Klasik Hodgkin Lenfomalı Reed-Sternberg Hücrelerinin Akış-Sıralama ve Ekstraksiyon Sıralaması

Bu prosedürün genel amacı, yüksek kaliteli tüm ekzom yeni nesil dizileme verilerinin oluşturulması ve analizi için canlı Hodgkin, Reed-Sternberg veya HRS hücrelerini inflamatuar lenfositik, klasik Hodgkin lenfoma veya CHL tümörlerinden ayırmak ve konsantre etmektir. Bu yöntem, anahtar sürücü mutasyonların tanımlanması, immüno-kaçış mutasyonları ve ayrıca sınıflandırma içindeki genetik çeşitliliğe bakmak da dahil olmak üzere CHR biyolojisindeki temel soruları yanıtlayabilir. Bu teknik, kalite ve saflık açısından çok yüksek olan tümör kaynaklı DNA verir.

Ön amplifikasyon adımına ihtiyaç duymadan yeni nesil dizileme kütüphanelerinin oluşturulmasını kolaylaştırmak. Bu teknik, bir alt sınıflandırma ve prognostikasyona yardımcı olabileceği için Hodgkin lenfoma tanısına yönelik önemli etkilere sahip olabilir. Bazı değişiklikler belirli ilaçlara karşı duyarlılığı veya direnci gösterebileceğinden, tedavi seçimini de etkileyebilir.

Jonathan From, HRS hücrelerinin akış sitometrisi ile nasıl görselleştirileceğini keşfettiğinde ve bu hücrelerle ilk sıralama deneylerini gerçekleştirdiğinde bu fikre sahip oldu. Hücreleri hazırlamadan önce, önceden titre edilmiş antikorları koyu renkli bir cam şişede karıştırın. Ardından, antikor kokteylini 100 mikrolitre hacme getirmek için PBS ve BSA'yı ekleyin.

Ve şişeyi sıvı nitrojenden bir buz kovasına veya kuru buza aktarın. Daha sonra, 37 santigrat derecelik bir su banyosunda ilgilenilen hücreleri hızla çözün. Sadece küçük bir donmuş kısım kaldığında, hücreleri 45 mililitre 37 santigrat derece çözdürme ortamı içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe dökün ve kriyojenik şişeyi bir mililitre taze çözdürme ortamı ile iki kez durulayın.

Her iki durulamayı da bir araya getirdikten sonra, hücrelerin oda sıcaklığında 15 dakika sindirilmesine izin verin. Hücreler yeniden dengelendiğinde, santrifüjleme ile toplayın. Süpernatantın son 200 mikrolitresi hariç hepsini aspire edin.

Kalan çözülme ortamında hücreleri yeniden askıya alın ve hücrelerin iki ila üç dakika daha dinlenmesine izin verin. Daha sonra, hücreleri 100 mikrolitre antikor kokteyli içinde oda sıcaklığında 15 dakika boyunca ışıktan korunarak inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri üç mililitre ayırma ortamında yıkayın ve peleti bir mililitre taze ayırma ortamında yeniden süspanse edin.

Ardından, hücreleri beş mililitrelik bir akış tüpü üst süzgecinden süzün. Tüpü ve süzgeci ek bir mililitre ayırma ortamı ile durulayın ve hücreleri buz üzerinde tutun. Hücre sıralamaya başlamadan önce, deney menüsü altındaki akış sitometresi yazılımında yeni deney'i seçin ve cihaz durumu penceresini açın.

Parametreler sekmesinde, kullanılmayan parametreleri silin. Ardından, deneme sekmesini yeniden açın ve ücret denetimlerini oluşturmak için ücret kurulumunu seçin. Tarayıcı penceresinde, kompanzasyon kontrol örneğini genişletmek için artı işaretine tıklayın ve verileri kaydetmeden kompanzasyon kontrol tüplerini çalıştırın.

Dedektör voltajlarını, her flora kromu için pozitif lekeli boncuk popülasyonları 10.000 ila 100.000 kanal arasında olacak şekilde gerektiği gibi ayarlayın. Ve birincil algılama kanallarındaki en parlak olanlardan. Her tüp için her parametre için gereken voltajları kaydedin.

Ardından, kompanzasyon kontrol numunesi altında, lekelenmemiş kontrol tüpünü vurgulamak için tek bir sol tıklama ve lekesiz kontrol tüpünü numune aşamasına yükleyin. Alım kontrolü penceresinde, yükle'ye tıklayın ve tüm parametrelerin belirlenen voltajları manuel olarak girmesi için dedektör voltaj alanlarına ayrı kompanzasyon kontrollerini çalıştırın. Lekelenmemiş kontrol verilerini elde etmek için kayda tıklayın.

Ardından, dedektör ayarlarının hiçbirini değiştirmeden verileri kaydederek kalan tüm kompanzasyon kontrollerini çalıştırın. Tüm kontroller analiz edildiğinde, devam etmeden önce cihazı herhangi bir kalıntı materyalden temizlemek için beş dakika boyunca bir tüp steril deiyonize su çalıştırın. HRS sıralaması için hücreleri kapılamak için, deney tüpünü yükleyin ve akış hızını saniyede 3.000 ila 4.000 olay elde edecek şekilde ayarlarken en az 100.000 olay kaydedin.

1.000 hücrede bir kadar az olabilen bir popülasyonu görselleştirmek için yeterli olay kaydettiğinizden emin olun. Somatik B ve T hücre kontrollerini tanımlamak için sırasıyla CD20 ve CD5 pozitif hücreleri açın. Tüm kapılar ayarlandığında, hücreleri yedi ila sekiz mililitre toplama ortamı içeren önceden soğutulmuş 15 mililitrelik konik tüplere ayırın.

Sıralamanın sonunda, izole edilmiş hücre popülasyonlarını 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın. Ve hücreleri santrifüjleme ile peletleyin. Daha sonra, hücreleri bir mililitre taze PBS'de yıkayın ve küçük topakları rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatanları her tüpten çıkarın.

Kütüphane amplifikasyonu ve nokta 8X boncuk temizliğinden sonra, istenen aralıkta parça boyutlarının normal bir ışık dağılımı gözlenmelidir. Bu şekilden sapmalar sergileyen kütüphaneler, yüksek veya düşük moleküler ağırlıklı bir artefaktın varlığını gösterir ve ideal olarak sıralanmamalıdır. Örneğin, adaptör dimer bazen 125 ila 130 baz çifti etrafında merkezlenmiş keskin bir tepe olarak görünen ilk sivri X boncuk temizliği boyunca devam edebilir.

Bu durumda, dimerin başarılı bir şekilde çıkarılmasını sağlamak için ek bir sivri X boncuk temizliği yapılmalı ve ardından boyut dağılımının tekrar görselleştirilmesi yapılmalıdır. Şerit başına dört numunenin çoğullama diziliminden sonra, hedef boyunca 50 ila 100 X arasında bir medyan kapsama derinliği elde edilebilir. Her ne kadar tek bir nanogram kitaplığından oluşturulan kopya numarası grafikleri, sahte kopya numarası kazanımlarına ve kayıplarına neden olabilir.

Klasik Hodgkin lenfoma vakalarının yaklaşık% 70'i B2M ve 820 mutasyonları ve/veya klonal gibi görünen ve göreceli tümör içeriğini tahmin etmek için kullanılabilen delesyonlar taşır. Somatik kontroller olarak T hücreleri kullanılırsa, HRS dizilemesi, T hücresi reseptörü alfa, delta ve beta pozisyonlarına karşılık gelen pozisyonlarda önemli kopya sayısı kazanımları gösterecektir. B hücresi reseptörü ağır ve kappa hafif zincir pozisyonlarında önemli kayıpların yanı sıra, ekzom vakası başına 100 ila 400 somatik mutasyon genel mutasyon yükü ile.

Bir kez ustalaştıktan sonra, hücre sıralama ve sıralama kitaplığı yapısını içeren bu teknik, uygun şekilde gerçekleştirilirse üç ila dört gün içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü takiben, Hodgkin lenfoma hakkında daha fazla bilgi edinmek ve daha spesifik kişiselleştirilmiş tedavilere doğru ilerlemek için daha büyük prospektif çalışmalar ve epigenetik, proteomik ve metabalomik gibi diğer yöntemleri uygulayabiliriz. Geliştirilmesinden sonra, yöntem HRS hücrelerini nispeten büyük sayılarda yüksek saflıkta incelememize izin verdi.

Bu videoyu izledikten sonra, HRS hücrelerini nasıl izole edeceğinizi ve genomik analizlerini nasıl başlatacağınızı iyi anlamış olmalısınız.