Kantitatif Uygulamalar için Homojen MALDI Örneklerin Hazırlanması

MALDI MS'den bu numune hazırlama yönteminin genel amacı, MALDI MS sırasında iyon sinyallerindeki uzamsal heterojenliği azaltmaktır. Kurutma işlemi sırasında numune damlacığı içindeki hidrodinamik akışları manipüle ederek geleneksel kurutulmuş damlacık yöntemini optimize etmek için iyi kontrol edilen bir kurutma ortamı oluşturulmuştur. Bu tekniğin temel avantajı, optimize edilmiş kurutulmuş damlacık yöntemiyle hazırlanan numune için iyon sinyallerinin uzamsal heterojenliğinin etkili bir şekilde azaltılabilmesidir. Bu yöntem THAP Metrik Sistemi için homojen numuneler sağlayabilir.

Alfa-Siyano-4-hidroksisinnamik asit gibi diğer metrik sistemlere de uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, kurutma durumunu kontrol etmek kolay olmadığı için zorlandı. Bu prosedüre başlamak için, bir kurutma odasının kapısını açın ve hemen önceden temizlenmiş bir numune plakasını bakır bazlı bloğun üzerine yerleştirin.

Ardından kapıyı kapatın. Nitrojen akış hızını saatte 10 standart fit küp olarak ayarlamak için gaz akış ölçeri manuel olarak ayarlayın. Bunu takiben, bir higrometre ile ölçüldüğü gibi, kurutma odasında bağıl nemin her zaman %25'in altında olmasını sağlamak için gaz akış ölçerde ince ayar yapın.

Sıcaklığı izlemek için K Tipi Termokupllar kullanarak, numune plakası deney için 5 santigrat dereceye ulaşana kadar su sirkülatör sıcaklığını manuel olarak ayarlayın. Numune biriktirmeden önce gerekli sıcaklıklara ve bağıl neme ulaşıldığından emin olun. 0.25 mikrolitre 0.1 Molar THAP çözeltisi ve 0.25 mikrolitre istenen analiti bir mikrosantrifüj tüpünde karıştırın.

Numuneyi üç saniye boyunca vorteksleyin. Ardından, çözeltiyi mikrosantrifüj tüpünün dibinde toplamak için numuneyi iki saniye santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, kurutma odasının kapısını açın ve 0,1 mikrolitre çözeltiyi bir pipetle numune plakasına dikkatlice bırakın.

Kapıyı hemen kapatın ve numune damlacığının kurumasını bekleyin. Numune plakası sıcaklığı çevresinden daha düşük tutulduğunda, molekülleri yeniden dağıtmak için damlacık içindeki devridaim akışlarının ortalama hızı önemli ölçüde artırılır. Numune biriktirme, veri kalitesini ve tekrarlanabilirliği belirleyen en kritik adımdır.

Numunenin kontrollü koşul altında kristalize olmasını sağlamak için önceden karıştırılmış numune çözeltisinin hemen numune plakasına bırakılması gerekir. Kuruduktan sonra kapıyı açın. kurutma odasının.

Ardından, su sirkülatörü sıcaklığını 25 santigrat dereceye ayarlayın. Numune plakası sıcaklığı 25 santigrat dereceye döndüğünde, numune plakasını kurutma odasından çıkarın. Örnek morfolojisini beş kat büyütülmüş bir Stereo mikroskop altında inceleyin ve anlık görüntü parlak alan görüntüsü alın.

Bu noktada, numune plakasını bir MALDI Kütle Spektrometresine yerleştirin. Ardından, görüntüleme kütle spektrometresi analizi yapın. Sonuç penceresinde gösterilen kütle listesinden karakteristik bir kütle tepe noktası seçin ve iki boyutlu bir iyon görüntüsü çizmek için 2D'ye tıklayın.

Ardından, görüntü çözünürlüğünü artırmak için sinyal yoğunluğunun üst ve alt sınırlarını belirlemek için açılır penceredeki ayar düğmelerine tıklayın ve bir resim kaydet'e tıklayın. Temel numune bölgesini elde etmek için iyon görüntüsünü gözlemleyin ve daha önce elde edilen parlak alan görüntüsüyle karşılaştırın. Şimdi, analiz edilecek bölgeye ince ayar yapmak için sonuç penceresinde gösterilen iyon görüntüsündeki boş noktalara ve çatlak bölgelere tıklayın.

İyon görüntüsünün en dış katmanını bulmak için kenarı bul düğmesine tıklayın. Bunu takiben, en dıştaki katmanın iyon bolluğu bilgisini bir veritabanına kaydetmek için çıkar'a tıklayın ve bu katmanı aynı anda iyon görüntüsünden kaldırın. İyon görüntüsünün merkezi tanımlanana kadar önceki adımları tekrarladıktan sonra, çıktı verileri listesindeki tüm onay kutularını tıklayıp seçin ve verileri dışa aktarmak için dışa aktar'a tıklayın.

Son olarak, iyonların uzamsal dağılım bilgilerini elde etmek için her katmanın ortalama iyon bolluğunu hesaplamak için elektronik tablo yazılımını kullanarak dışa aktarılan verileri açın. Maltotriozun parlak alan ve MALDI görüntülerinde, sodyum formun iyon sinyali, 25 santigrat derecelik bir numune plakası sıcaklığı ile hazırlandığında, esas olarak numune alanının çevresinde doldurulur. Sıcaklığı beş santigrat dereceye düşürerek, sinyal tüm numune alanı üzerinde homojen bir şekilde doldurulur, bu da numunelerin daha düşük bir numune plakası sıcaklığı altında hazırlanmasının molekülleri önemli ölçüde yeniden dağıtabileceğini ve heterojenliği azaltabileceğini düşündürür.

Protonlanmış bradikinin fragman iyonu görüntüsü, sodiated maltotrioz ile benzer bir eğilim gösterir. İstatistiksel analizler, 5 santigrat derece sıcaklıkta elde edilen iyon sinyallerinin heterojenliğinin, 25 santigrat derecenin altındakine göre yüzde 60 ila 80 oranında azaldığını göstermektedir. 25 santigrat derece sıcaklıkta bir numune plakası sıcaklığına sahip sodyum maltotrioz durumunda, merkezlerdeki sinyal yoğunlukları 5 santigrat derece sıcaklığa sahip olanlardan çok daha düşüktür.

Protonlanmış bradikinin fragmanı, numune plakası sıcaklığını 25 ila 5 santigrat dereceden düşürürken daha az varyasyon gösterir. Bu kurutma yöntemi denenirken, kurutma odasındaki sıcaklıkların ve bağıl nemin dikkatli bir şekilde kontrol edilmesi ve izlenmesi gerekir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknikle hazırlanan bir örnek, uygun şekilde yapılırsa 30 dakika içinde yapılabilir.

Geliştirildikten sonra, bu teknik, MALDI MS alanındaki araştırmacıların kurumuş damlacık örnekleri için kantitatif analizi keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, MALDI MS analizi için homojen kurutulmuş damlacık numunelerinin nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız.