Tıbbi Cihazlar Bakterilerin yüksek verimlilik Kimlik Savar Polimerler

Bu polimer mikro-dizi tekniğinin genel amacı, bakterilerin abiyotik yüzeylere tutunmasını modüle edebilen sentetik polimerleri belirlemektir. Bu yöntem, bakterilerin tıbbi cihazlara tutunmasını engelleyen basit ve maliyet etkin biyomalzemelerin keşfinde ilerlemeyi hızlandırmaya yardımcı olabilir. Tek tek malzemelerin test edildiği geleneksel biyomalzeme araştırmalarına kıyasla bu tekniğin temel avantajı, tek bir varlıkta yüzlerce polimeri eş zamanlı olarak tarayabilme yeteneğidir.

Başlamak için, metin protokolüne uygun olarak polimer çözeltilerini hazırlayın ve bunları 384 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına ekleyin. 48 satır ve 32 sütun şeklinde düzenlenmiş 1536 spottan oluşan, polimerlerin dörtlü setler halinde basılacağı bir rutin oluşturun; pinlerin temizlenmesine olanak sağlamak için yazıcının her bölümden sonra durdurulabilmesi amacıyla her seferinde 32 polimer çözeltisi basacak şekilde ayarlama yapın. Şimdi agaroza kaplı lamları platforma yerleştirin ve lamları konumunda tutmak için iyi bir vakum sızdırmazlığı sağlandığından emin olun.

Tüm pinlerin aynı yükseklikte olması için yazıcı kafasını ayarlamak amacıyla, kafayı manuel olarak bir lam üzerine indirin ve pinlerin aynı anda yukarı hareket ettiğini doğrulayın. Kuyucuklu plakayı, A1 kuyucuğu tutucunun sağ üst köşesine gelecek şekilde plaka tutucuya yerleştirin ve plakanın sıkıca sabitlendiğinden emin olun. İstendiğinde, lamın ve kuyucuklu plakanın konumda olduğunu doğrulayın.

Pinlerin bölümler arasında temizlenmesine olanak tanıyarak, her seferinde tek bir bölüm yazdırın. Ardından, pinleri iyice temizlemek için asetona batırılmış bir kağıt havlu kullanın. Pinlerin tamamen kuruduğundan emin olmak için ardından kuru kağıt mendil ile kurulayın.

Mikrodiziler tamamen basıldığında, onları bir lam tutucuya yerleştirin ve polimer spotlardaki N&P'yi uzaklaştırmak için kurutma amacıyla 40 degrees celsius'ye ayarlanmış bir vakum fırınına aktarın. Ardından, plakaları sterilize etmek için 30 dakika boyunca UV ışığı kullanın. Lamlara bakteri inokülasyonu yapmadan önce, metin protokolüne uygun olarak arka plan floresans ölçümü yapın.

Metin protokolüne uygun olarak, mikro diziler için kültürleme ve inokülum hazırlama işlemlerini tamamladıktan sonra, UV sterilize edilmiş polimer mikro dizileri dikdörtgen dört kuyucuklu plakalara yerleştirin ve altı mililitre karışık bakteri kültürü ekleyin. Plakaları 37 °C'de, hafif ajitasyon ile beş gün boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, mikro dizileri PBS kullanarak nazikçe iki kez durulayın.

Ardından, PBS içerisinde mililitrede bir mikrogram DAPI ekleyin ve 30 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, mikro dizileri taze bir dört kuyucuklu plakaya aktarın, mikro dizileri PBS ile kaplayın ve ardından nazikçe çalkalayın. Sonra PBS'yi bir kez değiştirin ve yıkama işlemini tekrarlayın.

Durulamanın ardından, mikro dizileri hava akımı altında kurutun, ardından sızdırmazlık filmi uygulayın ve mikro dizi lamlarına cam kapatma lamlarını sabitleyin. Yapıştırıcı kuruduğunda, dış yüzeyi sterilize etmek için %70 etanol kullanın. 20x objektif ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanarak, her bir polimer noktası için parlak alan ve strappy kanallarında tekil görüntüler yakalayın.

Lamel kaplamalarını polimerlerle kaplamak için, tetrahidrofüran veya başka bir uygun çözücü içinde HIT polimer çözeltileri hazırlayın. Bir spin coater kullanarak, uygun boyuttaki dairesel cam lamel kaplamalarını polimer çözeltileriyle 2000 RPM hızda on saniye boyunca kaplayın. Kaplanmış lamel kaplamalarını bir konveksiyonlu fırında 40 °C'de gece boyunca kurutun.

Bakterilerle ekim yapmadan önce, lamelleri sterilize etmek için 30 dakika boyunca UV ışığı kullanın. UV ile sterilize edilmiş lamelleri standart bir 12 veya 24 kuyucuklu plakaya yerleştirin ve bu videonun önceki kısımlarında gösterildiği gibi bakterilerle inkübe edin. İnkübasyonu takiben, kaplanmış lamelleri yıkamak için iki kez 0,1 molar kakodilat tamponu kullanın ve ardından %2,5 ağırlık/hacim glutaraldehit ve 0,1 molar kakodilat tamponu ile örnekleri iki saat boyunca sabitleyin.

Lamelleri %1 osmiyum tetroksit ile oda sıcaklığında bir saat boyunca fiksleyin. Ardından, her konsantrasyonda 30 dakika bekleyerek bir etanol serisi ileydehidre edin. Son olarak, bir sputter kaplama cihazı ve %60 altın - %40 platin alaşımı karışımı kullanarak, 30 miliamper akım ve 0,75 torr vakum altında örnekleri kaplayın.

SEM ile görüntüler alındıktan sonra, polimerlerin bakteriyel bağlanma veya itme yeteneklerini doğrulamak için kaplamasız lamellerin görüntüleri ile agaroz veya HIT polimerleri ile kaplanmış olanların görüntülerini görsel olarak karşılaştırın. Kateterin uç bölmesiyle uyumluluğunu ve HIT polimerini çözme yeteneklerini değerlendirmek amacıyla çeşitli çözücüleri test etmek için, kateter parçalarını çözücülere daldırın ve kateterin bütünlüğünü ve çözücünün berraklığını görsel olarak değerlendirmeden önce 12 saat boyunca inkübe edin. Kateterler üzerindeki bakteriyel tutunmayı SEM ile analiz etmek için, asetonda %10'luk polimer çözeltisi hazırlayın.

Kateterin kesilmiş parçasını tutmak için 200 µL'lik bir mikropipet ucunu parçanın orta kısmına bastırın ve parçayı yaklaşık 30 saniye boyunca polimer çözeltisine batırın. Kaplanmış parçayı ortam koşullarında 30 dakika boyunca kurutun, ardından kateter parçasını tekrar polimer çözeltisine daldırarak ikinci bir kaplama uygulayın ve ortam koşullarında gece boyunca kurutun. Kaplanmış ve kaplanmamış kateter parçalarını metin protokolüne göre inoküle edilmiş LB içerisinde inkübe ettikten sonra, kateterleri yıkamak için 1 mL PBS kullanın.

Ardından, bakterileri 30 dakika boyunca sabitlemek için PBS içinde %10 paraformaldehit kullanın. PBS ile yıkamanın ardından, kateter parçaları üzerindeki bakterileri boyamak için 20 dakika boyunca DAPI kullanın. Daha sonra bir mililitre PBS ile yıkayın.

Odacık içindeki örneklerin düzenini gözlemleyin. Aşağıdaki ayarları kullanarak kateter parçalarının konfokal görüntülerini alın. Kateterin 100 mikrometer uzunluğu boyunca 50 görüntünün z-yığınlamasıyla (z-stacking) konfokal görüntülemeyi tamamlayın.

UV işlemi ve bakterilerle inkübasyonun ardından, parçaları iki kez yıkamak için bir mililitre PBS kullanın ve ardından 30 dakika boyunca PBS içinde %10 formaldehit içeren 48 kuyucuklu plakalara aktarın. Numuneleri sabitledikten sonra, PBS ile bir yıkama daha gerçekleştirin ve oda sıcaklığında gece boyunca kurutun. Ardından, iletken karbon diskli stublara monte edin ve altın kaplama yapmak için bir sputter kaplayıcı kullanın.

Taramalı elektron mikroskobu kullanılarak görüntüleme öncesi. Bu şekil, mikroarray analizi ile belirlenen, bakterilerin bir dizi polimere tutunmasını göstermektedir. Polimer olmadan basılan noktalar negatif kontrol olarak işlev görür; çünkü agaroz bakteriyel bağlanmaya güçlü bir şekilde direnç gösterir ve bu nedenle floresans çok düşüktür.

Sergilenen polimerler alaşım bağlayıcıdır, ancak çoğu durumda bir polimerin itici özellikleri test edilen bakteriyel türler arasında önemli ölçüde farklılık gösterir. Bu durum, farklı türler arasındaki tutunma mekanizmalarındaki geniş farkları yansıtmaktadır. Düşük bağlayıcı polimerler, agaroz ile karşılaştırılarak kolayca tanımlanabilir.

Yüksek bağlama kapasiteli polimerlerin bir dizide tanımlanması muhtemeldir ve bunlar sonraki deneyler için pozitif kontroller olarak kullanılabilir. DAPI kanalında oto-floresan göstermeyen polimerler için nokta görüntülerinin kalitatif karşılaştırması görsel olarak yapılabilir. Tanımlanan 22 uygun polimerin bakteri itici özelliklerini doğrulamak amacıyla, daha geniş yüzeylerin kaplanmasını test eden ölçek büyütme deneyleri gerçekleştirilmiştir.

Burada, SEM ile analiz edildiği üzere cam lamelleri kaplamak için kullanılan en iyi performans gösteren örnekler sunulmuştur. Bu şekiller, konfokal mikroskopi ve SEM ile analiz edilen kateter kesitlerini göstermektedir. Her iki mikroskobik yöntemin de sağladığı avantaj, yüzeyde doğrudan hücre sayımına izin vererek hücre tutunmasındaki azalmanın kolayca görülebilir olması sayesinde kesin veriler sunmasıdır.

Bu prosedürün ardından, bakteriyel bağlanma üzerindeki etkilerini belirlemek için serum veya kan bileşenleri test edilebilir. Polimer kaplamaların klinik kullanım potansiyelini değerlendirmek için bir hayvan modeli kullanılabilir. Kimyasallar ve patojenik organizmalarla çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın.

Kişisel ve çevresel riskleri azaltmak için taşıma ve imha sırasında gerekli kontroller uygulanmalıdır.