Name: Oligonükleotid yönelik elüsyon kullanılarak Hücreler Aynı Kökenli RNA-protein kompleksleri izolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Öğrenin, RNA immunoprecipitation yöntemiyle retroviral transkriptlerdeki RNA-protein komplekslerini izole etme ve karakterize etme tekniğini. DHX9/RNA helicase A içeren kompleksleri seçici olarak zenginleştirerek viral enfeksiyon mekanizmalarını anlayın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar minnetle NIH P50GM103297, P30CA100730 ve Kapsamlı Kanser P01CA16058 tarafından destek için minnettarım.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> tampon kompozisyonlar </td></tr><tr><td> Yıkama Tamponu: </td></tr><tr><td> 50 mM Tris-HCI, pH 7.4 </td></tr><tr><td> 150 mM NaCI </td></tr><tr><td> 3 mM MgCI2 </td></tr><tr><td> Düşük tuz tamponu: </td></tr><tr><td> 20 mM Tris-HCI, pH 7.5 </td></tr><tr><td> 10 mM NaCI </td></tr><tr><td> 3 mM MgCI2 </td></tr><tr><td> 2 mM DTT </td></tr><tr><td> 1x proteaz inhibitör kokteyli EDTA&#39;sız </td></tr><tr><td> RNaz dışarı 5 ul / ml (RNaz inhibitörü) </td></tr><tr><td> Sitoplazmik Lizis Tampon: </td></tr><tr><td> 0.2 M sukroz </td></tr><tr><td> % 1.2 Triton X-100 </td></tr><tr><td> NETn-150 Yıkama Tamponu: </td></tr><tr><td> 20 mM Tris-HCI, pH 7.4 </td></tr><tr><td> 150 mMNaCI </td></tr><tr><td> % 0.5 NP-40 </td></tr><tr><td> 3 mM MgCI2 </td></tr><tr><td> % 10 Gliserol </td></tr><tr><td> Bağlama Tamponu: </td></tr><tr><td> 10 mM HEPES pH 7.6 </td></tr><tr><td> 40 mM KCI </td></tr><tr><td> 3 mM MgCI2 </td></tr><tr><td> 2 mM DTT </td></tr><tr><td> % 5 gliserol </td></tr></tbody></table> Tablo 2: Tampon kompozisyonlar. Hücreler ve bağlanma matrisinin hazırlanması 1. <ol><li> Kültür, 10 cm&#39;lik tabak alt izdiham (% 80) ile ilgi konusu bir hücre çizgisi. bir FLAG-etiketli NLS-MS2 kaplama proteininin bağımsız İmmüno için (PPI) 10 cm tabak kullanın. FLAG-epitop etiketi antiserumlar kullanılarak IP gerçekleştirin. FLAG-etiketli MS2 kılıf proteini plazmid ifade edilirken, hasat 20 peşin hücreler 24-48 saat transferinde. NOT: Belirli bir RNP nükleer veya sitoplazmadan zenginleştirilmiş olabilirBöyle bir sukroz degrade kesirleri olarak ic lizatları veya biyokimyasal-fraksiyone hazırlık. Ek bir negatif kontrol tesis paralel olmayan transfekte edilmiş hücrelerin lizatı hasat önerilir. </li><li> Transfer 1.7 ml mikrosantrifüj tüp protein G manyetik boncuk çamurunun IP başına 60 ul. </li><li> mikrosantrifüj tüpleri depolama çözümünden boncuk ayırmak için bir mıknatıs rafa yerleştirilir. </li><li> dikkatli bir mikropipet ile o kadar çizerek depolama çözümü çıkarın. </li><li> mıknatıs raftan borusunu sökün. </li><li> Yıkama ve 1 x yıkama tamponu 600 ul boncuk (boncuk 10 kez kullanılan hacim) dengelenmesi (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 3 mM MgCl2 ve 150 mM NaCI) ile 3 ve uç üzerinde uç döndürme Oda sıcaklığında dak. </li><li> mıknatıs rafa yerleştirilir ve yıkama tamponu çıkarın. </li><li> dengelenmiş pr 1x yıkama tamponu ve imüno FLAG antikoru 10 hacimleri (600 ul) ekleyinimmüno-çökeltilmesinin antikor konjügatı için en az 30 dakika boyunca, oda sıcaklığında ve döndürme ucu-üzerinde-uç (bir immünopresipitasyon üreticiler tarafından miktarına göre) otein G manyetik boncukları. Uygun bir antikor negatif kontrol olarak, ilgili izotip IgG kullanın. </li><li> boncuk toplamak ve süpernatant kaldırmak için mıknatıs rafa yerleştirilir. </li><li> Mıknatıs raf tüpü alınır ve oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 1 x yıkama tamponu ve dönme, 10 hacim (600 ul) ile antikor-eşlenik boncuklar yıkayın. İki kez bu adımı yineleyin. </li><li> mıknatıs rafa yerleştirilir ve yıkama tamponu çıkarın. </li></ol> 2. Hasat RNP NOT: Aşama 1.8 sonrasında inkübasyon süresi boyunca RNP hazırlayın. <ol><li> Aspirasyon ile hücrelerin kültür ortamı çıkarın ve buz soğukluğunda 1 x fosfat tamponlu tuzlu su içinde 1-5 ml (PBS) ile iki kez yıkama hücreleri. Islak çıkarmak için bir hücre kazıyıcı kullanın,4 ° C&#39;de 4 dakika boyunca 226 x g&#39;de santrifüj ile toplanmadan önce yapışmayan hücreler. </li><li> 3 mM MgCI2, 10 mM NaCI, 2 mM DTT, 1 x proteaz inhibitör kokteyli, EDTA-içermeyen ve 5 ul / ml buz gibi soğuk, düşük tuzlu tampon (20 mM Tris-HCI, pH 7.5 içinde 375 ul ekle RNaz hücre pelletine inhibitörü) ve 5 dakika buz üzerine yerleştirerek şişme sağlar. NOT: Hücre pelet büyüklüğüne göre düşük tuz tamponu hacmi Terzi. 10 cm plaka 1,2 x 10 6 hücre için tampon 375 ul yeterlidir. </li><li> Sitoplazmik hücre lizatı toplama, buz sıcaklığında lizis tamponu 125 ul (0.2 M sukroz /% 1.2 Triton X-100), ve daha sonra bir buz kovası önceden soğutulmuş bir Dounce homojenleştirici ile 10 vuruş yapar. NOT: Toplam hücre özü toplamak için, standart RIPA liziz tamponu nükleoplazmanın / kromatin çözündürülmesi için tavsiye edilir. </li><li> 1 dakika boyunca en yüksek hız (16.000 xg) bir mikrofüj Spin; Bu enkaz a süpernatant silecektirnd çekirdekler. </li><li> buz üzerinde olmuştur, yeni bir 1.7 ml mikrosantrifüj tüp süpernatant aktarın. Böyle Bradford Tahlil 23 olarak standart laboratuvar tercih edilen metot ile toplam protein konsantrasyonunu belirlemek. Bir Western blot analizi için, en azından% 10 bir kısım rezerve bir giriş kontrol olarak kullanılır. immüno-çökeltme için hemen hasat hücre lizatı kullanarak veya gelecekteki analiz için -80 ° C&#39;de saklayın. NOT: Bizim tecrübelerimize göre, bu örnekler saklanabilir ve bütünlüğü ödün vermeden immünopresipitasyon analizi için birkaç ay sonra kullanılır. </li></ol> 3. Immunoprecipitation <ol><li> Hedef antikor eşlenik boncuklar adım 2.5 belirlenen protein konsantrasyonu dayalı Hasat edilen hücre lizatının istenen hacmi, ekleyin. 1x yıkama tamponu kullanılarak, 600 ul kadar toplam hacmi getirmek ve oda sıcaklığında 90 dakika boyunca son aşırı ucunu döndürün. NOT: Bu süre oluşturmak için yeterlidirSpesifik-olmayan bağlanma en aza indirirken, yüksek afiniteli RNP kompleksleri sağlam bir izolasyon. Yukarıda da belirtildiği gibi, daha önce hazırlanmış boncuk-antikor kompleksleri ile inkübe ardından 1 x yıkama tamponu ile 1 ve: bir sükroz gradyanı kesirleri, en az 1 gibi alternatif RNP kaynaklarını seyreltilir. </li><li> inkübasyon 90 dakika sonra, boncuklar toplamak için mıknatıs raf IP tüp yerleştirin. flow-through olarak süpernatant saklıdır. NOT: Bu ilk akış yoluyla IP etkinliğini ölçmek için önemli bir kontrol örneğidir. Bir bağışıklık deneyi, bir IP verimliliğinin bir göstergesi, aynı zamanda incelenen etkileşimlerin spesifitesi sağlayacaktır. Aşağı analiz için bu süpernatant tutmak için tavsiye edilir. </li><li> 150 mM NaCI,, 3 mM MgCl2,% 0.5 NP40, buzla soğutulmuş NETn-150, yıkama tamponu (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 10 hacim (600 ul) ile RNP bağlı antikor-eşlenik boncuklar yıkayın Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca dönme altında,% 10 gliserol). adımı 3 kez tekrarlayın. NOT: Bu tampon lizis tamponu farklıdır ve etkili zayıf ya da spesifik olmayan dernekler azaltır. </li><li> Ve yedek% 10 Nihai yıkamayı takiben, buz soğukluğunda 1 x bağlayıcı tampon (40 mM KCI, 3 mM MgCl2,% 5 gliserol, 2 mM DTT, 10 mM HEPES, pH 7.6), 60 ul immobilize RNP kompleksleri tekrar süspansiyon Western blot ve RNA izolasyonu için% 20 immobilize karmaşık boncuk. </li></ol> 4. Elüsyon <ol><li> buz soğukluğunda 1 x bağlayıcı tampon ile 100 ul&#39;ye geri kalan hacim ayarlama ve 3 dakika boyunca 70 ° C&#39;de tüp ısıtın. </li><li> aynı kökenli RNA-protein kompleksleri ayırmak için, ilgi konusu RNA&#39;nın 3 &#39;sekansı, sınır tamamlayıcı olan bir ~ 30 nt DNA oligonükleotid ekleyebilir ve hafif sallanan, oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir (oligonükleotidin 100 nM yeterlidir). Not: oligonükleotid çalıştırma sitesi, bir exampl olarak kullanılan PCE yapının çeviri bitişik nükleotit kalıntısı elde etmek, anti-duyarlı olanBu protokol e. Uygun sekansı tamamlayıcı ~% 40 GC içeriğine tarafından sağlanır. hedef RNA&#39;nın asgari tamamlayıcı bölgeye verimli hibridizasyon için antisens oligonükleotidi tasarlayın. </li><li> tüpe RNaz H 5-10 adet ekleyin ve RNA RNA&#39;ya yapışacak şekilde 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe: DNA hibritidir. steril 1.7 ml mikrosantrifüj tüp süpernatantı aktarın; Bu örnek ilgi yakalanan RNP kompleksleri içerir. Not: aynı kökenli RNA erişilebilirlik bağlı olarak, Rnaz H tedavi iki veya daha fazla devre alt analizler için örnek zenginliğini artırmak için yararlı olabilir. </li><li> bilinen ilişkili proteinler ve RT qPCR ardından RNA izolasyonu için eluat% 20 bir Western blotta eluat% 20 kullanın. Geri kalan% 60 kütle spektrometresi için kullanılabilir ya da protein bileşenlerini tanımlamak için. </li><li> Buna paralel olarak, RNA izolasyonu ve RT-PCR analizi ile ayrılmış hücre lizatının bir kısım tabi. bu assessment bir RNP kompleksi içinde RNA zenginleşme bir gösterge sağlar. Not: RNase H ile bölünmesini immunuoprecipitated karmaşık RNP serbest etkili olduğunu tespit etmek için bir kontrol Western blot izole edilmiş bir protein preparatı kullanılması. </li></ol> 5. Protein elektroforezi ve Western Blot Analizi <ol><li> Standart laboratuar protokolüne göre SDS-PAGE ve bağışıklık beneklenme analizi, toplam numune konusu yaklaşık% 10-20. Not: Bu adım aşağı RNA analizinden önce, IP verimlilik ve özgüllüğü doğrulamak için hizmet vermektedir. Aynı zamanda, izole edilmiş RNP kompleksinin protein bileşiminin değerlendirilmesi için de kullanılabilir. </li></ol> Immünopresipitasyon RNA 6. Koleksiyonu Not: RNA izolasyonu tarif edilen protokol izlenerek Trizol yöntemi veya yapılabilir. <ol><li> oda t yeniden süspanse asit guanidinyum tiyosiyanat reaktif 750 ul toplam örnek yarısı ve inkübe5 dakika boyunca önceden yakalanan PCE-RNP komplekslerinden RNA ayıklanması için emperature. </li><li> tüpe kloroform 200 ul ekle, 10 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır ve 3 dakika süre ile, oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 16.000 x g&#39;de santrifüjden sonra, yeniden bir tüp içine, sulu fazı toplayın ve izopropanol eşit hacimde ekleyin. İyice karıştırın ve en azından 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. örnek glikol mavi 1 ul ekleyin ve gelecekteki bir tarihte etkili yağış veya işlenmek üzere dondurucuda -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 16,000 x g&#39;de santrifüjleyin tüpü. Dikkatle toplamak ve RNA pelet rahatsız etmeyecek şekilde süpernatant atın; Bir P-200 mikro pipet kullanımı, bu işlemi kolaylaştırmak için tavsiye edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 16,000 x g&#39;de, her tüp, girdap ve santrifüj tüpleri% 75 etanol içinde 500 ul ekle. Dikkatle toplamak ve adım 6.4 olarak süpernatant atın. Hava-RNaz içermeyen su, 100 ul 2-3 dakika ve tekrar süspansiyon pelet kurutulur. NOT: tabanda bir sorunu önlemek için zamanı pelet hava kurur uzatmak etmeyin. </li><li> bir RNA temizleme kolona RNA örnek 100 ul uygulayın. Üreticinin protokolü kullanarak işleyin. 3 aya kadar -80 ° C &#39;de RNaz içermeyen su ve mağaza 30 ul RNA Zehir. Not: Bu izole edilmiş RNA, RT-PCR, gerçek zamanlı (qPCR), mikrodizi ve RNA sıralaması ile alt baş analizi için de uygundur. RNP ve ilgi RNP izole edildiği verim bolluğu bağlı olarak, aynı lizat alt analizler için uygun yeterli bir RNA üretmek için IP iki veya daha fazla devre tabi tutulabilir. </li></ol> PCR ile cDNA 7. RNA ters transkripsiyon ve amplifikasyon <ol><li> manufa göre, yüksek kaliteli, ters transkriptaz (RT) ile rastgele bir primer tarafından ters transkripsiyon için, izole RNA Konucturer talimatları. </li><li> ilgi RNA yükseltmek için, RNase H ile bölünmesini dizisi içinde bir gen-spesifik antisens primer tasarımı. Antisens oligonükleotit, rasgele bir primer veya bir oligo-dT primeri benzer miktarlarda kullanarak (Malzeme tabloya bakınız). Not: Oligo-dT primeri ve poli-adenylated mRNA&#39;nın RT-PCR reaksiyonları için pozitif kontrol reaksiyonları sağlar. </li><li> Yedek cutoff tanımlar ve standart bir eğri oluşturmak için negatif kontrol lizat IP ve pozitif kontrol DNA numuneleri ile paralel olarak yapılan hazırlayıcı qPCR RT reaksiyonu (1 ul),% 5. hazırlayıcı qPCR BT değeri standart eğri aralığının dışında ise, üst üste 1 RT reaksiyonu sulandırmak: 5 dilüsyon ve adım 7.2 tekrarlayın. NOT: Bir RNA sıralanması ve kütle spektrometresi tekniği için, Ek Yöntem dosyasına bakın. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54391/Supplementary_method_File_Jove.docx" target="_blank">T tıklayınız</a>o Bu Ek Yöntem dosyasını görüntülemek. (Indirmek için sağ tıklatın.) </li></ol>

<ol><li>Bandziulis, R. J., Swanson, M. S., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+as+developmental+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins as developmental regulators.</a> Genes Dev. 3 (4), 431-437 (1989).</li>
<li>Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+RNA-binding+proteins+interact+with+functionally+related+sets+of+RNAs%2C+suggesting+an+extensive+regulatory+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system.</a> PLoS Biol. 6 (10), e255(2008).</li>
<li>Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+and+post-transcriptional+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation.</a> FEBS Lett. 582 (14), 1977-1986 (2008).</li>
<li>Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins%3A+modular+design+for+efficient+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Mol.Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins: modular design for efficient function.</a> Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).</li>
<li>Cochrane, A. W., McNally, M. T., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retrovirus+RNA+trafficking+granule%3A+from+birth+to+maturity%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">The retrovirus RNA trafficking granule: from birth to maturity.</a> Retrovirology. 3, 18(2006).</li>
<li>Hartman, T. R., Qian, S., Bolinger, C., Fernandez, S., Schoenberg, D. R., Boris-Lawrie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+helicase+A+is+necessary+for+translation+of+selected+messenger+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Struct.Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">RNA helicase A is necessary for translation of selected messenger RNAs.</a> Nat.Struct.Mol.Biol. 13 (6), 509-516 (2006).</li>
<li>Pullmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+turnover+and+translation+regulatory+RNA-binding+protein+expression+through+binding+to+cognate+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell.Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of turnover and translation regulatory RNA-binding protein expression through binding to cognate mRNAs.</a> Mol.Cell.Biol. 27 (18), 6265-6278 (2007).</li>
<li>Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+regulons%3A+coordination+of+post-transcriptional+events%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Genet%22%5BJournal%5D)">RNA regulons: coordination of post-transcriptional events.</a> Nat.Rev.Genet. 8 (7), 533-543 (2007).</li>
<li>Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+birth+to+death%3A+the+complex+lives+of+eukaryotic+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">From birth to death: the complex lives of eukaryotic mRNAs.</a> Science. 309 (5740), 1514-1518 (2005).</li>
<li>Hassan, M. Q., Gordon, J. A., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, J. L., Stein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonucleoprotein+immunoprecipitation+%28RNP-IP%29%3A+a+direct+in+vivo+analysis+of+microRNA-targets%5BTitle%5D)+AND+%22J.Cell.Biochem%22%5BJournal%5D)">Ribonucleoprotein immunoprecipitation (RNP-IP): a direct in vivo analysis of microRNA-targets.</a> J.Cell.Biochem. 110 (4), 817-822 (2010).</li>
<li>Selth, L. A., Close, P., Svejstrup, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+RNA-protein+interactions+in+vivo+by+RNA+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Studying RNA-protein interactions in vivo by RNA immunoprecipitation.</a> Methods Mol.Biol. 791, 253-264 (2011).</li>
<li>Singh, D., Boeras, I., Singh, G., Boris-Lawrie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Cognate+Cellular+and+Viral+Ribonucleoprotein+Complexes+of+HIV-1+RNA+Applicable+to+Proteomic+Discovery+and+Molecular+Investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of Cognate Cellular and Viral Ribonucleoprotein Complexes of HIV-1 RNA Applicable to Proteomic Discovery and Molecular Investigations.</a> Methods Mol.Biol. 1354, 133-146 (2016).</li>
<li>Stake, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+and+two+avian+retroviral+5%27+untranslated+regions+bind+orthologous+human+and+chicken+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 and two avian retroviral 5' untranslated regions bind orthologous human and chicken RNA binding proteins.</a> Virology. 486, 307-320 (2015).</li>
<li>Sung, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+analysis+using+microarray+identified+complex+signaling+pathways+modulated+by+hypoxia+in+nasopharyngeal+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression analysis using microarray identified complex signaling pathways modulated by hypoxia in nasopharyngeal carcinoma.</a> Cancer Lett. 253 (1), 74-88 (2007).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat.Rev.Genet. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Michlewski, G., Caceres, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNase-assisted+RNA+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RNase-assisted RNA chromatography.</a> RNA. 16 (8), 1673-1678 (2010).</li>
<li>Tacheny, A., Dieu, M., Arnould, T., Renard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+identification+of+proteins+interacting+with+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based identification of proteins interacting with nucleic acids.</a> J. Proteomics. 94, 89-109 (2013).</li>
<li>Duan, R., Sharma, S., Xia, Q., Garber, K., Jin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+understanding+RNA-mediated+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J.Genet.Genomics%22%5BJournal%5D)">Towards understanding RNA-mediated neurological disorders.</a> J.Genet.Genomics. 41 (9), 473-484 (2014).</li>
<li>Butsch, M., Hull, S., Wang, Y., Roberts, T. M., Boris-Lawrie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+5%27+RNA+terminus+of+spleen+necrosis+virus+contains+a+novel+posttranscriptional+control+element+that+facilitates+human+immunodeficiency+virus+Rev%2FRRE-independent+Gag+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The 5' RNA terminus of spleen necrosis virus contains a novel posttranscriptional control element that facilitates human immunodeficiency virus Rev/RRE-independent Gag production.</a> J. Virol. 73 (6), 4847-4855 (1999).</li>
<li>Bolinger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+helicase+A+interacts+with+divergent+lymphotropic+retroviruses+and+promotes+translation+of+human+T-cell+leukemia+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RNA helicase A interacts with divergent lymphotropic retroviruses and promotes translation of human T-cell leukemia virus type 1.</a> Nucleic Acids Res. 35 (8), 2629-2642 (2007).</li>
<li>Bolinger, C., Sharma, A., Singh, D., Yu, L., Boris-Lawrie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+helicase+A+modulates+translation+of+HIV-1+and+infectivity+of+progeny+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RNA helicase A modulates translation of HIV-1 and infectivity of progeny virions.</a> Nucleic Acids Res. 38 (5), 1686-1696 (2010).</li>
<li>Lee, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+the+DHX9+helicase+induces+premature+senescence+in+human+diploid+fibroblasts+in+a+p53-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">Suppression of the DHX9 helicase induces premature senescence in human diploid fibroblasts in a p53-dependent manner.</a> J.Biol.Chem. 289 (33), 22798-22814 (2014).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal.Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Glenn, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+protein+samples+for+mass+spectrometry+and+N-terminal+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Preparation of protein samples for mass spectrometry and N-terminal sequencing.</a> Methods Enzymol. 536, 27-44 (2014).</li>
<li>Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIP-Chip%3A+the+isolation+and+identification+of+mRNAs%2C+microRNAs+and+protein+components+of+ribonucleoprotein+complexes+from+cell+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Protoc%22%5BJournal%5D)">RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts.</a> Nat.Protoc. 1 (1), 302-307 (2006).</li>
<li>Ranji, A., Shkriabai, N., Kvaratskhelia, M., Musier-Forsyth, K., Boris-Lawrie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+double-stranded+RNA-binding+domains+of+RNA+helicase+A+are+necessary+for+selective+recognition+and+translation+of+complex+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">Features of double-stranded RNA-binding domains of RNA helicase A are necessary for selective recognition and translation of complex mRNAs.</a> J.Biol.Chem. 286 (7), 5328-5337 (2011).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada açıklanan RNP izolasyon ve aynı kökenli RNA tespiti stratejisi belirli bir RNA-protein etkileşimini inceleyen ve eş düzenleyen aday proteinleri keşfetmek hücreler belirli bir RNP seçici bir araçtır. RNP izole yapmak için oligonükleotid yönlendirilmiş RNase H ile bölünmesini kullanmanın avantajı yakalamak ve özellikle ilgi cis-hareket eden RNA elemanına aşağı bağlanmış heterojen RNP fazla RNP cis-hareket eden RNA eleman analizi yeteneğidir. Belirli bir RNP bir soydaş RNA bolluğu RNaz H...

Transkripsiyon sonrası gen tam olarak çekirdeğin DNA transkripsiyonu ile başlayan, düzenlenir. RNA proteinleri (RBPS) bağlayıcı tarafından kontrol mRNA biogenesis ve metabolizma RNA metabolizması 1-3 ilerlemesi sırasında bir alt tabaka öncüsü mRNA ile ayırmak doçent ve son derece dinamik Ribonükleoprotein parçacıklar (RNP), ortaya çıkar. RNP bileşenleri dinamik değişiklikler mRNA transkripsiyon sonrası kaderini etkileyen ve primer transkript, nükleer kaçakçılığı ve lokalizasyonu, çeviri için mRNA şablon olarak kendi faaliyet ve olgun mRNA nihai ciro işlenmesi sırasında kalite güvence sağlamak. Çok sayıda protein RNA tanıma motifinin (RRM) dahil olmak üzere korunmuş amino asit etki, sayesinde RBPS olarak tanımlanır, çift kollu bir RNA bağlama alanı (RDB) ve temel artıklarının kısımlarının (örneğin, arginin, lizin, glisin) 4. RBPS rutin vardırimmünopresipitasyon stratejileri ile izole ve soydaş RNA&#39;lar belirlemek için taranmaktadır. Bazı RBPS RNA regulonlarının 5-8 olarak tanımlanan fonksiyonel ilişkili olan önceden mRNA eş düzenler. Bu RBPS kendi aynı kökenli mRNA&#39;lar, ve bazen de kodlayıcı olmayan RNA bileşim içinde değişebilir katalitik RNP oluşturur; kendi benzersiz bağlı ilişkili faktörler, çeşitli kombinasyonları, aynı zamanda bunların etkileşimleri 9 zamansal dizisi, yer ve süresi için. RNA immünopresipitasyon (RIP) hücrelerden RNP izole etmek ve sekans analizi 10-13 kullanarak ilişkili transkript tanımlamak için güçlü bir tekniktir. Aday hareketle genom çapında için tarama bir mikro-dizi analizi 14 ya da yüksek verimlilik sıralaması (RNAseq) 15 ile kombine RIP ile mümkündür. Bunlar, birlikte-çökeltme antikor 16 yeterince zengindirler ve ayrılabilir Aynı şekilde, birlikte-çökeltme proteinler, kütle spektrometresi ile tespit edilebilir,17. yaklaşım, bitki hücreleri, mantar, virüs ve bakteri çözünebilir lizatları olarak değişebilir, ancak Burada, kültürlenmiş insan hücrelerinden belirli bir aynı kökenli RNA RNP bileşenlerini izole etmek için bir yöntem arayabilir. Şekil 1 &#39;de özetlendiği gibi, malzemenin aşağı akış analiz, aday belirlenmesi ve kabul immunoblotting, kütle spektrometrisi, biyokimyasal enzimatik tahlil, RT-qPCR, mikrodizi ve RNAseq bulunmaktadır. Transkripsiyon sonrası seviyede gene ekspresyonunu kontrol etmede RNP temel rolü göz önüne alındığında, bileşen RBPS veya erişilebilirlik ekspresyonunda değişiklikler RNA&#39;lar hücre için zararlı olabilir ve nörolojik hastalıkları 18 de dahil olmak üzere hastalıkların çeşitli türleri ile ilişkilidir, aynı soydan gelen. DHX9 / RNA helikaz A (RHA), hücresel ve retroviral kökenli 6 seçilmiş mRNA&#39;ların çevrilmesinin için gereklidir. Bu aynı kökenli RNA&#39;lar olan yapısal olarak ilgili, cis etkili elemanlar sergileyen kendiTranskripsiyon sonrası kontrol elemanının (PCE) 19 olarak belirlenmiş 5 &#39;UTR,. RHA-PCE aktivitesi, HIV-1 de dahil olmak üzere pek çok retrovirüsler, etkin kap bağımlı çeviri için gerekli olan ve JUND 6,20,21, büyüme düzenleyici genlerin. Önemli bir gen (dhx9) tarafından kodlanır, RHA hücre çoğalması ve düşük-regülasyona karşı gerekli hücre canlılığı 22 ortadan kaldırır. RHA-PCE RNP moleküler analiz RHA-PCE etkinliği hücre çoğalmasını kontrol etmek için neden gerekli olduğunu anlamak için önemli bir adımdır. Kararlı durumda ya da hücrenin fizyolojik pertürbasyon üzerine RHA-PCE RNP bileşenlerinin hassas karakterizasyonu aşağı analiz için yeterli bolluk içinde RHA-PCE RNP seçici zenginleştirme ve yakalama gerektirir. Burada, retroviral PCEgag RNA açık okuma çerçevesinde MS2 kaplama proteininin (CP) için sis etkili RNA bağlanma sitenin 6 kopya ile etiketlenmiş. MS2 kılıf proteini ekzo edildigenously birlikte ifade plazmid transfeksiyon ile PCEgag RNA ile büyüyen hücrelerde RNP Montajı kolaylaştırmak için. Aynı kökenli MS2-etiketli PCEgag RNA MS2 kaplama proteini içeren RNP hücre özütü immunoprecipitatesi manyetik boncuk (Şekil 2a) üzerinde alınmıştır. seçici PCE bağlı RNP bileşenleri elde etmek için, immobilize RNP RNase H aktivitesi için alt-tabaka olan bir RNA-DNA melezi oluşturan PCE distal dizilerine tamamlayıcı olan bir oligonükleotid ile inkübe edildi. PCE çevrilmemiş bölge 5 &#39;5&#39; ucu &#39;konumlandırılmış olduğundan, oligonükleotid retroviral başlangıç ​​sitesine (gag start kodonu) bitişik RNA dizilerine tamamlayıcı. yıkama sıvısı olarak toplandı immobilize RNP, serbest 5 &#39;UTR kompleksi kodon gag başlangıcına yakın RNaz H bölünme. Daha sonra, örnek captu onaylamak için PCEgag ve SDS PAGE ve immunoblot yakalamayı teyit etmek için RT-PCR ile değerlendirildiHedef MS2 kılıf proteini yeniden. PCE ilişkili RNA bağlayıcı proteinin doğrulama DHX9 / RNA helikaz A, sonra gerçekleştirildi.

<table><tbody><tr><td>Dynabeads Protein A</td><td>Invitrogen</td><td>10002D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG antikoru</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG antikoru</td><td>Sigma</td><td>F7425</td><td></td></tr><tr><td>Anti-RHA antikoru</td><td>Vaxron</td><td>PA-001</td><td></td></tr><tr><td>TRizol LS reaktifi</td><td>Yaşam teknolojisi</td><td>10296-028</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>Ambion</td><td>AM2292</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26184</td><td></td></tr><tr><td>RNaeasy temizleme sütunu</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>Omniscript ters transkriptaz</td><td>Qiagen</td><td>205113</td><td></td></tr><tr><td>RNase Out</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyli</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>98379</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Fisher Scientific</td><td>17904</td><td></td></tr><tr><td>Rastgele heksamer primerleri</td><td>Invitrogen</td><td>N8080127</td><td></td></tr><tr><td>Oligo-dT primerleri</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>AM5730G</tr><tr><td>PCR primerleri</td><td>IDT</td><td></td><td>Genine özgü primerler&nbsp; </td></tr><tr><td>RNase H aracılı bölünme</td><td>IDT</td><td></td> için PCR amplifikasyonu Oligonükleotid <td>Hedef RNA Tripsin için anti-sens astar</td></tr><tr><td></td><td>Gibco Life teknolojisi</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>DMEM doku kültürü ortamı</td><td>Gibco Life teknolojisi</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Gibco Life teknolojisi</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Tris tabanı</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>S642-212</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher Scientific</td><td>R0862</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-212</td><td></td></tr><tr><td>Nitroselüloz membran</td><td>Bio-Rad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik stand</td><td></td><td></td><td>1.7 ml mikro santrifüj tüpü tutma</td></tr><tr><td>Laminer başlık</td><td></td><td></td><td>Hayvan doku kültürü için</td></tr><tr><td>CO2 inkübatörü</td><td></td><td></td><td>Hayvan doku kültürü için</td></tr><tr><td>Protein jel aparatı</td><td></td><td></td><td>Protein numunesi ayırma</td></tr><tr><td>Protein transfer aparatı</td><td></td><td></td><td>Protein numune transferi</td></tr><tr><td>Kullanıma hazır protein jelleri (%4-15)</td><td></td><td></td><td>Protein numunesi ayırma Masa</td></tr><tr><td>üstü santrifüj</td><td></td><td></td><td>Numuneyi aşağı doğru pelet Masa</td></tr><tr><td>üstü döndürücü</td><td></td><td></td><td>Numuneyi uçtan uca karıştırın</td></tr><tr><td>Vorteks</td><td></td><td></td><td>Numuneleri karıştırın</td></tr></tbody></table>

oligonükleotid yönelik elüsyon kullanılarak hücreler aynı kökenli rna-protein kompleksleri izolasyonu

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Ribonükleoprotein parçacıkları, RNA bağlayıcı proteinlerin farklı kombinasyonları yoluyla tüm mRNA'ların biyogenezini ve transkripsiyon sonrası regülasyonunu yönlendirir. Pozisyona bağlı, cis-etkili RNA elementlerinden ve RNA bağlayıcı proteinlerin benzersiz kombinasyonlarından oluşurlar. Spesifik bir RNP'nin bileşimini tanımlamak, gen regülasyonunun temel bir anlayışını elde etmek için esastır. Seçilmiş bir RNP'nin izolasyonu, samanlıkta iğne bulmaya benzer. Burada, asenkron, transfekte edilmiş hücrelerde seçilmiş bir mRNA'nın 5' çevrilmemiş bölgesinde ilişkili RNP'leri izole etmek için bir yaklaşım gösteriyoruz. Bu akraba RNP'nin, seçilmiş virüslerin ve hücresel stres-tepki genlerinin translasyonu için gerekli olduğu gösterilmiştir.
Gösterilen RNA-protein ko-çökeltme protokolü, proteomik analizler, immünoblotlar veya uygun biyokimyasal tanımlama testleri yoluyla protein bileşenlerinin aşağı akış analizi için uygundur. Bu deneysel protokol, DHX9/RNA helikaz A'nın, aynı kökenli retroviral RNA'nın 5' terminalinde zenginleştirildiğini ve hücre stresi ile ilişkili huR ve junD aynı kökenli mRNA'lar ile ilişkisinin tanımlanması için ön bilgi sağladığını göstermektedir.

Önceki RIP sonuçları retroviral gag RNA'lar tespit ve co-çökelti hücresel RNA'lar DHX9 / RHA ile, HIV-1 6, JUND 6 ve Hur (Fritz ve Boris-Lawrie, yayınlanmamış) de dahil olmak üzere seçildi. Retroviral 5 'UTR çekirdekte DHX9 / RHA ile birlikte çökeltmek için ve poliribozomların ilgili sitoplazmada bir arada izole etmek için ortaya konmuştur. Bu benzersiz BDT -Oyunculuk transkripsiyon sonrası kontrol elemanının (PCE) 6 olarak tanımlanır. çoğalan hü...

Bu el yazması, ökaryotik hücrelerde oluşan seçilmiş akraba RNP'leri spesifik bir oligonükleotid yönelimli zenginleştirme yoluyla izole etmek için bir yaklaşımı açıklar. Bu yaklaşımın uygulanabilirliğini, DHX9/RNA helikaz A'dan oluşan retroviral 5' çevrilmemiş bölgeye bağlı bir akraba RNP'yi izole ederek gösteriyoruz.

Oligonükleotid yönelik elüsyon kullanılarak Hücreler Aynı Kökenli RNA-protein kompleksleri izolasyonu

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Bu RNA immünopresipitasyon tekniğinin genel amacı, ökaryotik hücrelerde oluşan endojen RNA protein komplekslerini spesifik bir oligonükleotid yönelimli zenginleştirme yoluyla seçici olarak izole etmek ve karakterize etmektir. Bu yöntem, gen ekspresyonunu düzenlemek için bir retroviral transkriptin beş asal UTR'sini tanımlayan RNA bağlayıcı proteinlerin bileşimi gibi transkripsiyon sonrası kontrol alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, bir araştırmacının, RNP'nin aşağı akışının daha küresel bir analizini yapma olasılığını korurken, ilgilenilen belirli bir RNA protein kompleksini seçici olarak izole etmesine ve karakterize etmesine izin vermesidir.Bu tekniğin sonuçları, viral enfeksiyonların ve çok sayıda hücresel hastalığın temel olarak anlaşılmasına kadar uzanır. Ve gen ekspresyonunun transkripsiyon sonrası kontrol mekanizmaları hakkında önemli bilgiler sağlar. Bu, yeni uygulanabilir ilaç hedefleri anlamına gelebilir.Hücreleri kültürledikten ve metin protokolüne göre FLAG etiketli bir proteinin immünopresipitasyonunu gerçekleştirdikten sonra, pro-TG manyetik boncuk bulamacının IP'si başına 60 mikrolitreyi 1.7 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüpü manyetik bir rafa yerleştirin ve dikkatlice pipetleyerek saklama solüsyonunu çıkarın. Ardından tüpü raftan çıkarın.600 mikrolitre 1x yıkama tamponu ekleyin. Ve boncukları yıkamak ve dengelemek için tüpü oda sıcaklığında üç dakika boyunca bir uçtan uca döndürücüye yerleştirin. Tüpü manyetik rafa yerleştirin ve yıkama tamponunu çıkarın.Ardından 10 hacim taze 1x yıkama tamponu ekleyin. Dengelenmiş pro-TG manyetik boncuklara immünopupresif FLAG antikoru ekleyin. Daha sonra, immünopresipitasyon yapan antikoru konjuge etmek için tüpü oda sıcaklığında en az 30 dakika döndürün.Tüpü mıknatısın üzerine yerleştirin ve süpernatanı çıkarın. Daha sonra tüpü mıknatıstan çıkarın ve boncuklara 1x yıkama tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında üç dakika döndürün. Yıkama adımını iki kez tekrarlayın ve son tamponu çıkarın.Kültür ortamını aspirasyon yoluyla hücrelerden çıkarın ve hücreleri iki kez yıkamak için 1.5 mililitre buz gibi soğuk PBS kullanın. Bir hücre kazıyıcı ile ıslak, yapışkan hücreleri yerinden çıkarın. Hücre süspansiyonunu taze tüplere pipetleyin ve ardından kültürü dört dakika boyunca dört santigrat derecede 226 kez G'de santrifüjleyin.Hücre peletine 375 mikrolitre buz gibi düşük tuzlu tampon ekleyin ve şişmeyi sağlamak için numuneyi beş dakika buz üzerinde inkübe edin. Erken mekanik bozulma olmadan tam daldırma ve şişmeyi sağlamak için düşük tuzlu lizis tamponuna hücre peletini eklerken ve yeniden süspanse ederken dikkatli olmak önemlidir. Sitoplazmik hücre lizatını toplamak için 125 mikrolitre buz gibi soğuk lizis tamponu ekleyin ve ardından on vuruş gerçekleştirmek için önceden soğutulmuş bir Dounce homojenizatör kullanın.Plazma zarı lizizini ve salınan sitoplazmik lizatın kontaminantlarını sağlamak için yeterli kuvvetle homojenize edin. Ancak mekanik bozulmayı aşırı uzatmamaya ve nükleer kontaminasyon, RNA protein kompleksinin bozulması veya salınan homojenatı bir dakika boyunca en yüksek hızda bir mikrofüje içinde döndürme riskini almamaya dikkat edin. Ardından süpernatanı buz üzerinde bulunan 1.7 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.Toplam protein konsantrasyonunu belirleyin. Giriş kontrolü olarak kullanılmak üzere western blot analizi için% 10 ayırın. İmmünopresipitasyonu gerçekleştirmek için, istenen hacimde hasat edilmiş hücre lizatını hedef antikor konjuge boncuklarına ekleyin.1x yıkama tamponu kullanarak toplam hacmi 600 mikrolitreye çıkarın ve numuneyi oda sıcaklığında döndürün. 90 dakikalık inkübasyondan sonra, boncukları toplamak için IP tüpünü mıknatıs rafına yerleştirin. Sonra süpernatanı toplayın ve akış olarak ayırın.Daha sonra, RNP bağlı, antikor konjuge boncuklara 10 hacim buz gibi soğuk NETN 150 yıkama tamponu ekleyin ve numuneyi oda sıcaklığında üç dakika döndürün. İmmobilize RNP komplekslerini metin protokolüne göre 1x bağlama tamponunda yeniden askıya aldıktan sonra, kalan hacmi 100 mikrolitre buz gibi soğuk 1x bağlama tamponunda ayarlayın. Ve tüpü üç dakika boyunca 70 santigrat derecede ısıtın.Aynı kökenli RNA protein komplekslerini izole etmek için, ilgilenilen RNA'nın üç asal dizi sınırını tamamlayan yaklaşık 30 nükleotidli bir DNA oligosu ekleyin. Ve hafifçe sallanarak oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Tüpe beş ila on birim veya RNase H ekleyin ve RNA'yı RNA DNA hibritinden ayırmak için numuneyi oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.Daha sonra, yakalanan RNP komplekslerini içeren süpernatanı, steril bir 1.7 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. İmmünopresipite edilmiş RNA'yı toplamak için, yakalanan RNA komplekslerinin toplam örneğinin yarısını 750 mikrolitre asit guanidinyum tiyosiyanat reaktifi içinde yeniden askıya alın. Tüpe 200 mikrolitre kloroform ekleyin, 10 saniye kuvvetlice çalkalayın, oda sıcaklığında üç dakika inkübe edin.Santrifüjlemeden sonra, sulu fazı taze bir tüpte toplayın ve eşit hacimde izopropanol ekleyin. İyice karıştırın ve numuneyi oda sıcaklığında en az on dakika inkübe edin. Numuneye bir mikrolitre glikol mavisi ekleyin ve gelecekteki bir tarihte verimli çökeltme veya işleme için eksi 20 santigrat derecede saklayın.Tüpü on dakika boyunca dört santigrat derecede 16.000 kez G'de santrifüjleyin. RNA peletini rahatsız etmemek için süpernatanı dikkatlice toplamak ve atmak için bir P200 mikropipet kullanın. Her tüpe 500 mikrolitre% 75 etanol ekleyin.Tüpleri beş dakika boyunca vorteksleyin ve santrifüjleyin. Süpernatanı az önce gösterildiği gibi dikkatlice toplayın ve atın. Peleti iki ila üç dakika havayla kurutun ve yeniden süspanse etmek için 100 mikrolitre RNase içermeyen su kullanın.100 mikrolitre RNA örneğini bir RNA temizleme kolonuna uygulayın. Ve üretici protokolüne göre işleyin. Son olarak, RNA'yı 30 mikrolitre RNaz içermeyen suda elüte edin ve üç aya kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.Transkripsiyon sonrası kontrol elemanlarını veya çoğalan hücrelerde oluşan PCE, GAG, RNA, RHA ribonükleoprotein komplekslerini izole etmek. FLAG-MS2 RNP immünopresipitasyonu, transfekte edilmiş HECK293 hücre lizatlarında gerçekleştirildi. Sonuçlar, FLAG-MS2 proteininin verimli bir şekilde çökeldiğini göstermektedir.DHX9 / RHA, RNP kompleksinde bulunduğundan ve IgG izotop kontrolünde veya negatif kontrol içinde bulunmadığından. Burada gösterilen, RNase H sindirilmiş RNA DNA komplekslerinden gelen batı lekeleridir. RNase H, PCE GAG RNA'yı parçaladı ve özellikle beş asal UTR'ye bağlı RNP kompleksini serbest bıraktı.DHX9 / RHA ile ilişkili RNP'ler eluentlerde zenginleştirildi. Daha da önemlisi, FLAG-MS2'ye bağlı RNP'ler antikor konjuge boncuklarla birlikte kaldı. Bu deneyde, hücrelerde ve eluentlerde retroviral PCE GAG RNA içeren MS2 kök döngüsünün HO immünopresipitasyonu, RT-PCR ve QRT-PCR ile doğrulandı.Sonuçlar, DHX9/RHA ile hedeflenen çeviri kontrolü için önemli olan benzersiz bir RNP olarak vurgulanan retroviral beş asal UTR arasında seçkin bir ilişki olduğunu doğruladı. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa yaklaşık beş saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, sağlam RNP komplekslerinin korunmasını ve ilgilenilen spesifik RNP kompleksinin izolasyonunu sağlamak için tüm adımları verimli ve dikkatli bir şekilde gerçekleştirmeyi unutmamak önemlidir.Bu prosedürü takiben, hedef RNA ile küresel protein ilişkisi gibi ek soruları yanıtlamak için kütle spektrometresi ve RNA-Seq gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Ve belirli bir RNP içinde yer alan tüm transkriptlerin bölge veya tam analizi. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, transkripsiyon sonrası gen kontrolü alanındaki araştırmacıların, patojenik viral gen sona ermesini ve hücresel gen ekspresyon kontrolünün genel mekanizmasını yöneten farklı RNA protein komplekslerini keşfetmesinin yolunu açtı.Bu videoyu izledikten sonra, bozulmamış hücresel RNP komplekslerinin nasıl hasat edileceğini ve seçici oligonükleotid yönelimli zenginleştirme kullanarak bileşimlerini nasıl belirleyeceğinizi iyi anlamalısınız. Unutmayın, patojenik virüsler ve biyolojik numuneler ve asit veya fenol gibi tehlikeli kimyasallarla çalışmak son derece tehlikeli olabilir. Bu prosedür gerçekleştirilirken uygun kişisel koruyucu ekipman gibi tüm önlemler her zaman alınmalıdır.

isolation-cognate-rna-protein-complexes-from-cells-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Pre-mRNA geçici doğası nedeniyle, izole etmek ve incelemek için zor...

İnsan pre-mRNA üzerinde Haritalama Ribonucleoproteins Hızlı Yüksek verim için Yöntemi (RNPs)

RIP-Chip aracılığıyla RNA ilişkili kompleksleri izole ve tanımlamak için adım protokolü bir adım.

RIP-Chip kullanarak Hücre Ekstraktlarının gelen mRNA mikroRNA&#39;lar ve ribonükleoprotein Kompleksi Protein Bileşenlerinin İzolasyonu ve Tanımlama için Yöntemi

Bu video, mRNA'daki adenilat-üridilat açısından zengin element (ARE) dizileri ile etkileşime giren RNA bağlayıcı proteinleri (RBP'ler) tanımlamak için bir in vitro RNA aşağı çekme testini göstermektedir. Bir hücre lizatından gelen hedef RBP'ler, RNA-protein kompleksleri oluşturmak için bir RNA probu ile karıştırılır. Kompleksler, RNA probunun destiyobiyotin etiketinin streptavidin etiketli bir manyetik boncuğa afinitesi kullanılarak afinite saflaştırması yoluyla izole edilir.

Afinite Ekstraksiyonu Yoluyla RNA Bağlayıcı Proteinleri İzole Etmek için RNA-Protein Pull-Down Testi

Mitokondriyal proteinleri kodlayan birçok mRNA'lar mitokondri dış membran ile ilişkilidir. Biz ilişkili mRNA'lardan ve ribozomlarla maya mitokondri izolasyonu amaçlayan bir hücre altı bölme prosedürü tarif. Bu protokol, mRNA lokalizasyonu mekanizmaları ve mitokondri yakın olarak lokalize çeviri ortaya çıkarmak için çeşitli koşullar altında yetiştirilen hücreler uygulanabilir.

Lokalize Çeviri Mekanizmaları Eğitim için Maya Mitokondri ile mRNAlarının Associated İzolasyonu

RNA-protein etkileşimleri birçok hücresel sürecin merkezinde yer alır. Burada, spesifik RNA'yı izole etmek ve onunla ilişkili yeni proteinleri tanımlamak için in vivo bir yöntemi açıklıyoruz. Bu, RNA'ların hücrede nasıl düzenlendiğine yeni bir ışık tutabilir.

Rapid Metodoloji tarafından Roman RNA Bağlayıcı Proteinler İzolasyon

Bu RNA açılan yöntem uzun kodlamayan RNA (lncRNA) RNA hedeflerini belirleme sağlar. Ev yapımı, tasarlanmış Anti-anlamda DNA Oligonükleotid probları bu lncRNA uygun bir şekilde sabit doku veya hücre için belirli hibridizasyon dayanarak, verimli bir şekilde lncRNA ait tüm RNA hedefleri yakalama sağlar.

Uzun kodlamayan RNA, RNA hedefleri tanımlamak için RNA Pull-down yordamı

Endogenously kurulan mRNA-protein kompleksleri kurtarılması için bir tandem RNA izolasyon yordam (seyahat) açıklanmıştır. Özellikle, çapraz vivo içindeRNA-protein kompleksleri vardır, poliadenile RNA'ların özleri ile oligo(dT) boncuk etkilenmezsiniz ve belirli mRNA'ların değiştirilmiş RNA antianlamlı oligonucleotides ile yakalanır. MRNA'ların için bağlı proteinler immunoblot analizi ile tespit edilir.

Ökaryotik mRNA-Protein kompleksleri kurtarmak için bir Tandem oligonükleotid tabanlı RNA izolasyon yordamı

RNA/protein kompleksleri Botin-streptavidin strateji kullanarak saf ve daha fazla fonksiyonel analiz için uygun olmayan bir biçimde denaturing koşullarda çözüm için eluted. Burada, yerel ve tamamen işlevsel RNA/protein kompleksleri verimli bir fotoğraf yarilabilir bağlayıcı RNA ve nazik bir UV-elüsyon adım kullanır bu stratejinin bir değişiklik açıklar.

Tek adım arıtma RNA bağlı Biotin ve fotoğraf yarilabilir bir bağlayıcı kullanarak makromoleküllerin kompleksleri

Burada, sadece kısa sentetik DNA ve RNA oligonükleotides ve arıtılmış pol II gerektiren RNA polimeraz II (pol II) uzama kompleklerinin montajını tarif ediyoruz. Bu kompleksleri, Pol II uzama kompleksi ile ilişkili transkriptlerin Co-transcriptional işleme temel mekanizmaları eğitim için yararlıdır.

Diseksiyon eş transkripsiyon RNA Işleme etkinlikleri için suni RNA polimeraz II uzama kompleksler

Bu protokol, NuTRAP fare modelini kullanarak hücre tipine özgü çeviri ribozomal mRNA'ları izole etmeyi amaçlamaktadır.

Hücre Tipine Özgü RNA'ları, Hücre Sıralama Olmadan Dondurulmuş Heterojen Doku Örneklerinden İzole Edin

AviTag-spesifik Konum Kısıtlı Aydınlatma Takviyeli Biyotinilasyon (ALIBi), ribozom popülasyonlarının etiketlenmesi ve afinite-affinite-arındırıcı olarak arındırılması amacıyla geliştirilen, sonraki dizileme ve proteomik analiz için geliştirilen yeni bir optogenetik olarak aktive edilmiş yöntemdir.

Rekombinant Peptit Etiketine Özgü Konum Kısıtlı Aydınlatma Güçlendirilmiş Biyotinilasyona Dayalı Subhücresel Ribozom Alt Popülasyonlarının İzolasyonu

Öğrenin, RNA immunoprecipitation yöntemiyle retroviral transkriptlerdeki RNA-protein komplekslerini izole etme ve karakterize etme tekniğini. DHX9/RNA helicase A içeren kompleksleri seçici olarak zenginleştirerek viral enfeksiyon mekanizmalarını anlayın.

Oligonükleotid yönelik elüsyon kullanılarak Hücreler Aynı Kökenli RNA-protein kompleksleri izolasyonu

Daha fazla video keşfet