Name: Katmanlı Aljinat Yapıları: Heterojen hücre popülasyonlarının Co-kültür için bir platform (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Öğrenin, çift katmanlı aljinat hidrojel diskler oluşturarak 3D ko-kültürde farklı hücre popülasyonları arasındaki ilişkileri nasıl araştıracağınızı. Bu yöntem, doku mühendisliği ve yük taşıyan dokuların fizyolojisi alanında mekanik uyarım için yapısal olarak uygun, ekonomik ve tekrarlanabilir bir platform sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Bilim Vakfı (CBET 0845754, AHH) tarafından finanse edilmiştir.

Aljinat Disklerin Oluşumunda 1. Hazırlık <ol><li> % 4 Hazırlama (a / h) 37 ° C su banyosu içinde, eklenmiş kalsiyum klorid veya magnezyum klorid ve yer olmadan 1x Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin aljinat çözeltisi. aljinat çözeltisi konsantrasyonları değişebilir, ancak 1-4% (w / v) aljinat çözeltileri önerilir. </li><li> İstenen bir hücre tipi için sıcak bir hücre kültür ortamı baz ile 1 (ör Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı).: 1 oranında aljinat çözeltisi karıştırın. Alginat konsantrasyonu orjinal konsantrasyonunun yarısı, yani.,% 2 (w / v). Steril 0.2 mikron naylon şırınga filtreleri kullanarak aljinat / medya çözümü sterilize edin. </li><li> (- 300 ml ~ 200) kalıp daldırın kadar çözelti steril su içinde, steril 102 mM kalsiyum klorür dihidrat banyo hazırlayın. </li><li> Steril &quot;jel oluşumu kalıp&quot; alüminyum levha içinde x 3 a 3 (6 mm çap x 3 mm uzunluğunda silindirik kuyu toplayın, bkz <strong&gt; Şekil 1) ve omurun (Alt: Bir alüminyum plaka x 3 3, en alüminyum plaka x 3, bir 1.5) ve aşağıdaki şekilde kalıplar hazırlamak: <ol><li> Yaklaşık 1 dakika kalın filtre kağıdı (kurutma filtre kağıdı) ve alt ve üst endplate&#39;lerin boyutları hücre microsieve zarı (10 mikron gözenek boyutu) kesin ve doyana kadar kalsiyum klorür banyosuna koyun. Eğer arzu edilirse, kullanımdan önce, 30 dakika boyunca otoklavda veya ultraviyole ışık ile kalın bir filtre kağıdı ve microsieve membran sterilize edin. </li><li> Ayar kalıp yapısının bir yarısının (alt yarısı). <ol><li> aşağıdaki sırayla birbiri üstüne aşağıdaki öğeleri yerleştirin ve steril bir spatula kullanılarak pürüzsüz: büyük uç plakası, kalın bir filtre kağıdı ve microsieve membran (3 inç x 3 inç olarak). </li><li> Ters çevirin ve aşırı kalsiyum klorür çözeltisinin kaybını sağlamak için kağıt havlu yığını üzerine kalıp basın. </li><li> c üstünde silindirik kuyuları ile &quot;jel oluşumu kalıp&quot; koyunell microsieve zarı ve hafifçe sol ve sağ tarafta bağlayıcı klipleri kullanarak iki tarafta birbirine kalıp tutturmak. Tamamen sonra kuyuları kapsayacak şekilde (in x 3 1.5) üst plak için yeterli odadan emin olun. </li></ol></li><li> Set-up kalıp yapısının ikinci yarısında (üst yarısı). <ol><li> aşağıdaki sırayla birbirlerine tepesinde aşağıdaki öğeleri koyun ve pürüzsüz: küçük uç plakası, kalın filtre kağıdı, microsieve membran. </li><li> Ters çevirin ve aşırı kalsiyum klorür çözeltisinin kaybını sağlamak için kağıt havlu yığını üzerine kalıp bu yarım basın. Şu anda bağlayıcı klipleri kullanarak kalıp bu yarısını tutturmak yok. </li></ol></li></ol></li><li> Kültür hücreleri olarak üreticinin talimatlarına göre önerilir. katmanlı aljinat hidrojeller gömmek için istenen hücreler hasat. Tavsiye hücre yoğunluğu 1 - 2 x 10 6 hücre / mL, ancak bu arzu edilen deneyler bağlı olarak değişebilir. Not: Bu yöntemi kullanırkenfarklı hücre tipleri ile katmanları yapmak için, katman paralel olarak kültür iki hücre tipleri emin olun. Mezenkimal kök hücreler (MSC&#39;ler) 1 x 10 6 hücre bir hücre yoğunluğunda tohumlandı / ml, aşağıdaki protokol için bir örnek olarak kullanılacaktır. gerektiği gibi hücre sayısı ve disk numarası deneyler için ölçeklendirilebilir. <ol><li> Bazal üreme ortamı, 10 ml (Dulbecco Modifiye Eagle ortamı,% 10 fetal sığır serumu,% 2 L-glutamin, 1 5000 hücre / cm2 - bir ya da iki hafta önce 3.000 hücre yoğunluğunda, tohum mezenkimal kök hücreleri gömme T-75 şişelerinde% temel olmayan amino asitler,% 1 penisilin / streptomisin). </li><li> 3 gün ve hücreler, 80 kadar bazal üreme ortamı 10 ml yerine - - her 2 harcanan Ortamı çıkarın% 90 konfluent. </li><li> ilave kalsiyum klorür veya hücreleri durulama magnezyum klorür olmadan 1x Dulbecco&#39;nun fosfat tamponlu tuzlu 3 ml, hücreler hasat harcanan ortamı çıkarın ve pipet için. pipet,% 0.25 Try 3 ml bu çözüm çıkarınT-75 şişelerinde büyüyen hücreler üzerine psin-EDTA ve 37 ° C&#39;de 5 dakika inkübe edilir. Bazal büyüme ortamının 9 ml - hücreleri yapışık yüzeyden kaldırılır sonra 6 ekleyin. </li><li> Santrifüj MSC&#39;ler, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 600 x g&#39;de, süpernatanı havalandırın, ve 1 ile yeniden askıya - bazal üreme ortamı, 5 ml. Cihaz yönergeleri kullanarak hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. </li><li> Santrifüj aynı koşullar kullanılarak, toplam hücre yeniden süspanse 1 x 10 6 hücreleri çıkarın ve süpernatant aspire. </li></ol></li></ol> Hücre Tohumlu Aljinat Disklerin 2. oluşumu <ol><li> 1 x 10 6 hücre / ml hücre yoğunluğu elde etmek için steril aljinat / ortam çözeltisi 1 ml hücre pelletini yeniden askıya. Hücreler uygun olarak karıştırıldığı zaman hücre alginat karışımı görünüşte homojen bulutlu olacaktır. </li><li> Pipet kalıbın alt yarısında, altı 6 mm çap x 3 mm uzunluğunda kuyulara hücre alginat karışımı 130 ulkabarcıkları yaratmak için değil, böylece damla damla inşa. Hafif dışbükey menisküsün her bir kenarında üzerinde görünür olmalıdır. </li><li> Dikkatle steril bir spatula kullanarak kalıp yapısının üst yarısını pürüzsüz ve hücre microsieve zarı kuyularının üstünde olacak şekilde, ters çevirin. Kalıp hücresi ve tamamen aljinat karışımı içeren kuyuları kapsayacak şekilde emin olun, kuyu üstüne inşa yerleştirin. </li><li> ortasına bastırarak ederken, yüklenen kalıp yapı kaldırın ve bağlayıcı kalıp yapısının üst ve alt yarılarını tutturmak için kalan iki taraf (alt ve üst) klip. Hücre-aljinat çözümleri güvenli şu anda kuyularda sokuldu edilmelidir. </li><li> Tüm yapı altında olduğundan emin, 102 mM kalsiyum klorür banyosuna bağlanmış kalıp yapı daldırın. 90 dakika için oda sıcaklığında, hücre kültürü kaputu inkübe edin. </li><li> 90 dakika sonunda, 102 mM kalsiyum klorür kalıp yapı kaldırmaHücre kültürü kaputu kağıt havlu yığını üzerinde banyo ve yer. Dört bağlayıcı klipleri çıkarın ve kalıp yapının iki yarısını ayırın. kuyularda oluşan hidrojeller kabarcıkları olmamalıdır ve tamamen kuyu doldurmalıdır. </li><li> Bir spatula kullanarak, dikkatli dikkatli gevşetin ve hidrojeller dışarı kama hidrojeller içeren kuyuların kenarına iz. Kalıp yapısı arasında hidrojeller ayrılmasından sonra, doğrudan kalsiyum klorür ve magnezyum klorür ile 1x Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu bir banyo içine hidrojeller bırakın. 5 dakika - 1 için aşırı kalsiyum klorür solüsyonu yıkayın tamamen jelleri örtün. </li><li> Tamamen hidrojeller kapsayan arzu edilen çanak bazal büyüme ortamı çözeltisine (örn., 6 havuzlu plakalar) içine hidrojeller aktarın. 37 ° C&#39;de hücre kültürü inkübatöründe en az 1 saat% 5 katman adımına devam etmeden önce CO2 inkübe edin. Not: hücreleri ihtiva eden hidrojeller tutulabilir3 gün - başka hücre popülasyonu ile jellerin katman kadar şu anda süresiz hücre kültür inkübatör medya değişiklikleri her 2 tamamlamış olması şartıyla, arzu edilir. </li></ol> Aljinat Disklerin 3. Katmanlama <ol><li> 1 saat inkübasyon son yarım saat süresince, toplamak ve jeller tavlamak için steril kalıpları ve solüsyon hazırlanır. <ol><li> x (bir plak için 3 (alüminyum levha içinde x 3 a 3 6 mm çap x 1.5 mm uzunluğunda kuyu) &quot;jel oluşumu kalıp&quot; yüksekliğinin kuyu yarısı olan bir kalıp sıkarak &quot;kesme kalıp&quot; hazırlayın sağ ve sol tarafta bağlayıcı klipleri kullanarak alüminyum levha 3). </li><li> x ((alüminyum levha içinde x 3 a 3 9 mm çap x 3 mm boyunda kuyu) bir plak için &quot;jel oluşumu kalıp&quot; den çapı 3 mm daha geniş bir kalıp sıkarak 3 &quot;tavlama kalıp&quot; hazırlayın sağ ve sol tarafta bağlayıcı klipleri kullanarak alüminyum levha 3). </li><li> ihtiva eden bir çözelti hazırlayın100 mM sodyum sitrat / 30 mM EDTA, steril su içinde (sodyum sitrat dihidrat, etilendiamintetraasetik asit tetrasodyum tuzu dihidrat). </li></ol></li><li> istenen hücre popülasyonlarının jeller çıkarın (bu örnekte, iki hMSCs diskleri) çanak ortamdan ve &quot;kesme kalıbı&quot; kuyu içine koyun. Her jel kalıp üzerinde çıkıntılı jel yarısı ile kuyu içine rahatça oturmalıdır. </li><li> Bir neşter kullanılarak, kalıp yüzeyi boyunca jel (Bu devre hidrojel kesecek) dilim. jel üst yarısını çevirmek ve açık kalıp kuyunun içine yerleştirin. jel yarısı da iyi kalıp içine rahatça sığacak, ancak şimdi her iki yarım jeller görünür kesilmiş iç yüzeyi ile kalıp yüksekliği olmalıdır. İkinci jel ile tekrarlayın. Not: Uyarı: Yalnızca iç kesim yüzeyleri katmanlı diskleri oluşturacaktır. Dış yüzeyler kullanılarak yarıları ayırma neden olur. Bu jel yüzeyi önlemek aktarılır microsieve membrandan bu doku şüphesiTavlama işleminin başarısı. </li><li> microsieve membran tavlanabilir jel yarılarının her temas halinde olduğundan emin olduktan ve tamamen bunları kapsayan, kuyu üzerine kuru hücre microsieve membranın bir parça yerleştirin. tamamen jelleri kapsayacak şekilde emin olun, microsieve membran üstüne kalın filtre kağıdı yerleştirin. </li><li> Bu doyana kadar kalın filtre kağıdı üzerine, 100 mM sodyum sitrat / 30 mM EDTA (sodyum sitrat dihidrat, Etilendiamintetraasetik asit tetrasodyum tuzu dihidrat) çözeltisi Pipet. Yaklaşık 750 | il dört kuyu için yeterlidir. </li><li> Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca jeller inkübe edin. Sonra, hücre microsieve zarı ve kalın filtre kağıdı çıkarın ve atın. bağlayıcı klipleri çıkarın ve kalıp açın. </li><li> Her tavlı jel, kesme yüzeyi yukarı bakacak şekilde hazırlanan &quot;tavlama kalıp&quot; olarak hidrojel bir sodyum sitrat / EDTA ile muamele edilmiş yarısını aktarın. Bu tavlanmış Kat yarısı olacakdürme. </li><li> kesim yüzeyi olduğunu bu yüzden ikinci yarı jel saygısız, zaten &quot;tavlama kalıp&quot; olarak jel üzerine (bir farklı hücre tipi içerebilir) spatula, asansör kullanma ve ikinci sodyum sitrat / EDTA ile tedavi edilen yarı jel yerleştirin zaten &quot;tavlama kalıp&quot; olarak jel kesim yüzeyi ile temasa geçin. </li><li> hafifçe aşağı iki jeller arasındaki kabarcıklarını çıkarmak için bir spatula kullanarak iki jeller basın. birbirlerinin üstüne doğrudan olduğundan emin olmak için gerekli olarak da, j eller yerleştirin. </li><li> Yavaşça &quot;tavlama kalıp&quot; kaldırma ve 30 dakika boyunca 102 mM kalsiyum klorür banyosu içinde daldırın. Bir plak ile kuyu örtmeyin. </li><li> 30 dakika inkübasyondan sonra, &quot;tavlama kalıp&quot; kaldırmak ve kağıt havlu üzerine koyun. bağlayıcı klipleri çıkarın ve plak kalıp ayırın. </li><li> tavlanmış jeller toplamak ve kalsiyum klorid ve M ile bir 1 x Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin içine yerleştirin, spatulaagnesium klorür banyo jelleri yıkamak. Daha sonra, arzu edilen bir çanak hücre kültür ortamına tavlanmış hidrojeller transferi (örneğin., 6-yuvalı plaka) kültür. </li></ol>

<ol><li>Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Basic+Science+of+Articular+Cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Sports+Health%22%5BJournal%5D)">The Basic Science of Articular Cartilage.</a> Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).</li>
<li>Neidlinger-Wilke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+loading+of+the+intervertebral+disc%3A+from+the+macroscopic+to+the+cellular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Spine+J%22%5BJournal%5D)">Mechanical loading of the intervertebral disc: from the macroscopic to the cellular level.</a> Eur. Spine J. 23 (3), 333-343 (2013).</li>
<li>Klein, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+of+stratified+articular+cartilage+from+chondrocyte+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarth.+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering of stratified articular cartilage from chondrocyte subpopulations.</a> Osteoarth. Cartilage. 11 (8), 595-602 (2003).</li>
<li>Han, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-free+Grafts+for+Articular+Cartilage+Defects%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+R%22%5BJournal%5D)">Scaffold-free Grafts for Articular Cartilage Defects.</a> Clin. Orthop. Relat. R. 466 (8), 1912-1920 (2008).</li>
<li>Ng, K. W., Ateshian, G. A., Hung, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zonal+chondrocytes+seeded+in+a+layered+agarose+hydrogel+create+engineered+cartilage+with+depth-dependent+cellular+and+mechanical+inhomogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+A%22%5BJournal%5D)">Zonal chondrocytes seeded in a layered agarose hydrogel create engineered cartilage with depth-dependent cellular and mechanical inhomogeneity.</a> Tissue Eng. A. 15 (9), 2315-2324 (2009).</li>
<li>Ng, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+layered+agarose+approach+to+fabricate+depth-dependent+inhomogeneity+in+chondrocyte-seeded+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">A layered agarose approach to fabricate depth-dependent inhomogeneity in chondrocyte-seeded constructs.</a> J. Orthop. Res. 23 (1), 134-141 (2005).</li>
<li>Nguyen, L. H., Kudva, A. K., Saxena, N. S., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+articular+cartilage+with+spatially-varying+matrix+composition+and+mechanical+properties+from+a+single+stem+cell+population+using+a+multi-layered+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Engineering articular cartilage with spatially-varying matrix composition and mechanical properties from a single stem cell population using a multi-layered hydrogel.</a> Biomaterials. 32 (29), 6946-6952 (2011).</li>
<li>Leone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+multilayered+composite+hydrogel+as+osteochondral+substitute%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Continuous multilayered composite hydrogel as osteochondral substitute.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 103 (8), 2521-2530 (2015).</li>
<li>Lai, J. H., Kajiyama, G., Smith, R. L., Maloney, W., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+catalyze+cartilage+formation+by+neonatal+articular+chondrocytes+in+3D+biomimetic+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Stem cells catalyze cartilage formation by neonatal articular chondrocytes in 3D biomimetic hydrogels.</a> Sci. Rep. 3, (2013).</li>
<li>Vigfúsdòttir, ÁT., Pasrija, C., Thakore, P. I., Schmidt, R. B., Hsieh, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Pericellular+Matrix+in+Mesenchymal+Stem+Cell+Deformation+during+Chondrogenic+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Role of Pericellular Matrix in Mesenchymal Stem Cell Deformation during Chondrogenic Differentiation.</a> Cell. Mol. Bioeng. 3 (4), 387-397 (2010).</li>
<li>Lee, C. S. D., Gleghorn, J. P., Won Choi, N., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+layered+chondrocyte-seeded+alginate+hydrogel+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Integration of layered chondrocyte-seeded alginate hydrogel scaffolds.</a> Biomaterials. 28 (19), 2987-2993 (2007).</li>
<li>Gleghorn, J. P., Lee, C. S. D., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. Adhesive properties of laminated alginate gels for tissue engineering of layered structures. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGleghorn%2C+JP+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22">J. Biomed. Mater. Res. A</a>. 85 (3), 611-618 (2008).</li>
<li>Gharravi, A. M., Orazizadeh, M., Ansari-Asl, K., Banoni, S., Izadi, S., Hashemitabar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Fabrication+of+Anatomical+Bioreactor+Systems+Containing+Alginate+Scaffolds+for+Cartilage+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Avicenna+J.+Med.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Design and Fabrication of Anatomical Bioreactor Systems Containing Alginate Scaffolds for Cartilage Tissue Engineering.</a> Avicenna J. Med. Biotechnol. 4 (2), 65-74 (2012).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+Differentiation+of+Human+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Three-Dimensional+Alginate+Gels%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+A%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells in Three-Dimensional Alginate Gels.</a> Tissue Eng. A. 14 (5), 667-680 (2008).</li>
<li>Yeatts, A. B., Gordon, C. N., Fisher, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+an+aggregated+alginate+construct+in+a+tubular+perfusion+system%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Formation of an aggregated alginate construct in a tubular perfusion system.</a> Tissue Eng. C, Methods. 17 (12), 1171-1178 (2011).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada, örneğin, örneğin, fizyolojik olarak tabakalı dokularda olanlar, kıkırdak gibi çeşitli hücre popülasyonlarının, ko-kültürlere Katmanlı aljinat hidrojel disklerin oluşturulması için bir protokol açıklar. Bu tarif edilen, kültür platformu olarak tabakalı yapılar, aynı kültür ortamı ya da yük altında maruz iki farklı hücre popülasyonlarının arasındaki etkileşimi incelemek için kullanılabilir. Aljinat biyolojik olarak uyumlu olduğu bulunmuştur ve başarılı bir şekilde kık...

Böyle eklem kıkırdağı veya intervertebral diskleri gibi sıkıştırma yükü taşıyan dokular dokuda hem biyomekanik fonksiyon ve uygun mekano-iletimi için kritik olan heterojen doku bölgeleri oluşur. Sadece hücresel organizasyonu ve farklı bölgelerde farklı işlev, ancak hücre dışı matris (ECM) ayrıca kompozisyon ve organizasyonda çeşitlidir. Örneğin, eklem kıkırdağı değişen hücre morfolojisi, mekanik fonksiyon ve ECM ile üç birincil bölgeler oluşur. Yük taşıyan sorumlulukları diferansiyel kendi ECM kurşun farklılıklar; Orta ve derin bölgeler sıkıştırma 1 yanıt esas hesap ise yüzeysel bir tabaka esas olarak, yük germe cevap yer almaktadır. Benzer bir şekilde, intervertebral disk, jel benzeri bir çekirdeği pulposus katmanlı bir halka fibrozis ile çevrilidir ve bu iki farklı alanlarda hücreler biyofiziksel uyarıcıların farklı deneyimDoku maruz ve mekanik kuvvetlere yanıt olarak, 2., Doku tabakaları içinde dokular, hücreler ve hücre-dışı matrisler Bu tip birbiriyle etkileşime girer. Böyle heterojen doku yapılarının Rekapütülasyon doku mühendisliği ve rejeneratif tıpta bir sorun olmaya devam etmektedir, ve biyolojik önemi anlayışımız sınırlıdır. Bir yapının farklı hücre popülasyonlarının tabakalı dokular yanı sıra ko-kültürler analiz etmek için platformlar kültürlenmesi için bir ihtiyaç vardır. Eklem kıkırdak doku mühendisliği, iskele-az katmanlı yapılar bu dokuda 3,4 farklı katmanlarını taklit etmek çeşitli ECM yatırmak için bölgesel kondrositlerin yeteneği yararlanarak inşa edilmiştir. Ancak, katmanlı hidrojel yapıları bağımsız sağlam dokuyu oluşturmak için yeteneğinden yoksun hücre popülasyonlarının farklı tipleri etkileşimini araştırmak için bir fırsat sağlar. Örneğin, farklı popmezenkimal kök hücrelerin ulations katmanlı yapıları içinde birlikte yetiştirilebilir. Böyle katmanlı iskeleleri kondrosit ve gelişmiş doku mühendisliği için 5 mezenkimal kök hücrelerin ayırt hem kullanılmıştır. Sadece farklı hücre popülasyonu içindeki hidrojel tabakaları kültürlenen-co, ancak tek bir hücre tipi, aynı zamanda hücre 6,7 farklı yanıtlar ortaya çıkarmak için çeşitli sertlik veya biyokimyasal içeriğe sahip manipüle edilmiştir tabakalar içinde kültürlenebilir. Birçok farklı biyo materyal hidrojeller, örneğin polietilen glikol veya poli vinil alkol bazları 7-9 kullananlar gibi kıkırdak doku mühendisliği için hücre popülasyonlarının katman kullanılmaktadır. Ancak, aljinat hidrojeller ko-kültür heterojen hücre popülasyonlarının eğitim için katmanlı iskeleleri oluşturmak için basit biyomalzeme biridir. agaroz hidrojeller de kolayca oluşurken, aljinat hidrojeller kolay izin yararı vartek tek hücrelerin analizi için 3-D yapısının bir hücre olation önce 10 tarif edildiği gibi. Daha önceki çalışmalarda, iki tabakalı aljinat hidrojellerin ince tabakalar halinde oluşmuş ve bu levhalar, kesitler dilimlenmiş (örn., Bir biyopsi yumruk kullanarak) bu tür biyokimyasal içerik veya arayüzey kayma özelliklerinin 11,12 analizi için olduğu gibi özel uygulamalar için. İnce aljinat tabakaların oluşturulması için bir diğer yöntem, çoklu katmanlar içine sınıflandırması için potansiyel olarak tarif edilmiştir, ama yine de, mekanik test 13 kullanım için hidrojel değişiklik gerektirir. Burada, tekrarlanabilir hücrelerinin ko-kültür farklı popülasyonlarda kullanım için çift tabakalı alginat hidrojel diskler yaratmak için bir yöntem sunulmaktadır. Bu aljinat disk platformu birkaç avantajlara sahiptir. Öncelikle, tekrarlanabilir şekli ve küçük boyutlu bir biyopsi pu gerektirmeden gömülü hücrelerin mekanik uyarılması için elverişlinch veya birçok uygulama için hidrojel diğer fiziksel değişiklik. Buna ek olarak, hücre canlılığı, tabaka oluşturma süreci sırasında yüksek kalır ve jel oluşumu sonrası jel içinde iki hücre popülasyonlarının arasında net bir ayrım: ilk üst üste bölgesi ile görülebilir.

<table><tbody><tr><td>Aljinik Asit sodyum tuzu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1112</td><td>DPBS (-/-)</td></tr><tr><td>1x Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (-/-)</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp;</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>1x Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu (+/+)</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp;</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium</td><td>Gibco Life Teknolojileri&nbsp;</td><td>11965</td><td>Örneği. İstenilen orta tip</td></tr><tr><td>Şırınga Filtrelerini kullanın (0.02 & # 956; m Naylon)</td><td>FisherBrand</td><td>0979C</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür Dihidrat</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP510</td><td>Steril suda çözelti hazırlayın</td></tr><tr><td>Criterion Blotter Filtre Kağıdı</td><td>Biorad</td><td>1704085</td><td>Küf oluşumu için uç plakaların boyutuna göre kesin</td></tr><tr><td>Hücre Mikrosieve Membran (10 &# 956; m gözenek boyutu)</td> <td>Biodesign Inc of New York</td><td>N10R Küf</td><td>oluşumu için uç plakaların boyutuna göre kesin</td></tr><tr><td>Sodyum sitrat dihidrat</td><td>FisherScience</td><td>S93364</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit tetrasodyum tuzu dihidrat (EDTA)</td> <td>FisherBioreagent</td><td>BP121</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu&nbsp;</td><td>Gibco Yaşam Teknolojileri&nbsp;</td><td>26140</td><td>Örneğin mezenkimal kök hücre bazal büyüme ortamında kullanılır</td></tr><tr><td>Penicilin/Streptomisin (10.000 U/ml)</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp;</td><td>15140</td><td>Örneğin mezenkimal kök hücre bazal büyüme ortamında kullanılan</td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp;</td><td>25030081</td><td>Örneğin mezenkimal kök hücre bazal büyüme ortamında kullanılan</td></tr><tr><td>Esansiyel Olmayan Amino Asitler (100x)</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp;</td><td>11140050</td><td>Örneğin mezenkimal kök hücre bazal büyüme ortamında kullanılır</td></tr></tbody></table>

katmanlı aljinat yapıları: heterojen hücre popülasyonlarının co-kültür için bir platform

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Birçok yük taşıyan doku, tipik olarak diferansiyel mekanoslama özelliklerine sahip farklı hücre fenotiplerinin eşlik ettiği yapısal ve fonksiyonel olarak farklı bölgelere sahiptir. Bu doku tiplerinin mühendisliği ve analizi hala bir zorluktur. Katmanlı hidrojel yapıları, tek yapılar içindeki çoklu hücre popülasyonları arasındaki etkileşimleri araştırmak için bir fırsat sağlar. Aljinat hidrojeller hem biyouyumludur hem de deneyden sonra hücrelerin kolay izolasyonuna izin verir. Burada, küçük boyutlu çift katmanlı aljinat hidrojel disklerin geliştirilmesi için bir yöntem açıklıyoruz. Bu işlem, oluşum süreci sırasında insan mezenkimal kök hücrelerinin yüksek hücre canlılığını korur ve bu katmanlı diskler, kondrogenez geçiren hMSC'lerin uyarılması için yaygın olarak kullanılan sınırlandırılmamış döngüsel kompresyona dayanabilir. Bu katmanlı yapılar potansiyel olarak ek seviyeler içerecek şekilde ölçeklendirilebilir ve ayrıca katmanlamadan sonra başlangıçta hücre popülasyonlarını ayırmak için kullanılabilir. Bu çift katmanlı aljinat hidrojel kültür platformu, yük taşıyan dokuların hücrelerinin ve diğer hücre tiplerinin ko-kültürlerinin mühendisliği ve analizi dahil olmak üzere birçok farklı uygulama için kullanılabilir.

Şekil 1 aljinat hidrojellerin oluşumunu ve katmanlarını gösteriyor. Bu hidrojeller ve tabakalı, yüksek ve dökme hidrojeller karşılaştırılabilir kalır içinde gömülü insan mezenkimal kök hücrelerin Şekil 2. Hücre canlılığı) &#39;de gösterildiği gibi, Şekil 3&#39; de gösterildiği gibi, hücre popülasyonlarının tam bir başlangıç ​​ayrılma göstermez iki katmanlı jeller tamamlandı. Canlılık değerlendirildi tavlama sonrası, ardından merkezi eriş...

Heterojen hücre popülasyonlarına sahip yük taşıyan dokuların mühendisliği ve analizi hala bir zorluktur. Burada, tek bir yapı içinde çeşitli hücre popülasyonlarının birlikte kültürü için bir platform olarak iki katmanlı aljinat hidrojel diskler oluşturmak için bir yöntem açıklıyoruz.

Katmanlı Aljinat Yapıları: Heterojen hücre popülasyonlarının Co-kültür için bir platform

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Bu prosedürün genel amacı, 3B ko-kültür sırasında farklı hücre popülasyonları arasındaki ilişkileri incelemek için tekrarlanabilir şekilde çift katmanlı alginat hidrojel diskler oluşturmaktır. Bu yöntem, doku mühendisliği ve yük taşıyan dokuların fizyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilecek, mekansal olarak heterojen 3B kültürlerde çoklu hücre popülasyonları arasındaki etkileşimlerin çalışılmasını kolaylaştırır. Bu tekniğin temel avantajı, mekanik stimülasyon için yapısal olarak elverişli, hücre ekilmiş, çok katmanlı alginat hidrojeller oluşturmak için basit, ekonomik ve tekrarlanabilir bir yol sunmasıdır.Bu prosedürü, laboratuvarımdan lisansüstü öğrencisi Poonam Sharma gerçekleştirecektir. Aljinat diskleri oluşturmak için, önce üçle üç inçlik bir uç plaketin üzerine kalın bir filtre kağıdı parçası, ardından bir hücre mikroelek membranı yerleştirin. Membranı ve filtre kağıdını düzeltmek için steril bir spatula kullanın.Ardından, yığını bir miktar kağıt havlu üzerine ters çevirin ve fazla kalsiyum klorür çözeltisini uzaklaştırmak için malzemeleri sıkıştırın. Sonra, silindirik kuyucuklara sahip bir jel oluşturma kalıbını mikrosüzgeç membranın üzerine yerleştirin ve kalıbı sol ve sağ yanlardan uç plakaya nazikçe sabitlemek için ataçlar kullanın. Şimdi, kalın bir filtre kağıdı parçasını küçük bir uç plaka üzerine yerleştirin, ardından bir mikrosüzgeç membran parçası ekleyin ve az önce gösterildiği gibi, fazla kalsiyum klorürü uzaklaştırmak için yığını ters çevirin.Kalıp yarılarının her ikisi de hazır olduğunda, steril alginat ortamının mililitre başına 10⁶ hedef hücreyi yeniden süspande edin. Hücreler uygun şekilde dağıldığında karışım homojen olarak bulanık görünecektir. Ardından, kalıp yapısının alt yarısında bulunan altı milimetre çapında ve üç milimetre yüksekliğindeki her bir kuyucuğa 130 µL hücreyi damla damla aktarın.Her kuyucuğun kenarında hafif dışbükey bir menisküs görülmelidir. Tüm hücreler ekildikten sonra, kalıp yapısının üst yarısını dikkatlice düzeltmek için steril bir spatula kullanın. Ardından, mikrosüzgeç membran kuyucukların üzerinde kalacak şekilde kalıbı ters çevirin ve hücre ile aljinat karışımlarını içeren kuyucukları tamamen kapattığınızdan emin olarak kalıbı kuyucukların üzerine yerleştirin.Kalıp yerleştirildiğinde, yüklü kalıp düzeneğini kaldırın ve merkeze sıkıca bastırarak, kalıbın üst ve alt yarılarını sabitlemek için düzeneğin kalan iki yanına binder klipsleri takın. Hücre alginat çözeltileri kuyucuklara güvenli bir şekilde yerleşmiş olmalıdır. Ardından, tüm kalıp düzeneğini oda sıcaklığında, bir hücre kültürü davlumbazı içinde 102 millimolar kalsiyum klorür banyosuna 90 dakika boyunca daldırın.İnkübasyonun sonunda, yapıyı bir kağıt havlu yığınının üzerine aktarın ve üst uç plakayı kalıba sabitleyen iki binder klempi çıkarın. Yapının iki yarısını birbirinden ayırın. Kuyucuklarda oluşan hidrojellerde hava kabarcığı olmamalı ve kuyucuklar tamamen dolmuş olmalıdır.Kalan iki ataç klipsini çıkarın ve hidrojel içeren kalıbı kalan uç plakadan ayırın. Bir spatula kullanarak, jelleri dikkatlice gevşetmek için hidrojelleri içeren kuyucukların kenarlarını dikkatlice takip edin. Ardından, hidrojelleri doğrudan kalsiyum klorür ve magnezyum klorür içeren bir DPBS banyosuna aktarın.Bir ila beş dakika sonra, hidrojelleri, jelleri tamamen daldıracak kadar fesleğen büyüme ortamı çözeltisi içeren altı kuyucuklu bir plakanın münferit kuyucuklarına aktarın ve 37 °C ve %5 CO2 ortamında en az bir saat bekletin. İnkübasyonun son 30 dakikasında, jel oluşum kalıbının yarı yüksekliğindeki kuyucuklara sahip kalıbı, bir kesim kalıbı oluşturmak için sol ve sağ taraflardaki 3x3 inç veya 3x1,5 inç boyutundaki alüminyum uç plakalara binder klipsler yardımıyla sabitleyin. Ardından, jel oluşum kalıbından çapı 3 mm daha büyük kuyucuklara sahip kalıbı, sol ve sağ taraflardaki 3x3 inç boyutundaki alüminyum uç plakalara klipsleyerek tavlama modunu oluşturun.Şimdi, hidrojelleri kesme kalıbı kuyucuklarına aktarın. Her bir jel, yarısı kalıbın üzerinde kalacak şekilde kuyucuğa sıkıca yerleşmelidir. Hidrojeli ikiye bölmek için bir skalpel kullanarak kalıp yüzeyi boyunca kesin.Jelin üst yarısını ters çevirip açık bir kalıp kuyusuna yerleştirin. Jel parçası kuyuya tam olarak oturmalı, ancak her iki yarı kalıp yüksekliğinde olmalı ve kesilmiş iç yüzeyler görünür kalmalıdır. Ardından, membranının tavlanacak tüm jel yarılarıyla temas ettiğinden emin olarak, kuyuların üzerine bir parça kuru hücre mikrosüzgeç membranı yerleştirin ve membranı kalın bir filtre kağıdı parçasıyla örtün.Jeller tamamen kaplandığında, filtre kağıdını EDTA takviyeli sodyum sitrat ile doyurun ve jelleri oda sıcaklığında inkübe edin. Bir dakika sonra, hücre mikroelek membranını ve kalın filtre kağıdını atın ve kıskaçları çıkarın. Ardından, kalıbı açın ve bir jel yarısını, kesik yüzeyi yukarı bakacak şekilde hazırlanmış bir tavlama kalıbına aktarın.Bir spatula kullanarak, kesilen yüzeyi ilk jelin kesilen yüzeyiyle temas edecek şekilde ikinci işlem görmüş yarım jeli ilk jelin üzerine aktarın. Tüm jeller yerleştirildikten sonra, hava kabarcıklarını gidermek için bir spatula ile jellerin üzerine hafifçe bastırın ve tavlama kalıbını dikkatlice kalsiyum klorür banyosuna daldırın. 30 dakika sonra, tavlama kalıbını kağıt havlu yığınının üzerine aktarın ve bağlama klipslerini çıkarın.Ardından, kalıbı uç plakadan ayırın ve jelleri kısa süreliğine bir DPBS banyosuna, ardından uygun hücre kültürü ortamına daldırın. Tamamlanmış çift katmanlı jeller, yeşil veya kırmızı hücre takip boyalarıyla işaretlenmiş 293 FT hücrelerinin bu görüntüsünde gözlemlendiği gibi, hücre popülasyonlarının başlangıçta tamamen ayrıştığını göstermektedir. Tavlama sonrası gömülen insan mezenkimal kök hücrelerinin canlılığı, kütle hidrojellerde gözlemlenen hücre canlılığına benzer şekilde, katmanlı hidrojeller içinde yüksektir.Dört saatlik sınırsız siklik kompresyon boyunca her döngüden tepe stresini izole ettikten sonra, hücre içermeyen katmanlı hidrojeller, her iki hidrojel türü kültürde yedi gün sonra bile bütünlüğünü korumasına rağmen, kütle halindeki katmansız hücre içermeyen hidrojellere kıyasla büyüklük açısından önemli ölçüde daha küçük bir strese tepki gösterir. Tüm malzemelerin hazırlanması da dahil olmak üzere, bu teknik düzgün bir şekilde uygulandığında dört buçuk saatten daha kısa sürede tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, hataları önlemek ve farklı örnekleri daha kolay takip edebilmek için dikkatli ve yavaş çalışmak önemlidir.Bu prosedürün ardından, oluşabilecek hücre dışı matrislerdeki farklı hücre popülasyonları arasındaki etkileşimlerle ilgili ek soruları yanıtlamak için mekanik stimülasyon ve immün boyama gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu teknik, mekanobiyoloji ve doku mühendisliği alanındaki araştırmacıların, mezenkimal kök hücreler, kondrositler ve nukleus pulposus hücreleri gibi farklı hücre popülasyonları arasındaki ilişkiyi daha kolay incelemesine olanak tanıyacaktır. Kesici aletler, biyolojik materyaller ve özellikle insan hücreleri ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken uygun kişisel koruyucu ekipmanların giyilmesi gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

layered-alginate-constructs-platform-for-co-culture-heterogeneous

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu protokolde, teknolojinin dayandığı dikey yerinden mesajların microactuator dizi imalat, ve nasıl bu temel teknoloji, yüksek verimli mekanik dinamik hücre kültürü, hem de iki boyutlu ve üç boyutlu kültür yapmak için değiştirilebilir göstermektedir paradigmalar.

Mekanik Dinamik Hücre Kültürü için Microfabricated platformlar

Üç boyutlu bağlamında normal hücreleri Kültür, hücresel dönüşüm ve tümörogenez için gerekli erken olayları incelemek için alternatif bir yöntem temsil eder. Bu yöntem, normal yumurtalık ve yumurtalık kanseri oluşumu erken olayları incelemek için oviductal hücreleri büyümek için kullanılır.

Yumurtalıklar ve fallop borularında Üç Boyutlu Organ Kültür Aljinatta Hidrojeller

Aşağıdaki bölümlerde, biyomedikal uygulamalarda kullanım için aljinat mikroküreler hazırlanması için prosedürleri özetlemektedir. Biz özellikle tip 1 diyabet için potansiyel bir tedavi olarak hücre ve protein encapsulation çift amaçlı çok katmanlı aljinat mikroküreler oluşturmak için bir teknik göstermektedir.

Biyomedikal Uygulamalar için Aljinatta Mikrokürelerin Üretimi

Sulu de iki fazlı sistemlerde hücrelerin aynı anda birden fazla kalıp popülasyonları için kullanılmıştır. Hücre desenlendirme için bu hızlı ve kolay bir yöntem dekstran ve polietilen glikol ve iki polimer çözümleri arasında var arayüzey gerilimi sulu çözeltilerinin faz ayrışması yararlanır.

Sulu İki fazlı sistemler kullanma Hücre Co-kültür desenlendirme

Pluripotent kök hücreleri (PS hücreleri) bir koaksiyel nozul kullanarak aljinat hidrojel kapsüllerine kapsüllemek için bir yöntem oluşturduk.  Bu, hücrelerin aşırı toplanmasını önler ve süspansiyon kültüründeki hücrelerin yaşadığı kesme stresini sınırlar.  Teknik, PS hücrelerinin seri üretiminin yanı sıra kök hücre nişi üzerine yapılan araştırmalara da uygulanabilir.

Bir Koaksiyel Memesini kullanma Pluripotent Kök Hücre Aljinat Encapsulation

Aşağıdaki protokol, iki boyutlu (2B) ve üç boyutlu (3B) hücresel ortamlar arasında bir ara aşama olarak kullanılacak sandviç benzeri kültürleri bir araya getirme prosedürünü açıklar. Tasarlanmış sistemler mikroskopi, biyomekanik, biyokimya ve hücre biyolojisi tahlillerinde uygulamalara sahip olabilir.

Sandviç gibi mikroçevrelerde Hücre / Malzeme Etkileşimleri Harness

Mikro desenli hidrojel levhaların üretimini, bağımsız bir biçimde monte edilebilen ve manipüle edilebilen basit bir işlem kullanarak açıklıyoruz. Bu modüler hidrojel tabakalar kullanılarak, kontrollü bir hücresel mikro çevre ile basit bir makro ölçekli 3D hücre kültürü sistemi oluşturulabilir.

Micropatterned Makro ölçekli 3D Hücresel Mimarlık Modüler Hidrojel Levhaların İnşaatı

Aljinat boncuklarda üç boyutlu kültür, basitliği ve tekrarlanabilirliği nedeniyle, hipofiz adenom hücrelerini korumak için seçildi. Prosedürler, ilk enzimatik sindirimi ve tümör dokusunun mekanik ayrışmasını içeriyordu ve sonraki hücre süspansiyonu, aljinat boncukları içinde kapsüllendi.

İnsan Hipofiz Adenom Hücreleri üç boyutlu Aljinat-boncuk Kültür

Geçerli bilayer kültür modelleri içinde vivo microenvironments taklit fonksiyonel vitro çalışmalar için izin vermez. Polietilen glikol ve çinko oksit şablon oluşturma yöntemi kullanarak, bu iletişim kuralını geliştirme, bir ultrathin biomimetic membran tunable sertlik, porozite ve yakından vivo içinde taklit eden biyokimyasal kompozisyonu ile açıklanır hücre dışı matrisler.

Kültür Ultrathin Porated elastik Hydrogels bir Biomimetic membran için çift olarak hücre

Bu çalışma, kendi kendini iyileştiren tavlanabilir parçacık-hücre dışı matris kompozitleri içindeki nöral kök hücrelerin serbest biçimli gömülü 3D baskısı için bir protokolü açıklamaktadır. Protokol, birbirine bağlı insan sinir dokusu yapılarının yüksek doğrulukla programlanabilir modellenmesini sağlar.

İnsan Nöral Yapılarının Gömülü 3D Baskısı için Mikrojel-Hücre Dışı Matris Kompozit Desteği

Protokol, üç boyutlu (3D) baskılı bir iskele ile iki tür yapışık hücre hattının biyolojisini özetleyebilen yeni bir in vitro deneysel modeli göstermektedir. Bu modelin inşası ve hücre hazırlığı ve hücre kültüründen analiz ve değerlendirmeye kadar işletme prosedürleri açıklanmaktadır.

İki Tip Yapışık Hücre Hattı Kullanan Ko-Kültür Modeli

Öğrenin, çift katmanlı aljinat hidrojel diskler oluşturarak 3D ko-kültürde farklı hücre popülasyonları arasındaki ilişkileri nasıl araştıracağınızı. Bu yöntem, doku mühendisliği ve yük taşıyan dokuların fizyolojisi alanında mekanik uyarım için yapısal olarak uygun, ekonomik ve tekrarlanabilir bir platform sunar.

Katmanlı Aljinat Yapıları: Heterojen hücre popülasyonlarının Co-kültür için bir platform

Daha fazla video keşfet