Tıbbi Cihazlar Bakterilerin yüksek verimlilik Kimlik Savar Polimerler

Bu polimer mikrodizi tekniğinin genel amacı, bakterilerin abiyotik yüzeylere bağlanmasını modüle edebilen sentetik polimerleri tanımlamaktır. Bu yöntem, tıbbi cihazlara bakteri bağlanmasını engelleyen basit, uygun maliyetli biyomalzemelerin keşfinde ilerlemeyi hızlandırmaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin, bir kerede bir malzemeyi test eden geleneksel biyomateryal araştırmalarıyla karşılaştırıldığında ana avantajı, tek bir varlıkta yüzlerce polimeri aynı anda tarama yeteneğidir.

Başlamak için, polimer çözeltileri hazırlayın ve bunları metin protokolüne göre 384 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına ekleyin. Polimerleri 48 satır ve 32 sütun olarak düzenlenmiş 1536 noktadan oluşan dörtlü olarak yazdırmak için bir rutin oluşturun, bir seferde 32 polimer çözeltisi yazdırın, böylece pimlerin temizlenmesine izin vermek için her bölümü yazdırdıktan sonra yazıcı durdurulabilir. Şimdi agaroz kaplı kızakları platforma yerleştirin ve kızakları yerinde tutmak için iyi bir vakum sızdırmazlığı sağlayın.

Yazıcı kafasını tüm pimler aynı yükseklikte olacak şekilde ayarlamak için, kafayı manuel olarak bir cam kızağın üzerine indirin ve pimlerin aynı anda yukarı hareket ettiğini onaylayın. Kuyu plakasını, tutucunun sağ üst köşesinde A1 kuyusu olacak şekilde plaka tutucusuna yerleştirin ve kuyu plakasının sıkıca sabitlendiğinden emin olun. İstendiğinde sürgü ve kuyu plakasının yerinde olduğunu onaylayın.

Bölümler arasındaki pimlerin temizlenmesine izin verecek şekilde her seferinde bir bölüm yazdırın. Ardından, pimleri iyice temizlemek için asetona batırılmış bir kağıt havlu kullanın. Ardından pimlerin tamamen kuru olduğundan emin olmak için kuru kağıt mendil uygulayın.

Mikrodiziler tamamen basıldığında, bunları bir kayar tutucuya yerleştirin ve polimer lekelerindeki N&P'yi çıkarmak için kuruması için 40 santigrat dereceye ayarlanmış bir vakumlu fırına aktarın. Ardından plakaları 30 dakika sterilize etmek için UV ışığı kullanın. Slaytları bakterilerle aşılamadan önce, metin protokolüne göre arka plan floresansını ölçün.

Mikrodiziler için aşılamayı kültürledikten ve hazırladıktan sonra, metin protokolüne göre, UV ile sterilize edilmiş polimer mikrodizilerini dikdörtgen dört oyuklu plakalara yerleştirin ve altı mililitre karışık bakteri kültürü ekleyin. Plakaları beş gün boyunca hafif çalkalama ile 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, mikrodizileri iki kez nazikçe durulamak için PBS kullanın.

Daha sonra PBS'de mililitre DAPI başına bir mikrogram ekleyin ve 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, mikrodizileri yeni bir dört oyuklu plakaya aktarın, mikrodizileri PBS ile örtün ve ardından hafifçe döndürün. Ardından PBS'yi bir kez değiştirin ve yıkamayı tekrarlayın.

Durulamadan sonra, mikrodizileri bir hava akışı altında kurutun, ardından sızdırmazlık filmi uygulayın ve cam kapak kızaklarını mikrodizi slaytlarına yapıştırın. Tutkal kuruduğunda, dış yüzeyi sterilize etmek için% 70 etanol kullanın. 20x subjektif ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanarak, parlak alan ve askılı kanallardaki her polimer noktası için tek görüntüler yakalayın.

Kapak fişlerini polimerlerle kaplamak için, tetrahidrofuran veya başka bir uygun çözücü içinde HIT polimerlerinin çözeltilerini hazırlayın. Bir sıkma kaplayıcı kullanarak, on saniye boyunca 2000 RPM'de polimer çözeltileri ile uygun boyutta dairesel cam kapak kızaklarını sıkın. Kaplanmış kapak fişlerini gece boyunca 40 santigrat derecede bir konveksiyonlu fırında kurutun.

Ve bakteri ile aşılamadan önce kapak fişlerini 30 dakika sterilize etmek için UV ışığı kullanın. UV ile sterilize edilmiş lamele fişlerini standart 12 veya 24 oyuklu bir plakaya yerleştirin ve bu videoda daha önce gösterildiği gibi bakterilerle inkübe edin. İnkübasyonun ardından, kaplanmış örtü fişlerini iki kez yıkamak için 0.1 molar kakodilat tamponu kullanın ve daha sonra hacim başına% 2.5 ağırlık glutaraldehit ve 0.1 molar kakodilat tamponu ile numuneleri iki saat sabitleyin.

Kapak kaymalarını oda sıcaklığında bir saat boyunca %1 osmiyum tetroksit ile sonradan sabitleyin. Her konsantrasyonda 30 dakika boyunca bir etanol serisinde kurutmadan önce. Daha sonra bir püskürtme kaplayıcı ve% 60 ila 40 altın ila platin alaşımı karışımı ile numuneleri 30 miliamperlik bir akım ve 0.75 torr'luk bir vakum kullanarak kaplayın.

SEM ile görüntü çektikten sonra, polimerlerin bakteriyel bağlanma veya itme yeteneklerini doğrulamak için kaplanmamış kapak fişlerinin ve agaroz veya HIT polimerleri ile kaplanmış olanların görüntülerini görsel olarak karşılaştırın. Çeşitli çözücüleri, kateterin uç kuyu kısmı ile uyumluluğun yanı sıra HIT polimerini çözme yetenekleri açısından değerlendirmek için, kateter parçalarını çözücülere daldırın ve kateterin bütünlüğünü ve çözücünün berraklığını görsel olarak değerlendirmeden önce 12 saat inkübe edin. SEM ile kateterler üzerindeki bakteri bağlanmasını analiz etmek için, asetonda% 10 polimer çözeltisi hazırlayın.

200 mikrolitrelik bir mikropipet ucunu kateterin kesilen parçasının orta kısmına bastırarak tutun ve parçayı yaklaşık 30 saniye boyunca polimer solüsyonu içinde yapıştırın. Kaplanmış parçayı ortam koşullarında 30 dakika kurutun, ardından kateter parçasını tekrar polimer çözeltisine daldırarak ikinci bir kaplama uygulayın ve ortam koşullarında gece boyunca kurutun. Kaplanmış ve kaplanmamış kateter parçalarını inoküle edilmiş LB'de inkübe ettikten sonra, metin protokolüne göre, kateterleri yıkamak için bir mililitre PBS kullanın.

Daha sonra bakterileri 30 dakika boyunca sabitlemek için PBS'de% 10 paraformaldehit kullanın. PBS ile yıkadıktan sonra, kateter parçaları üzerindeki bakterileri 20 dakika boyunca lekelemek için DAPI kullanın. Bir mililitre PBS ile yıkamadan önce.

Haznedeki numunelerin düzenini gözlemleyin. Aşağıdaki ayarları kullanarak kateter parçalarının konfokal görüntülerini alın. Kateterin 100 mikrometre uzunluğu boyunca 50 görüntüyü z-istifleyerek konfokal görüntülemeyi tamamlayın.

UV muamelesi ve bakterilerle inkübasyondan sonra, parçaları iki kez yıkamak için bir mililitre PBS kullanın ve bunları 30 dakika boyunca PBS'de% 10 formaldehit içeren 48 oyuklu plakalara aktarın. Numuneleri sabitledikten sonra, PBS ile başka bir yıkama yapın ve gece boyunca oda sıcaklığında kurutun. Daha sonra iletken karbon diskli saplamalara monte edin ve altın kaplamak için bir püskürtme kaplayıcı kullanın.

Görüntülemeden önce, bir taramalı elektron mikroskobu kullanarak. Bu şekil, mikrodizi analizi ile belirlenen bir dizi polimere bakteri bağlanmasını göstermektedir. Polimer olmadan basılan noktalar, agarozun bakteri bağlanmasına güçlü bir şekilde direnmesi ve dolayısıyla floresan çok düşük olması nedeniyle negatif kontrol görevi görür.

Görüntülenen polimerler alaşım bağlayıcıdır, ancak çoğu durumda, bir polimerin itici özellikleri test edilen bakteri türleri arasında önemli ölçüde farklılık gösterir. Bu, farklı türler arasındaki bağlanma mekanizmaları arasındaki geniş farklılıkları yansıtır. Düşük bağlayıcı polimerler, agaroz ile karşılaştırılarak kolayca tanımlanır.

Yüksek bağlayıcı polimerlerin bir dizide tanımlanması muhtemeldir ve sonraki deneyler için pozitif kontroller olarak kullanılabilir. DAPI kanalında oto-floresans göstermeyen polimerler için, spot görüntülerin kalitatif karşılaştırması görsel olarak yapılabilir. Tanımlanan 22 uygun polimerin bakteri itici özelliklerini doğrulamak için daha geniş yüzeylerin kaplanmasını test etmek için ölçek büyütme deneyleri yapıldı.

Burada gösterilenler, SEM tarafından analiz edildiği gibi cam kaplama astarlarını kaplamak için kullanılan en iyi performans gösteren numunelerdir. Bu şekiller, konfokal mikroskopi ve SEM ile analiz edilen kateter dilimlerini göstermektedir. Her iki mikroskobik yöntem de yüzeyde doğrudan hücre sayımlarına izin verme avantajına sahiptir ve hücre bağlanmasındaki azalma kolayca görülebildiği için kesin veriler sağlar.

Bu prosedürü takiben, bakteri bağlanması üzerindeki etkilerini belirlemek için serum veya kan bileşenleri test edilebilir. Polimer kaplamaların klinik kullanım potansiyelini değerlendirmek için bir hayvan modeli kullanılabilir. Kimyasallar ve patojenik organizmalarla çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın.

Kişisel ve çevresel riskleri azaltmak için taşıma ve bertaraf sırasında gerekli kontroller yapılmalıdır.