Üzüm Berry metabolomik ve transkriptomik aracılığıyla yorumlanır Terroir Kavramı

Bu deneysel prosedürlerin genel amacı, Corvina üzüm kültivarının meyve metabolomu ve transkriptomundaki farklı teruar imzalarını gözlemlemektir. Burada açıklanan vaka çalışması, üç büyüme mevsimi boyunca üç makro bölgedeki yedi bağdan üç farklı olgunlaşma aşamasında örneklerin toplanmasını ve analiz edilmesini içermektedir. Açıklanan teknikler, hasat yılı etkisinin meyve metabolomu üzerindeki hakim olgunlaşma etkisini ortaya koymaktadır.

Olgun meyvelerde, üç makro bölgeyi temsil eden belirgin spesifik kimyasal imzalar da tespit edilmiştir. Makro bölge düzeyindeki teruar imzası; hem transkriptomik hem de metabolomik veri matrislerini analiz etmek için PCA (temel bileşen analizi) ve auto BLSDA (çift yönlü ortogonal projeksiyonla ayrık analiz) gibi uygun istatistiksel teknikler kullanılarak ortaya çıkarılmıştır. Öte yandan, münferit bağlar arasındaki farklar daha belirsizdir ve daha gelişmiş ile hassas istatistiksel yaklaşımlar gerektirmektedir.

Deneye uygun bir örnekleme planı geliştirerek başlayın. Örnekleme planının; örnekleme yerlerini, zamanlarını ve kesin örnekleme prosedürünü belirttiğinden emin olun. İki asma sırası boyunca farklı konumlardan 30 salkım hasat ettikten sonra, görünür hasarı olan veya enfeksiyon belirtileri gösterenlerden kaçınarak her salkımdan rastgele üç tane meyve seçin.

Her olgunlaşma aşaması için üç bağımsız havuz elde etmek üzere bu işlemi tekrarlayın. Meyvelerin çekirdeklerini çıkarın ve perikarpı derhal sıvı azot içinde dondurun. Her havuzdaki tüm donmuş meyveleri otomatik bir değirmende öğütün.

Her bir toz örneği, biri transkriptomik analiz ve diğeri metabolomik analiz için olmak üzere iki eşit parçaya bölün. Ardından, dövücüyü kapatıp çıkarın ve tozları -80 °C'de saklayın. Meyve örneklerinin metabolik ekstraktlarını, oda sıcaklığında, %0,1 formik asit ile asitlendirilmiş üç hacim metanol içinde, 40 kHz'lik bir ultrasonik banyoda 15 dakika boyunca hazırlayın.

Ekstratları 4 °C'de 10 dakika boyunca 16,000 ×g'de santrifüjleyin. Süpernatanı iki hacim deiyonize su ile seyreltin ve 0.2 µm'lik bir filtreden geçirin. Metin protokolünde açıklandığı şekilde, bir elektro sprey iyonizasyon kaynağına bağlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi veya HPLC-ESI-MS sistemini kurun.

HPLC ayrımını, 30 µL örnek enjeksiyon hacmi kullanarak, A ve B çözücüleri ile lineer gradyanla ve 0.2 mL/dak sabit akış hızında gerçekleştirin. Kütle spektrumlarını, metin protokolünde listelenen parametreler ile dönüşümlü negatif ve pozitif iyonizasyon modlarında elde edin. LCMS verilerini işlemek için M Zeta Mine sürüm 2.14 gibi uygun bir açık kaynaklı yazılım kullanarak pik tespit hizalama, boşluk doldurma ve pik filtreleme prosedürlerini uygulayın.

Elde edilen metin dosyalarını bir hesap tablosuna aktarın. Bu işlem; bir tanımlama numarası, kütle-yük oranı değeri ve alıkonma süresi ile tanınan tüm saptanan metabolitlerin, tüm örneklerdeki pik alan değerleri cinsinden kantifiye edildiği bir veri matrisi oluşturur. Deiyonize RNAaz içermeyen suyun 41,8 microliters nihai hacminde, 1,65 micrograms siyanin etiketli tamamlayıcı RNA yerleştirerek dörtlü paket format spesifikasyonlarına dayalı hibridizasyon düzeneğini hazırlayın.

11 µL 10X bloklama ajanı ve 2,2 µL 25X fragmantasyon tamponu ekleyin. RNA'yı fragmente etmek için termostatik banyoda 60 °C'de 30 dakika inkübe edin. 30 dakika sonra, hemen buz üzerinde bir dakika boyunca soğutun.

Son olarak, 55 µL 2X hibridizasyon tamponu ekleyin ve pipetleyerek iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 15.500 ×g hızda bir dakika boyunca santrifüjledikten sonra, mikro santrifüj tüpünü hemen buz üzerine yerleştirin. Özel mikro-diziyi yüklemek için, etiketi yukarı bakacak şekilde bir conta lamını hibridizasyon odasının tabanına yerleştirin.

Hibritleme örneğinin 100 µL'sini, hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek bir pipet ucuyla her bir conta kuyucuğuna yavaşça yükleyin. Sayısal barkodun yukarı baktığından emin olarak, özel mikro-diziyi yavaşça aşağı bakacak şekilde yerleştirin. Sandviç çiftinin düzgün şekilde hizalandığından emin olun.

Son olarak, hibridizasyon odasının kapağını sandviç haline getirilmiş slaytların üzerine yerleştirin ve kelepçeyi odaya el ile sıkıştırın. Kabarcıkların hareketliliğini değerlendirmek için monte edilmiş odayı döndürün. Monte edilmiş slayt odasını, 65 °C'ye ayarlanmış bir hibridizasyon fırınındaki dengeli bir rotiserye yerleştirin.

Rotatörü 10 RPM hızda dönecek şekilde ayarlayın. Hibritizasyonun 17 saat boyunca sürmesine izin verin. Mikro-array lam yıkama işlemine geçmek için üç adet lam boyama kabı hazırlayın ve bunları uygun yıkama tamponları ile doldurun.

İki kabı oda sıcaklığındaki bir numaralı yıkama tamponu ile, bir kabı ise önceden ısıtılmış iki numaralı yıkama tamponu ile doldurun. Hibridizasyon odasını sökün ve sandviç yapıyı çıkarın. Mikro-dizi lamının sayısal barkodu yukarı bakacak şekilde, sandviç yapıyı oda sıcaklığındaki bir numaralı yıkama tamponu ile dolu ilk lam boyama kabına daldırın ve temiz bir pens yardımıyla contayı mikro-dizi lamından ayırın.

Mikrodizilim lamını hızla bir lam rafına aktarın ve oda sıcaklığındaki yıkama tamponu bir ile dolu ikinci lam boyama kabına yerleştirin. Lam boyama kabını manyetik karıştırıcı üzerine koyun ve orta şiddette karıştırarak bir dakika boyunca yıkayın. Lam rafını hızla, önceden ısıtılmış yıkama tamponu iki ile dolu üçüncü lam boyama kabına aktarın ve orta şiddette karıştırarak bir dakika boyunca yıkayın.

Slayt boyama kabını yavaşça çıkarın ve damlacık oluşumunu önleyerek slaytı raftan dikkatlice alın. Mikro-dizi slaytını uygun bir tarayıcıya yerleştirin ve her bir diziyi, mikro-dizi üreticisinin kullanım kılavuzunda önerilen parametre ayarlarını kullanarak tarayın. İstatistiksel analiz yazılımını hazırlamak için önce metabolomik ve transkriptomik verileri içe aktarın.

Elde edilen veri matrisini aktarmak için Dosya, Yeni Standart Proje, Yeni Standart Proje yolunu izleyin. Ardından Düzenle'ye tıklayın. Tüm matrisi devriğinizden (Transpose) emin olun ve uygun birincil ve ikincil kimlikleri (ID) atayın. Ardından işlemi tamamlayın.

Çok değişkenli istatistiksel analizi gerçekleştirmek için Çalışma Seti (Workset) penceresine gidin, model türü olarak PCAX'i seçin ve AutoFit'e tıklayın. Örneklerin olası gruplandırmasını gösteren grafiği görmek için önce Scores, ardından Scatter seçeneğini seçin. PCA skor grafiğini inceleyin.

İyi bir model elde edilirse, O2PLS diskriminant analiz modeli oluşturmak için aynı örnek sınıflarını kullanın. MacroZone tarafından sınıflandırılan örnekleri kullanarak iki O2PLS diskriminant analiz modeli oluşturmak için Ana penceresinden Yeni Olarak, M1 ve Gözlemler adımlarını izleyerek sınıfları atayın. İstenen sınıfları belirleyin.

Ardından, model tipini PCAX'ten O2PLS diskriminant analizine değiştirin. Autofit düğmesine basın. Proje penceresinden M2'yi seçin, ardından grafiği ve örnek sınıflarının konumunu görmek için Scores ve sonrasında Scatter seçeneklerine tıklayın.

Veri Türünü Seç (Select Data Type) kısmına gidin ve Gözlemler ve Yüklemeler (Observations and Loadings) seçeneğini belirleyin. Ardından Seri Ekle (Add Series) düğmesine tıklayın; PQ korelasyon bir (PQ correlation one), PQ korelasyon iki (PQ correlation two) ve mevcutsa diğer bileşenleri seçin. Grafik üzerinde farenin sağ düğmesine basarak Özellikler (Property) sekmesine gidin, Renk (Color) seçeneğini belirleyin ve ardından molekülleri ve sınıfları grafik sembolleri üzerinden ayırt etmek için Terimlere Göre (By Terms) seçeneğini seçin.

İstenilen özelliklerle grafiği düzenlemek için Layout, Format Plot, Access ve/veya Styles bölümlerine gidin. Bir veya daha fazla spesifik sınıfı hangi metabolitlerin karakterize ettiğini gözlemlemek için Plot List ve ardından Scatter seçeneklerine gidin. Tüm veri matrisinin PCA ile yapılan keşifçi analizi, örneklerin ilk ve ikinci temel bileşenler boyunca veraison, orta olgunlaşma ve olgun aşamaları dahil olmak üzere olgunlaşma evresine göre kümelendiğini göstermiştir.

Örnekler, üçüncü temel bileşen boyunca büyüme mevsimine göre kümelenmiştir. Olgun meyvelerin O2PLS ayırt edici analizi; Valpolicella, Garda Gölü ve Soave olmak üzere üç makro bölgeyi temsil eden spesifik teruar imzalarının tanımlanmasına olanak tanır. Bu modellerin yükleme grafikleri, örnek sınıfı P ile metabolitler Q arasındaki korelasyon olan PQ korelasyonu olarak ifade edilmiştir.

Yükleme grafiklerinde kırmızı kareler örnek sınıfını veya makrobölgeleri, renkli üçgenler ise bireysel metabolitleri temsil etmektedir. Metabolitler kimyasal sınıflarına göre renklerle kodlanmıştır ve metabolitler ile örnekler arasındaki mesafe, aralarındaki ilişkileri yansıtmaktadır. Garda Gölü makrobölgesi stilbenler ile karakterize edilirken, Soave ve Valpolicella flavonoidler ile belirginleşmiştir.

Antosiyaninler arasında, peonidin ve türevleri Garda Gölü makro bölgesinde daha yaygınken, diğer antosiyaninler Valpolicella makro bölgesinde daha yaygındı. Ayrıca, antosiyanin üç-O-glukozidleri Valpolicella makro bölgesinde daha yaygın görülürken, asillenmiş ve kumerillenmiş türevler Soave makro bölgesinde daha yaygındı. Transkriptomik, RA ve RNA sig yöntemleri, binlerce üzüm asması transkriptinin eş zamanlı olarak izlenmesine olanak tanır.

Yakın zamanda, yeni keşfedilen ek asma cinslerini temsil eden ve çok daha fazla prob içeren yeni bir özel mikro-dizi tasarlanmıştır. Transkriptomik platformların hızla geçerliliğini yitirmesi nedeniyle; 1392 yeni tanımlanmış peno lokusu için 249 daha fazla peno öngörülen transkripti ve 179 corvina prava geni dahil olmak üzere, eskisine göre daha fazla prob içeren yeni bir platform kullanan alternatif bir prosedür tanımladık. HPLC-ESI-MS ile yapılan metabolomik analiz, çok sayıda metaboliti eş zamanlı olarak tespit edebilecek kadar hassastır.

Bir örnekleme düzlemi oluşturma yeteneği kritik öneme sahiptir. Genetik farklılıkları en aza indirmek için tek bir klonun seçilmesi ve örneklemenin çoklu süresi, teruarlar arasındaki gerçek farkların belirlenmesini sağlamıştır. Aynı kültivarın daha az optimal bölgelerde yetişmiş hallerini karşılaştırmak ilgi çekici olurdu ancak ne yazık ki bu bağlar mevcut değildi.