Sıvı Kromatografi / Kütle Spektrometresi zehirlidir pufferfish Geliştirilmiş Polimeraz Zincir Reaksiyonu-kısıtlama Parça Uzunluk Polimorfizmi Genotiplemesi

Bu deneyin genel amacı, küçük PCR amplikonlarını analiz ederek toksik kirpi balıklarının hızlı ve doğru bir genotiplemesini gerçekleştirmektir. Kirpi balığı yemeğini hazırlamak için kullanılan kirpi balığının yenilebilir kısmı türüne göre değişir ve bazı türler vücutta toksinler içerir. Bu kas, kirpi balığının veri tabanı ve masu, yüzgeci ve doğum derisi, kirpi balığının genotiplendirilmesinde, herkes için ve araştırma için tam güvenli gıda açısından yardımcı olabilir.

Bir kit kullanarak DNA ekstraksiyonu yapmak için, önce 30 ila 50 miligram balık dokusunu 0,5 veya 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Bir mikrospatula kullanarak dokuyu yüzgeç ve deri olmadan ezin. 180 mikrolitre hayvan dokusu lizis tamponu ve 40 mikrolitre proteinaz k ekleyin ve kısaca girdap yapın.

56 santigrat derecede bir blok ısıtıcıda iki saat veya gece boyunca inkübe edin. Numuneyi 13000xg'de beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı yeni bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktardıktan sonra, kitten guanidin hidroklorür içeren 200 mikrolitre kaotropik tampon ekleyin.

Daha sonra 200 mikrolitre% 99.5 etanol ekleyin ve girdaplama ile karıştırın. Herhangi bir çökelti de dahil olmak üzere karışımı, iki mililitrelik bir toplama tüpüne yerleştirilmiş döndürme kolonuna aktarın. 13000xg'de bir dakika santrifüjledikten sonra akışı atın.

Kitten guanidin hidroklorür içeren 500 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin ve daha önce olduğu gibi santrifüjleyin. Akış geçişini ve toplama borusunu atın. Döndürme kolonunu, kit ile birlikte verilen iki mililitrelik yeni bir toplama tüpüne yerleştirin.

500 mikrolitre yıkama tamponu iki ekleyin ve 20.000xg'de üç dakika santrifüjleyin. Akışı ve toplama tüpünü attıktan sonra, spin kolonunu yeni bir 1,5 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın. Elüsyon tamponunun 200 mikrolitresini spin kolon zarının merkezine pipetleyin.

Bir dakika sonra, 6000xg'de bir dakika santrifüjleyin. Daha sonra 50 mikrolitre alueti tek kullanımlık bir ultraviyole küvete pipetleyin. Bir spektrofotometre kullanarak aluetin ultraviyole spektrumunu 220 ila 300 nanometrede ve 260 nanometrede absorbansını ölçün.

Deterjan içermeyen reaktifin kullanılması, sıvı kromatografisinin başarısı için kritik öneme sahiptir, çünkü reaktif, analitik kolonda gerçekten olası hasara neden olur. Kontaminasyonu önlemek için temiz bir tezgah üzerinde çalışarak, metin protokolünde açıklandığı gibi buz üzerinde ekstrakte edilen her DNA örneği için 25 mikrolitrelik bir PCR, bir pozitif kontrol ve bir negatif kontrol ayarlayın. Kolay kullanım için, şablon DNA'sı olmayan tüm reaktifleri içeren yeterli miktarda kokteyl yapın ve dağıtın.

PCR ürününe üç asal adenin çıkıntısının eklenmesini önlemek için düzeltme okuma aktivitesine sahip DNA polimeraz kullanın. Metin protokolünde gösterilen döngü programını kullanarak bir termal döngüleyici üzerinde PCR amplifikasyonu gerçekleştirin. Enzimatik sindirimi gerçekleştirmek için, PCR çözeltisine iki mikrolitre enzimatik sindirim tamponu ekleyin.

Her kısıtlama enziminden bir mikrolitre ekleyin ve hafifçe karıştırın. Numuneyi termal döngüleyicide 37 santigrat derecede 30 dakika, ardından 72 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. Tıkanmayı önlemek ve analitik kolona zarar vermemek için reaksiyon çözeltisini 0,2 ila 0,5 mikronluk bir santrifüj filtre cihazı ile filtreleyin.

Süzüntüyü konik bir polipropilen şişeye aktarın ve analize kadar 20 santigrat derecede saklayın. Metin protokolünde açıklandığı gibi bir litrelik şişede bir heksafloroizopropanol ve trietilamin çözeltisi hazırlayın. Şişeyi sıvı kromatografi cihazının A hattına bağlayın, buharlaşmayı önlemek için doğrudan soğutmalı bir portatif buzdolabı kullanarak şişeyi soğutun.

Metanol ile doldurulmuş başka bir şişeyi B hattına bağlayın. Koruma kolonunu ve analitik kolonunu cihaza bağlayın. Sütunları dengelemek için ilk mobil aşamayı akıtmaya başlayın. C-Trap basıncını kontrol etmek için yazılım olmayan bir kütle spektrometresi kullanıyorsanız, çubuğu manuel olarak kontrol ederek C-Trap'in basıncını azaltmanız gerekir.

Bunu yapmak için, kilidi açmak için düğmeyi çekin ve yüksek vakum basıncını 1/3'e düşürmek için düğmeyi saat yönünün tersine çok yavaş çevirin. Belirtilen basınç gecikmeli bir şekilde kademeli olarak değişmelidir. Düşük basınçla ilgili uyarı mesajını dikkate almayın.

Kilitlemek için düğmeyi itin. Kalibrasyon için kurulum yaptıktan sonra, metin protokolünde açıklandığı gibi, ısıtılmış elektrosprey iyonizasyon probunu B konumundaki kütle spektrometresinin arayüzüne yaklaştırın. Gömülü şırınga pompasını kullanarak kalibrantı sürekli olarak dakikada 10 mikrolitrelik bir akış hızında demleyin.

Özelleştirilmiş kalibrasyon tablosunda yalnızca altı düşük kütleli iyonu kontrol edin. Sinyallerin yoğunluğu stabilize edildikten sonra kalibrasyona devam edin. Kalibrasyondan sonra, yalnızca altı yüksek kütleli iyonu kontrol edin ve kalibrasyona devam edin.

Arızayı önlemek için tüm iyonları aynı anda kullanarak kalibrasyon yapmaktan kaçının. Dakikada 0,4 mililitrelik bir akış hızı için probu D konumuna getirin ve alete inert bir metal tüp ile bağlayın. Parametreleri metin protokolünde açıklandığı gibi ayarladıktan sonra, şişelerin alt kısımlarına dokunarak kabarcıkları boşaltın.

Numune şişelerini numune rafına yerleştirin ve analize başlamak için otomatik numune alma cihazını kullanarak bir mikrolitre numune enjekte edin. Ham veri dosyalarını bir tarayıcı yazılımıyla açın ve pozitif ve negatif kontroller de dahil olmak üzere tüm alımların başarıyla tamamlandığını onaylayın. Metin protokolünde açıklandığı gibi bir yöntem ayarlayın ve ardından evrişim çözme yazılımını başlatmak için çalıştırma işareti sekmesindeki çalıştır düğmesine tıklayın.

İşaret tamamlandıktan sonra, bir satır seçin ve evrişim sonuçlarını elde etmek için üst başlıktaki sonucu aç'a tıklayın. Burada, negatif bir kontrol ve bir kirpi balığı örneğinden elde edilen tipik bir toplam iyon akımı kromatogramı verilmiştir. Her tepe, uzunluklarına göre ayrılan bir DNA dupleksini temsil eder.

Bu örnekte, kirpi balığı örneğinden üç tepe noktası gözlenmiştir. Bu zirveler, iki endonükleaz kullanılarak amplikon sindiriminin sonuçlarıdır. Negatif kontrol numunesinde herhangi bir pik gözlenmemiştir.

Her tepe noktası, çok yüklü iyonlardan oluşan bir kütle spektrumunu temsil eder. Kütle spektrumunun genişletilmesi, izotopik olarak çözülmüş düzinelerce zirvenin fark edilmesini sağlar. Bu çözünürlük, monoizotopik kütlenin belirlenmesi için bir gerekliliktir ve yalnızca yüksek çözünürlüklü bir kütle spektrometresi ile uygulanabilir.

Bu örnekte, üçüncü zirvenin monoizotopik kütleleri 16296.7656 ve 16468.6616 Dalton'dur. Üç ppm'lik bir kütle toleransı göz önüne alındığında, ölçülen değerler burada gösterildiği gibi takifugu rubripes'in teorik değerleriyle aynıdır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik ortak aletler ve aparatlar kullanılarak bir günde yapılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, genotipleme için sıvı kromatografisi, yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile küçük amplikonların nasıl analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Teknik, dizi varyasyonunun analiz edilecek küçük amplikonlara yansıtılması koşuluyla diğer DNA polimorfizmlerinin analizinde uygulanabilir. Bununla birlikte, bu teknik yalnızca baz bileşimlerini tanımlar, aynı merkür içindeki baz ikamesi ayırt edilemez.