Oligonükleotid yönelik elüsyon kullanılarak Hücreler Aynı Kökenli RNA-protein kompleksleri izolasyonu

Bu RNA immünopresipitasyon tekniğinin genel amacı, ökaryotik hücrelerde oluşan endojen RNA protein komplekslerini spesifik bir oligonükleotid yönelimli zenginleştirme yoluyla seçici olarak izole etmek ve karakterize etmektir. Bu yöntem, gen ekspresyonunu düzenlemek için bir retroviral transkriptin beş asal UTR'sini tanımlayan RNA bağlayıcı proteinlerin bileşimi gibi transkripsiyon sonrası kontrol alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, bir araştırmacının, RNP'nin aşağı akışının daha küresel bir analizini yapma olasılığını korurken, ilgilenilen belirli bir RNA protein kompleksini seçici olarak izole etmesine ve karakterize etmesine izin vermesidir.

Bu tekniğin sonuçları, viral enfeksiyonların ve çok sayıda hücresel hastalığın temel olarak anlaşılmasına kadar uzanır. Ve gen ekspresyonunun transkripsiyon sonrası kontrol mekanizmaları hakkında önemli bilgiler sağlar. Bu, yeni uygulanabilir ilaç hedefleri anlamına gelebilir.

Hücreleri kültürledikten ve metin protokolüne göre FLAG etiketli bir proteinin immünopresipitasyonunu gerçekleştirdikten sonra, pro-TG manyetik boncuk bulamacının IP'si başına 60 mikrolitreyi 1.7 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüpü manyetik bir rafa yerleştirin ve dikkatlice pipetleyerek saklama solüsyonunu çıkarın. Ardından tüpü raftan çıkarın.

600 mikrolitre 1x yıkama tamponu ekleyin. Ve boncukları yıkamak ve dengelemek için tüpü oda sıcaklığında üç dakika boyunca bir uçtan uca döndürücüye yerleştirin. Tüpü manyetik rafa yerleştirin ve yıkama tamponunu çıkarın.

Ardından 10 hacim taze 1x yıkama tamponu ekleyin. Dengelenmiş pro-TG manyetik boncuklara immünopupresif FLAG antikoru ekleyin. Daha sonra, immünopresipitasyon yapan antikoru konjuge etmek için tüpü oda sıcaklığında en az 30 dakika döndürün.

Tüpü mıknatısın üzerine yerleştirin ve süpernatanı çıkarın. Daha sonra tüpü mıknatıstan çıkarın ve boncuklara 1x yıkama tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında üç dakika döndürün. Yıkama adımını iki kez tekrarlayın ve son tamponu çıkarın.

Kültür ortamını aspirasyon yoluyla hücrelerden çıkarın ve hücreleri iki kez yıkamak için 1.5 mililitre buz gibi soğuk PBS kullanın. Bir hücre kazıyıcı ile ıslak, yapışkan hücreleri yerinden çıkarın. Hücre süspansiyonunu taze tüplere pipetleyin ve ardından kültürü dört dakika boyunca dört santigrat derecede 226 kez G'de santrifüjleyin.

Hücre peletine 375 mikrolitre buz gibi düşük tuzlu tampon ekleyin ve şişmeyi sağlamak için numuneyi beş dakika buz üzerinde inkübe edin. Erken mekanik bozulma olmadan tam daldırma ve şişmeyi sağlamak için düşük tuzlu lizis tamponuna hücre peletini eklerken ve yeniden süspanse ederken dikkatli olmak önemlidir. Sitoplazmik hücre lizatını toplamak için 125 mikrolitre buz gibi soğuk lizis tamponu ekleyin ve ardından on vuruş gerçekleştirmek için önceden soğutulmuş bir Dounce homojenizatör kullanın.

Plazma zarı lizizini ve salınan sitoplazmik lizatın kontaminantlarını sağlamak için yeterli kuvvetle homojenize edin. Ancak mekanik bozulmayı aşırı uzatmamaya ve nükleer kontaminasyon, RNA protein kompleksinin bozulması veya salınan homojenatı bir dakika boyunca en yüksek hızda bir mikrofüje içinde döndürme riskini almamaya dikkat edin. Ardından süpernatanı buz üzerinde bulunan 1.7 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.

Toplam protein konsantrasyonunu belirleyin. Giriş kontrolü olarak kullanılmak üzere western blot analizi için% 10 ayırın. İmmünopresipitasyonu gerçekleştirmek için, istenen hacimde hasat edilmiş hücre lizatını hedef antikor konjuge boncuklarına ekleyin.

1x yıkama tamponu kullanarak toplam hacmi 600 mikrolitreye çıkarın ve numuneyi oda sıcaklığında döndürün. 90 dakikalık inkübasyondan sonra, boncukları toplamak için IP tüpünü mıknatıs rafına yerleştirin. Sonra süpernatanı toplayın ve akış olarak ayırın.

Daha sonra, RNP bağlı, antikor konjuge boncuklara 10 hacim buz gibi soğuk NETN 150 yıkama tamponu ekleyin ve numuneyi oda sıcaklığında üç dakika döndürün. İmmobilize RNP komplekslerini metin protokolüne göre 1x bağlama tamponunda yeniden askıya aldıktan sonra, kalan hacmi 100 mikrolitre buz gibi soğuk 1x bağlama tamponunda ayarlayın. Ve tüpü üç dakika boyunca 70 santigrat derecede ısıtın.

Aynı kökenli RNA protein komplekslerini izole etmek için, ilgilenilen RNA'nın üç asal dizi sınırını tamamlayan yaklaşık 30 nükleotidli bir DNA oligosu ekleyin. Ve hafifçe sallanarak oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Tüpe beş ila on birim veya RNase H ekleyin ve RNA'yı RNA DNA hibritinden ayırmak için numuneyi oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.

Daha sonra, yakalanan RNP komplekslerini içeren süpernatanı, steril bir 1.7 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. İmmünopresipite edilmiş RNA'yı toplamak için, yakalanan RNA komplekslerinin toplam örneğinin yarısını 750 mikrolitre asit guanidinyum tiyosiyanat reaktifi içinde yeniden askıya alın. Tüpe 200 mikrolitre kloroform ekleyin, 10 saniye kuvvetlice çalkalayın, oda sıcaklığında üç dakika inkübe edin.

Santrifüjlemeden sonra, sulu fazı taze bir tüpte toplayın ve eşit hacimde izopropanol ekleyin. İyice karıştırın ve numuneyi oda sıcaklığında en az on dakika inkübe edin. Numuneye bir mikrolitre glikol mavisi ekleyin ve gelecekteki bir tarihte verimli çökeltme veya işleme için eksi 20 santigrat derecede saklayın.

Tüpü on dakika boyunca dört santigrat derecede 16.000 kez G'de santrifüjleyin. RNA peletini rahatsız etmemek için süpernatanı dikkatlice toplamak ve atmak için bir P200 mikropipet kullanın. Her tüpe 500 mikrolitre% 75 etanol ekleyin.

Tüpleri beş dakika boyunca vorteksleyin ve santrifüjleyin. Süpernatanı az önce gösterildiği gibi dikkatlice toplayın ve atın. Peleti iki ila üç dakika havayla kurutun ve yeniden süspanse etmek için 100 mikrolitre RNase içermeyen su kullanın.

100 mikrolitre RNA örneğini bir RNA temizleme kolonuna uygulayın. Ve üretici protokolüne göre işleyin. Son olarak, RNA'yı 30 mikrolitre RNaz içermeyen suda elüte edin ve üç aya kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Transkripsiyon sonrası kontrol elemanlarını veya çoğalan hücrelerde oluşan PCE, GAG, RNA, RHA ribonükleoprotein komplekslerini izole etmek. FLAG-MS2 RNP immünopresipitasyonu, transfekte edilmiş HECK293 hücre lizatlarında gerçekleştirildi. Sonuçlar, FLAG-MS2 proteininin verimli bir şekilde çökeldiğini göstermektedir.

DHX9 / RHA, RNP kompleksinde bulunduğundan ve IgG izotop kontrolünde veya negatif kontrol içinde bulunmadığından. Burada gösterilen, RNase H sindirilmiş RNA DNA komplekslerinden gelen batı lekeleridir. RNase H, PCE GAG RNA'yı parçaladı ve özellikle beş asal UTR'ye bağlı RNP kompleksini serbest bıraktı.

DHX9 / RHA ile ilişkili RNP'ler eluentlerde zenginleştirildi. Daha da önemlisi, FLAG-MS2'ye bağlı RNP'ler antikor konjuge boncuklarla birlikte kaldı. Bu deneyde, hücrelerde ve eluentlerde retroviral PCE GAG RNA içeren MS2 kök döngüsünün HO immünopresipitasyonu, RT-PCR ve QRT-PCR ile doğrulandı.

Sonuçlar, DHX9/RHA ile hedeflenen çeviri kontrolü için önemli olan benzersiz bir RNP olarak vurgulanan retroviral beş asal UTR arasında seçkin bir ilişki olduğunu doğruladı. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa yaklaşık beş saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, sağlam RNP komplekslerinin korunmasını ve ilgilenilen spesifik RNP kompleksinin izolasyonunu sağlamak için tüm adımları verimli ve dikkatli bir şekilde gerçekleştirmeyi unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, hedef RNA ile küresel protein ilişkisi gibi ek soruları yanıtlamak için kütle spektrometresi ve RNA-Seq gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Ve belirli bir RNP içinde yer alan tüm transkriptlerin bölge veya tam analizi. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, transkripsiyon sonrası gen kontrolü alanındaki araştırmacıların, patojenik viral gen sona ermesini ve hücresel gen ekspresyon kontrolünün genel mekanizmasını yöneten farklı RNA protein komplekslerini keşfetmesinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, bozulmamış hücresel RNP komplekslerinin nasıl hasat edileceğini ve seçici oligonükleotid yönelimli zenginleştirme kullanarak bileşimlerini nasıl belirleyeceğinizi iyi anlamalısınız. Unutmayın, patojenik virüsler ve biyolojik numuneler ve asit veya fenol gibi tehlikeli kimyasallarla çalışmak son derece tehlikeli olabilir. Bu prosedür gerçekleştirilirken uygun kişisel koruyucu ekipman gibi tüm önlemler her zaman alınmalıdır.