Name: Yenilenebilir Biyoyakıt ve Biyokimyasal Üretim için bir Sıradışı Maya Genetik Mühendisliği (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Öğrenin Yarrowia lipolytica Po1g'de KU70 geni silinerek homolog rekombinasyonu artıran ve Cre/LoxP sistemiyle çoklu gen delesyonu sağlayan genetik mühendislik protokolünü. Bu yöntem biyoyakıt ve biyokimyasal üretim için gelişmiş suş mühendisliğine olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz minnetle Singapur (ETRP 1201102) Ulusal Çevre Ajansı finansman desteği kabul, Singapur Ulusal Araştırma Vakfı (UÇK-CRP5-2009-03), Singapur Bilim, Teknoloji ve Araştırma Ajansı Rekabet Araştırmaları Programı ( 1324004108), Küresel Ar-Ge Proje Programı, Bilgi Ekonomisi Bakanlığı, Kore Cumhuriyeti (N0000677), Savunma Tehdit Azaltma Dairesi (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) ve Sentetik Biyoloji Singapur Ulusal Üniversitesi Girişimi ( DPRT / 943/09/14).

Y 1. Üretim lipolytica KU70 Silme Gerilme <ol><li> bozulma kasetinin İnşaatı Not: polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) amplifikasyonda kullanılan tüm primerler için Tablo 1&#39;e bakınız. <ol><li> LEU2 ekspresyon kaseti PCR kuvvetlendirmek için tasarım primerleri 20 Y&#39;den (Tablo 1 e bakınız) sırasıyla ve uzun ters primer (Tablo 1 # 2); lipolytica ifade vektörü 5 &#39;ve 3&#39; olarak LoxP yerleri sokacak uzun ileri primer (Tablo 1 # 1), LEU2 kasetinin sona erer. Klonlama işlemi sonraki adım için ilave bir sınırlama mevkisinin katılması için, primer # 1 &#39;de, bir BamHI sınırlandırma bölgesi ekleyin. </li><li> Tablo 2&#39;de ayrıntılı olarak yüksek doğrulukta bir DNA polimerazı kullanılarak PCR gerçekleştirin. </li><li> PCR purificatio kullanılarak loxp-promoteri-LEU2-terminatör-loxP kaseti PCR ürünü saflaştırmaküreticinin talimatlarına uygun olarak N kiti. Üreticinin talimatlarına uygun olarak 21 saflaştınlmış PCR ürününe 3&#39;-A çıkıntıları ekleyin. Kullanım T4 DNA ligazı, Tablo 3&#39;de belirtilen plazmid T-LEU2 vermek üzere, bir TA klonlama vektörüne A kuyruklu PCR ürünü bağlanması için. </li><li> PCR Y. astarları 3. / 4. kullanarak KU70 geninin 1 kb 5 &#39;yukarı serisini yükseltmek lipolytica Po1g Tablo 2&#39;deki gibi genomik DNA, 22., üreticinin talimatlarına uygun olarak bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak PCR ürünü saflaştırmak. <ol><li> Çift. Tablo 4 uyarınca Sac II ile BamHI enzimleri ile saflaştınlmış PCR ürünü ve T-LEU2 plazmid hem özet üretici talimatlarına göre bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak Sindirim karışımı saflaştırılır. Saflaştırılmış bağlanması için T4 DNA ligaz kullanma ve Sac II ile sindirilmiş PCR ürünü / T LEU2 Bam HI bölgelerine vermek üzereTablo 3&#39;de belirtilen plazmid T-LEU2-5E. </li></ol></li><li> PCR Y. astarları # 5 / # 6 kullanarak KU70 geninin 1 kb 3 &#39;aşağı serisini yükseltmek lipolytica Po1g Tablo 2&#39;deki gibi genomik DNA, 22., üreticinin talimatlarına uygun olarak bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak PCR ürünü saflaştırmak. Çift saflaştırılmış PCR ürünü ve Tablo 4&#39;te göre değil ben ve Nde enzimlerle T-LEU2-5E plazmid hem sindirmek. <ol><li> üreticinin talimatlarına göre bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak Sindirim karışımı saflaştırılır. Daha sonra, saflaştırılmış bağlanır ve Not I / nde Tablo 3&#39;de belirtilen, T4 DNA ligazı kullanılarak plazmid T-KO vermek üzere t-LEU2-5E I sitelerine PCR ürünü ile sindirilmiş. </li></ol></li><li> Bozulma kasetini üretmek için Tablo 4&#39;de gereğince Sac II ve nde I enzimleri ile plazmid T-KO sindirimi (Şekil 1 </strong&gt;). üreticinin talimatlarına göre bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak sindirilmiş DNA fragmanlarının saflaştınlır. </li></ol></li><li> Yetkili Hücre hazırlama ve Y dönüşümü lipolytica Po1g suşu <ol><li> Yetkili Hücre hazırlama <ol><li> Y. bir koloni aşılamak YPD ortamı 10 ml (% 1 maya özütü,% 2 pepton,% 2 glukoz ve 50 mM sitrat tamponu, pH 4.0) 100 ml&#39;lik bir şişe içinde bir taze maya ekstresi-pepton-dekstroz (YPD) plakadan lipolytica Po1g soyu. Doyum noktasına kadar 20 saat (bir spektrofotometre kullanılarak ölçülen OD yaklaşık 15 600,) 225 rpm&#39;de 30 ° C çalkalama inkübatöründe inkübe edin. </li><li> Oda sıcaklığında 5000 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüjlenerek pelet hücreleri. 20 ml Tris-EDTA (TE) tampon çözeltisi (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.5) ile hücrelerin yıkayın ve aşama 1.2.1.2 tarif edildiği gibi hücreler pelet. (Asetik asit ile pH değeri 6.0), 0.1 M lityum asetat, 1 ml hücrelerin tekrar ve oda Tempe 10 dakika süre ile inküberature. </li><li> Steril 1.5 ml tüpler kompetan hücreler (100 ul) kısım. hemen altındaki dönüştürme adımları geçin ya da uzun süreli depolama için -80 ° C&#39;da bir son% 25 konsantrasyonunda (h / h) ve saklamak için gliserol ekleyin. </li></ol></li><li> dönüşüm <ol><li> Yavaşça yetkin hücre 100 ul ile denatüre somon sperm DNA (10 mg / ml) ve saflaştırılmış bozulması kasetinin 1-5 ug, 10 ul karıştırın ve 15 dakika boyunca 30 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> (0.1 M lityum asetat pH 6.0 içinde çözülmüş)% 40 polietilen glikol (PEG) -4000 700 ul eklenir, iyice karıştırılır ve 60 dakika boyunca 225 rpm&#39;de 30 ° C çalkalama inkübatöründe inkübe edin. Not: yerine (tipik olarak geleneksel maya transformasyonu kullanılmaktadır) PEG-3350, 4000 ortalama molekül ağırlığına sahip PEG kullanılması önemlidir. </li><li> Isı 60 dakika için 39 ° C su banyosu içinde tüp yerleştirmek sureti ile transformasyon karışımı şok. </li><li> 1 ml YPD ortamı ilave edin ve30 ° C&#39;de 2 saat ve 225 rpm&#39;de için geri. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 9.000 x g santrifüj, süpernatant kaldırmak ve TE tamponu 1 ml pelletini. </li><li> Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 9.000 x g&#39;de santrifüj ile hücreler repellet ve supernatant atın. TE tamponu, 100 | il pelletini ve seçici plakaları (örneğin, lösin-eksikli plakalar) üzerine plaka ve 2-3 gün boyunca 30 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 10 tek koloniler 4 Pick up ve YPD orta 2 ml ayrı aşılamak. 225 rpm&#39;de 30 ° C&#39;de ve çalkalama gece boyunca inkübatör içinde inkübe edin. Sırasıyla primer # 55 / # 56, iki set ve # 56 / # 57 kullanılarak Tablo 5&#39;teki gibi transformantların 22 genomik DNA, PCR analizi ile pozitif kolonileri tanımlamak. Not: Ben pYLEX1 vektörü Y dönüştürülür doğrusallaştırılmış sayısını sayarak transformasyon etkinliğini belirlemek amacıyla lipolytica Po1g kompetan hücrelerug plazmid başına koloni oluşturan birim (CFU) DNA 23 kullanılır. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Marker Kurtarma <ol><li> Cre sentezleme plasmidinin yapımı <ol><li> pYLEX1-CRE ve pYLEX1-Eden Hastaneler İnşaat <ol><li> Tasarım primerleri 20 Cre ve Eden Hastaneler açık okuma çerçevelerini PCR kuvvetlendirmek için. Ileri primer # 82 ve # 84 başlangıç ​​kodonunun üst akışında bir ekstra bir adenin nükleotid ekleyin ve PCR CRE açık okuma çerçevelerini amplifiye ters primerler # 83 ve # 85, durdurma kodonunun aşağı Kpn I kısıtlama bölgelerinin sokulması ve Tablo 2&#39;deki gibi pSH69 (erişim numarası HQ412578) 24 dan hph. </li><li> Cre ve üreticinin talimatlarına göre bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak HPH parçaları hem saflaştınlır. Digest hem ben Tabl başına enzim Kpn ile saflaştırılmış CRE ve hph fragmanlarıE 4.. Tablo 4 uyarınca Pml I ve Kpn I enzimleri ile pYLEX1 plazmid sindirimi Çift üreticinin talimatlarına göre bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak Sindirim karışımı saflaştırılır. </li><li> Y. Pml I / Kpn I sitelerine saflaştırılmış ve sindirilmiş CRE ve hph parçalarını birbirine bağlamak için Tablo 3&#39;de göre T4 DNA ligaz kullanın sırasıyla pYLEX1-CRE ve pYLEX1-hph elde lipolytica ifade vektörü. </li></ol></li><li> pSL16-CRE-Eden Hastaneler İnşaat <ol><li> PCR primerleri, 86. kullanılarak pYLEX1-CRE gelen CRE promotör-gen-sonlandırıcı kaseti amplifiye / 87. Tablo 2&#39;deki gibi Sal I / Pst I sınırlandırma bölgeleri çevreleyen. Üreticinin talimatlarına göre bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak PCR ürünü saflaştırmak . <ol><li> Çift Sal I ile saflaştırılan PCR ürünü ve pSL16-CEN1-1 (227) plazmid 25 hem özetPst Tablo 4&#39;te göre ben enzimleri. Üreticinin talimatlarına göre bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak sindirim karışımı arındırın. Daha sonra, Tablo 3&#39;de belirtilen, T4 DNA ligazı kullanılarak pSL16-CRE oluşturmak için karşılık gelen bölgelerde pSL16-CEN1-1 (227) saflaştırılmış ve sindirilmiş PCR ürünü ligate. </li></ol></li><li> PCR primerleri kullanılarak pYLEX1-Eden Hastaneler gelen Eden Hastaneler promotör-gen-sonlandırıcı kaseti amplifiye # 88 / # 89. Tablo 2&#39;deki gibi Xho I / Bgl II kısıtlama alanlarını yandan kuşatan, üretici talimatlarına göre bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak PCR ürünü saflaştırmak . <ol><li> Çift. Saflaştınlmış PCR ürünü ve Tablo 4 uyarınca Xho I ve Bgl II enzimleri ile pSL16-CRE plazmid hem özet üretici talimatlarına göre bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak Sindirim karışımı saflaştırılır. Daha sonra, karşılık gelen en pSL16-CRE saflaştırılmış ve sindirilmiş PCR ürünü ligateYer Tablo 3&#39;de belirtilen, T4 DNA ligazı kullanılarak pSL16-CRE-hph üretir. Not: Elde edilen Cre sentezleme plasmidi, pSL16-CRE-HPH, seçilebilir bir higromisin B işaretleyici taşımaktadır ve bir sentromer ve epizomal kopyalayan vektörü (Şekil 2). </li></ol></li><li> Tablo 4 uyarınca uygun kısıtlama enzimleri (örneğin, Sal I / Pst I, vektöründen inserti kesip çıkarmak için) ile sindirme ile bütün bileşenleri kontrol edin. </li></ol></li></ol></li><li> Cre rekombinaz aracılık ettiği işaretçi kurtarma <ol><li> Yukarıdaki Bölüm 1.2&#39;de açıklanan dönüşüm protokolü aşağıdaki KU70 nakavt suşu yetkili hücrelerine pSL16-CRE-HPH Transform. YPD artı higromisin B üzerine Plaka dönüştürülmüş hücreler (YPDH) plakaları (400 ug / ml higromisin B ihtiva eden) ve 2-3 gün boyunca 30 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Tablo 5&#39;te göre koloni PCR gerçekleştirin primerler kullanılarak # 84 / # 85 pozitif tespit etmekdönüşümden sonra pSL16-CRE-HPH plazmidi içeren koloniler. Not: ileri primer 84. ve revers primer 85. hph geni (Tablo 1) kodlama bölgesi içinde yer alır. Sadece pozitif klonlar PCR reaksiyonunda spesifik bir PCR ürünü üretir. </li><li> Pozitif klon almak ve YPDH orta 2 ml inoküle ve doygunluk gece boyunca 225 rpm&#39;de 30 ° C çalkalama inkübatöründe inkübe edin. Spektrofotometre ile hücre OD 600 ölçün. ~ 15 bir OD 600 hücreleri Hasat. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 5000 x g&#39;de santrifüj ve steril su, 2 ml ile bir kez yıkanır. </li><li> Bir ilk OD 0.1 600 YPD ortamı 2 ml hücreleri yeniden inoküle ve hücreler, gece boyunca 225 rpm&#39;de 30 ° C çalkalama inkübatöründe büyümeye olanak sağlar. Streak YPD plakalar üzerine bir gecede hücre kültürü tek koloniler 23 izole etmek. Replika plaka YPD, YPDH üzerine koloniler ve lösin eksik plakalar 23 </s&gt; Yukarı. Not: (Şekil 3), hem LEU2 işaretleyici kaybetmiş ve pSL16-CRE-STEH plazmid sadece YPD plakalar üzerinde büyüyebilir Koloni. </li></ol></li></ol> Alkol Dehidrogenaz ve Alkol Oksidaz Genleri 3. Silme <ol><li> Y üzerinde bir arama yapın silme 26 gen adaylarını belirlemek için Temel Yerel Hizalama Arama Aracı (BLAST) kullanarak lipolytica genom veritabanı. Giriş S. protein dizisidir ŞOK arama aracı haline cerevisiae alkol dehidrojenaz I (http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence?prog=blast&amp;db=yli&amp;seqid=aa). Not: BLAST arama aracı Y en benzer protein dizileri döndürür lipolytica genom veritabanı. </li><li> 56. (Tablo 1) primerleri 7. PCR ile yok etme kasetleri Construct ve kısıtlayıcı enzim dijestiyonu ve yukarıdaki bölüm 1.1&#39;de açıklandığı gibi aynı usuller kullanılarak ligasyon reaksiyonları gerçekleştirmek. </li><li> HazırlıkKU70 nakavt suşu yetkili hücreleri vardır dönüşümleri gerçekleştirmek ve yukarıdaki bölüm 1.2&#39;de açıklanan protokol takip ederek 81. (Tablo 1) 55. astar, # 58 ile pozitif koloniler tanımlamak için PCR gerçekleştirin. Not: Bir örnek olarak, YALI0E17787g gen silme işlemi, Şekiller 4 ve 5&#39;te tarif edilir. homolog rekombinasyon oranı 1 kb ve 2 kb uzunluğunda homolog bölgenin etkileri bildirilmiştir. </li></ol>

<ol><li>Jiménez-Bremont, J. F., Rodrìguez-Hernández, A. A., Rodrìguez-Kessler, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJim%C3%A9nez-Bremont%2C+JF+%22Development+and+dimorphism+of+the+yeast+Yarrowia+lipolytica.+Dimorphic+fungi%3A+Their+importance+as+models+for+differentiation+and+fungal+pathogenesis%22">Development and dimorphism of the yeast Yarrowia lipolytica. Dimorphic fungi: Their importance as models for differentiation and fungal pathogenesis</a>. J, R. uiz-H. errera , 58-66 (2012).</li>
<li>Coelho, M., Amaral, P., Belo, I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoelho%2C+M+%22Yarrowia+lipolytica%3A+an+industrial+workhorse.+Current+research%2C+technology+and+education+topics+in+applied+microbiology+and+microbial+biotechnology%22">Yarrowia lipolytica: an industrial workhorse. Current research, technology and education topics in applied microbiology and microbial biotechnology</a>. Méndez-Vilas, A. , 930-940 (2010).</li>
<li>Martinez-Vazquez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+transcription+factor+Znc1p%2C+which+regulates+the+yeast-to-hypha+transition+in+the+dimorphic+yeast+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Identification of the transcription factor Znc1p, which regulates the yeast-to-hypha transition in the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica.</a> Plos One. 8 (6), e66790(2013).</li>
<li>Richard, M., Quijano, R. R., Bezzate, S., Bordon-Pallier, F., Gaillardin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tagging+morphogenetic+genes+by+insertional+mutagenesis+in+the+yeast+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Tagging morphogenetic genes by insertional mutagenesis in the yeast Yarrowia lipolytica.</a> J. Bacteriol. 183 (10), 3098-3107 (2001).</li>
<li>Flores, C. L., Martìnez-Costa, O. H., Sánchez, V., Gancedo, C., Aragòn, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dimorphic+yeast+Yarrowia+lipolytica+possesses+an+atypical+phosphofructokinase%3A+characterization+of+the+enzyme+and+its+encoding+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">The dimorphic yeast Yarrowia lipolytica possesses an atypical phosphofructokinase: characterization of the enzyme and its encoding gene.</a> Microbiology. 151 (5), 1465-1474 (2005).</li>
<li>Domìnguez, Á, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-conventional+yeasts+as+hosts+for+heterologous+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Non-conventional yeasts as hosts for heterologous protein production.</a> Int. Microbiol. 1 (2), 131-142 (1998).</li>
<li>Zinjarde, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Food-related+applications+of+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Food-related applications of Yarrowia lipolytica.</a> Food Chem. 152, 1-10 (2014).</li>
<li>Finogenova, T., Morgunov, I., Kamzolova, S., Chernyavskaya, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organic+acid+production+by+the+yeast+Yarrowia+lipolytica%3A+a+review+of+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Biochem.+Micro%2B%22%5BJournal%5D)">Organic acid production by the yeast Yarrowia lipolytica: a review of prospects.</a> Appl. Biochem. Micro+. 41 (5), 418-425 (2005).</li>
<li>Groguenin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+the+%CE%B2-oxidation+pathway+in+the+yeast+Yarrowia+lipolytica+to+increase+the+production+of+aroma+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Catal.+B-Enzym%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of the β-oxidation pathway in the yeast Yarrowia lipolytica to increase the production of aroma compounds.</a> J. Mol. Catal. B-Enzym. 28 (2), 75-79 (2004).</li>
<li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodiesel+production+from+oleaginous+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Renew.+Energ%22%5BJournal%5D)">Biodiesel production from oleaginous microorganisms.</a> Renew. Energ. 34 (1), 1-5 (2009).</li>
<li>Papanikolaou, S., Aggelis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+production+by+Yarrowia+lipolytica+growing+on+industrial+glycerol+in+a+single-stage+continuous+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technol%22%5BJournal%5D)">Lipid production by Yarrowia lipolytica growing on industrial glycerol in a single-stage continuous culture.</a> Bioresource Technol. 82 (1), 43-49 (2002).</li>
<li>Tai, M., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+push+and+pull+of+lipid+biosynthesis+in+oleaginous+yeast+Yarrowia+lipolytica+for+biofuel+production%5BTitle%5D)+AND+%22Metab.+Eng%22%5BJournal%5D)">Engineering the push and pull of lipid biosynthesis in oleaginous yeast Yarrowia lipolytica for biofuel production.</a> Metab. Eng. 15, 1-9 (2013).</li>
<li>Liu, H. H., Ji, X. J., Huang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotechnological+applications+of+Yarrowia+lipolytica%3A+Past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Biotechnological applications of Yarrowia lipolytica: Past, present and future.</a> Biotechnol. Adv. 33 (8), 1522-1546 (2015).</li>
<li>Liu, L., Alper, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Draft+genome+sequence+of+the+oleaginous+yeast+Yarrowia+lipolytica+PO1f%2C+a+commonly+used+metabolic+engineering+host%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Announc%22%5BJournal%5D)">Draft genome sequence of the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica PO1f, a commonly used metabolic engineering host.</a> Genome Announc. 2 (4), e00652-e00614 (2014).</li>
<li>Dujon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+evolution+in+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome evolution in yeasts.</a> Nature. 430 (6995), 35-44 (2004).</li>
<li>Chen, D. C., Beckerich, J. M., Gaillardin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+transformation+of+the+dimorphic+yeast+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbial.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">One-step transformation of the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica.</a> Appl. Microbial. Biotechnol. 48 (2), 232-235 (1997).</li>
<li>Wang, J. H., Hung, W., Tsai, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+by+electroporation+of+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation by electroporation of Yarrowia lipolytica.</a> J. Microbiol. 49 (3), 469-472 (2011).</li>
<li>Matsuoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+regions+essential+for+the+function+of+chromosomal+replicator+sequences+from+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Analysis of regions essential for the function of chromosomal replicator sequences from Yarrowia lipolytica.</a> Mol. Gen. Genet. 237 (3), 327-333 (1993).</li>
<li>Kretzschmar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+homologous+integration+frequency+in+Yarrowia+lipolytica+strains+defective+in+non-homologous+end-joining%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genet%22%5BJournal%5D)">Increased homologous integration frequency in Yarrowia lipolytica strains defective in non-homologous end-joining.</a> Curr. Genet. 59 (1-2), 63-72 (2013).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+Chain+Reaction%3A+Basic+Protocol+Plus+Troubleshooting+and+Optimization+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies.</a> J. Vis. Exp. (63), e3998(2012).</li>
<li>Kobs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+blunt-end+DNA+fragments+into+the+pGEM-T+Vector+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Promega+Notes%22%5BJournal%5D)">Cloning blunt-end DNA fragments into the pGEM-T Vector Systems.</a> Promega Notes. 62, 15-18 (1997).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Isolating Nucleic Acids from Yeast. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. , JoVE. Cambridge, MA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast">http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast</a> (2016).</li>
<li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+laboratory+techniques%3A+plating+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Aseptic laboratory techniques: plating methods.</a> J. Vis. Exp. (63), e3064(2012).</li>
<li>Hegemann, J. H., Heick, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delete+and+repeat%3A+a+comprehensive+toolkit+for+sequential+gene+knockout+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Delete and repeat: a comprehensive toolkit for sequential gene knockout in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Mol. Biol. 765, 189-206 (2011).</li>
<li>Yamane, T., Sakai, H., Nagahama, K., Ogawa, T., Matsuoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+centromeric+DNA+from+yeast+Yarrowia+lipolytica+and+identification+of+protein-binding+site+required+for+plasmid+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Dissection of centromeric DNA from yeast Yarrowia lipolytica and identification of protein-binding site required for plasmid transmission.</a> J. Biosci. Bioeng. 105 (6), 571-578 (2008).</li>
<li>McGinnis, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLAST%3A+at+the+core+of+a+powerful+and+diverse+set+of+sequence+analysis+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools.</a> Nucleic Acids Res. 32 ((Web Server issue)), W20-W25 (2004).</li>
<li>Madzak, C., Tréton, B., Blanchin-Roland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+hybrid+promoters+and+integrative+expression%2Fsecretion+vectors+for+quasi-constitutive+expression+of+heterologous+proteins+in+the+yeast+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica.</a> J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2 (2), 207-216 (2000).</li>
<li>Nicaud, J. M., Le Clainche, A., Le Dall, M. T., Wang, H., Gaillardin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yarrowia+lipolytica%2C+a+yeast+model+for+the+genetic+studies+of+hydroxy+fatty+acids+biotransformation+into+lactones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Catal.+B-Enzym%22%5BJournal%5D)">Yarrowia lipolytica, a yeast model for the genetic studies of hydroxy fatty acids biotransformation into lactones.</a> J. Mol. Catal. B-Enzym. 5 (1), 175-181 (1998).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu çalışma için Amacımız Y. hedefli gen tırnakları hızlı ve etkin üretimini sağlamaktır Bunu başarmak için lipolytica Po1g suşu. Çeşitli düşünceler ele alınması gerekmektedir. İlk olarak, yüksek bir dönüşüm etkinliği gerekir. Y için Böylece, etkili ve uygun bir kimyasal dönüşümü protokolü lipolytica Po1g suşu Bu çalışmada tanımlanmıştır. PEG-4000 kullanımı, bu soyun başarılı bir transformasyonu için önemli bir faktördür. Bunun yerine, PEG-4000 (S. cerevisiae&#39;nin ...

Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, geleneksel olmayan bir maya farklı çevresel koşullar 1,2 değişikliklere yanıt olarak maya ya da misel şeklinde büyüyebilir. Böylece, bu iki şekilli maya mantar farklılaşma, morfolojilerinden ve taksonomi 3,4,5 çalışma için iyi bir model olarak kullanılabilir. Genellikle yaygın olarak organik asitler, polialkoller, aroma maddeleri, emülsiyon yapıcılar ve yüzey aktif maddeler 6,7,8,9 gibi gıda katkı maddelerinin çeşitli üretmek için kullanılan bir kasa (GRAS) maya türleri, olarak kabul edilir. Bu kadar hücre kuru ağırlığının 10% 70, zorunlu bir aerobe ve doğal olarak yüksek miktarlarda lipitleri biriken yeteneğine tanınmış yağlı maya, yani. Ayrıca besinlerin 11,12,13 atık kaynaklarının kalıntıların farklı türde de dahil olmak üzere, büyüme için karbon kaynakları geniş bir yelpazede yararlanabilirler. Bu eşsiz özelliklerin tümü Y. yapmak için çok cazip lipolyticaçeşitli biyoteknolojik uygulamalar. Y&#39;nin tüm genom sekansı, ancak lipolytica 14,15 yayınlandı, bu sıradışı maya genetik manipülasyon diğer maya türleri daha karmaşıktır. İlk olarak, bu maya türlerinin dönüşümü nedeniyle istikrarlı ve verimli bir genetik transformasyon sisteminin 16,17 olmaması çok daha az etkilidir. Doğal epizomal plazmid sistemi bu maya 18 bulunmuştur İkinci olarak, lineer ekspresyon kasetlerinin zahmetli genomik entegrasyon yaygın ilgili genlerin ekspresyonu için kullanılır. Bu maya doğru homolog rekombinasyon yoluyla verimliliği hedefleyen gen düşüktür ve çoğu entegrasyon olayları homolog olmayan sonunda katılmadan (NHEJ) 19 içinden gelmesi nedeniyle genetik knock-out ve knock-ins Üçüncü nesil sınırlıdır. Bu çalışmada, Y için optimize edilmiş bir transformasyon protokolü rapor lipolytica </em&gt; kolay, hızlı, verimli ve tekrarlanabilir Po1g suşu. Hassas homolog rekombinasyon frekansını artırmak için, NHEJ yolunun önemli bir enzimi kodlayan KU70 geni silinmiş. Optimize edilmiş dönüşüm protokolü kullanılarak ve 1 kb Y. KU70 geni homoloji bölgeleri kuşatan içeren doğrusal bir nakavt kaset dönüştürerek lipolytica Po1g başarıyla silindi. Bu gen silinmesi metodoloji sağlamlığı daha sonra Po1g KU70 Δ suşu alkol dehidrogenaz ve alkol oksidazı genlerini hedef alan ile gösterilmiştir. Bu KU70 delesyon suşu doğal tipte Po1g soyunun daha hedefleme homolog rekombinasyon aracılığıyla gen bir ölçüde daha yüksek bir verimlilik sergilemiş olduğu gözlemlenmiştir. Buna ek olarak, higromisin B direnç taşıyan bir yineleme Cre ifade plazmid işaretleyici kurtarma gerçekleştirmek için inşa edilmiştir. işaretleyici kurtarma th hedef genin birden fazla mermi kolaylaştırırE gen silinmesi Elde edilen mutantlar. Gen silme yanı sıra, burada tarif edilen genetik transformasyonu ve gen silinmesi için protokol özel bir lokus genlerin eklemek için, ve Y alana özgü mutasyonların katılması için uygulanabilir lipolytica genomu.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Reaktif / Malzeme< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Oligonükleotid primerleri</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td></td><td>25 nmol DNA oligos</td></tr><tr><td>Y. lipolytica suşu Po1g</td><td>Mayalı Biyoteknoloji</td><td></td><td>lösin vahşi tip suşun oksotrofik türevi W29 (ATCC 20460)</td></tr><tr><td>Vektör pYLEX1</td><td>Mayalı Biyoteknoloji</td><td>FYY203-5MG</td><td>Y. lipolytica ekspresyon</td></tr> <tr><td>vektörüE. coli TOP10</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Plazmitlerin klonlanması ve çoğaltılması için</td></tr><tr><td>pGEM-T vektörü&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A3600</td><td>TA klonlama vektörü</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kiti</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>Plazmit izolasyonu için</td></tr><tr><td>Sihirbaz SV Jel ve PCR Temizleme Sistemi</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td>Agaroz jellerinden DNA parçalarını çıkarın ve PCR ürünlerini bir amplifikasyon reaksiyonundan saflaştırın</td></tr><tr><td>iProof yüksek kaliteli DNA polimeraz</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5302</td><td>Yüksek kaliteli DNA polimeraz</td></tr><tr><td>BamHI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136S</td><td>Kısıtlama enzimi</td></tr><tr><td>BglII&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144L</td><td>Restriksiyon enzimi</td></tr><tr><td>KpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0142S</td><td>Restriksiyon enzimi</td></tr><tr><td>NdeI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td>Restriksiyon enzimi</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189L</td><td>Restriksiyon enzimi</td></tr><tr><td>PmlI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0532S</td><td>Restriksiyon enzimi</td></tr><tr><td>PstI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0140S</td><td>Restriksiyon enzimi</td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0157S</td><td>Restriksiyon enzimi</td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0138S</td><td>Restriksiyon enzimi</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146L</td><td>Restriksiyon enzimi</td></tr><tr><td>T4 DNA ligaz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA polimeraz & nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>M0267L</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Gibco-Life Teknolojileri</td><td>11593-027</td><td>Antibiyotikler</td></tr><tr><td>Higromisin B</td><td>PAA</td><td>P21-014</td><td>Antibiyotikler</td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb DNA merdiveni</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0312</td><td>1 kb DNA merdiveni</td></tr><tr><td>PEG4000</td><td>Sigma</td><td>95904-F</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0729</td><td></td></tr><tr><td>Somon Sperm DNA</td><td>İnvitrojen</td><td>15-632-011</td><td></td></tr><tr><td>Lityum Asetat</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Asetik asit</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cam boncuklar (425-600 & mikro; m)</td> <td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>DNA Yükleme Boyası</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Maya Özü</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>D-Glikoz</td><td>1. Baz</td><td>BIO-1101</td><td></td></tr><tr><td>YNB amino asitler Sigma</td><td>olmadan</td><td>Y0626</td><td></td></tr><tr><td>DO Takviyesi-Leu</td><td>Clontech</td><td>630414</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Difco LB Et Suyu</td><td>BD</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Difco LB Agar</td><td>BD</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR makinesi</td><td>Biorad</td><td>T100 Termal Döngüleyici</td><td></td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td>Memmert</td><td>WNB 14</td><td></td></tr><tr><td>Sabit/Çalkalamalı İnkübatör</td><td>Yihder</td><td>LM-570RD</td><td></td></tr><tr><td>Termo-çalkalayıcı</td><td>Allsheng</td><td>MS-100</td><td></td></tr><tr><td>Mikro santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometre</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>Biyofotometre plus</td><td></td></tr><tr><td>Jel görüntüleyici</td><td>GE</td><td>Amersham Görüntüleyici 600</td><td></td></tr></tbody></table>

yenilenebilir biyoyakıt ve biyokimyasal Üretim için bir sıradışı maya genetik mühendisliği

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

Yarrowia lipolytica bir, patojen olmayan dimorfik ve kesinlikle aerobik maya türüdür. kendine özgü fizyolojik özellikleri ve metabolik özellikleri nedeniyle, bu sıradışı maya sadece mantar farklılaşma temel doğası çalışma için iyi bir model değil, aynı zamanda biyokimyasal üretim ve kapsamlı genetik manipülasyonlar gerektiren çeşitli biyoteknolojik uygulamalar için umut verici bir mikrobik bir platformdur. Y&#39;nin Ancak genetik manipülasyonlar lipolytica nedeniyle başta KU70 geni isnat edilebilir verimli ve istikrarlı bir genetik transformasyon sisteminin eksikliği yanı sıra homolog olmayan rekombinasyon çok yüksek oranlarda sınırlı olmuştur. Burada, verimli genetik transformasyonu için ve Y gen silinmesi için kolay ve hızlı bir protokol rapor lipolytica Po1g. Y dışsal DNA etkin transformasyonu için İlk olarak, bir protokol lipolytica Po1g kurulmuştur. Second, hedef genlerin daha silinmesi için geliştirilmiş çift çaprazlama homolog rekombinasyon oranı elde etmek için, KU70 gen 1 kb homoloji silah taşıyan bir bozulma kaset dönüştürerek tarafından silindi. Üçüncü olarak, KU70 geninin silindikten sonra gelişmiş gen silme verimliliğini göstermek için, biz tek tek KU70 nakavt platformu zorlanma aynı prosedürler kullanılarak alkol dehidrogenaz ve alkol oksidaz kodlayan 11 hedef genleri silindi. Kesin homolog rekombinasyon oranı silinmesi için en az% 0.5 önemli bir artış gözlenmiştir Po1g KU70 ö 11 hedef genlerin tek gen silinmesi için% 33 -71% ile Po1g içinde KU70 geninin. higromisin B direnç işareti, CRE / LoxP taşıma sistemi bir replikatif plazmit ve maya nakavt suşlarında seçim marker geni, sonunda targe birden fazla tur kolaylaştırmak için Cre rekombinazın ifadesinin uzaklaştırıldıted genetik manipülasyonlar. Ortaya çıkan tek gen silme mutantlar biyoyakıt ve biyokimyasal üretimde potansiyel uygulamalar var.

Lineerleştirilmiş Y. lipolytica ifade vektörü Y genomunda pBR yerleştirme platformu yerleştirildi Tek bir geçit rekombinasyona 27 gerçekleştirerek lipolytica Po1g süzün. Bu çalışmada kurulan hızlı kimyasal dönüşüm prosedürü, doğrusallaştırılmış Y. kullanarak lipolytica ifade vektörü başarıyla&gt; 100 CFU / ug DNA bir transformasyon verimi yabani tip Po1g suşuna transforme edildi. 1 kb homolog dizilerin çevrili bir nakavt kaset Po1g ...

Burada, gelişmiş gen delesyon verimliliği için Yarrowia lipolytica Po1g suşunun moleküler genetik manipülasyonuna ilişkin yöntemleri rapor ediyoruz. Elde edilen mühendislik ürünü Y. lipolitica suşları, biyoyakıt ve biyokimyasal üretimde potansiyel uygulamalara sahiptir.

Yenilenebilir Biyoyakıt ve Biyokimyasal Üretim için bir Sıradışı Maya Genetik Mühendisliği

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

Bu prosedürün genel amacı, transformasyon DNA'sının hazırlanması, DNA transformasyonu, transformant seçimi ve homolog rekombinasyon yoluyla hedeflenen gen delesyonu da dahil olmak üzere, konvansiyonel olmayan bir maya türü için etkili genetik mühendisliği yöntemleri geliştirmektir. Biyoyakıt ve biyokimyasal üretimde potansiyel uygulamaları olan yarrowia lipolytica PO1G suşunda, yüksek düzeyde gen delesyonu tekniği oluşturduk. Bu tekniğin PCR aracılı gen bozulması gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, büyük miktarda gen delesyonu fragmanlarının ve geniş bir seçilebilir marker yelpazesinin mevcut olmasıdır.Bu çalışmada, Yarrowia lipolytica PO1G suşu için etkili, kolay, güvenilir ve tekrarlanabilir genetik transformasyon protokolünü sunuyoruz. Bu çalışmada oluşturulan Yarrowia lipolytica PO1G KU70 delesyon suşu, hedef gen delesyonlarının daha hızlı ve kolay taranmasını sağlayan çok yüksek bir homolog rekombinasyon sıklığı göstermektedir. Bu prosedürün ilk adımı, bir Y.lipolytica ekspresyon vektöründen LEU2 ekspresyon kasetinin PCR ile amplifiye edilmesi ve LEU2 kasetinin 5-prime ve 3-prime uçlarına LoxP bölgelerinin yerleştirilmesidir.Klonlama sürecinin sonraki adımları için birinci primere bir BamHI restriksiyon bölgesi de eklenmiştir. LoxP promotörü LEU2 terminatörü LoxP kaseti saflaştırıldıktan sonra, saflaştırılmış PCR ürününe üç prim-A çıkıntısı eklenir. A-kuyruklu PCR ürünü daha sonra, T-LEU2 plazmidini elde etmek için bir TA klonlama vektörüne ligasyonu yapılır.İkinci PCR adımı, Y.lipolytica PO1G genomik DNA'sındaki üç ve dört numaralı primerleri kullanarak KU70 geninin bir kilobazlık 5-prime üst akış sekansını amplifiye etmektir. Ardından, hem saflaştırılmış PCR ürününü hem de T-LEU2 plazmidini SacII ve BamHI enzimleri ile çift sindirime tabi tutun ve saflaştırılmış ve sindirilmiş PCR ürününü T-LEU2'nin SacII BamHI bölgelerine ligleyerek T-LEU2-5E plazmidini elde edin. Üçüncü PCR adımı, Y.lipolytica PO1G genomik DNA'sındaki beş ve altı numaralı primerleri kullanarak KU70 geninin bir kilobazlık 3-prime alt akış sekansını amplifiye etmektir.Ardından, hem saflaştırılmış PCR ürününü hem de T-LEU2-53 plazmidini NotI ve NdeI enzimleri ile çift sindirime tabi tutun ve saflaştırılmış, sindirilmiş PCR ürününü T-KO plazmidini elde etmek için T-LEU2-5E'nin NotI NdeI bölgelerine ligeyin. Son olarak, disrupsiyon kasetini üretmek için T-KO plazmidini SacII ve NdeI enzimleri ile sindirin. Bu prosedüre yetkin Y.lipolytica PO1G hücreleri hazırlayarak başlayın.Taze bir maya özütü pepton dekstroz veya YPD plak masasındaki Y. lipolytica PO1G suşu kolonisini, 100 mililitrelik bir flask içindeki 10 mililitre YPD ortamına ekleyin. Doygunluğa ulaşana kadar 30 derece santigrat sıcaklıktaki çalkalayıcı inkübatörde, 225 RPM'de 20 saat boyunca inkübe edin. Ertesi gün, hücreleri oda sıcaklığında 5000 G'de beş dakika santrifüj ederek pelletleyin.Hücreleri 20 mililitre TE tamponu ile yıkayın ve hücreleri tekrar çöktürün. Süpernatantı uzaklaştırdıktan sonra hücreleri bir mililitre 0.1 molar lityum asetat içinde yeniden süspande edin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Kompetan hücreleri steril 1.5 mililitrelik tüplerde 100 mikrolitrelik alikotlara bölün.10 µL denatüre somon spermi DNA'sını ve bir ila beş µg saflaştırılmış yıkım kasetini, 100 µL kompetan hücre ile nazikçe karıştırarak hemen transformasyon prosedürüne geçin. 30 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin. 700 µL %40 polietilen glikol 1000 ekleyin.İyice karıştırın ve 30 °C'deki çalkalamalı inkübatörde 225 RPM'de 60 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, tüpü 39 °C'lik bir su banyosuna yerleştirerek transformasyon karışımını ısı şokuna tabi tutun ve 60 dakika bekletin. 60 dakika sonra tüpe bir mililitre YPD besiyeri ekleyin ve hücrelerin 30 °C'de, 225 RPM'de iki saat boyunca toparlanmasını sağlayın.Oda sıcaklığında, 9000 ×g'de bir dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı uzaklaştırın ve peleti bir mililitre TE tamponu içerisinde yeniden süspanse edin. Hücreleri tekrar santrifüj edin ve süpernatantı atın.Pelleti 100 µL TE tamponunda yeniden süspande edin ve lösin eksik plaklara ekin. Plağı 30 °C'de iki ila üç gün inkübe edin. CRE rekombinaz aracılı markör kurtarma işlemi gerçekleştirilmeden önce, CRE ekspresyon plazmidi metin protokolünde açıklandığı şekilde oluşturulur.Episomal olarak replike olan bu plazmidin bazı özellikleri arasında bir CRE rekombinaz geni, bir higromisin B direnç belirteci ve bir ampisilin direnç geni yer almaktadır. Bu prosedüre başlamak için, daha önce gösterilen transformasyon protokolünü takip ederek CRE ekspresyon plazmidini KU70 nakavt suşunun kompetan hücrelerine transforme edin. Transforme edilen hücreleri YPD artı higromisin B plaklarına ekin ve 30 °C'de iki ila üç gün inkübe edin.Pozitif kolonileri belirlemek için metin protokolünde açıklanan koloni PCR'ı gerçekleştirdikten sonra, iki mililitre YPDH besiyerine ekim yapmak üzere pozitif bir klon seçin ve doygunluğa ulaşana kadar 30 °C'de, 225 RPM'de çalkalamalı inkübatörde gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, kültürün OD 600 değerini bir spektrofotometre ile ölçün. Hücreler yaklaşık 15 OD 600 değerine ulaştığında, oda sıcaklığında 5000 ×g'de beş dakika santrifüj ederek hasat edin.Süpernatantı uzaklaştırın, iki mililitre steril su ekleyin ve tekrar santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri YPD medyumunda yeniden süspanse edin. Hücreleri, başlangıç OD 600 değeri 0,1 olacak şekilde iki mililitre YPD medyumuna yeniden ekleyin. Ve hücrelerin 30 °C'lik bir inkübatörde, 225 RPM'de gece boyunca büyümesine izin verin.Ertesi gün, tek kolonileri izole etmek için gece boyunca inkübe edilen hücre kültürünü YPD plaklarına ekle. Koloniler görünene kadar 30 Celsius'ta inkübe et. Kolonileri YPD, YPDH ve Lösin eksikliği olan plaklara replika plaklama yöntemiyle aktar.Plakaları 30 °C'de iki gün boyunca inkübe edin. KU70 knockout plazmidinin bir şeması gösterilmiştir. Plazmidin SacII ve NdeI enzimleri ile sindirilmesi sonucu bozucu kaset elde edilir.Jel elektroforezi, bozunma kasetinin beklenen boyutu olan 4.3 kilobazlık bir bandın varlığını doğrular. Y.lipolytica PO1G'deki KU70 geni delesyonu PCR ile doğrulanır. Birinci ve onuncu şeritler arası transformantların genomik DNA'sından amplifiye edilen PCR ürünlerini, 11. şerit ise yabani tip suşun PCR ürünlerini içerir.Yedinci şerit pozitif bir nakavtı gösterirken, birinci şerit yalancı bir pozitifi göstermektedir. KU70 nakavt suşundaki seleksiyon marker geni, nihayetinde CRE rekombinaz ekspresyonu ile uzaklaştırılmıştır. Marker içermeyen pozitif transformanlar, yalnızca YPD plakası üzerinde büyümeleriyle doğrulanmıştır.KU70 geni delesinden sonra, gen delesyon hızındaki artışı doğrulamak için, KU70 nakavt suşunda aynı prosedür kullanılarak 11 hedef gen tek tek delesyona uğratılmıştır. Her bir gen bozulması PCR ile doğrulanmış olup; bir, iki ve dört numaralı şeritlerin pozitif nakavtlar olarak tanımlandığı temsili bir sonuç burada gösterilmiştir. Yarrowia lipolytica PO1G KU70 delesyon platin suşu, diğer kromozomal delesyon mutantları oluşturulurken metabolik yol mühendisliği ve suş optimizasyonu uygulamaları için daha verimli bir sistem ve daha iyi bir seçenek sunar.Bu videoyu izledikten sonra, yarrowia lipolytica PO1G hücrelerinde homolog rekombinasyon yoluyla hedeflenmiş tek gen silme stratejisi hakkında kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız.

genetic-engineering-an-unconventional-yeast-for-renewable-biofuel

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Yeşil Canavar yöntemi bir muhabir gen kodlaması yeşil flüoresan protein ile işaretlenmiş birden silme hızlı montaj sağlar. Bu yöntem, tekrarlanan delesyonlar cinsel çeşit döngüleri ve daha fazla silme taşıyan hücrelerin floresan merkezli zenginleştirme yoluyla maya suşu sürüş dayanmaktadır.

Çoklu Gen Delesyonlar Taşıma Maya Suşlarında Nesil için Yeşil Canavar Süreci

Geliştirmek dönüşümü, yönetmek ve probiyotik maya Saccharomyces boulardii heterolog protein ifadesini test etmek için kullanılabilecek tekniklerin birleşik bir açıklama burada sunulmuştur.

Farelerde oral sonda ardından Probiyotik Maya Dönüşümü ve Gastrointestinal Bağışıklık Dokular Onların Kurtarma

Saccharomyces cerevisiae'de yönlendirilmiş evrim kampanyaları için mutant kütüphaneler oluşturmak ve taramak için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Evrim Yöntemi yönettiği<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Kütüphane Oluşturma ve Tarama

Adaptif gelişimi ve izolasyon teknikleri tarif hızla heksoz ve enzimin pentoz karışık şekerler undetoxified hidrolizatlarını şekerleştirilir ve 40 g / L etanol içinde birikir tüketmek mümkün Scheffersomyces stipitis suşunun türevleri NRRL-Y-7124 elde etmek üzere gösterilmektedir.

Etanol ile lignoselüloz biyo dönüşümünü için Sağlam Pentoz-fermente Maya Evrimi Teknikleri

Mikrobiyal mühendisliğin 'tasarım-yap-test' döngüsündeki bir darboğaz, suşların işlevsel ekranlarını gerçekleştirebildiğimiz hızdır. Damlacık bazlı RNA dizilimi kullanan deney başına yüzlerce ila binlerce maya hücresine uygulanan gerinim taraması için yüksek iş letme yöntemini tanımlıyoruz.

Damlacık Tabanlı RNA Sıralamaile Yüksek EldeLi Maya Zorlanma Fenotilik

Mikrobiyal metabolizmanın optogenetik kontrolü, fermantasyon süreçleri üzerinde esnek dinamik kontrol sağlar. Buradaki protokol, farklı hacimsel ölçeklerde kimyasal ve protein üretimi için mavi ışık ayarlı fermantasyonların nasıl kurulacağını göstermektedir.

Mikrobiyal Kimyasal ve Protein Üretimi için Işık Kontrollü Fermantasyonlar

Bu protokol, Saccharomyces eubayanus'ta transkripsiyonel aktivite ölçümlerine izin vererek, glikozdan maltoza geçişi izlemek, metabolik adaptasyonların gerçek zamanlı analizini sağlamak ve çeşitli koşullar altında endüstriyel fermantasyon için gerinim optimizasyonunu desteklemek için bir biyolüminesan raportör kullanır.

In vivo (İn canlı) Mayada Biyolüminesan Raportör Kullanılarak Metabolik Geçiş Sırasında Transkripsiyonel Aktivitenin İzlenmesi

Bir yüksek verimlilik, otomatik, tütün protoplast üretim ve dönüşüm metodolojisi açıklanmıştır. Robotik sistem dışı bir model ürünlere çevrilebilir olmalıdır modeli BY-2 sistemde güçlü paralel gen ifadesi ve keşif sağlar.

Yüksek verim Protoplast İzolasyonu ve Dönüşüm için Robotik Platformu

Büyük ölçekli gRNA kitaplıkları oluşturmak için yöntemleri basit, verimli ve maliyet-etkin olmalıdır. Biz gRNA kütüphaneler hedef DNA Enzimatik sindirim üzerinde dayalı üretim için bir iletişim kuralı tanımlamak. Bu yöntem CORALINA (kapsamlı gRNA Kütüphane üretimi kontrollü nükleaz faaliyetleri ile) pahalı özel Oligonükleotid sentezi için bir alternatif sunuyor.

Büyük ölçekli gRNA Kütüphane üretim herhangi bir DNA kaynaktan için evrensel bir iletişim kuralı

Bu protokol için baculovirus baculovirus plazmid geçici transfection Sf9 hücreleri tarafından üretilen ve bir serum serbest süspansiyon kültürde güçlendirilmiş. Süpernatant heparin benzeşme Kromatografi tarafından saf ve ultrasantrifüj tarafından daha da yoğunlaştı. Bu iletişim kuralı üretim ve baculovirus gen terapisi uygulama için arıtma için yararlıdır.

Üretim ve Baculovirus arınma gen tedavisi uygulaması için

Öğrenin Yarrowia lipolytica Po1g'de KU70 geni silinerek homolog rekombinasyonu artıran ve Cre/LoxP sistemiyle çoklu gen delesyonu sağlayan genetik mühendislik protokolünü. Bu yöntem biyoyakıt ve biyokimyasal üretim için gelişmiş suş mühendisliğine olanak tanır.

Yenilenebilir Biyoyakıt ve Biyokimyasal Üretim için bir Sıradışı Maya Genetik Mühendisliği

Daha fazla video keşfet