Name: Zebra balığı Embriyolar Endojen Reseptör Affinity Etiketleme Tespiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Öğrenin, AFLIP yöntemiyle zebra balığı embriyolarında düşük yoğunluklu büyüme faktörü reseptörlerini tespit etmeyi. Bu teknik, afinitetik etiketleme ve immünopresipitasyonu birleştirerek gelişimsel biyoloji araştırmalarında reseptör dinamiklerini incelemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, balık bakımı ve bakımı için Gilberto Morales'e ve tavşan bağışıklaması konusundaki yardımları için Dr. Claudia Rivera ve Hector Malagòn'a (IFC-UNAM Hayvan Tesisi) teşekkür eder. Bu çalışma CONACYT 131226 ve PAPIIT-DGAPA-UNAM IN204916 tarafından sağlanan hibelerle desteklenmiştir.

Hayvanlarda yürütülen tüm deneyler CICUAL-Protokol numarası altında, Laboratuar Hayvanları Bakım ve México Özerk Ulusal Üniversitesi (UNAM) Kullanımı Komitesi tarafından kabul edildi: FLC40-14. (CICUAL: &quot;Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio del Instituto de fizyoloji Celular, Universidad Nacional Autonoma de México&quot;). Embriyo Protein Özü 1. Hazırlık <ol><li> Her koşul örneği 72 saat sonra döllenme (hpf) için, istenilen aşamada (morphants vs yabani tip) karşılaştırmak için 200 embriyolar - 100 toplayın. </li><li> Balık su içeren Petri yerleştirin embriyolar (Tablo 1) ve elle ince uçlu forseps kullanarak embriyolar dechorionate. hedeflenen reseptör sindirmek olabilir bu aşamada (ya da protokol boyunca başka herhangi bir proteaz) sırasında pronase kullanmaktan kaçının. </li><li> 1.5 ml mikrofuge&#39;de tüp yerleştirin embriyolar ve embriyo tw yıkama1x Fosfat tampon çözeltisi (PBS) ile buz (Tablo 1 e bakınız). </li><li> Deyolk tampon 500 ul ekle (Tablo 1 e bakınız). </li><li> (- 40 kez yaklaşık 30) çözelti içinde embriyolar yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme sarısı en bırakın. 72 hpf ve 48 hpf embriyolar için sırasıyla mavi ve sarı pipet uçları kullanın. Sarı ipuçları biraz embriyoların yok önlemek için kesmek gerekebilir. Başarılı sarısı bırakma mikroskop altında embriyoların gözlemleyerek kontrol edilebilir. </li><li> 15 saniye boyunca 600 x g&#39;de santrifüj ile embriyolar toplayın. </li><li> Bir pipet kullanarak dikkatlice süpernatant atın. </li><li> Yıkama embriyolar iki kez 500 ul yıkama tamponu ile hafifçe düşük hızda karıştırın (Tablo 1 e bakınız). </li><li> 15 saniye boyunca 600 x g&#39;de santrifüj ile embriyolar toplayın. </li><li> Buradan itibaren, 4 ° C&#39;de prosedürü devam etmektedir. </li><li> Bir pipet kullanarak dikkatlice süpernatant atın. </li><li> lizis tamponu 350 ul süspanse embriyolar (Tablo 1 &#39;e bakınız) ve plastik bir havan tokmağı kullanılarak homojen hale getirilir. </li><li> 4 ° C de bir test tüpü rocker lize embriyolar çalkalama ile 30 dakika kuluçkalayın. </li><li> Santrifüj çözünmeyen artık çıkarmak için 15 dakika 11,000 x g&#39;de embriyolar parçalanmıştır. </li><li> Transferi yeni bir tüp bir pipet kullanarak süpernatant temizledi. </li><li> Bradford protein deneyi 4 veya başka bir uygun yöntem vasıtasıyla, toplam protein belirler. Bradford tahlili kullanıldığında, bunlar 4 Standart proteinin tahmin edilmesine neden olarak, liziz tamponunda deterjanlar sunar eşdeğer konsantrasyonlarının varlığında kalibrasyon eğrisi gerçekleştirin. </li></ol> 2. Tespit Endojen Reseptör Protein <ol><li> Affinity Etiketleme ve Immunoprecipitation (bütün bu adımlar 4 o C&#39;de) <ol><li> 1.5 ml mikrofuge&#39;de tüp içinde toplam embriyo protein, 500 mg ve tamponu 1 (bakınız Tablo 1) ile 1 mcg / ul sulandırmak - 400 yerleştirin. Not: yaklaşık 100 toplam embriyo proteinin 500 ug elde etmek için - 200 embriyo ilk işlenmelidir. 72 HPF embriyolar rutin Betaglikan tarama için yeterli olana toplam embriyo proteininin ~ 5 ug verim. </li><li> 150 pM&#39;lik bir nihai konsantrasyon elde edildi ve 4 ° C &#39;de, bir test tüpü külbütör 2 saat ajitasyonla inkübasyona etiketli TGF-β2 stokunun yeterli hacim. AFLIP başlatılmadan önce Cheifetz ve ark., 5 ile tarif edildiği gibi, TGF-β2 kloramin T yöntemiyle 125I ile etiketlenmesi gerekir. DİKKAT: Ben ligand etiketli 125 taşıma sırasında maruziyeti en aza indirmek için koruyucu. </li><li> 100 seyreltme ve (kuluçka O / N olabilir), 4 ° C&#39;de başka bir 2 saat daha inkübasyona devam: 1 ulaşmak için ilgi alıcısına karşı seyreltilmemiş antikorun yeterli hacim. Bu, bu çalışmada kullanılan ve başka bir yerde tarif edilen 3, ama kalitesine bağlı olarak, antiserum # 31 optimal dilüsyonudurtibody daha büyük veya daha küçük bir seyreltme uygun olabilir. </li><li> Uygun bir immünoglobulin bağlama, boncuk tanelerin 50 ul ekle (örneğin, daha önce TNTE içinde dengelenmiş 1 yeniden süspanse edildi, G-proteini-Sefaroz: TNTE orjinal hacminin 5) ve 4 ° bir test tüpü rocker çalkalama ile 50 dakika boyunca inkübe C. </li><li> 20 saniye boyunca 11.000 xg mikrosantrifüj boncuk kurtarın. </li><li> Uygun bir radyoaktif çöp konteyner içinde süpernatant atın. </li><li> 20 saniye, her seferinde 11,000 xg, vorteks ve mikro santrifüjleme IP yıkama tamponu (bakınız Tablo 1) 1 ml IP boncuk üç kez yıkayın. </li><li> Süspanse IP-boncuk, IP yıkama tamponu 250 ul. </li><li> (10 mg / ml DMSO içinde çözülmüş DSS) disüksinimidil suberat 1.5 ul ekle. Sadece bu aşamada kullanılmadan önce DSS çözeltisi hazırlayın. </li><li> çalkalama ile 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Çapraz bağlama reaksiyonu söndürmek için 500 ul o eklemeYeterince Tris-Cl, pH 7.4 stok ile desteklenmiş F IP yıkama tamponu, 25 mM Tris-Cl ulaşmak için. Tris serbest amino grupları reaksiyona girmemiş DSS yakalamak. </li><li> 20 saniye boyunca 11.000 xg&#39;de Santrifüj IP boncuk toplamak ve süpernatant atmak için. </li><li> Süspanse IP boncuk Laemmli tamponu indirgeme 30 ul. </li><li> Kaynama örnekleri 94 ° C &#39;de 5 dak. </li><li> İsteğe bağlı olarak, imalatçının protokolü kullanılarak bir gamma sayacında örnekleri analiz eder. </li></ol></li><li> numune Analizi <ol><li> SDS-PAGE denatüre Konu örnekler. reseptör kütlesi için uygun oranda poliakrilamid kullanın ve standart prosedür altında jel çalıştırın. </li><li> Sabitleştirici çözeltide jel daldırın oda sıcaklığında 30 dakika boyunca (bakınız Tablo 1). </li><li> 15 dakika boyunca damıtılmış su ile jel yıkayın. </li><li> Daha önce sulu filtre kağıdına jel yerleştirin ve Saran wrap film ile kaplayın. </li><li> 1 saat boyunca 80 ° C&#39;de kuru jeli. </li><li> Beyaz Fosfor bağırıyorum üzerinde jel AçığaRT O / N en-. </li><li> Üreticinin protokolü kullanılarak bir fosforimager kullanılarak maruz ekranı tarayın. </li></ol></li></ol>

<ol><li>López-Casillas, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+expression+of+the+membrane+proteoglycan+betaglycan%2C+a+component+of+the+TGF-%CE%B2+receptor+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure and expression of the membrane proteoglycan betaglycan, a component of the TGF-β receptor system.</a> Cell. 67 (4), 785-795 (1991).</li>
<li>Cheifetz, S., Andres, J. L., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transforming+growth+factor-beta+receptor+type+III+is+a+membrane+proteoglycan.+Domain+structure+of+the+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The transforming growth factor-beta receptor type III is a membrane proteoglycan. Domain structure of the receptor.</a> J. Biol. Chem. 263 (32), 16984-16991 (1988).</li>
<li>Kamaid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betaglycan+knock-down+causes+embryonic+angiogenesis+defects+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Betaglycan knock-down causes embryonic angiogenesis defects in zebrafish.</a> Genesis. 53, 583-603 (2015).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+and+Sensitive+Method+for+the+Quantitation+of+Microgram+Quantities+of+Protein+Utilizing+the+Principle+of+Protein-Dye+Binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Cheifetz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+transforming+growth+factor-b+receptor+subsets+as+determinants+of+cellular+responsiveness+to+three+TGF-b+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Distinct transforming growth factor-b receptor subsets as determinants of cellular responsiveness to three TGF-b isoforms.</a> J. Biol. Chem. 265, 20533-20538 (1990).</li>
<li>López-Casillas, F., Wrana, J. L., Massagué, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betaglycan+presents+ligand+to+the+TGF%CE%B2+signaling+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Betaglycan presents ligand to the TGFβ signaling receptor.</a> Cell. 73 (7), 1435-1444 (1993).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> PNAS USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Maccari, F., Volpi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+specific+recognition+of+glycosaminoglycans+by+antibodies+after+their+separation+by+agarose+gel+electrophoresis+and+blotting+on+cetylpyridinium+chloride-treated+nitrocellulose+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Direct and specific recognition of glycosaminoglycans by antibodies after their separation by agarose gel electrophoresis and blotting on cetylpyridinium chloride-treated nitrocellulose membranes.</a> Electrophoresis. 24 (9), 1347-1352 (2003).</li>
<li>Volpi, N., Maccari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosaminoglycan+blotting+and+detection+after+electrophoresis+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Glycosaminoglycan blotting and detection after electrophoresis separation.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 1312, 119-127 (2015).</li>
<li>Guesdon, J. L., Ternynck, T., Avrameas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+avidin-biotin+interaction+in+immunoenzymatic+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques.</a> J Histochem Cytochem. 27 (8), 1131-1139 (1979).</li>
<li>Bratthauer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+avidin-biotin+complex+%28ABC%29+method+and+other+avidin-biotin+binding+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">The avidin-biotin complex (ABC) method and other avidin-biotin binding methods.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 588, 257-270 (2010).</li>
<li>Heimer, R., Molinaro, L., Sampson, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+by+125I-cationized+cytochrome+c+of+proteoglycans+and+glycosaminoglycans+immobilized+on+unmodified+and+on+positively+charged+Nylon+66%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Detection by 125I-cationized cytochrome c of proteoglycans and glycosaminoglycans immobilized on unmodified and on positively charged Nylon 66.</a> Anal. Biochem. 165 (2), 448-455 (1987).</li>
<li>Das, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+radiolabeling+of+a+cell+surface+receptor+for+epidermal+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Specific radiolabeling of a cell surface receptor for epidermal growth factor.</a> PNAS USA. 74 (7), 2790-2794 (1977).</li>
<li>Massague, J., Guillette, B., Czech, M., Morgan, C., Bradshaw, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+nerve+growth+factor+receptor+protein+in+sympathetic+ganglia+membranes+by+affinity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of a nerve growth factor receptor protein in sympathetic ganglia membranes by affinity labeling.</a> J. Biol. Chem. 256 (18), 9419-9424 (1981).</li>
<li>Massague, J., Pilch, P. F., Czech, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+resolution+of+three+major+insulin+receptor+structures+with+unique+subunit+stoichiometries%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic resolution of three major insulin receptor structures with unique subunit stoichiometries.</a> PNAS USA. 77 (12), 7137-7141 (1980).</li>
<li>Hoosein, N. M., Gurd, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Glucagon+Receptors+in+Rat+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Identification of Glucagon Receptors in Rat Brain.</a> PNAS USA. 81, 4368-4372 (1984).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Ilgi konusu bir proteinine karşı spesifik bir antikor ile Western lekeleri kullanımı embriyojenez sırasında ifadesini 7 incelemek için değerli bir araçtır. Bununla birlikte, yüksek-glikosile proteinlerin immünoblot yetersizlikler nedeniyle transfer ve nitroselüloz ya da PVDF zarlarına 8,9 zayıf bağlanma için çok başarılı olmamıştır. Proteoglikanlar çünkü negatif yüklü ve polistiren yüzeyler veya hidrofobik lekeleme membranların ya iyi bağlamaz onların kovalent bağlı gli...

Embriyonik gelişim sırasında eksprese edilen proteinlerin spesifik tespiti, aynı kökenli mRNA'larının RT-PCR veya in situ hibridizasyon (ISH) ile ölçülmesiyle elde edilen ekspresyon profillerini doğrulamak için gereklidir. Bu genellikle bir batı embriyo ekstraktları lekesi ve ardından spesifik antikorlarla tespit edilerek elde edilir. Bununla birlikte, bu yaklaşımın çok düşük miktarda bulunan veya lekelenmeleri sırasında kantitatif transferlerini engelleyen özelliklere sahip proteinlere uygulanması zordur. Tip III dönüştürücü büyüme faktörü β (TGF-β) reseptörü (TGFBR3) olarak da bilinen betaglikan, bu zorluklara bir örnektir. TGFBR3, TGF-β'yi çekirdek proteini 1 aracılığıyla bağlayan yarı zamanlı bir membran proteoglikanıdırve onu diğer TGF-β bağlayıcı protein2'den ayıran bir özellik olan TGF-β2 izoformu için belirgin şekilde daha yüksek afiniteye sahiptir. Zebra balığındaki TGFBR3, mRNA3'ünün RT-PCR'si ile tespit edildiği gibi, 8 hpf'den itibaren ifade edilir ve maksimum 72 hpf'ye ulaşır. 
Ancak, çok spesifik bir antikor3'ün mevcudiyetine rağmen, çevrilmiş ürününü western blot ile tespit etmeye yönelik her girişim başarısız oldu. TGFBR3'ün proteoglikan doğasının yanı sıra varsayılan düşük bolluğunun bu başarısızlıktan sorumlu olabileceği göz önüne alınarak, TGFBR3'ün TGF-β2 için yüksek afinitesinden yararlanan bir tespit yöntemi olan AFLIP geliştirilmiştir. Bu yöntemde, havuzlanmış embriyolardan elde edilen bir protein ekstraktının 125I etiketli TGF-β2'yi spesifik olarak bağlamasına izin verilir ve reseptör-ligand kompleksleri, SDS-PAGE ile ayrılmadan önce immünopresipitasyon ile saflaştırılır ve çapraz bağlanır. Jellerin otoradyografisi ile gözlemlenen göç modelleri, etiketli reseptör türlerinin varlığını ve doğasını ortaya çıkardı. Bu yaklaşım, afinite etiketlemesinin ligand özgüllüğünü spesifik antikorlar tarafından immünopresipitasyon ile birleştirir, algılama aralığını arttırır ve TGFBR3'ün verimsiz transfer lekelenmesini önler. Doğal özellikleri nedeniyle, AFLIP testi kantitatif bir test değildir, ancak analiz edilen reseptördeki göreceli deneysel farklılıkları güvenle ölçmek için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Diseksinimidil suberat (DSS)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>21555</td><td></td></tr><tr><td>Protein G Sefaroz 4 Hızlı Akış</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td>17-0618-01</td><td></td></tr><tr><td>Jel Kurutucu Model 583 & nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>1651745</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9400</td><td>GE Sağlık Yaşam Bilimleri</td><td>63-0055-78</td><td></td></tr><tr><td>Cobra II Otomatik gama sayacı</td><td>Packard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pozlama Kaseti</td><td>Moleküler Dinamik</td><td>63-0035-44</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>3624</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>J.T. Baker</td><td>3040</td><td></td></tr><tr><td>Na2</ alt>HPO<alt>4</alt></td><td>JT Fırıncı</td><td>3828</td><td></td></tr><tr><td>K<alt>2</alt>HPO<alt>4</alt></td><td>JT Fırıncı</td><td>3246</td><td></td></tr><tr><td>CH<alt>3</alt>OH</td><td>J.T. Fırıncı</td><td>9070</td><td></td></tr><tr><td>CH<alt>3</alt>COOH</td><td>JT Fırıncı</td><td>9508</td><td></td></tr><tr><td>HCHO</td><td>J.T. Fırıncı</td><td>2106</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Kristal Deniz Marine Mix</td><td>Deniz İşletmeleri Uluslararası</td><td>http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix</td><td></td></tr></tbody></table>

zebra balığı embriyolar endojen reseptör affinity etiketleme tespiti

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

Affinity Labeling ve Immunoprecipitasyon (AFLIP) güçlerini birleştirerek, zebra balığı embriyolarında düşük bolluk reseptörlerinin tespiti için bir teknik uygulanmıştır. Bu teknik, belirli bir reseptörün, immünopresipitasyonun özgüllüğü ile ligandı tarafından afinite etiketlemesi ile sağlanan seçicilik ve duyarlılıktan yararlanır. Erken zebra balığı gelişimi sırasında betaglikan olarak da bilinen tip III TGF-β reseptörünü (TGFBR3) tespit etmek için AFLIP kullandık. AFLIP, bir TGFBR3 morfant zebra balığı fenotipinin etkinliğini doğrulamada etkili oldu. İlk adımda, embriyo protein ekstraktları hazırlanır ve immünopresipitasyon ile saflaştırılan 125I-TGF-β2-TGFBR3 kompleksi oluşturmak için kullanılır. Daha sonra, bu kompleksler kovalent olarak çapraz bağlanır ve SDS-PAGE ayırma ve otoradyografi tespiti kullanılarak ortaya çıkarılır. Bu teknik, tespit edilecek reseptör için etiketli bir ligandın ve ona karşı spesifik bir antikorun mevcudiyetini gerektirir ve bu gereksinimleri karşılayan herhangi bir büyüme faktörü veya sitokin reseptörünü tanımlamak için kolayca uyarlanmalıdır.

Şekil 1, AFLIP ile elde edilen temsili bir sonuç göstermektedir. 125 I-ligand gelen Lane 1 Sinyaller kovalent (150 kDa işaretleyici altında BG çekirdek) zebrabalıkları Betaglikan çekirdek protein veya glikozaminoglikan eki (GAG, smear tarafından proteoglikan forma işlendikten BG çekirdek ya bağlı ), 170 kDa, jelin en arasında değişmektedir. Göç Bu model, keskin çekirdek proteini ek olarak (nedeniyle GAG zincirlerinin uzunluğu heterojenliği) bir bulaşmış proteo...

Zebra balığı embriyolarında bulunan düşük bolluktaki endojen reseptörlerin tespiti için yeni bir teknik tanımlanmıştır. Buna AFLIP adını verdik çünkü reseptörün immünopresipitasyona bağlı ligandı tarafından afinite etiketlemesinden oluşuyor.

Zebra balığı Embriyolar Endojen Reseptör Affinity Etiketleme Tespiti

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

Bu prosedürün genel amacı, seçilen reseptörün radyoaktif ligandı ile gerçekleştirilen afinite etiketlemesinin seçiciliğini ve hassasiyetini birleştirerek, zebra balığı embriyolarındaki düşük bolluktaki büyüme faktörü reseptörlerini tespit etmektir. Bu yöntem, reseptör ekspresyon seviyeleri ve biyokimyasal özellikleri gibi gelişimsel biyoloji alanlarındaki soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. AFLIP olarak adlandırdığımız bu yöntem, iyi tanımlanmış bir hücre biyolojisi tekniği olan afinite etiketlemesinin güçlü tanımlayıcı özelliklerini zebra balığı gelişimsel çalışmalarına taşımaktadır.Bu prosedüre başlamak için, her bir koşul için 100 ila 200 embriyo toplayın ve bunları balık suyu içeren petri kaplarına yerleştirin. Ardından, ince uçlu pensler kullanarak embriyoların koryonlarını manuel olarak çıkarın; hedef reseptörleri sindirebileceği için protokol boyunca pronaz veya başka herhangi bir proteaz kullanmaktan kaçının. Daha sonra, embriyoları 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve 1X PBS ile iki kez yıkayın.Ardından 500 µL deyolking tamponu ekleyin. Embriyoları çözelti içinde nazikçe yaklaşık 30 ila 40 kez pipetleyerek yolkun büyük kısmını serbest bırakın. 72 HPF ve 48 HPF embriyolar için sırasıyla mavi ve sarı pipet uçları kullanın.Embriyoların zarar görmesini önlemek için sarı uçlar hafifçe kesilebilir. Başarılı bir vitellus salınımı, embriyoların mikroskop altında gözlemlenmesiyle kontrol edilebilir. Vitellus lipidleri ve proteinleri, sonraki ligand veya antikor bağlanma basamaklarını etkileyebileceğinden, vitellusun uzaklaştırılması mümkün olduğunca eksiksiz yapılmalıdır.Ardından, embriyoları 600 x g'de 15 saniye boyunca santrifüj ederek toplayın. Süpernatantı bir pipet yardımıyla dikkatlice uzaklaştırın. Daha sonra, embriyoları en düşük hızda nazikçe vorteksleyerek 500 microliter yıkama tamponu ile iki kez yıkayın.Ardından embriyoları 600 x g'de 15 saniye boyunca santrifüj ederek toplayın. Bu aşamadan itibaren prosedüre dört santigrat derecede devam edin. Süpernatantı bir pipet kullanarak dikkatlice uzaklaştırın.Ardından, embriyoları 350 µL lizis tamponu içinde süspanse ederiz ve plastik bir havan eli kullanarak homojenize ederiz. Daha sonra, lizize edilmiş embriyoları 4 °C'de, bir tüp sallayıcı üzerinde ajitasyonla 30 dakika boyunca inkübe edin. Son olarak, çözünmeyen kalıntıları uzaklaştırmak için lizize edilmiş embriyoları 11,000 x g'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin.Ardından, berraklaşmış süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Toplam proteini Bradford protein analizi ile belirleyin ve kalibrasyon eğrisini çizin. Bu adımda, 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüpüne 400 ila 500 mikrogram toplam embriyo proteini yerleştirin ve tampon 1 ile mikrolitre başına bir mikrogram olacak şekilde seyrelttirin.Ardından, son konsantrasyon 150 picomolar olacak şekilde İyot-125 işaretli TGF-beta II stok çözeltisi ekleyin ve bir tüp sallayıcı ile dört derece Celsius'ta iki saat boyunca ajitasyonla inkübe edin. Daha sonra, 1:100 dilüsyon oranına ulaşmak için ilgili reseptöre karşı yalın antikor ekleyin. Ardından inkübasyona dört derece Celsius'ta iki saat daha veya gece boyunca devam edin.İnkübasyon sonrası, 50 µL uygun immünoglobulin bağlayıcı boncuk ekleyin ve dört °C'de tüp sallayıcıda ajitasyonla 50 dakika inkübe edin. Ardından, boncukları 11.000 x g'de 20 saniye boyunca mikro santrifüjle geri kazanın ve süpernatantı uygun bir radyoaktif atık konteynerine boşaltın. Sonrasında, IP boncuklarını, her seferinde 11.000 x g'de 20 saniye mikro santrifüjleme ve vorteksleme işlemleriyle bir mL IP yıkama tamponu ile üç kez yıkayın.Ardından IP boncuklarını 250 µL IP yıkama tamponu içinde yeniden süspande edin. Taze DSS çözeltisi hazırlayın ve numuneye 1,5 µL ekleyin. Bunu takiben, numuneyi dört °C'de, ajitasyon ile 15 dakika boyunca inkübe edin.Çapraz bağlama reaksiyonunu durdurmak için, pH 7.4'te 25 millimolar tryst chloride konsantrasyonuna ulaşacak miktarda tryst chloride stok ile desteklenmiş 500 microliters IP yıkama tamponu ekleyin. Ardından, IP boncuklarını toplamak için 11, 000 x g'de 20 saniye boyunca santrifüjleyin. Sonrasında, süpernatantı atın ve IP boncuklarını 30 microliters indirgeyici laemmli tamponu içinde yeniden süspande edin.Ardından, SDS-PAGE jel elektroforezi öncesinde örneği 94 °C'de beş dakika boyunca kaynatın ve ardından kurutulmuş jelleri bir fosforimetre ile veya geleneksel otoradyografi yöntemiyle analiz edin. Bu şekil, AFLIP ile elde edilen temsili sonuçları göstermektedir. 72 hpf ve 48 hpf'deki embriyolardan ekstrakte edilen toplam proteinler, İyot-125 TGF-beta II afinite etiketlemesine ve ardından kontrol olarak tavşan anti-zebrafish BG veya tavşan anti-rat BG ile IP işlemine tabi tutulmuştur.Otoradyografide, BG'nin GAG olmadan veya glikozaminoglikan modifiyeli bir BG olarak tespit edilebileceği görülebilir. Bu şekil, AFLIP'in deneysel bir manipülasyona maruz kalmış embriyolarda belirli bir reseptörün ekspresyon seviyelerini ölçmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir; bu örnekte, morfolino enjeksiyonu ile betaglikan seviyesindeki azalma ele alınmıştır. Birinci şerit 72 hpf yabanıl tip bir embriyodaki TGF beta reseptörü III seviyesini gösterirken, ikinci şerit ZFPG primer transkriptinin ekzon 2-intron 2 sınırına yönelik yedi nanogram morfolino uygulanmasının etkisini göstermektedir. Bu morfolino ile elde edilen BG downregülasyonunun, uyumsuz kontrolü ile tekrarlanmadığına dikkat ediniz.Bu sonuçlar, bu morfolino ile elde edilen fenotipin, daha önce açıklandığı üzere TGF beta reseptör III'ün nakavt edilmesine özgü olduğunu doğrulamıştır. AFLIP'in bir büyüme faktörü veya sitokin reseptörlerini tespit etmedeki başarısı, reseptörüne bağlanabilen ve çapraz bağlanabilen radyolabel bir ligandın mevcut olmasına bağlıdır. Ayrıca, immünopresipitasyon için uygun bir antikor gereklidir.Bu teknik bir kez kavrandığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde iki günde tamamlanabilir. AFLIP, western blot'un transfer basamağını dışladığı için, yoğun şekilde glikozillenmiş reseptörlerin daha gelişmiş bir şekilde saptanmasına olanak tanır. Bunu, western blot'ta transferi oldukça verimsiz gerçekleşen proteoglikan betaglikan örneğinde gördük. Bu prosedürün ardından, elektroforetik tekniklerle ortaya çıkarılabildikleri sürece, ek post-translasyonel modifikasyonları tanımlamak amacıyla enzimatik sindirim gibi diğer yöntemler uygulanabilir.Bu videoyu izledikten sonra, AFLIP yönteminin immünopresipitasyona bağlı afinite etiketlemesi yoluyla çeşitli balık embriyolarındaki düşük bolluklu reseptörlerin tespit edilmesine nasıl yardımcı olabileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Son olarak, İyot-125 ile çalışmanın dikkatle ve yeterli koruma altında yapılması gerektiğini unutmayın. Deneylerinizde başarılar dileriz.

affinity-labeling-detection-endogenous-receptors-from-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Erken embriyo şekli morfogenetik süreçleri anlamanın anahtarı, yüksek çözünürlükte görüntü hücrelerinin yeteneği. Biz burada tüm zebrafish embriyolar membran hedefli Yeşil Floresan Protein hücrelerin tek hücreler veya küçük kümeler etiketleme için kullanılan bir tekniktir açıklar.

Zebra balığı Beyin Etiketleme ve Görüntüleme Hücreleri

Bu protokol, Uncaged floresein gelen sinyali yükseltmek için immunolabeling tüm montaj takip kafesli flöresein UV uncaging kullanarak hücrelerin zebrafish embriyoların küçük gruplar kaderi etiket ve takip etmek için bir yol çizer.

Lazer Uncagable Floresein Dextran&#39;ın Zebra balığı Hücre Lineage Etiketleme

Safir femtosaniye lazer osilatör: Ti bir yöntem olup, bir iki-fotonlu emme ile bir kafes floresan proteini içeren tek bir hücre photoactivate için tarif edilmiştir. Kader haritası için fotoaktive hücre, immunohistokimya kullanılır. Bu teknik, her hücre tipi için de uygulanabilir.

Zebra balığı Tek Hücre Kader Haritalama

Bu video, zebra balığı radyal glia progenitörlerinde Notch/DeltaD sinyalini görüntülemek için bir antikor alım testini göstermektedir. Agaroza gömülü dekoryonlu zebra balığı embriyolarının monte edilmesini, RGP'ler üzerinde DeltaD ligandlarını hedefleyen bir boya çözeltisinin enjekte edilmesini ve Notch / DeltaD sinyal aktivasyonunu doğrulayan asimetrik hücre bölünmesi için bir floresan mikroskobu altında görüntülemeyi içerir.

Zebra Balığı Radyal Glia Progenitörlerinde Çentik/DeltaD Sinyalini Görüntülemek için Bir Antikor Alım Testi

Zebra balığı embriyolarının dokuya özel floresans yarı otomatik görüntüleme için bir protokol aşağıda tarif edilmiştir.

Zebra balığı Embriyolar Doku spesifik Floresans yarı otomatik Görüntüleme

Zebra balığı embriyo gelişim biyoloji araştırma için mükemmel bir model. Embriyogenez sırasında, zebra balığı örnek gözlem ve analiz için üç-boyutlu zorluklar sunuyor, bir yumurta sarısı kitle ile gelişir. Bu protokol situ (DİLERİZ) lekeli Zebra balığı embriyo örnekleri içinde bütün montaj iki-boyutlu düz monte hazırlıkları nasıl oluşturulacağı açıklanır.

Tüm Dağı ile Zebra balığı Embriyo örnekler Vitray gözlenmesi ve Analiz Daire Dağı Hazırlık<em&gt; In situ</em&gt; Melezleme

Kirpikler geliştirme için uygun organogenesis hayati önem taşımaktadır. Bu iletişim kuralı etiket ve Zebra balığı siliyer hücreleri görselleştirmek için en iyi duruma getirilmiş bir yöntemini açıklar.

Zebra balığı bütün Dağı Floresan Situ hibridizasyon ve ayirt kombine bir protokol aracılığıyla Multiciliated hücrelerde görüntülenmesi

Bu protokol, erken evre zebrafit embriyoları belirli hücre popülasyonlarında hassas kolokalizasyon analizlerini sağlayarak, krobölümler üzerinde sıralı immünofluoresesans ve immünhistokimyasayı gösterir.

Cryosec, zebrafish embriyo üzerinde sıralı Immünofluorescence ve Immünhistokimya

Bu protokol, zebra balığı embriyonik kesitlerinin in situ hibridizasyonu ve immünohistokimyasını birleştirerek görüntülerin nasıl elde edileceğini açıklar. Kriyoseksiyondan önce in situ hibridizasyon yapıldı, bunu takiben antikor boyaması yapıldı. Zebra balığında iki genin ekspresyon kalıplarını, antikorların yetersizliği varsa tespit etmek yararlıdır.

In Situ Kriyokesitli Zebra Balığı Embriyolarında İmmünohistokimya ile Kombine Hibridizasyon

Bu çalışma, embriyonik zebra balığı beyninin radyal glia progenitörlerinin bölünmesinde soy içi Notch / DeltaD sinyalini görüntülemek için bir antikor alım testi geliştirmektedir.

Zebra Balığı Radyal Glia Progenitörlerinin Asimetrik Bölünmesi Sırasında Çentik / Delta Endositozunu İzlemek için Antikor Alım Testi

Burada, özellikle zebra balıklarında düşük bolluktaki proteinleri görselleştirmek için yararlı olan, yeni geliştirilen ve modifiye edilen bir in vivo sistem olan zebra balığı larvalarında proteinleri floresan protein etiketi ile etiketlemek için bir protokol sunuyoruz.

Zebra balıklarında düşük eksprese edilen proteinleri görselleştirmek için floresan etiketleme

Öğrenin, AFLIP yöntemiyle zebra balığı embriyolarında düşük yoğunluklu büyüme faktörü reseptörlerini tespit etmeyi. Bu teknik, afinitetik etiketleme ve immünopresipitasyonu birleştirerek gelişimsel biyoloji araştırmalarında reseptör dinamiklerini incelemenizi sağlar.

Zebra balığı Embriyolar Endojen Reseptör Affinity Etiketleme Tespiti

Daha fazla video keşfet