Katmanlı Aljinat Yapıları: Heterojen hücre popülasyonlarının Co-kültür için bir platform

Bu prosedürün genel amacı, 3B ko-kültür sırasında farklı hücre popülasyonları arasındaki ilişkileri incelemek için tekrarlanabilir şekilde çift katmanlı alginat hidrojel diskler oluşturmaktır. Bu yöntem, doku mühendisliği ve yük taşıyan dokuların fizyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilecek, mekansal olarak heterojen 3B kültürlerde çoklu hücre popülasyonları arasındaki etkileşimlerin çalışılmasını kolaylaştırır. Bu tekniğin temel avantajı, mekanik stimülasyon için yapısal olarak elverişli, hücre ekilmiş, çok katmanlı alginat hidrojeller oluşturmak için basit, ekonomik ve tekrarlanabilir bir yol sunmasıdır.

Bu prosedürü, laboratuvarımdan lisansüstü öğrencisi Poonam Sharma gerçekleştirecektir. Aljinat diskleri oluşturmak için, önce üçle üç inçlik bir uç plaketin üzerine kalın bir filtre kağıdı parçası, ardından bir hücre mikroelek membranı yerleştirin. Membranı ve filtre kağıdını düzeltmek için steril bir spatula kullanın.

Ardından, yığını bir miktar kağıt havlu üzerine ters çevirin ve fazla kalsiyum klorür çözeltisini uzaklaştırmak için malzemeleri sıkıştırın. Sonra, silindirik kuyucuklara sahip bir jel oluşturma kalıbını mikrosüzgeç membranın üzerine yerleştirin ve kalıbı sol ve sağ yanlardan uç plakaya nazikçe sabitlemek için ataçlar kullanın. Şimdi, kalın bir filtre kağıdı parçasını küçük bir uç plaka üzerine yerleştirin, ardından bir mikrosüzgeç membran parçası ekleyin ve az önce gösterildiği gibi, fazla kalsiyum klorürü uzaklaştırmak için yığını ters çevirin.

Kalıp yarılarının her ikisi de hazır olduğunda, steril alginat ortamının mililitre başına 10⁶ hedef hücreyi yeniden süspande edin. Hücreler uygun şekilde dağıldığında karışım homojen olarak bulanık görünecektir. Ardından, kalıp yapısının alt yarısında bulunan altı milimetre çapında ve üç milimetre yüksekliğindeki her bir kuyucuğa 130 µL hücreyi damla damla aktarın.

Her kuyucuğun kenarında hafif dışbükey bir menisküs görülmelidir. Tüm hücreler ekildikten sonra, kalıp yapısının üst yarısını dikkatlice düzeltmek için steril bir spatula kullanın. Ardından, mikrosüzgeç membran kuyucukların üzerinde kalacak şekilde kalıbı ters çevirin ve hücre ile aljinat karışımlarını içeren kuyucukları tamamen kapattığınızdan emin olarak kalıbı kuyucukların üzerine yerleştirin.

Kalıp yerleştirildiğinde, yüklü kalıp düzeneğini kaldırın ve merkeze sıkıca bastırarak, kalıbın üst ve alt yarılarını sabitlemek için düzeneğin kalan iki yanına binder klipsleri takın. Hücre alginat çözeltileri kuyucuklara güvenli bir şekilde yerleşmiş olmalıdır. Ardından, tüm kalıp düzeneğini oda sıcaklığında, bir hücre kültürü davlumbazı içinde 102 millimolar kalsiyum klorür banyosuna 90 dakika boyunca daldırın.

İnkübasyonun sonunda, yapıyı bir kağıt havlu yığınının üzerine aktarın ve üst uç plakayı kalıba sabitleyen iki binder klempi çıkarın. Yapının iki yarısını birbirinden ayırın. Kuyucuklarda oluşan hidrojellerde hava kabarcığı olmamalı ve kuyucuklar tamamen dolmuş olmalıdır.

Kalan iki ataç klipsini çıkarın ve hidrojel içeren kalıbı kalan uç plakadan ayırın. Bir spatula kullanarak, jelleri dikkatlice gevşetmek için hidrojelleri içeren kuyucukların kenarlarını dikkatlice takip edin. Ardından, hidrojelleri doğrudan kalsiyum klorür ve magnezyum klorür içeren bir DPBS banyosuna aktarın.

Bir ila beş dakika sonra, hidrojelleri, jelleri tamamen daldıracak kadar fesleğen büyüme ortamı çözeltisi içeren altı kuyucuklu bir plakanın münferit kuyucuklarına aktarın ve 37 °C ve %5 CO2 ortamında en az bir saat bekletin. İnkübasyonun son 30 dakikasında, jel oluşum kalıbının yarı yüksekliğindeki kuyucuklara sahip kalıbı, bir kesim kalıbı oluşturmak için sol ve sağ taraflardaki 3x3 inç veya 3x1,5 inç boyutundaki alüminyum uç plakalara binder klipsler yardımıyla sabitleyin. Ardından, jel oluşum kalıbından çapı 3 mm daha büyük kuyucuklara sahip kalıbı, sol ve sağ taraflardaki 3x3 inç boyutundaki alüminyum uç plakalara klipsleyerek tavlama modunu oluşturun.

Şimdi, hidrojelleri kesme kalıbı kuyucuklarına aktarın. Her bir jel, yarısı kalıbın üzerinde kalacak şekilde kuyucuğa sıkıca yerleşmelidir. Hidrojeli ikiye bölmek için bir skalpel kullanarak kalıp yüzeyi boyunca kesin.

Jelin üst yarısını ters çevirip açık bir kalıp kuyusuna yerleştirin. Jel parçası kuyuya tam olarak oturmalı, ancak her iki yarı kalıp yüksekliğinde olmalı ve kesilmiş iç yüzeyler görünür kalmalıdır. Ardından, membranının tavlanacak tüm jel yarılarıyla temas ettiğinden emin olarak, kuyuların üzerine bir parça kuru hücre mikrosüzgeç membranı yerleştirin ve membranı kalın bir filtre kağıdı parçasıyla örtün.

Jeller tamamen kaplandığında, filtre kağıdını EDTA takviyeli sodyum sitrat ile doyurun ve jelleri oda sıcaklığında inkübe edin. Bir dakika sonra, hücre mikroelek membranını ve kalın filtre kağıdını atın ve kıskaçları çıkarın. Ardından, kalıbı açın ve bir jel yarısını, kesik yüzeyi yukarı bakacak şekilde hazırlanmış bir tavlama kalıbına aktarın.

Bir spatula kullanarak, kesilen yüzeyi ilk jelin kesilen yüzeyiyle temas edecek şekilde ikinci işlem görmüş yarım jeli ilk jelin üzerine aktarın. Tüm jeller yerleştirildikten sonra, hava kabarcıklarını gidermek için bir spatula ile jellerin üzerine hafifçe bastırın ve tavlama kalıbını dikkatlice kalsiyum klorür banyosuna daldırın. 30 dakika sonra, tavlama kalıbını kağıt havlu yığınının üzerine aktarın ve bağlama klipslerini çıkarın.

Ardından, kalıbı uç plakadan ayırın ve jelleri kısa süreliğine bir DPBS banyosuna, ardından uygun hücre kültürü ortamına daldırın. Tamamlanmış çift katmanlı jeller, yeşil veya kırmızı hücre takip boyalarıyla işaretlenmiş 293 FT hücrelerinin bu görüntüsünde gözlemlendiği gibi, hücre popülasyonlarının başlangıçta tamamen ayrıştığını göstermektedir. Tavlama sonrası gömülen insan mezenkimal kök hücrelerinin canlılığı, kütle hidrojellerde gözlemlenen hücre canlılığına benzer şekilde, katmanlı hidrojeller içinde yüksektir.

Dört saatlik sınırsız siklik kompresyon boyunca her döngüden tepe stresini izole ettikten sonra, hücre içermeyen katmanlı hidrojeller, her iki hidrojel türü kültürde yedi gün sonra bile bütünlüğünü korumasına rağmen, kütle halindeki katmansız hücre içermeyen hidrojellere kıyasla büyüklük açısından önemli ölçüde daha küçük bir strese tepki gösterir. Tüm malzemelerin hazırlanması da dahil olmak üzere, bu teknik düzgün bir şekilde uygulandığında dört buçuk saatten daha kısa sürede tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, hataları önlemek ve farklı örnekleri daha kolay takip edebilmek için dikkatli ve yavaş çalışmak önemlidir.

Bu prosedürün ardından, oluşabilecek hücre dışı matrislerdeki farklı hücre popülasyonları arasındaki etkileşimlerle ilgili ek soruları yanıtlamak için mekanik stimülasyon ve immün boyama gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu teknik, mekanobiyoloji ve doku mühendisliği alanındaki araştırmacıların, mezenkimal kök hücreler, kondrositler ve nukleus pulposus hücreleri gibi farklı hücre popülasyonları arasındaki ilişkiyi daha kolay incelemesine olanak tanıyacaktır. Kesici aletler, biyolojik materyaller ve özellikle insan hücreleri ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken uygun kişisel koruyucu ekipmanların giyilmesi gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.