Zebra balığı Embriyolar Endojen Reseptör Affinity Etiketleme Tespiti

Bu prosedürün genel amacı, seçilen reseptörün radyoaktif ligandı ile afinite etiketlemesinin seçiciliğini ve duyarlılığını birleştirerek zebra balığı embriyolarında düşük bolluklu büyüme faktörü reseptörlerini tespit etmektir. Bu yöntem, reseptör ekspresyon seviyeleri ve biyokimyasal özellikleri gibi gelişimsel biyoloji alanlarındaki soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. AFLIP olarak adlandırdığımız bu yöntem, zebra balığı gelişim çalışmalarına iyi bilinen bir hücre biyolojisi tekniği olan afinite etiketlemesinin güçlü bir tanımlayıcı niteliğini genişletir.

Bu işleme başlamak için, her koşul için 100 ila 200 embriyo toplayın ve bunları balık suyu içeren petri kaplarına yerleştirin. Daha sonra ince uçlu forseps kullanarak embriyoları manuel olarak dekoryonlayın ve hedeflenen reseptörleri sindirebileceği için protokol boyunca pronaz veya başka bir proteaz kullanmaktan kaçının. Daha sonra, embriyoları 1.5 mililitrelik bir mikrofüj tüpüne yerleştirin ve 1X PBS ile iki kez yıkayın.

Ardından 500 mikrolitre yumurta sarısı giderme tamponu ekleyin. Solüsyondaki embriyoları yaklaşık 30 ila 40 kez yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyerek yumurta sarısının çoğunu serbest bırakın. 72 HPF ve 48 HPF embriyosu için sırasıyla mavi ve sarı pipet uçları kullanın.

Embriyoları tahrip etmemek için sarı uçların hafifçe kesilmesi gerekebilir. Başarılı bir yumurta sarısı salınımı, embriyoların mikroskop altında gözlemlenmesiyle kontrol edilebilir. Sarısı lipitleri ve proteinleri sonraki ligand veya antikor bağlama adımlarına müdahale edebileceğinden, yumurta sarısının çıkarılması mümkün olduğunca eksiksiz olmalıdır.

Bundan sonra, embriyoları 15 saniye boyunca 600 x g'da santrifüjleme ile toplayın. Süpernatanı bir pipet kullanarak dikkatlice atın. Daha sonra, embriyoları 500 mikrolitre yıkama tamponu ile en düşük hızda hafifçe girdaplayarak iki kez yıkayın.

Daha sonra embriyoları 15 saniye boyunca 600 x g'da santrifüj ederek toplayın. Buradan itibaren işleme dört santigrat derecede devam edin. Süpernatanı bir pipet kullanarak dikkatlice atın.

Daha sonra embriyoları 350 mikrolitre lizis tamponunda bekletiyoruz ve plastik bir tokmak kullanarak homojenize ediyoruz. Daha sonra, parçalanmış embriyoları dört santigrat derecede bir test tüpü rocker üzerinde çalkalama ile 30 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, çözünmeyen kalıntıları gidermek için parçalanmış embriyoları 15 dakika boyunca 11.000 x g'da santrifüjleyin.

Bunu takiben, temizlenmiş süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Bradford protein tahlili ve çizim kalibrasyon eğrisi ile toplam proteini belirleyin. Bu adımda, 400 ila 500 mikrogram toplam embriyo proteinini 1.5 mililitrelik bir mikrofüj tüpüne yerleştirin ve tampon 1 ile mikrolitre başına bir mikrograma seyreltin.

Daha sonra, 150 pikomolar nihai konsantrasyona ulaşmak için İyot-125 etiketli TGF-beta II stoğu ekleyin ve dört santigrat derecede iki saat boyunca bir test tüpü külbütörü üzerinde çalkalama ile inkübe edin. Bundan sonra, 1:100 seyreltmeye ulaşmak için ilgilenilen reseptöre karşı seyreltilmemiş antikor ekleyin. Daha sonra inkübasyona iki saat veya gece boyunca dört santigrat derecede devam edin.

İnkübasyondan sonra, 50 mikrolitre uygun immünoglobulin bağlayıcı boncuk ekleyin ve dört santigrat derecede bir test tüpü külbütörü üzerinde çalkalama ile 50 dakika inkübe edin. Daha sonra boncukları 20 saniye boyunca 11.000 x g'da mikrosantrifüjleme ile geri kazanın ve süpernatanı uygun bir radyoaktif çöp kutusuna atın. Daha sonra, IP boncuklarını, her seferinde 20 saniye boyunca 11.000 x g'da mikrosantrifüjlemede girdaplayarak bir mililitre IP yıkama tamponu ile üç kez yıkayın.

Ardından IP boncuklarını 250 mikrolitre IP yıkama tamponunda yeniden askıya alın. Taze DSS çözeltisi hazırlayın ve numuneye 1,5 mikrolitre ekleyin. Bunu takiben, numuneyi çalkalama ile dört santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.

Çapraz bağlama reaksiyonunu söndürmek için, 25 milimolar kırma klorüre ulaşmak için pH 7.4'te yeterli kırma klorür stoğu ile desteklenmiş 500 mikrolitre IP yıkama tamponu ekleyin. Daha sonra, IP boncuklarını toplamak için 20 saniye boyunca 11, 00 x g'de santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı atın ve IP boncuklarını 30 mikrolitre indirgeyici laemmli tamponunda yeniden süspanse edin.

Daha sonra, SDS-PAGE jel elektroforezinden önce numuneyi 94 santigrat derecede beş dakika kaynatın ve ardından kurutulmuş jelleri bir fosforimetrede veya geleneksel otoradyografi ile analiz edin. Bu şekil, AFLIP ile elde edilen temsili sonuçları göstermektedir. Embriyolardan 72 hpf ve 48 hpf'de ekstrakte edilen toplam protein, İyot-125 TGF-beta II afinite etiketlemesine tabi tutuldu, ardından kontrol olarak tavşan anti-zebra balığı KŞ veya tavşan anti-sıçan KŞ ile IP uygulandı.

Otoradyografide KŞ, GAG olmadan veya glikozaminoglikan ile modifiye edilmiş bir KŞ olarak tespit edilebilir. Bu şekil, AFLIP'in deneysel bir manipülasyona tabi tutulan embriyolarda belirli bir reseptörün ekspresyon seviyelerini ölçmek için nasıl kullanılabileceğini, bu durumda betaglikanın morfolino enjeksiyonuna indirgenmesini göstermektedir. Birinci şerit, 72 hpf vahşi tip bir embriyoda TGF beta reseptörü III seviyesini gösterirken, ikinci şerit, ZFPG primer transkriptinin ekzon 2-intron 2 sınırına yönlendirilmiş yedi nanogram bir morfolino'nun uygulanmasının etkisini gösterir. Bu morfolino ile elde edilen KŞ aşağı regülasyonunun, uyumsuz kontrolü tarafından yeniden üretilmediğine dikkat edin.

Bu sonuçlar, bu morfolino ile elde edilen fenotipin, daha önce tarif edildiği gibi TGF beta reseptörü III'ün yıkılmasına özgü olduğunu doğruladı. AFLIP'in bir büyüme faktörünü veya sitokin reseptörlerini tespit etmedeki başarısı, reseptörüne bağlanabilen ve çapraz bağlanabilen radyoaktif işaretli bir ligandın mevcudiyetine bağlıdır. İmmünopresipitasyon için iyi bir antikor da gereklidir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki gün içinde yapılabilir. AFLIP, western blotun transfer adımından kaçındığından, ağır glikosile reseptörlerin gelişmiş bir şekilde saptanmasına izin verir. Ve burada, western blot'ta çok verimsiz bir şekilde transfer olan proteoglikan betaglikan için gördük Bu prosedürü takiben, elektroforetik tekniklerle ortaya çıkarıldıkları sürece, ek translasyon sonrası modifikasyonu tanımlamak için enzimatik sindirim gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, AFLIP'in immünopresipitasyona bağlı afinite etiketlemesi ile birkaç balık embriyosunda düşük miktarda bulunan reseptörleri tespit etmenize nasıl yardımcı olabileceğini iyi anlamalısınız. Son olarak, İyot-125 ile çalışmanın dikkatli ve yeterli koruma ile yapılması gerektiğini unutmayın. Deneylerinizde iyi şanslar.