Katmanlı Aljinat Yapıları: Heterojen hücre popülasyonlarının Co-kültür için bir platform

Bu prosedürün genel amacı, 3D ko-kültür sırasında farklı hücre popülasyonları arasındaki ilişkileri araştırmak için tekrarlanabilir bir şekilde iki katmanlı aljinat hidrojel diskler oluşturmaktır. Bu yöntem, uzamsal olarak heterojen 3D kültürlerde çoklu hücre popülasyonları arasındaki etkileşimlerin incelenmesini kolaylaştırır ve bu da doku mühendisliği ve yük taşıyan dokuların fizyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, mekanik stimülasyon için yapısal olarak elverişli olan hücre tohumlu, çok katmanlı aljinat hidrojelleri oluşturmak için basit, ekonomik ve tekrarlanabilir bir yol sunmasıdır.

Bu prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Poonam Sharma olacak. Aljinat diskleri oluşturmak için, önce üç x üç inçlik bir uç plakanın üzerine bir parça kalın filtre kağıdı koyun, ardından bir hücre mikrosive zarı koyun. Membranı ve filtre kağıdını düzleştirmek için steril bir spatula kullanın.

Ardından, yığını bir kağıt havlu yığını üzerine ters çevirin ve fazla kalsiyum klorür çözeltisini çıkarmak için malzemeleri sıkıştırın. Daha sonra, mikro elek zarının üzerine silindirik oyuklara sahip bir jel oluşum kalıbı yerleştirin ve kalıbı sol ve sağ taraftaki uç plakaya nazikçe sabitlemek için bağlayıcı klipsler kullanın. Şimdi, bir parça kalın filtre kağıdını küçük bir uç plakaya, ardından bir parça mikro elek zarına istifleyin ve az önce gösterildiği gibi fazla kalsiyum klorürü çıkarmak için yığını ters çevirin.

Kalıp yarısının her ikisi de hazır olduğunda, steril aljinat ortamının mililitresi başına 10 ila altıncı ilgili hücreyi bir kez yeniden askıya alın. Hücreler uygun şekilde dağıldığında karışım homojen bir şekilde bulanık görünecektir. Daha sonra, 130 mikrolitre hücreyi, kalıp yapısının alt yarısındaki altı milimetre çapında üç milimetre yüksekliğindeki kuyucuklara damla damla aktarın.

Her kuyucuğun kenarının üzerinde hafif bir dışbükey menisküs görünmelidir. Tüm hücreler tohumlandığında, kalıp yapısının üst yarısını dikkatlice düzleştirmek için steril bir spatula kullanın. Daha sonra kalıbı, mikroelek zarı kuyucukların üzerine gelecek şekilde ters çevirin ve hücre ve aljinat karışımlarını içeren kuyucukların üzerini tamamen kaplamaya özen göstererek kalıbı kuyuların üzerine yerleştirin.

Kalıp yerine oturduğunda, yüklenen kalıp yapısını kaldırın ve merkeze sıkıca bastırın, kalıbın üst ve alt yarısını sabitlemek için yapının kalan iki tarafına bağlayıcı klipsler yerleştirin. Hücre aljinat çözeltileri kuyucuklara güvenli bir şekilde yerleştirilmelidir. Daha sonra, tüm kalıp yapısını 90 dakika boyunca oda sıcaklığında bir hücre kültürü davlumbazında 102 milimolar kalsiyum klorür banyosuna daldırın.

İnkübasyonun sonunda, yapıyı bir kağıt havlu yığınına aktarın ve üst uç plakayı kalıba sabitleyen iki bağlayıcı klipsi çıkarın. Yapının iki yarısını ayırın. Kuyularda oluşan hidrojellerde kabarcık olmamalı, kuyuları tamamen doldurmalıdır.

Kalan iki bağlayıcı klipsi çıkarın ve hidrojel içeren kalıbı kalan uç plakadan ayırın. Bir spatula kullanarak, jelleri dikkatlice gevşetmek için hidrojelleri içeren oyukların kenarını dikkatlice izleyin. Daha sonra, hidrojelleri doğrudan kalsiyum klorür ve magnezyum klorür içeren bir DPBS banyosuna aktarın.

Bir ila beş dakika sonra, hidrojelleri, jelleri 37 santigrat derece ve yüzde beş CO2'de en az bir saat boyunca tamamen daldırmak için yeterli fesleğen büyüme ortamı çözeltisi içeren altı oyuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına aktarın. İnkübasyonun son 30 dakikası boyunca, kalıbı jel oluşum kalıbının yüksekliğinin yarısı kadar kuyucuklarla sol ve sağ taraflarda üç x üç inç veya üç x 1,5 inç alüminyum uç plakaya sabitlemek için bağlayıcı klipsler kullanın. Daha sonra kalıbı, jel oluşum kalıbından üç milimetre daha büyük çaplı kuyucuklarla sol ve sağ taraflarda üçe üç inç alüminyum levha uç plakalarına kırparak tavlama modunu oluşturun.

Şimdi, hidrojelleri kesme kalıbı kuyularına aktarın. Her jel, jelin yarısı kalıbın üzerinde çıkıntı yapacak şekilde kuyuya sıkıca oturmalıdır. Ve hidrojeli ikiye kesmek için kalıbın yüzeyini dilimlemek için bir neşter kullanın.

Jelin üst yarısını çevirin ve açık bir kalıba yerleştirin. Jel parçası kuyuya sıkıca oturmalıdır, ancak şimdi her iki yarım da kalıbın yüksekliği olmalı ve kesilen iç yüzey görünmelidir. Daha sonra, zarın tavlanacak tüm jel yarımlarıyla temas halinde olduğundan emin olarak, kuyucukların üzerine bir parça kuru hücre mikrosieve zarı yerleştirin ve zarı bir parça kalın filtre kağıdı ile örtün.

Jeller tamamen kaplandığında, filtre kağıdını EDTA ile desteklenmiş sodyum sitrat ile doyurun ve jelleri oda sıcaklığında inkübe edin. Bir dakika sonra, hücre mikrosive zarını ve kalın filtre kağıdını atın ve bağlayıcı klipsleri çıkarın. Daha sonra kalıbı açın ve bir jel yarısını, kesilen yüzey yukarı bakacak şekilde hazırlanmış bir tav kalıbına aktarın.

Bir spatula kullanarak, kesilen yüzey ilk jelin kesilen yüzeyi ile temas edecek şekilde birinci jelin üzerine ikinci bir işlenmiş yarım jel aktarın. Tüm jeller yerleştirildiğinde, kabarcıkları gidermek için jellerin üzerine hafifçe bastırmak için bir spatula kullanın ve tavlama kalıbını dikkatlice kalsiyum klorür banyosuna daldırın. 30 dakika sonra tav kalıbını bir yığın kağıt havlu üzerine aktarın ve ciltleme klipslerini çıkarın.

Daha sonra, kalıbı uç plakadan ayırın ve jelleri kısa bir süre için bir DPBS banyosuna aktarın, ardından uygun hücre kültürü ortamına daldırın. Tamamlanmış iki katmanlı jeller, yeşil veya kırmızı hücre izleyici boyalarla etiketlenmiş 293 FT hücresinin bu görüntüsünde gözlemlendiği gibi, hücre popülasyonlarının toplam bir başlangıç ayrımını sergiler. Tavlamadan sonra gömülen insan mezenkimal kök hücrelerinin canlılığı, toplu hidrojellerde gözlenen hücre canlılığına benzer şekilde, katmanlı hidrojeller içinde yüksektir.

Dört saatlik sınırlandırılmamış döngüsel sıkıştırma boyunca her döngüden en yüksek gerilimi izole ettikten sonra, hücresiz katmanlı hidrojeller, döngüsel sıkıştırmaya karşı, toplu katmansız hücresiz hidrojellere kıyasla büyüklük olarak önemli ölçüde daha küçük olan bir stres tepkisi sergiler, ancak her iki hidrojel türü de kültürde yedi gün sonra bozulmadan kalır. Bir kez ustalaştıktan sonra, tüm malzemelerin hazırlanması da dahil olmak üzere bu teknik, uygun şekilde yapılırsa dört buçuk saatten daha kısa sürede tamamlanabilir. Bu yordamı denerken, herhangi bir hatayı önlemek ve farklı örnekleri daha kolay takip etmek için kasıtlı ve yavaş çalışmak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, oluşabilecek hücre dışı matrislerdeki farklı hücre popülasyonları arasındaki etkileşimlerle ilgili ek soruları yanıtlamak için mekanik stimülasyon ve immün boyama gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu teknik, mekanobiyoloji ve doku mühendisliği alanındaki araştırmacıların mezenkimal kök hücreler, kondrositler ve nükleus pulposus hücreleri gibi farklı hücre popülasyonları arasındaki ilişkiyi daha kolay araştırmalarını sağlayacaktır. Kesici aletler, biyolojik materyaller ve özellikle insan hücreleri ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman uygun kişisel koruyucu giysi giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.