Bir Antijen odaklı Kolit Modelinin Geliştirilmesi Antijen T hücreleri için Hücreler sunulması ile Antijen Sunumu Eğitim için

Bu antijen kaynaklı kolit modelinin genel amacı, antijenle spesifik kolit sırasında CX3, CR1 pozitif mononükleer fagositlerin CD4 pozitif T hücreleri ile etkileşime girip girmediğini ve onları aktive edip etmediğini ve bu mononükleer fagosit bağımlı efektör T hücresi ekspansiyonunun intestinal lamina propria içinde gerçekleşip gerçekleşmediğini belirlemektir. Bu yöntem, kolonik lamina propriadaki antijen sunan hücreler ile efektör T hücreleri arasında ne tür etkileşimlerin meydana geldiği gibi, inflamatuar bağırsak hastalığı alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, immün hücrelerin etkileşiminin ve inflamatuar bağırsak hastalığının patojenitesine yol açan unsurların incelenmesine olanak tanımasıdır.

Bu yöntem, kırmızı floresan antijen spesifik naive CD4 T hücrelerinin, mononükleer hücrelerde yeşil floresan protein eksprese eden immünodefisyent konakçıya aktarıldığı T hücresi transfer kolit modelini kullanmaktadır. Hücre transferini, mavi floresan antijen eksprese eden bakterilerin oral gavage yoluyla verilmesi takip eder. Konakçıların intestinal lamina propriasında meydana gelen immün olaylar, hastalık gelişiminin çeşitli aşamalarında izlenebilir.

Kolonu boylamasına açmak için diseksiyon makası kullanın ve kalıntı ile mukusu temizlemek için dokuyu 25 mililitre PBS içeren bir petri kabında yıkayın. Kolonu beş ila sekiz milimetrelik parçalara bölün ve elde edilen fragmanları, on milimolar HEPES ve beş milimolar EDTA ile desteklenmiş, kalsiyum ve magnezyum içermeyen 20 mililitre taze DPBS içine yerleştirin. Numunenin bulunduğu tüpü maksimum hızda 30 saniye boyunca vorteksleyin.

Ardından, epitelyumu uzaklaştırmak için 37 °C'de on dakika boyunca hafifçe çalkalayarak inkübe edin. İnkübasyon sonunda, tekrar 30 saniye boyunca Vortex ile karıştırın. Sonrasında, epitelyal hücreleri içeren süpernatanı uzaklaştırın.

Doku parçalarını 20 milliliters taze PBS, HEPES ve EDTA tamponu içeren yeni bir tüpe aktarın ve öncesinde ve sonrasında vorteksleme adımlarını uygulayarak inkübasyonu tekrarlayın. Üçüncü tekrardan sonra, tüm epitel hücreleri uzaklaştırılmış olur ve süpernatan berraklaşır. Kalan epitel hücrelerini temizlemek için doku fragmanlarını PBS ile nazikçe yıkayın.

Doku fragmanlarını ikiye iki milimetrelik parçalara ayırın ve sindirim için 0,5 mg/mL kollajenaz tip sekiz ve 10 U/mL DNAz bir ile desteklenmiş 10 mL RPI ortamına aktarın. Örnekleri 30 saniye boyunca vorteksleyin. Ardından, doku parçalarını 37 °C'de çalkalamalı olarak 30 ila 35 dakika inkübe edin ve inkübasyon sırasında tüpü her beş dakikada bir vorteksleyin.

Doku sindirildiğinde, elde edilen bulamacı 70 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirerek 50 mililitrelik konik bir tüpe süzün. Hücre süzgecini bir kez yıkayın ve tek hücre süspansiyonunu santrifüjle çöktürün. Son olarak, hücreleri PBS ile bir kez yıkayın ve santrifüjleyin.

Ardından, trypan blue dışlama yöntemiyle canlı hücre sayısı belirlenir. Siyan floresan protein ovalbümin proteini üreten e. coli, e. coli'nin aksine, in vitro ortamda OT-II hücrelerinde interferon gama üretimini aktive eder.

Sadece CFP eksprese eden coli. E. coli PCFP ova ile beslenen, transgenik yeşil floresan protein eksprese eden farelerin kolon dokusunun ex vivo 3D konfokal görüntülemesi, floresan protein eksprese eden bakterilerin, bağırsak epitel hücrelerinin yakınındaki kolon kriptlerinde bulunduğunu ve konak bağırsak fagositleri ile ko-lokalize olduğunu göstermektedir.

OT-II kırmızı hayvanlarda, CD4 pozitif T hücreleri, kırmızı floresan protein ve V beta 5.1'i birlikte eksprese etmeleriyle karakterize edilir. E. coli PCFP ova ile karşı karşıya kaldıklarında, OT-II kırmızı CD4 pozitif CD62 ligand pozitif T hücreleri ile adoptif olarak transplantasyon yapılmış, BNT lenfosit eksikliği olan ve yeşil floresan protein eksprese eden transgenik fareler hızla vücut ağırlığı kaybeder ve kolit klinik belirtileri geliştirir.

Hücre transferinden yedi gün sonra, yalnızca birkaç konak fagositi e. coli PCFP ovumlarını örneklemiştir ve OT-II kırmızı pozitif hücreler saptanmamıştır. Hücre transferinden 14 gün sonra, e. coli örnekleyen konak fagositleri

coli PCFP ova, adaptif olarak transfer edilen OT-II red pozitif hücrelerin yakınında yer almaktadır. Hücre transferinden 21 gün sonra, çok sayıda konak hücresi e. coli PCFP ova ile etkileşime girmiş olup, kolon lamina propria boyunca dağılmış halde bulunan donör OT-II red pozitif hücreler, konak intestinal fagositleri ile yakın temas halindedir.

Bu teknik uzmanlaşıldığında, uygun şekilde uygulandığı takdirde dört saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürün ardından, CD4 T hücrelerinin aktivasyon durumu hakkında ek soruları yanıtlamak ve kolitin şiddetini doğrulamak için intestinal lenfositlerin boyanması ve serum sitokin analizi gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Her gelişimle birlikte bu teknik, fare modelinde inflamatuar bağırsak hastalığına yol açan küçük olayları araştırmak için immünoloji alanındaki çalışmalara zemin hazırlar.

Bu videoyu izledikten sonra, sonraki ex vivo analizler için kolon lamina propria immün hücrelerinin nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.