Name: Kantitatif Uygulamalar için Homojen MALDI Örneklerin Hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Öğrenin MALDI kütle spektrometrisi için homojen örnek hazırlama yöntemini. Kontrollü kurutma ortamı ve hidrodinamik akış manipülasyonu kullanarak iyon sinyallerindeki uzamsal heterojenliği azaltın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Sinica Akademisi Genomik Araştırma Merkezi ve Çin Cumhuriyeti Tayvan Bilim ve Teknoloji Bakanlığı tarafından desteklenmektedir (Sözleşme No. 104-2119-M-001-014).

NOT: Bu protokol, kurutuldu-damlacık yöntemiyle hazırlanan maltotrioz ve bradikinin fragmanı (1-7) mekansal heterojen azaltmak için geliştirilmiştir. Protokol hazırlanması ve ön koşullandırma, örnek bırakma ve kurutma ve kütle spektrometrisi veri analizi de dahil olmak üzere, üç ana adımdan oluşur. prosedürleri tarif ve aşağıda daha ayrıntılı olarak tarif edilmiştir: 1. Hazırlık ve Önkoşullanma <ol><li> Örnek Plate Temizleme <ol><li> nitril eldiven giyin ve deterjan ve distile-deiyonize su (DDW) ile hafifçe örnek plaka el yıkayın. </li><li> metanol (MeOH) ve DDW ile örnek plaka durulayın. </li><li> 600 ml beher örnek plaka takın ve DDW ile doldurun. </li><li> ultrasonik banyoda (200 W, 40 kHz) &#39;de 15 dakika süre ile DDW içinde örnek plaka sonikasyon. </li><li> kaptan DDW çıkarın ve MeOH ile beher doldurun. </li><li> ultrasonik banyo (200 W, 40 kHz) 15 dakika boyunca MeOH içerisinde örnek plaka sonikasyon. </li><li> Azot gazı ile plaka üzerinde çözücü damla uçururum ve örnek birikimi önce kuru numune plaka tutun. </li></ol></li><li> Düzenlenmesi Kurutma Odası Sıcaklığı NOT:. Kurutma odası 35 x 20 x 45 cm 3 (W x D x Y) akrilik haznesi Şekil 1, bu kurutma sisteminin resmini gösterir. odası kurutma bölmesinin içine monte kalibre edilmiş bir higrometre ile gözlenmiş düşük nispi nem durumunu korumak için sabit bir akış oranında bir gaz akış ölçer ile oda sıcaklığında azot gazı ile temizlenmiştir. programlanmış sabit sıcaklık su sirkülatör sahip kurutma bölmesi bir bakır temel blok çelik örneği plakaları karşılamak için kullanılır. bakır taban bloğu 25 ° C 5 örnek plaka ısısını düzenlemek için yapabiliyor. hava, bakır taban bloğu ve numune plakasının sıcaklık K-tipi termokupllar ile kontrol edilir. <ol><li> Kapıyı açın ve hızla bakır örnek plaka koymakBaz bloğu sonra kapağını kapatın. </li><li> El ile saatte 10 standart kübik feet (SCFH&#39;dir) azot akış hızını ayarlamak için gaz debi ölçer ayarlayın. </li><li> bağıl nem her zaman% 25&#39;in altına sağlamak için higrometre ve ince ayar gaz debimetre ile kurutma odasında bağıl nemi izleyin. </li><li> K-tipi termokupl tarafından numune plaka sıcaklığını izlemek ve örnek plakası deney ya da kontrol için oda sıcaklığında (25 ° C) 5 ° C ulaşana kadar manuel olarak su sirkülasyon sıcaklığını ayarlamak. NOT: tasarlanan sıcaklıkta örnek plaka stabilize etmek için, su sirkülasyon sıcaklığı tipik olarak tasarlanmış örnek daha düşük, 5 ° C ila 0 olarak ayarlanır. Örneğin, örnek plakasına 5 ° C tutmak için su sirkülatörün sıcaklık ayarı 2 ° C ila 0 aralığındadır; 25 ° C&#39;de bir örnek plaka korumak için, suyun sirkülatörün sıcaklık ayarı 23-25 ​​° C aralığındadır. </li><li> Gerekli sıcaklık ve bağıl nem örnek birikimi önce (Tablo 1) ulaşılır emin olun. Not: farklı numune plakası sıcaklıkları kurutma işlemleri için tüm parametrelerin yanı sıra ayar değerleri Tablo 1 &#39;de gösterilmiştir. NOT: oda kapısı uzun süre açık ise düşük örnek plaka sıcaklığında numune plaka üzerinde su yoğunlaşması oluşabilir. Su yoğunlaşması oluşursa kapıyı kapatın ve su yoğunlaşması kurumuş kadar üzerinde herhangi bir örnek yatırmak ETMEYİN. </li></ol></li><li> Matris ve analit Çözümleri Hazırlanması <ol><li> matris çözümleri hazırlanması <ol><li> % 50 DDW sulu solüsyon: 50% asetonitril (ACN) ile 0.1 M thap çözeltisi hazırlayın. </li></ol></li><li> Analitlerin hazırlanması <ol><li> DDW ile 10 -4 M maltotriozdur çözeltisi hazırlayın. </li><li> % 50 asetonitril, 10 5 M bradikinin fragmanı hazırlandı (1-7) çözeltisi(ACN):% 50 DDW sulu çözelti. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Örnek Biriktirme ve Kurutma <ol><li> Karışımlar 0.1M thap solüsyonu 0.25 | il 10 4 M maltotrioz veya 10 5 M bradikinin fragmanı (1-7), bir mikrosantrifüj tüpü içinde çözeltiler 0.25 ul. </li><li> 3 sn karışık bir çözüm karıştırın. </li><li> santrifüj tüpünün dibinde çözüm toplamak için 2 sn (2000 xg) karışık bir çözüm santrifüjleyin. </li><li> dikkatle, kurutma odasının kapısını açın pipet ile örnek plaka üzerinde solüsyonun 0.1 ul yatırmak ve hemen kapıyı kapatın. </li><li> Örnek damlacık kurumasını bekleyin. . NOT: Farklı numune plaka sıcaklıkları genellikle gözlenen kurutma süreleri Tablo 1&#39;de listelenen 5 ° C örnek plaka sıcaklığı için, ortalama kuruma süresi 800 1000 sn; 25 ° C Örnek plakası sıcaklığı için ortalama kuruma süresi 100 ile 150 sec. </li><li> Kuruduktan sonra, kurutma odasının kapısını açın. </li><li> oda sıcaklığında (25 ° C) su sirkülasyon sıcaklığını ayarlamak. NOT: Numune plaka kurutma işlemi sırasında, oda sıcaklığında (25 ° C) sürekli tutulursa, bu adımı atlayın. </li><li> Oda sıcaklığında (25 ° C) Örnek plaka sıcaklığı döndükten sonra, kurutma bölmesinin örnek plakasını çıkarın. </li><li> 5X stereomikroskop altında örnek morfolojisi incelemek ve bir anlık parlak alan görüntü almak. Not: kristal morfolojileri olarak beklenmemektedir, bu aynı prosedür ile yeni bir numune hazırlamak için gereklidir. Tipik bir kristal morfolojisi, Şekil 2&#39;nin üst panel gösterilmiştir. NOT: 5 ° C gibi düşük örnek plaka sıcaklığına sahip durumlarda, kurutma bölmesinin çıkarmadan önce oda sıcaklığına örnek plaka ısıtmak için önemlidir. Örnekleri yatırma yaparken, önceden karıştırılmış Solutio tutmak YAPMAYINn 10 sn boyunca pipet ucu. numuneleri yatırma sonra yeniden premix çözüm kullanmayan ETMEYİN. Şekil 2&#39;nin üst panel farklı numune plakası sıcaklıkları ile hazırlanan numunelerin parlak alan görüntüleri gösterir. </li></ol> 3. Kütle Spektrometresi Veri Analizi <ol><li> Kütle Spektrometre Veri Toplama NOT: hazırlandıktan sonra, numune görüntüleme kütle spektrometresi kullanılarak analiz edilebilir. Bu çalışmada, görüntüleme MS deneyler laboratuar yönelik yapılmış senkronlaştırılmış çift kutup TOF kullanılarak gerçekleştirilir (DP-TOF) kütle spektrometresi görüntüleme. Görüntüleme yeteneği ile 15 ticari MALDI-TOF kütle spektrometre aynı zamanda, deneyler için de uygundur. kütle spektrometresi doğrusal ekstraksiyon ve optimize edilmiş emme gecikmeler ile pozitif iyon modunda çalıştırılır. iyonların kinetik enerjisi 20 kV. Lazer ışını boyutu örnek yüzeyinde çapı 35 mikron ve her nokta spektrum ave olduğunu5 lazer çekim öfke. <ol><li> MALDI kütle spektrometresi içine örnek plaka yerleştirin. </li><li> adımlarda 2,1-2,9 hazırlanan örnek kütle spektrometresi analizi görüntüleme gerçekleştirin. </li><li> sonuç penceresinde gösterilen kitle listeden karakteristik kitle tepe seçin ve iki boyutlu iyon görüntü çizmek için &quot;2D&quot; tıklayın. Not: thap ile karıştırılır maltotrioz için, karakteristik tepe noktaları maltotrioz, protonlanmış thap sodiated ve thap sodiated edilir. Thap ile karıştırıldı bradikinin fragmanı (1-7) için, karakteristik tepe noktaları bradikinin fragmanını (1-7) protonlanmış thap protonlanmış ve thap sodiated içerir. </li><li> sinyal yoğunluğu üst ve alt limitlerini belirlemek için pop-up pencere ayar düğmelerini tıklatın ve &quot;bir resmi kaydetmek&quot; butonuna tıklayınız. Bu ayar, iyon resimlerin kontrastını tanımlar. NOT: veri her bireyin setinde, kırık bölgeler ve düşük parlaklığını gösteren boş noktalar ortadan kalkar. </li><li> Gözlemlemek ve iyon karşılaştırmakAdım 2.9 olarak alınmıştır parlak alan görüntü ile görüntü. Not: kütle spektrometrisi ve özellikle iyonlarının görüntülerin inşaat Görüntüleme ticari araçlar ile elde edilebilir. Nedeniyle veri toplama ve analiz yazılımı çeşitli kullanıcıların yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için cihaz satıcısı tarafından sağlanan yazılım talimatları takip etmelidir. </li></ol></li><li> Veri analizi NOT: Numunelerin heterojen kantitatif analiz edilir. Bu gösteri, her numune iyonları dağılımını analiz etmek in-house geliştirilen yazılımın birden fazla eş merkezli bölüme ayrılmıştır. analiz, tek başına bir veri analiz yazılımı kullanılarak gerçekleştirilebilir. <ol><li> önemsiz alanları kaldırmak için sonuç penceresinde gösterilen iyon görüntüde boş noktalar ve kırık bölgeleri tıklayın. NOT: Bu prosedür iyon görüntünün temel alanını tanımlar. </li><li> iyon görüntünün dıştaki katman bulmak için lütfen &quot;kenar bulmak&quot; tıklayın. </li><li> bir veritabanında dış tabakasında iyon bolluğu bilgileri kaydetmek ve aynı anda iyon görüntüden bu katmanı kaldırmak için &quot;düşeriz&quot; tıklayın. Bu dıştaki katman temsil eden bir onay kutusu sonucu penceresinin &quot;çıkış verileri&quot; listesinde görünür. </li><li> iyon görüntünün merkez tanımlanır yineleyerek 3.2.2 ve 3.2.3 adımları. </li><li> Tıklayın ve &quot;çıkış verileri&quot; listedeki tüm onay kutularını seçin ve verileri vermek için &quot;ihracat&quot; a tıklayın. </li><li> iyonların mekansal dağılımı bilgilerini elde etmek için her katmanın ortalama iyon bolluğu hesaplamak için tablo yazılımını kullanarak dışa aktarılan verileri açın. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Desorption+Ionization+of+Proteins+with+Molecular+Masses+Exceeding+10000+Daltons%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Laser Desorption Ionization of Proteins with Molecular Masses Exceeding 10000 Daltons.</a> Anal. Chem. 60, 2299-2301 (1988).</li>
<li>Beavis, R. C., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Velocity+Distributions+of+Intact+High+Mass+Polypeptide+Molecule+Ions+Produced+by+Matrix+Assisted+Laser+Desorption%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Velocity Distributions of Intact High Mass Polypeptide Molecule Ions Produced by Matrix Assisted Laser Desorption.</a> Chem. Phys. Lett. 181, 479-484 (1991).</li>
<li>Beavis, R. C., Chaudhary, T., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-Cyano-4-Hydroxycinnamic+Acid+as+a+Matrix+for+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Mass-Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Alpha-Cyano-4-Hydroxycinnamic Acid as a Matrix for Matrix-Assisted Laser Desorption Mass-Spectrometry.</a> Org. Mass Spectrom. 27, 156-158 (1992).</li>
<li>Ehring, H., Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Photoionization+and+Photochemistry+in+Ionization+Processes+of+Organic-Molecules+and+Relevance+for+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Ionization+Mass-Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Role of Photoionization and Photochemistry in Ionization Processes of Organic-Molecules and Relevance for Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry.</a> Org. Mass Spectrom. 27, 472-480 (1992).</li>
<li>Strupat, K., Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%2C5-Dihydroxybenzoic+Acid+-+a+New+Matrix+for+Laser+Desorption+Ionization+Mass-Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mass+Spectrom.+Ion+Process%22%5BJournal%5D)">2,5-Dihydroxybenzoic Acid - a New Matrix for Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry.</a> Int. J. Mass Spectrom. Ion Process. 111, 89-102 (1991).</li>
<li>Hu, H., Larson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaporation+of+a+Sessile+Droplet+on+a+Substrate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Evaporation of a Sessile Droplet on a Substrate.</a> J. Phys. Chem. B. 106, 1334-1344 (2002).</li>
<li>Deegan, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+Flow+as+the+Cause+of+Ring+Stains+from+Dried+Liquid+Drops%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Capillary Flow as the Cause of Ring Stains from Dried Liquid Drops.</a> Nature. 389, 827-829 (1997).</li>
<li>Hu, J. -B., Chen, Y. -C., Urban, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coffee-Ring+Effects+in+Laser+Desorption%2FIonization+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Coffee-Ring Effects in Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal. Chim. Acta. 766, 77-82 (2013).</li>
<li>Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Tissue+Analysis+Using+Matrix-Assisted+Laser+Desorption%2FIonization+Mass+Spectrometry%3A+Practical+Aspects+of+Sample+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Direct Tissue Analysis Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry: Practical Aspects of Sample Preparation.</a> J. Mass Spectrom. 38, 699-708 (2003).</li>
<li>Hu, H., Larson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marangoni+Effect+Reverses+Coffee-Ring+Depositions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Marangoni Effect Reverses Coffee-Ring Depositions.</a> J. Phys. Chem. B. 110, 7090-7094 (2006).</li>
<li>Bhardwaj, R., Fang, X., Attinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+Formation+During+the+Evaporation+of+a+Colloidal+Nanoliter+Drop%3A+A+Numerical+and+Experimental+Study%5BTitle%5D)+AND+%22New+J.+Phys%22%5BJournal%5D)">Pattern Formation During the Evaporation of a Colloidal Nanoliter Drop: A Numerical and Experimental Study.</a> New J. Phys. 11, 075020(2009).</li>
<li>Savino, R., Paterna, D., Favaloro, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Buoyancy+and+Marangoni+Effects+in+an+Evaporating+Drop%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thermophys+Heat+Tr%22%5BJournal%5D)">Buoyancy and Marangoni Effects in an Evaporating Drop.</a> J Thermophys Heat Tr. 16, 562-574 (2002).</li>
<li>Probstein, R. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aProbstein%2C+RF+%22Surface+Tension.+in+Physicochemical+Hydrodynamics+%3A+An+Introduction%22">Surface Tension. in Physicochemical Hydrodynamics : An Introduction</a>. , John Wiley & Sons. Ch. 10 305-361 (1994).</li>
<li>Lai, Y. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+Spatial+Heterogeneity+of+MALDI+Samples+with+Marangoni+Flows+During+Sample+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Reducing Spatial Heterogeneity of MALDI Samples with Marangoni Flows During Sample Preparation.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27, 1314-1321 (2016).</li>
<li>Hsiao, C. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Molecular+Imaging+of+Photolabile+Surface+Samples+with+Synchronized+Dual-Polarity+Time-of-Flight+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Molecular Imaging of Photolabile Surface Samples with Synchronized Dual-Polarity Time-of-Flight Mass Spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 25, 834-842 (2011).</li>
<li>Vorm, O., Roepstorff, P., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Resolution+and+Very+High-Sensitivity+in+MALDI+TOF+of+Matrix+Surfaces+Made+by+Fast+Evaporation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Improved Resolution and Very High-Sensitivity in MALDI TOF of Matrix Surfaces Made by Fast Evaporation.</a> Anal. Chem. 66, 3281-3287 (1994).</li>
<li>Gabriel, S. J., Schwarzinger, C., Schwarzinger, B., Panne, U., Weidner, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Segregation+as+the+Major+Cause+for+Sample+Inhomogeneity+in+MALDI+Dried+Droplet+Spots%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Matrix Segregation as the Major Cause for Sample Inhomogeneity in MALDI Dried Droplet Spots.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25, 1356-1363 (2014).</li>
<li>Mampallil, D., Eral, H. B., van den Ende, D., Mugele, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Evaporating+Complex+Fluids+through+Electrowetting%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Control of Evaporating Complex Fluids through Electrowetting.</a> Soft Matter. 8, 10614-10617 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir rakip mali çıkar beyan etmemektedir.

önceki teorik tahminlere dayanarak, damlacıklar içindeki sıcaklık kaynaklı hidrodinamik akışları dışa çözücü buharlaştırma yoluyla uyarılan kılcal akışları üstesinden gelebilir. sıcaklık damlacık artışı içinde gradyanlar zaman moleküllerin bu iç sirkülasyonu verimliliği artırılmıştır. çevre sıcaklığında çevresi muhafaza edilirken, 5 ° C&#39;nin altında Örnek plaka sıcaklığı tutmak zaman tahmin edilen sonuçlara göre, damlacık içindeki sirkülasyon akımlarının ortalama hızı dışa kılcal akımlarının daha yaklaşık 4 kat daha ...

Kütle spektrometresi (MS), karmaşık numunelerin moleküler bileşimlerini analiz etmek için en önemli analitik tekniklerden biridir. MS'de kullanılan tüm iyonizasyon yöntemleri arasında, matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonizasyon (MALDI), biyoanalitik uygulamalarda en hassas ve yaygın olarak kullanılan yöntemdir. 1 Diğer iyonizasyon teknikleriyle karşılaştırıldığında, MALDI tuz kirleticilerine karşı en yüksek hassasiyete ve yüksek toleransa sahiptir. Bu tür analitik özellikler, MALDI'yi karbonhidrat analizi ve birçok proteomik uygulama için ilk tercih haline getirir. Bununla birlikte, numune hazırlama, MALDI-MS'de yüksek kaliteli veri elde etmek için çok önemli bir adımdır.
MALDI-MS için en yaygın kullanılan numune hazırlama yöntemi, numune damlacıklarının bir yüzey üzerinde biriktirildiği ve ortam koşulları altında kurutulduğu kurutulmuş damlacık yöntemidir. Bu kurutma yöntemi basit ve genellikle etkilidir. 2-5 Bununla birlikte, kurutulmuş damlacık yönteminde yaygın bir sorun, elde edilen analit/matris kristallerinin normalde düzensiz dağılmasıdır. Çoğu durumda, kristaller numune alanlarının çevresinde toplanır ve bu da halka lekesi oluşumu olarak adlandırılan duruma neden olur. 6-8 Heterojen kristal morfolojileri, analit moleküllerinin uzamsal dağılımını etkiler, bu da numune alanları üzerinde iyon sinyalinde ciddi dalgalanmalara neden olur. Bu tür ciddi sinyal dalgalanmaları ve zayıf veri tekrarlanabilirliği, MALDI-MS'deki "tatlı nokta" sorunu olarak bilinir. 9 Bu nedenle, MALDI-MS kurutulmuş damlacık uygulamalarında mekansal heterojenliklerin azaltılmasına büyük ihtiyaç vardır.
Kurutulmuş damlacık yöntemi ile hazırlanan numunelerin mekansal dağılımının belirlenmesinde numune damlacığındaki hidrodinamik akışlar önemli rol oynamaktadır. 10-12 Çözücünün buharlaşmasının, halka lekesi oluşumundan sorumlu olan damlacıklar içinde dışa doğru kılcal akışlara neden olduğu bulunmuştur. 7,10 Buna karşılık, teğetsel yüzey gerilimi gradyanları tarafından indüklenen devridaim akışları, dışa doğru kılcal akışlarını dengeleyebilir. 13 Devridaim akış hızları, dışa doğru kılcal akışlarınkinden daha yüksekse, heterojenlik sorununu azaltmak için numuneler verimli bir şekilde yeniden dağıtılabilir. 14
Bu çalışmada, damlacık kurutma işlemleri sırasında verimli devridaim akışları sağlamak için basit bir kurutma odası ile numunelerin hazırlanması için ayrıntılı bir protokol gösteriyoruz. Damlacık kurutma koşulları, numune plakasının ve çevresinin sıcaklıkları ve hazne içindeki bağıl nem dahil olmak üzere hassas bir şekilde kontrol edilir. Model analitler arasında maltotrioz ve bradikinin zinciri (1-7) bulunur. Gösteri için kullanılan matris 2,4,6-trihidroksiasetofenondur (THAP). Numuneler uçuş süresi (TOF) MS ile incelenir ve veriler heterojenliğin azaldığını göstermek için nicel olarak analiz edilir.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Reaktif< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Deterjan tozu</td><td>Alconox</td><td>242985</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Merck</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>Asetonitril</td><td>Merck</td><td>100003</td><td></td></tr><tr><td>2,4,6-trihidroksiasetofenon (THAP)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T64602&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Bradykinin fragmanı (1-7)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1651</td><td></td></tr><tr><td>Maltotriose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47884</td><td></td></tr><tr><td>Pipet uçları</td><td>Mettler Toledo</td><td>17005091</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpü</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q su arıtma sistem</td><td>Kırlangıç</td><td>ZMQS6VFT1</td><td></td></tr><tr><td>Pudrasız nitril eldiven</td><td>Microflex</td><td>SU-690</td><td></td></tr><tr><td>600 ml beher</td><td>Duran</td><td>2110648</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonik temizleyici</td><td>Delta</td><td>DC300H</td><td></td></tr><tr><td>Higrometre</td><td>Wisewind</td><td>5330</td><td></td></tr><tr><td>Azot gazı akış ölçer</td><td>Dwyer</td><td>RMA-6-SSV</td><td></td></tr><tr><td>K-tipi termokupllar</td><td>Digitron</td><td>311-1670</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Select BioProducts</td><td>Force Mini&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pipet</td><td>Rainin</td><td>pipet-lite XLS</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Sıcaklık kontrollü kurutma odası</td><td>bu laboratuvar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Senkronize çift kutuplu uçuş süresi görüntüleme kütle spektrometresi (DP-TOF IMS)</td> <td>bu laboratuvar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF paslanmaz çelik numune bu</td><td>laboratuvarı</td><td></td> <td>hedefliyor</td></tr></tbody></table>

kantitatif uygulamalar için homojen maldi Örneklerin hazırlanması

Preparation of Homogeneous MALDI Samples for Quantitative Applications

Bu protokol, matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon (MALDI) kütle spektrometresi sırasında iyon sinyallerindeki uzamsal heterojenliği azaltmak için basit bir numune hazırlığını gösterir. İyon sinyallerinin heterojenliği MALDI'de ciddi bir sorundur, bu da zayıf veri tekrarlanabilirliği ile sonuçlanır ve MALDI'yi kantitatif analiz için uygun hale getirmez. Numune hazırlama sırasında numune plakası sıcaklığını düzenleyerek, numune çözeltisi damlacıkları içindeki termal kaynaklı hidrodinamik akışlar, heterojenlik problemini azaltabilir. MALDI numune plakalarını tutan, sıcaklık ayarlı bir bakır taban bloğu ile donatılmış, oda sıcaklığında bir numune hazırlama odası, numune kurutma durumunun hassas kontrolünü kolaylaştırır. Numune damlacıklarının kurutulmasından sonra, numune plakalarının sıcaklığı oda sıcaklığına geri döndürülür ve müteakip kütle spektrometrik analizi için hazneden çıkarılır. Numunelerin alanları, numunedeki tüm bileşenlerin uzamsal dağılımını elde etmek için MALDI görüntüleme kütle spektrometresi ile incelenir. Numuneleri sıcaklık kontrolü olmadan ortam koşulları altında hazırlayan geleneksel kurutulmuş damlacık yöntemi ile karşılaştırıldığında, burada gösterilen yöntemle hazırlanan numuneler önemli ölçüde daha iyi uzamsal dağılım ve sinyal yoğunluğu göstermektedir. Karbonhidrat ve peptit numuneleri kullanılarak yapılan gözlemlere göre, kurutma işlemi sırasında çevreyi ortam sıcaklığında tutarken substrat sıcaklığının düşürülmesi, iyon sinyallerinin heterojenliğini etkili bir şekilde azaltabilir. Bu yöntem genellikle çeşitli numune ve matris kombinasyonlarına uygulanabilir.

Parlak alan görüntüleri ve örnek plakası 5 sıcaklığı ve 25 ° C ile hazırlanan maltotrioz ve bradikinin fragmanı (1-7) MS Fotoğraflar, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Sodiated maltotrioz, iyon sinyali esas olarak doldurulur halinde örnek alanın çevresine 25 ° C lik bir örnek plakası sıcaklığı hazırlandığında. 5 ° C&#39;ye örnek plaka sıcaklığı düşürerek, sinyal homojen tüm numune alanı üzerinde doldurur. 5 ° C&#39;nin altında örnekleri hazırlamak tek fark olumsuz 25 ° C&#...

Örnek Kurutma işlemleri esnasında alt-tabaka sıcaklığının ayarlanması sayesinde yöntemde MALDI kütle spektrometresi iyon sinyallerin uzaysal farklılıklarını azaltmak için bir kuralı gösterilmektedir.

Kantitatif Uygulamalar için Homojen MALDI Örneklerin Hazırlanması

This protocol demonstrates a simple sample preparation to reduce spatial heterogeneity in ion signals during matrix-assisted laser desorption/ionization ...

MALDI MS için geliştirilen bu numune hazırlama yönteminin genel amacı, MALDI MS sırasında iyon sinyallerindeki uzamsal heterojenliği azaltmaktır. Kurutma işlemi sırasında numune damlacığı içerisindeki hidrodinamik akışlar manipüle edilerek, geleneksel kurutulmuş damlacık yöntemini optimize etmek için iyi kontrollü bir kurutma ortamı oluşturulmuştur. Bu tekniğin temel avantajı, optimize edilmiş kurutulmuş damlacık yöntemiyle hazırlanan numunelerin iyon sinyallerindeki uzamsal heterojenliğin etkili bir şekilde azaltılabilmesidir. Bu yöntem, THAP Metrik Sistemi için homojen numuneler sağlayabilmektedir.Bu yöntem, alfa-Siyano-4-hidroksisinnamik asit gibi diğer metrik sistemlere de uygulanabilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, kurutma koşullarını kontrol etmenin kolay olmaması nedeniyle zorluk yaşamışlardır. Bu prosedüre başlamak için kurutma odasının kapısını açın ve önceden temizlenmiş bir numune plakasını hemen bakır bazlı bloğun üzerine yerleştirin.Ardından, kapağı kapatın. Azot akış hızını saatte 10 standart kübik fit olarak ayarlamak için gaz akış ölçerini manuel olarak ayarlayın. Bunun ardından, bir higrometre ile ölçüldüğünde, kurutma odasındaki bağıl nemin her zaman %25'in altında olduğundan emin olmak için gaz akış ölçerini hassas şekilde ayarlayın.Sıcaklığı izlemek için K Tipi Termokupllar kullanarak, deney için örnek plakası 5 °C'ye ulaşana kadar su sirkülatörü sıcaklığını manuel olarak ayarlayın. Örnek biriktirme işleminden önce gerekli sıcaklıklara ve bağıl neme ulaşıldığından emin olun. Bir mikrosantrifüj tüpünde 0,25 µL 0,1 M THAP çözeltisi ve 0,25 µL istenen analiti karıştırın.Numuneyi üç saniye boyunca vorteksleyin. Ardından, çözeltiyi mikrosantrifüj tüpünün dibinde toplamak için numuneyi iki saniye boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminin ardından, kurutma odasının kapağını açın ve bir pipet yardımıyla numune plakasına dikkatlice 0.1 µL çözelti bırakın.Kapağı hemen kapatın ve örnek damlacığının kurumasını bekleyin. Örnek plakası sıcaklığı çevresinden daha düşük tutulduğunda, moleküllerin yeniden dağılması için damlacık içindeki yeniden dolaşım akışlarının ortalama hızı önemli ölçüde artar. Örnek biriktirme, veri kalitesini ve tekrarlanabilirliğini belirleyen en kritik adımdır.Örneğin kontrollü koşullar altında kristalleşmesini sağlamak için önceden karıştırılmış örnek çözeltisi derhal örnek plakasına yerleştirilmelidir. Kurutma işleminden sonra kurutma haznesinin kapağını açın.Ardından, su sirkülatör sıcaklığını 25 °C'ye ayarlayın. Örnek plakası sıcaklığı 25 °C'ye döndüğünde, örnek plakasını kurutma haznesinden çıkarın. Örnek morfolojisini beş kat büyütmeli bir Stereo mikroskop altında inceleyin ve parlak alan görüntüsünün anlık fotoğrafını çekin.Bu noktada, örnek plakasını bir MALDI Kütle Spektrometresine yerleştirin. Ardından, görüntüleme kütle spektrometrisi analizini gerçekleştirin. Sonuç penceresinde gösterilen kütle listesinden karakteristik bir kütle piki seçin ve iki boyutlu bir iyon görüntüsü çizmek için 2D'ye tıklayın.Ardından, sinyal yoğunluğunun üst ve alt sınırlarını belirlemek ve görüntü çözünürlüğünü artırmak için açılır penceredeki ayar düğmelerine tıklayın ve resmi kaydet'e tıklayın. Temel numune bölgesini elde etmek için iyon görüntüsünü, daha önce elde edilen parlak alan görüntüsü ile gözlemleyin ve karşılaştırın. Şimdi, analiz edilecek bölgeyi hassas bir şekilde ayarlamak için sonuç penceresinde gösterilen iyon görüntüsündeki boş noktalara ve çatlak bölgelere tıklayın.İyon görüntüsünün en dış katmanını bulmak için "find edge" (kenarı bul) düğmesine tıklayın. Ardından, en dış katmanın iyon bolluğu bilgisini bir veri tabanına kaydetmek ve aynı zamanda bu katmanı iyon görüntüsünden kaldırmak için "deduct" (çıkar) düğmesine tıklayın. İyon görüntüsünün merkezi tanımlanana kadar önceki adımları tekrarladıktan sonra, çıktı veri listesindeki tüm onay kutularını tıklayarak seçin ve verileri dışa aktarmak için "export" (dışa aktar) düğmesine tıklayın.Son olarak, her katmanın ortalama iyon bolluğunu hesaplayarak iyonların uzaysal dağılım bilgilerini elde etmek için dışa aktarılan verileri bir hesap tablosu yazılımı kullanarak açın. Maltotriozun brightfield ve MALDI görüntülerinde, numune plakası sıcaklığı 25 °C olarak ayarlandığında, sodyumlanmış formun iyon sinyali temel olarak numune alanının çevresinde yoğunlaşır. Sıcaklık beş °C'ye düşürüldüğünde, sinyal tüm numune alanı boyunca homojen olarak dağılır; bu durum, numunelerin daha düşük bir numune plakası sıcaklığında hazırlanmasının molekülleri önemli ölçüde yeniden dağıtabileceğini ve heterojenliği azaltabileceğini göstermektedir.Protonlanmış bradikinin fragman iyon görüntüsü, sodyumlanmış maltotriozla benzer bir eğilim göstermektedir. İstatistiksel analizler, 5 °C örnek plaka sıcaklığında elde edilen iyon sinyallerinin heterojenliğinin, 25 °C'ye kıyasla yüzde 60 ila 80 oranında azaldığını göstermektedir. Sodyumlanmış maltotrioz durumunda, 25 °C örnek plaka sıcaklığında merkezlerdeki sinyal yoğunlukları, 5 °C sıcaklıktakilere göre çok daha düşüktür.Protonlanmış bradikinin fragmanı, örnek plaka sıcaklığı 25'ten 5 santigrat dereceye düşürüldüğünde daha az varyasyon göstermektedir. Bu kurutma yöntemi denenirken, kurutma odasındaki sıcaklık ve bağıl nemin dikkatle kontrol edilmesi ve izlenmesi gerekir. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, prosedür doğru şekilde uygulandığı takdirde bir örneğin hazırlanması 30 dakikada tamamlanabilir.Geliştirilmesinin ardından bu teknik, MALDI MS alanındaki araştırmacıların kurumuş damlacık örnekleri için kantitatif analizleri keşfetmelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, MALDI MS analizi için homojen kurumuş damlacık örneklerinin nasıl hazırlanacağı konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız.

preparation-of-homogeneous-maldi-samples-for-quantitative-applications

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu video Matriks Yardımlı Lazer Desorpsiyon İyonizasyon Kütle Spektrometresi (MALDI-MS) ile peptitler ve proteinlerin analizi için bir ultra-ince matris / analit bir tabaka hazırlık göstermektedir.

MALDI Numune Hazırlama: Ultra İnce Tabaka Yöntemi

Bu, insan serumu ile düşük molekül ağırlıklı proteinler ve peptitler selektif geri kazanımı için gözenekli silis ince film dayanan bir teknoloji geliştirilmiştir. Bizim gözenekli cips fiziko-kimyasal özellikleri ince peptid zenginleştirme önemli kontrolü sağlamak ve sonuçta tanısal amaçlı serum proteom profil ayarlı edildi.

Biyomarker Discovery için Mezogözenekli Silika İnce Filmler üzerine düşük molekül ağırlıklı Protein Zenginleştirme

Doğru kütle ölçüm proteinlerin soruşturma sırasında önemli bir adımı temsil etmektedir. Matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon (MALDI) kütle spektrometresi (MS) gibi tespiti için kullanılabilir ve önemli avantajı tuzları, deterjan ve kirleticilere karşı tolerans. Burada MALDI-MS ile 100 kDa'dan daha büyük proteinlerin analizi için erişilebilir bir yaklaşımı göstermektedir.

Uçuş lazer desorpsiyon / iyonizasyon zaman sağlam proteinler (MALDI-TOF) kütle spektrometrik analizi Matris destekli daha büyük 100 kDa

Bu protokol, ökaryotik hücrelerde tam hücre MALDI-TOF kütle spektrometresinin kullanımını açıklar. Burada, makrofajların mikro çevrelerine yanıt olarak çoklu aktivasyon durumlarını analiz ederek bu tekniğin doğruluğunu gösteriyoruz.

Tüm hücre MALDI-TOF Kütle Spektrometre Makrofaj Aktivasyon Farklı Modu analiz için Doğru ve Hızlı Yöntem

Kitle spektometrik görüntüleme (MSI), biyolojik süreçler içine yeni anlayışlar sağlayabilir kendi doğal ortamlarında bileşikleri koruyarak, sağlam dokularda çeşitli kimyasal türler keşfetmek ve tanımlamak için kullanılan güçlü bir araçtır. Burada küçük moleküllerin analizi için geliştirilmiş bir MSI yöntem tarif edilmektedir.

Metabolitlerdeki Soruşturma MALDI-Kütle Spektrometrik Görüntüleme<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Kök Nodüller

Endüktif olarak eşleştirilmiş plazma - kütle spektrometresi (ICP-MS) ile tirelenmiş boyut dışlama kromatografisi, metaloproteinlerin bolluğundaki değişiklikleri doğrudan biyolojik örneklerden ölçmek için güçlü bir araçtır. Burada, moleküler kütleyi ve bilinmeyen proteinlerle ilişkili metal miktarını tahmin etmek için kullanılan bir dizi metaloprotein standardını açıklıyoruz.

Boyut Dışlama ICP-MS kullanarak Nicel Metalloproteomic Analiz Standartları

Otomatik IMMUNO-maldı (iMALDI) teknolojisini kullanarak karmaşık biyolojik sıvı protein miktar için bir protokol sunulmuştur.

Peptid ve Protein miktar kullanarak otomatik IMMUNO-maldı (iMALDI)

Bu iletişim kuralı için görüntüleme kütle spektrometresi mukadder doku sabit formalin süblimasyon tabanlı hazırlanması için tekrarlanabilir ve güvenilir bir yöntem açıklanır.

Örnekleri için matris peptit esaslı tamir Formalin en iyi hazırlık lazer desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi iş akışlarını görüntüleme destekli

Karbonhidrat iyon sinyalleri maldı kütle spektrometresi reform kristal yapılar tarafından örnek hazırlama sürecinde güçlendirmeye yönelik bir protokol gösterilmiştir.

Matris yardımlı Lazer Desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi karbonhidrat iyon sinyalleri geliştirmek için bir verimli örnek hazırlama yöntemi

Bu protokolün amacı, biyolojik örneklerde metabolik ve moleküler tespiti en üst düzeye çıkarmak için MALDI MSI kullanarak deneyler planlarken numune hazırlama konusunda ayrıntılı rehberlik sağlamaktır.

MALDI Kütle Spektrometresi Görüntüleme Kullanarak Metabolik Profilleme için Örnek Hazırlama

Öğrenin MALDI kütle spektrometrisi için homojen örnek hazırlama yöntemini. Kontrollü kurutma ortamı ve hidrodinamik akış manipülasyonu kullanarak iyon sinyallerindeki uzamsal heterojenliği azaltın.

Kantitatif Uygulamalar için Homojen MALDI Örneklerin Hazırlanması

Daha fazla video keşfet