Bir Pnömatik Damlacık Manipülasyon Platformu Multi-nükleotid Polimorfizmlerinin Görsel Kolorimetrik Tespiti

Bu prosedürün genel amacı, çok nükleotid polimorfizmlerini görsel olarak tespit etmek için basit bir yöntemi pnömatik damlacık manipülasyon platformuyla birleştirmektir. DNA tespit platformu açık bir yüzeydedir ve biyokimyasal araştırmacılar için kullanımı kolaydır. Genetik mutasyonları ve genetik hastalıkları tekrar tekrar tespit etmek için basit bir araç araştırdık.

Genetik çeşitliliğin hastalığa nasıl yol açtığını anlamamıza yardımcı olan daha büyük bir potansiyele sahiptir. İki yeni ve basit yöntemi birleştirdik. Çok nükleotid polimorfizmi, pnömatik damlacık manipülasyon platformunda çıplak gözle ve herhangi bir ek alet olmadan tespit edilebilir.

Çoklu nükleotid polimorfizmini tespit etme yöntemi, grubumuzdaki post doktor Tzu-Ming Wang tarafından gösterilecektir. Bu prosedüre başlamak için, metin protokolünde belirtildiği gibi 100 mikromolar bir prob DNA çözeltisi hazırlayın. Daha sonra, prob DNA'sını mililitre altın nanopartikül çözeltisi başına bir OD'ye ekleyin.

SDS'nin son konsantrasyonunu %0.01'e ve PBS'yi 0.01 molar'a getirin. Çözeltinin 20 dakika inkübe edilmesine izin verin. Daha sonra, iki molar sodyum klorür ve 0.01 molar PBS'den oluşan bir çözelti ekleyerek sodyum klorür konsantrasyonunu 0.05 molar'a yükseltin.

SDS konsantrasyonunu %0.01'de tutun ve çözeltinin 20 dakika inkübe etmesine izin verin. Sodyum klorür konsantrasyonunu, bir molar'lık nihai konsantrasyona ulaşılana kadar 20 dakikalık aralıklarla 0.1 molar'lık artışlarla arttırın. Çözeltiyi bir döndürücü üzerinde gece boyunca 23 santigrat derecede inkübe edin.

DNA örnekleri ve altın nanopartiküller konjuge hale geldikten sonra, çözeltiyi 30 saniye boyunca 7.000 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın. Daha sonra, peleti deiyonize suda yeniden süspanse ederek 25 nanomolar altın nanopartikül prob çözeltisi hazırlayın.

Hedef DNA örneklerini metin protokolünde belirtildiği gibi hazırlayın. Sodyum klorür ile her DNA örneğine altı mikrolitre altın nanopartikül prob çözeltisi ekleyin. Bir girdap karıştırıcı kullanarak, her bir numune çözeltisini 23 santigrat derecede beş dakika çalkalayın.

Daha sonra, her DNA örneği çözeltisine altı mikrolitre 400 milimolar hidroksil amin ve altı mikrolitre 25.4 milimolar kloroaurik asit ekleyin. Önümüzdeki bir saat içinde renklenmede sabit bir değişiklik meydana geleceği için bu örnekleri bir kenara koyun. nanopartikülün boyutu, şekle bağlı optik özellikleri, tipik bir örnek DNA parçasındaki uyumsuzluğun sayısı gözle ayırt edilebilir.

Damlacık manipülasyon platformunu üretmeye başlamak için, mikro yapılara sahip PMMA tabanlı ana kalıplar üretmek için 0,5 milimetre matkap ucu ile donatılmış bir bilgisayar sayısal kontrollü makine kullanın. Matkap için saniyede yedi milimetre ilerleme hızı ve 26.000 rpm dönüş hızı kullanın ve deldikten sonra kalıpları inceleyin. Ana kalıpların yüzeyini temizlemek ve PMMA artıklarını çıkarmak için bir hava üfleyici ve deiyonize su kullanın.

Bunu takiben, 10'a bir PDMS bazı ve kürleme maddesi karışımı hazırlayın. Tüm hava kabarcıkları giderilene kadar karışımı bir desikatörde gazdan arındırın. Ardından, PDMS karışımını ana kalıba dökün.

Hava odalarındaki ve hava kanallarındaki ters mikro yapıları elde etmek için 60 santigrat derecede üç saat pişirin. Pişirme tamamlandıktan sonra, PDMS katmanını ana kalıptan çıkarın ve hava emme girişleri için içine delikler açın. PDMS membranını ve PDMS katmanını temizlemek için bir oksijen plazma işleme sistemi kullanın.

İşlemden sonra, PDMS membranını ve PDMS katmanını birleştirin ve ardından bu konjuge yapıda delikler açın. Ardından, PDMS ve cam alt tabakayı 10 dakika boyunca 90 santigrat derecede bir sıcak plaka kullanarak birbirine yapıştırın. Katmanlar birbirine bağlandıktan sonra, kompozit plakayı membran tarafı yukarı bakacak şekilde bir lazer kesim makinesi PDMS'ye yerleştirin.

Süper hidrofobik alanı tanımlamak için dwg dosyasını içe aktarın ve bunun doğrudan PDMS membranına kazınacağını unutmayın. Yeni oyulmuş süperhidrofobik yüzeyi deiyonize su ile temizleyin. Bu, kömürleşmiş kalıntıları temizleyecektir.

Yüzey temizlendikten sonra, hava emme girişini ve vakum pompasını bir solenoid valf aracılığıyla bağlayın. Ardından, dijital bir IO USB modülü ile kontrol etmek için solenoid valfi bir bilgisayara bağlayın. Pnömatik damlacık manipülasyon platformu kurulduktan sonra, süperhidrofobik alana 10 mikrolitre 0.5 mikromolar hedef DNA ekleyin.

Daha sonra, hedef DNA damlasının yanına 10 mikrolitre taze hibritleştirilmiş 25 nanomolar altın nanoparçacık prob çözeltisi ekleyin. Bir solenoid valf aracılığıyla platforma hava emişini kontrol etmek için basit bir program kullanın. Basıncı eksi 80 kilopaskal'a ve sürüş frekansını beş hertz'e ayarlayın.

Damlacığın titreşim yolları boyunca emiş sağlayarak çarpışmalarına ve birleşmelerine neden olun. Daha sonra, numuneyi üç dakika boyunca yuvarlamak için emişi manipüle ederek birleşik damlacığı karıştırın. Pnömatik damlacık manipülasyon platformunun süperhidrofobik alanına iki mikrolitre 400 milimolar hidroksilamin ve iki mikrolitre 25.4 milimolar kloroaurik asit ekleyin.

Emişi, damlacıkların çarpışması ve birleşmesi için manipüle edin. Ardından, birleştirilmiş damlacığı bir dakika yuvarlayarak karıştırın. Son damlacığın rengini çıplak gözle gözlemleyin.

Bu çalışmada, çoklu nükleotid polimorfizmleri, altın nanoparçacık problarının DNA hibridizasyon aracılı büyümesi kullanılarak kolorometrik olarak tespit edilmiştir. Burada, DNA örnekleri, prob DNA'sına farklı afinitelere sahiptir ve bu da renk değişikliği olarak görülen altın nanopartiküllerin büyümesinde farklılıklara neden olur. Üç baz çifti uyumsuz DNA örneği, özellikle daha yüksek konsantrasyonlarda renkte gözle görülür farklılıklar olarak görülebilen, tamamen tamamlayıcı DNA'dan daha az hibridizasyona sahiptir.

Altı baz uyumsuz DNA, proba zayıf hibridizasyon afinitesine sahiptir ve bu nedenle altın nanopartiküllerin büyüme boyutu küçüktü. Bu kolorometrik analizin, numuneler pnömatik bir emme platformu aracılığıyla manipüle edildiğinde tekrarlanabilir olduğu gösterilmiştir, çünkü DNA uyumsuzluğunun sonuçları çıplak gözle kolayca gözlemlenebilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, tüm prosedür, numunenin ve reaktifin eklenmesinden bunların sonucuna kadar beş dakikadan daha az sürer, bu da geleneksel yöntemden çok daha hızlıdır.

Her işlemdeki toplam sadece 10 mikrolitredir, bu da büyük bir sistemde gerekenden önemli ölçüde daha azdır. Bu prosedürü takiben, DNA fragmanının boşluğunun dizi varyasyonunun belirli bir hastalıktan sorumlu olduğu doğrulanır. Özel olarak tasarlanmış ürün, numune DNA'sının bir dizi uyumsuzluğunu elde etmek için kullanılabilir.

Pnömatik damlacık manipülasyon platformu, optik ağırlıklandırma, boya elektro floresansı, elektro ağırlıklandırma ve shoomoo'nun kılcal harekete geçirmesi gibi diğer yöntemlerden daha biyouyumludur. Önerilen multinükleotid polimorfizm tespit yöntemi, pnömatik damlacık manipülasyon platformu altında gerçekleştirilmiştir, bu da numunelerin ve reaktiflerin doğrudan pipet ile yüklenebileceği ve toplanabileceği anlamına gelir. Geliştirildikten sonra, bu teknik DNA taraması ve diğer kimyasal ve biyometrik uygulamalar için yüksek bir potansiyele sahiptir.