yanıt alınmadığı doğrulandıktan sonra, anestezi altındaki farenin ventral abdomen bölgesini temizlemek için %70 etanol kullanın.Ardından, abdominal boşluğu açmak için ma

reliable-and-high-efficiency-extraction-of-kidney-immune-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, farenin retroperitoneal boşluğundan böbrek çıkarma prosedürünü açıklıyoruz. Çıkarılan böbrek, böbrek kapsülü ve çevresindeki yağ tabakası olmadan sağlam bir böbrek elde etmek için ayrıca mikrodiseke edilebilir.

Fareden Sağlam Böbreğin Çıkarılması: Murin Modellerinden Böbrek Kapsülü Olmadan Böbrek Elde Etme Tekniği

DNabT hücreleri periferal T-hücreleri arasında nadirdir; Bununla birlikte, belli olmayan lenfoid dokuda bol miktarda bulunmaktadır. Non-lenfoid doku DN T hücrelerini izole Zorluk patofizyolojik önemini kabul kapasitelerine rağmen fonksiyonel analizini engellemektedir. Bu murin böbreğinden yüksek derecede arıtılmış DN T hücrelerinin izole edilmesi için yeni bir protokol açıklar.

Böbrek gelen Çift Negatif αβ T Hücreleri İzolasyon

Bu protokol, Sprague Dawley sıçan böbreklerinin, deterjanların vaskülatür yoluyla antegrad perfüzyonu yoluyla hücreden arındırılmasını tanımlar ve insan böbrek epitel hücreleri ile yeniden popülasyon için şablon görevi gören aselüler renal hücre dışı matrisler üretir. Büyümeyi izlemek için resazurin perfüzyon testinin yeniden hücreselleştirilmesi ve kullanımı, özel olarak tasarlanmış perfüzyon biyoreaktörleri içinde gerçekleştirilir.

Epitel Hücre Repopulation ve Böbrek Doku Kalkınma Kemirgen Ekstrasellüler Matriks iskelelerinin hazırlanması

Burada böbrek Perivasküler Stromal bütün organ perfüzyon sindirim enzimleri ve NG2 hücreli zenginleştirme dayalı hücreleri (kPSCs) için bir roman klinik sınıf izolasyon ve kültür yöntem mevcut. Bu yöntemle, hücresel tedavi için yeterli hücre sayıları elde etmek mümkündür.

İnsan böbrek Perivasküler Stromal hücreler için bir roman klinik sınıf izolasyon yöntemi

Bu protokol ana odak verimli bir şekilde uygun birincil glomeruli kültürlerin çeşitli aşağı akım uygulamaları kullanmak için en az kirletici maddeleri ile izole etmektir. İzole glomeruli bileşeni hücre tipleri arasındaki yapısal ilişkileri korumak ve kültürlü ex vivo kısa bir süre için olabilir.

Yetişkin sıçan böbrek üzerinden olduğu gibi Glomeruli yalıtmak için verimli bir eleme yöntemi

Antikor etiketleme, optik temizleme ve gelişmiş ışık mikroskobu kombinasyonu, tam yapıların veya organların üç boyutlu analizini sağlar. Burada açıklanan, kalın böbrek dilimleri immünolabeling birleştirmek için basit bir yöntemdir, etil cinnamate ile optik Temizleme, ve üç boyutlu böbrek yapıların görselleştirme ve kantifikasyon sağlayan konfoköz görüntüleme.

Optik temizleme ve Immünolabeled böbrek dokusu görüntüleme

mikroRNA'lar IgA nefropatisinin patogenezinde rol oynarlar. Bir IgA nefropati fare modelinin (HIGA fareleri) böbreklerindeki mikroRNA ekspresyon seviyelerini tespit etmek için güvenilir bir yöntem geliştirdik. Bu yeni yöntem, IgA nefropatisinde miRNA tutulumunu kontrol etmeyi kolaylaştıracaktır.

İmmünoglobulin A Nefropatik Farelerin Böbreklerinde MikroRNA Ekspresyonunun Tespiti

Viral enfeksiyonutaki böbrek, nispeten çok sayıda CD8+ T hücrebarındırır ve mukozal olmayan TRM hücrelerini inceleme fırsatı sunar. Burada, akış sitometri analizi için fare böbrek lenfositleri izole etmek için bir protokol açıklar.

Akış Sitometri Analizi için Fare Böbrek-Resident CD8+ T hücrelerinin izolasyonu

Burada, medüller böbrek hücresi tiplerinin temsilini geliştiren ve enzimatik doku ayrışmasından kaynaklanan gen ekspresyon artefaktlarını önleyen donmuş fare böbreklerinden yüksek kaliteli çekirdekleri izole etmek için bir protokol sunuyoruz.

Tek Çekirdekli RNA Dizilimi için Yetişkin Fare Böbreğinden Çekirdek İzolasyonu

Burada, insan CD59 / intermedilysin hücre ablasyon aracı kullanılarak rejenerasyonlarını incelemek için renal makrofajların seçici ablasyonu için bir protokol bildirilmiştir. Bu yöntem aynı zamanda böbrek, karaciğer ve yağ dokusundaki diğer hücre popülasyonlarının işlevini ve yenilenmesini incelemek için de geçerlidir.

İnsan CD59 / Intermedilysin Hücre Ablasyon Aracı Kullanılarak Renal Makrofajların Hızlı Tükenmesi

Bu çalışma, murin mezanjiyal hücrelerinin (MC'ler) ve bunların ex vivo hücre kültürlerinin izolasyonu için optimize edilmiş bir protokol geliştirmiştir. Bu hücreler, hücre büyümesinden veya protein ekspresyonundan ödün vermeden birden çok kez pasajlanabilir, dondurulabilir, canlandırılabilir ve kültürlenebilir.

Murin Glomerüler Mezanjiyal Hücrelerin İzolasyonunu ve Saflaştırılmasını Optimize Etmek

Öğrenin böbrek bağışıklık hücrelerini güvenilir ve ekonomik bir yöntemle izole etmeyi. Bu teknik çok renkli akış sitometrisi için canlı tek hücre süspansiyonları sağlar ve böbrek immünbiyolojisi araştırmalarında değerlidir.

Böbrek Bağışıklık Hücreleri Güvenilir ve Yüksek Verimlilik Ekstraksiyon

Daha fazla video keşfet