Kantitatif Uygulamalar için Homojen MALDI Örneklerin Hazırlanması

MALDI MS için geliştirilen bu numune hazırlama yönteminin genel amacı, MALDI MS sırasında iyon sinyallerindeki uzamsal heterojenliği azaltmaktır. Kurutma işlemi sırasında numune damlacığı içerisindeki hidrodinamik akışlar manipüle edilerek, geleneksel kurutulmuş damlacık yöntemini optimize etmek için iyi kontrollü bir kurutma ortamı oluşturulmuştur. Bu tekniğin temel avantajı, optimize edilmiş kurutulmuş damlacık yöntemiyle hazırlanan numunelerin iyon sinyallerindeki uzamsal heterojenliğin etkili bir şekilde azaltılabilmesidir. Bu yöntem, THAP Metrik Sistemi için homojen numuneler sağlayabilmektedir.

Bu yöntem, alfa-Siyano-4-hidroksisinnamik asit gibi diğer metrik sistemlere de uygulanabilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, kurutma koşullarını kontrol etmenin kolay olmaması nedeniyle zorluk yaşamışlardır. Bu prosedüre başlamak için kurutma odasının kapısını açın ve önceden temizlenmiş bir numune plakasını hemen bakır bazlı bloğun üzerine yerleştirin.

Ardından, kapağı kapatın. Azot akış hızını saatte 10 standart kübik fit olarak ayarlamak için gaz akış ölçerini manuel olarak ayarlayın. Bunun ardından, bir higrometre ile ölçüldüğünde, kurutma odasındaki bağıl nemin her zaman %25'in altında olduğundan emin olmak için gaz akış ölçerini hassas şekilde ayarlayın.

Sıcaklığı izlemek için K Tipi Termokupllar kullanarak, deney için örnek plakası 5 °C'ye ulaşana kadar su sirkülatörü sıcaklığını manuel olarak ayarlayın. Örnek biriktirme işleminden önce gerekli sıcaklıklara ve bağıl neme ulaşıldığından emin olun. Bir mikrosantrifüj tüpünde 0,25 µL 0,1 M THAP çözeltisi ve 0,25 µL istenen analiti karıştırın.

Numuneyi üç saniye boyunca vorteksleyin. Ardından, çözeltiyi mikrosantrifüj tüpünün dibinde toplamak için numuneyi iki saniye boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminin ardından, kurutma odasının kapağını açın ve bir pipet yardımıyla numune plakasına dikkatlice 0.1 µL çözelti bırakın.

Kapağı hemen kapatın ve örnek damlacığının kurumasını bekleyin. Örnek plakası sıcaklığı çevresinden daha düşük tutulduğunda, moleküllerin yeniden dağılması için damlacık içindeki yeniden dolaşım akışlarının ortalama hızı önemli ölçüde artar. Örnek biriktirme, veri kalitesini ve tekrarlanabilirliğini belirleyen en kritik adımdır.

Örneğin kontrollü koşullar altında kristalleşmesini sağlamak için önceden karıştırılmış örnek çözeltisi derhal örnek plakasına yerleştirilmelidir. Kurutma işleminden sonra kurutma haznesinin kapağını açın.

Ardından, su sirkülatör sıcaklığını 25 °C'ye ayarlayın. Örnek plakası sıcaklığı 25 °C'ye döndüğünde, örnek plakasını kurutma haznesinden çıkarın. Örnek morfolojisini beş kat büyütmeli bir Stereo mikroskop altında inceleyin ve parlak alan görüntüsünün anlık fotoğrafını çekin.

Bu noktada, örnek plakasını bir MALDI Kütle Spektrometresine yerleştirin. Ardından, görüntüleme kütle spektrometrisi analizini gerçekleştirin. Sonuç penceresinde gösterilen kütle listesinden karakteristik bir kütle piki seçin ve iki boyutlu bir iyon görüntüsü çizmek için 2D'ye tıklayın.

Ardından, sinyal yoğunluğunun üst ve alt sınırlarını belirlemek ve görüntü çözünürlüğünü artırmak için açılır penceredeki ayar düğmelerine tıklayın ve resmi kaydet'e tıklayın. Temel numune bölgesini elde etmek için iyon görüntüsünü, daha önce elde edilen parlak alan görüntüsü ile gözlemleyin ve karşılaştırın. Şimdi, analiz edilecek bölgeyi hassas bir şekilde ayarlamak için sonuç penceresinde gösterilen iyon görüntüsündeki boş noktalara ve çatlak bölgelere tıklayın.

İyon görüntüsünün en dış katmanını bulmak için "find edge" (kenarı bul) düğmesine tıklayın. Ardından, en dış katmanın iyon bolluğu bilgisini bir veri tabanına kaydetmek ve aynı zamanda bu katmanı iyon görüntüsünden kaldırmak için "deduct" (çıkar) düğmesine tıklayın. İyon görüntüsünün merkezi tanımlanana kadar önceki adımları tekrarladıktan sonra, çıktı veri listesindeki tüm onay kutularını tıklayarak seçin ve verileri dışa aktarmak için "export" (dışa aktar) düğmesine tıklayın.

Son olarak, her katmanın ortalama iyon bolluğunu hesaplayarak iyonların uzaysal dağılım bilgilerini elde etmek için dışa aktarılan verileri bir hesap tablosu yazılımı kullanarak açın. Maltotriozun brightfield ve MALDI görüntülerinde, numune plakası sıcaklığı 25 °C olarak ayarlandığında, sodyumlanmış formun iyon sinyali temel olarak numune alanının çevresinde yoğunlaşır. Sıcaklık beş °C'ye düşürüldüğünde, sinyal tüm numune alanı boyunca homojen olarak dağılır; bu durum, numunelerin daha düşük bir numune plakası sıcaklığında hazırlanmasının molekülleri önemli ölçüde yeniden dağıtabileceğini ve heterojenliği azaltabileceğini göstermektedir.

Protonlanmış bradikinin fragman iyon görüntüsü, sodyumlanmış maltotriozla benzer bir eğilim göstermektedir. İstatistiksel analizler, 5 °C örnek plaka sıcaklığında elde edilen iyon sinyallerinin heterojenliğinin, 25 °C'ye kıyasla yüzde 60 ila 80 oranında azaldığını göstermektedir. Sodyumlanmış maltotrioz durumunda, 25 °C örnek plaka sıcaklığında merkezlerdeki sinyal yoğunlukları, 5 °C sıcaklıktakilere göre çok daha düşüktür.

Protonlanmış bradikinin fragmanı, örnek plaka sıcaklığı 25'ten 5 santigrat dereceye düşürüldüğünde daha az varyasyon göstermektedir. Bu kurutma yöntemi denenirken, kurutma odasındaki sıcaklık ve bağıl nemin dikkatle kontrol edilmesi ve izlenmesi gerekir. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, prosedür doğru şekilde uygulandığı takdirde bir örneğin hazırlanması 30 dakikada tamamlanabilir.

Geliştirilmesinin ardından bu teknik, MALDI MS alanındaki araştırmacıların kurumuş damlacık örnekleri için kantitatif analizleri keşfetmelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, MALDI MS analizi için homojen kurumuş damlacık örneklerinin nasıl hazırlanacağı konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız.