Name: Bir Pnömatik Damlacık Manipülasyon Platformu Multi-nükleotid Polimorfizmlerinin Görsel Kolorimetrik Tespiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Öğrenin, pnömatik damlacık manipülasyon platformu kullanarak çoklu nükleotid polimorfizmlerini görsel olarak tespit etme yöntemini. Bu basit ve erişilebilir teknik, biyokimyasal araştırmacılar için genetik mutasyonları incelemede kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Tayvan Bilim ve Teknoloji Bakanlığı, MOST-103-2221-E-002 -097 -MY3 sözleşmeleri kapsamında bu araştırmaya mali destek sağlamıştır.

MNP Algılama 1. Yöntem Not: Bu bölüm altın nanoparçacıkların hibridizasyon aracılı büyüme dayalı MNP algılamak için yordam açıklanır. <ol><li> Prob DNA konsantrasyonu 100 uM olarak (5&#39;-tiol-GAGCTGGTGGCGTAGGCAAG-3 &#39;) çözeltisi hazırlayın. </li><li> Prob DNA modifiye AuNP (AuNP prob) parçacıkların hazırlanması. 21 Not: Burada kullanılan hacim prob DNA modifiye AuNP (AuNP prob) parçacıkların gereksinimi bağlıdır. Deneylerin sayısı, yapılacak üzerinde dolayısıyla bağlıdır. Biz genellikle yedek olarak aşırı AuNP prob parçacıkları hazırlamak. Bu adımların kullanılan hacim ayarlanabilir ve esnektir. <ol><li> Konsantrasyon 1 OD / ml altın nano partiküller içeren bir çözeltiye (13 nm, 17 nM) (100 uM, Aşama 1.1&#39;de elde edilmiş) prob DNA ekleyin. </li><li> Sodyum dodesil sülfat nihai konsantrasyonlar getirin (NAC 12 H 25 SO 4 SDS) ve fosfat tamponu (PBS),% 0.01 ve 0.01 M, respectivel içinY. </li><li> 20 dakika sonra, NaCl (2M) ve PBS (0.01 M),% 0.01 SDS muhafaza edilirken bir çözeltisi ile, 0.05 M sodyum klorür (NaCI) konsantrasyonunu getirmek ve 20 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 1 M üzerinde 20 dakika aralıklarla bir son konsantrasyona kadar 0.1 M artışlarla NaCI konsantrasyonunu artırır. </li><li> 23 ° C &#39;de, bir girdaplı karıştırıcı üzerinde çalkalayarak gece inkübe edin. sallayarak hızı sürece DNA örnekleri ve AuNP sondalar hibritlenmiş olmak gibi deney etkilemez. </li><li> 30 saniye boyunca 7.000 xg&#39;de altın nanopartiküller Santrifüj ve süpernatant kaldırmak. </li></ol></li><li> 25 nM (AuNP prob çözeltisi) bir konsantrasyonda deiyonize suda (DI su) içine AuNP prob parçacıkları ekleyin. </li><li> Hedef DNA örnekleri hazırlama (: &#39;, üç temel-çift uyumsuz: 5&#39;-CTTGCCTAC TTT ACCAGCTC-3&#39;; 5&#39;-CTTGCCTACGCCACCAGCTC-3 tam olarak komplementer altı baz çiftli uyumsuz: 5&#39;-CTTGCCT TTTTTT CCAGCTC-3 &#39;) konsantrasyonlarda0.06, 0.11, 0.17, sırasıyla, 0.20, 0.30, 0.50 uM. </li><li> NaCl (14 uM) ile birlikte DNA örnekleri (350 ul) içine AuNP prob çözeltisi (6 ml, 25 nM) eklenir. </li><li> DNA hibridizasyonu için 5 dakika boyunca 23 ° C&#39;de bir girdaplı karıştırıcı ile DNA örnekleri ve AuNP problarının Karışım çalkalanır. </li><li> AuNP büyümesi için, çözelti (DNA örnekleri ve AuNP prob karışımı) NH 2OH (6 ul, 400 mM) ve HAuCl 4 (6 ul, 25.4 mM) ilave edin. AuNP büyüme tamamlanması için yaklaşık 30 saniye sürer. renk sürekli değişim en fazla 1 saat korur. DİKKAT: HAuCl 4 ile Ciltle temas şiddetli toksik etkiler üretebilir. Kullanmadan önce malzeme güvenlik bilgi formlarını (MSDS) danışın. Eldiven giymek ve HAuCl 4 kullanırken duman dolap kullanın. </li></ol> Bir Pnömatik Damlacık Manipülasyon Platformu 2. Fabrikasyon Not: P: PDMS tabanlı damlacık manipülasyon platformu iki bileşenden oluşursüper hidrofobik yüzey ve bir hava kanal tabakası (5 mm) DMS membran (100 um). olan bir MEMS işlemi olmadan, yaygın işleme işlemleri imalatı için mikroakışkan bileşenlerin hızlı prototipleme için bir kalıbın PDMS döküm ve çoğaltma yapmak için bir bilgisayar sayısal kontrollü (CNC) mikroişleme içeren cihaz ve lazer mikro imal kullanılmıştır süper hidrofobik yüzey (bakınız Şekil 3). <ol><li> Mikroyapısında ile PMMA esaslı ana kalıpları (bakınız Şekil 3) üretmek için bir matkap ucu (0.5 mm) ile donatılmış CNC makinesini kullanın. matkap ucu 7 mm / sn bir besleme hızı ve dönme 26,000 rpm hızını kullanın. PMMA hurda kaldırmak ve ana kalıp yüzeyini temizlemek için bir hava üfleyici ve DI su kullanın. </li><li> PDMS taban ve oranı 10 içinde sertleştirici madde karışımı hazırlanması: 1 arasındadır. tüm hava kabarcıkları kaldırılır 30 dakika boyunca ya kadar desikatörde içinde karışım Degas. </li><li> th içine PDMS dökünE Ana kalıp ve hava odaları ters mikro-(PDMS membran) ve hava kanalı (PDMS tabakası) elde etmek üzere bir fırında 60 ° C sıcaklıkta 3 saat PDMS fırında. </li><li> (Elle) ana kalıp PDMS katmanı kaldırın. Hava emme ağızlığı için PDMS katman üzerinde delikler. </li><li> Oksijen plazma arıtma sistemi odasına PDMS membran, PDMS katman ve cam alt tabaka koyun. oksijen plazma muamelesinden sonra, 10 dakika süre ile bir ocak (90 ° C) bir araya PDMS membran PDMS tabakası ve cam substrat bağlanması. </li><li> lazer kesim makinesi (PDMS membran tarafı yukarı) içine kompozit çip koyun. süperhidrofobik alan (15 mm x 12 mm) tanımlamak için .dwg dosyasını içe aktarın. Bakınız Şekil 3. Doğrudan PDMS membran (güç 12 W, tarama hızı 106,68 mm / sn) üzerinde süperhidrofobik alan oluşturmak için bir CO 2 -lazer makinesi ile PDMS membran engrave. </li><li> yıkamak için DI su ile süperhidrofobik yüzeyini temizleyinyüzeyde uzak kömürleşmiş artıkları. </li><li> Bir selenoid vana aracılığıyla hava emme girişi ve vakum pompası bağlayın (Şekil 4). Bir dijital I / O USB modülü ile bilgisayar ve kontrol selenoid vana takın. </li></ol> Pnömatik Platformunda MNP Saptanması İçin 3. Operasyon Not: Bu bölüm pnömatik damlacık manipülasyon platformunda kolorimetrik ve hızla MNP tanımlamak için çalışmasını açıklar (bakınız Şekil 5). Tüm adımlar 23 ° C (ortam sıcaklığı) yeri ve bağıl nem% 85 alır. <ol><li> Pnömatik damlacık manipülasyon platformu süperhidrofobik alana (10 ul, 0.5 uM) hedef DNA örneği damlacık yerleştirin. </li><li> Pnömatik damlacık manipülasyon platformu süperhidrofobik alanda AuNP prob damlacık (10 ul, 25 nM) yerleştirin. </li><li> Bir selenoid vana ve bir si ile PDMS membran saptırma neden hava emiş kontrolmple programı (örneğin, Labview). damlacıkları birbiri ile çarpışır ve birleşme şekilde PDMS zar üzerinde (sırasıyla, hedef DNA ve AuNP problar ihtiva eden) damlacıklarının geçiş yolu boyunca her bir hava odası içinde hava emişi sağlar. -80 KPa (gösterge basıncı) vakum pompasının bir çalışma basıncı kullanın. <ol><li> Alternatif olarak, elle sürece damlacık tamamen karışık olarak hava emişi kontrol eder. elle bağlamak ya da test erken dönemlerinde tüplerle vakum pompası ve hava bölmesinin girişlerine ayırın. </li></ol></li><li> selenoid vana kontrol sistemi kullanılarak 3 dakika boyunca karıştırma verimliliği artırmak için ileri ve geri coalesced damlacık rulo hava emişi kontrol eder. hedef DNA ve AuNP probları iyice karıştırılır ve 3 dakika içinde melezleşmiştir olur. sırasıyla, itici frekans ve 5 Hz ve -80 kPa (gösterge basıncı) bir çalışma basıncını kullanın. </li><li> NH2 OH (2 ul, 400 mM) ve HAuCl ihtiva eden bir damlacık yerleştirinPnömatik damlacık manipülasyon platformun süperhidrofobik alanı 4 (2 ul, 25.4 mM). </li><li> damlacıkları birbirleriyle ve COALESCE çarpışır izin hava emişi (-80 kPa gösterge basıncı) kontrol eder. Sonra ileri ve geri coalesced damlacık rulo 1 dakika boyunca karıştırma verimliliği artırmak için izin hava emişi (5 Hz ve -80 kPa gösterge basıncı) kontrol eder. </li><li> Tedbir ve çıplak gözle coalesced damlacık rengini kaydedin. </li></ol>

<ol><li>Chorley, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+verification+of+functional+single+nucleotide+polymorphisms+in+regulatory+genomic+regions%3A+current+and+developing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res.+Rev.+Mutat%22%5BJournal%5D)">Discovery and verification of functional single nucleotide polymorphisms in regulatory genomic regions: current and developing technologies.</a> Mutat. Res. Rev. Mutat. 659 (1), 147-157 (2008).</li>
<li>Hinds, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+patterns+of+common+DNA+variation+in+three+human+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Whole-genome patterns of common DNA variation in three human populations.</a> Science. 307 (5712), 1072-1079 (2005).</li>
<li>Rosenfeld, J. A., Malhotra, A. K., Lencz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+multi-nucleotide+polymorphisms+in+the+human+genome+characterized+by+whole+genome+and+exome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Novel multi-nucleotide polymorphisms in the human genome characterized by whole genome and exome sequencing.</a> Nucleic Acids Res. , 408(2010).</li>
<li>Whelan, S., Goldman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+frequency+of+events+that+cause+multiple-nucleotide+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Estimating the frequency of events that cause multiple-nucleotide changes.</a> Genetics. 167 (4), 2027-2043 (2004).</li>
<li>Saiki, R. K., Walsh, P. S., Levenson, C. H., Erlich, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+amplified+DNA+with+immobilized+sequence-specific+oligonucleotide+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (16), 6230-6234 (1989).</li>
<li>Kim, S., Misra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+genotyping%3A+technologies+and+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">SNP genotyping: technologies and biomedical applications.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 9, 289-320 (2007).</li>
<li>Kwok, P. Y., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+single+nucleotide+polymorphisms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Issues+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of single nucleotide polymorphisms.</a> Curr. Issues Mol. Biol. 5, 43-60 (2003).</li>
<li>Elghanian, R., Storhoff, J. J., Mucic, R. C., Letsinger, R. L., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+colorimetric+detection+of+polynucleotides+based+on+the+distance-dependent+optical+properties+of+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Selective colorimetric detection of polynucleotides based on the distance-dependent optical properties of gold nanoparticles.</a> Science. 277 (5329), 1078-1081 (1997).</li>
<li>Lee, J. S., Han, M. S., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+Detection+of+Mercuric+Ion+%28Hg2%2B%29+in+Aqueous+Media+using+DNA-Functionalized+Gold+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem%22%5BJournal%5D)">Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-Functionalized Gold Nanoparticles.</a> Angew. Chem. 119 (22), 4171-4174 (2007).</li>
<li>Storhoff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanoparticle-based+detection+of+genomic+DNA+targets+on+microarrays+using+a+novel+optical+detection+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Gold nanoparticle-based detection of genomic DNA targets on microarrays using a novel optical detection system.</a> Biosens. Bioelectron. 19 (8), 875-883 (2004).</li>
<li>Bao, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+identification+in+unamplified+human+genomic+DNA+with+gold+nanoparticle+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">SNP identification in unamplified human genomic DNA with gold nanoparticle probes.</a> Nucleic Acids Res. 33 (2), 15-15 (2005).</li>
<li>Chen, Y. T., Hsu, C. L., Hou, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+single-nucleotide+polymorphisms+using+gold+nanoparticles+and+single-strand-specific+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Detection of single-nucleotide polymorphisms using gold nanoparticles and single-strand-specific nucleases.</a> Anal. Biochem. 375 (2), 299-305 (2008).</li>
<li>Li, H., Rothberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+detection+of+DNA+sequences+based+on+electrostatic+interactions+with+unmodified+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (39), 14036-14039 (2004).</li>
<li>Fang, W. F., Chen, W. J., Yang, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+determination+of+DNA+concentration+and+mismatches+using+hybridization-mediated+growth+of+gold+nanoparticle+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Sensor.+Actuat.+B+Chem%22%5BJournal%5D)">Colorimetric determination of DNA concentration and mismatches using hybridization-mediated growth of gold nanoparticle probes.</a> Sensor. Actuat. B Chem. 192, 77-82 (2014).</li>
<li>Wang, Z., Zhang, J., Ekman, J. M., Kenis, P. J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-mediated+control+of+metal+nanoparticle+shape%3A+one-pot+synthesis+and+cellular+uptake+of+highly+stable+and+functional+gold+nanoflowers%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">DNA-mediated control of metal nanoparticle shape: one-pot synthesis and cellular uptake of highly stable and functional gold nanoflowers.</a> Nano Lett. 10 (5), 1886-1891 (2010).</li>
<li>Chen, L., Manz, A., Day, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+nucleic+acid+analysis+integrated+on+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Total nucleic acid analysis integrated on microfluidic devices.</a> Lab Chip. 7 (11), 1413-1423 (2007).</li>
<li>Lien, K. Y., Liu, C. J., Lin, Y. C., Kuo, P. L., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+genomic+DNA+and+detection+of+single+nucleotide+polymorphism+genotyping+utilizing+an+integrated+magnetic+bead-based+microfluidic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid.+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Extraction of genomic DNA and detection of single nucleotide polymorphism genotyping utilizing an integrated magnetic bead-based microfluidic platform.</a> Microfluid. Nanofluid. 6 (4), 539-555 (2009).</li>
<li>Ng, J. K. K., Feng, H. H., Liu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+discrimination+of+single-nucleotide+mismatches+using+a+microfluidic+device+with+monolayered+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Rapid discrimination of single-nucleotide mismatches using a microfluidic device with monolayered beads.</a> Anal. Chim. Acta. 582 (2), 295-303 (2007).</li>
<li>Xing, S., Harake, R. S., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-driven+transports+on+superhydrophobic-patterned+surface+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Droplet-driven transports on superhydrophobic-patterned surface microfluidics.</a> Lab Chip. 11 (21), 3642-3648 (2011).</li>
<li>Huang, C. J., Fang, W. F., Ke, M. S., Chou, H. Y. E., Yang, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biocompatible+open-surface+droplet+manipulation+platform+for+detection+of+multi-nucleotide+polymorphism%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A biocompatible open-surface droplet manipulation platform for detection of multi-nucleotide polymorphism.</a> Lab Chip. 14 (12), 2057-2062 (2014).</li>
<li>Mirkin, C. A., Letsinger, R. L., Mucic, R. C., Storhoff, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA-based+method+for+rationally+assembling+nanoparticles+into+macroscopic+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A DNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materials.</a> Nature. 382 (6592), 607-609 (1996).</li>
<li>Ichimura, K., Oh, S. K., Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-driven+motion+of+liquids+on+a+photo-responsive+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Light-driven motion of liquids on a photo-responsive surface.</a> Science. 288 (5471), 1624-1626 (2000).</li>
<li>Jones, T. B., Gunji, M., Washizu, M., Feldman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dielectrophoretic+liquid+actuation+and+nanodroplet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Dielectrophoretic liquid actuation and nanodroplet formation.</a> J. Appl. Phys. 89 (2), 1441-1448 (2001).</li>
<li>Lee, J., Kim, C. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-tension-driven+microactuation+based+on+continuous+electrowetting%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microelectromech.+S%22%5BJournal%5D)">Surface-tension-driven microactuation based on continuous electrowetting.</a> J. Microelectromech. S. 9 (2), 171-180 (2000).</li>
<li>Daniel, S., Chaudhury, M. K., De Gennes, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibration-actuated+drop+motion+on+surfaces+for+batch+microfluidic+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Vibration-actuated drop motion on surfaces for batch microfluidic processes.</a> Langmuir. 21 (9), 4240-4248 (2005).</li>
<li>Darhuber, A. A., Valentino, J. P., Davis, J. M., Troian, S. M., Wagner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+actuation+by+modulation+of+surface+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Microfluidic actuation by modulation of surface stresses.</a> Appl. Phys. Lett. 82 (4), 657-659 (2003).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Bu protokol, basit bir kolorimetrik yöntem MNP 0,11-0,50 uM arasında mikrosantrifüj tüpleri içinde değişen konsantrasyonlarda uygulanabilir tespit etmek. Ayrıca, önerilen MNP saptama yöntemi, DNA taraması ve diğer biyo-medikal uygulamalar için yüksek potansiyele sahip bir pnömatik damlacık manipülasyon platformunda yapılır. Uygulamada, DNA örneği konsantrasyonu tespit edilebilir niteliktedir çalışma platformları karıştırma verimliliğine bağlıdır. coalesced damlacık tamamen karışık olduğundan emin olmak için, bu protokol...

Bir DNA sekansının bir tek baz çifti fark tek nükleotid polimorfizm (SNP), en yaygın genetik varyasyonları biridir. Mevcut çalışmalar SNP hastalık riski, ilaç etkinliği ve gen fonksiyonlarını etkileyerek bireylerin yan etkileri ile ilişkili olduğunu bildirmektedir. 1,2 Son çalışmalar da iki veya çok nokta mutasyonları (multi-nükleotid polimorfizmi) belirli hastalıklar ve bireysel neden olduğunu ortaya hastalığın etkileri farklılıklar. 3,4 nükleotid polimorfizm tespit hastalığı prescreening nedenle zorunludur. Diziye özgü oligonükleotid hızlı tespiti için basit ve etkili yöntemler son derece son yirmi yılda geliştirilmiştir. Vb prob immobilizasyon, floresan etiketleme, jel elektroforezi de dahil olmak üzere prosedürler genellikle DNA mutasyonları tespit dahil 1,5 Güncel yaklaşımlar, 6,7 ancak bu yöntemler genellikle masraflı, uzun analitik süreç gerektirirsive ekipman, iyi eğitimli teknisyenler ve numune ve reaktiflerin önemli tüketim. hacmi ve benzersiz fiziksel ve kimyasal özelliklerine yüzey alanının büyük bir oranı ile bir nanopartikül belirli biyolojik bir çok hassas ve ucuz bir algılama platformu olarak ideal bir malzemedir. Altın nanopartiküller (AuNP) yaygın oligonükleotid prob ile değiştirilecek dolayı büyük bir yetenek DNA tespiti için kullanılır. 8-10 SNP tespit teknikleri de AuNP kullanılarak geliştirilmiştir. 11-13 Bu çalışmada biz tespit etmek için yeni bir kolorimetrik yaklaşımını benimsemiştir çoklu nükleotid polimorfizmi (MNT) AuNP problarının DNA hibridizasyon dolayımlı büyüme ile. 14, bu basit ve hızlı tarama yöntemi teorisine dayanmaktadır konjuge tek bağlı DNA (ssDNA) ya da çift-şeritli DNA (dsDNA) değişik uzunluklarda AuNP büyüme büyüklüğü ve şekli etkileyen AuNP (Şekil 1 e bakınız). 15, DNA Bu tespit yöntemireaktiflerin küçük tüketimi, küçük bir deney süresi (birkaç dakika) ve klinik tanı ve yerli tıbbi tarama için ileriye dönük uygulanabilir termal kontrolü olmadan basit bir prosedür vardır. DNA&#39;nın duyarlılık, algılama sınırı ve özgüllüğünü artırmak amacıyla deneysel protokolleri büyük ölçekli ekipman az parçalarını gerekli geleneksel deneysel protokollerin evrimleştiği, 16 o mikroakışkan sistemleri ve basitleştirilmiş DNA dizisini tespit etmek için birkaç mikroakışkan sistemleri geliştirilmiştir biyosensör. Mikroakışkan sistemleri DNA saptama yöntemleri de heterojen bir SNP tespit etmek tek okuma için, ancak, sinyal amplifikasyonu ve bir floresan okuyucu için, bir PCR (polimeraz zincir reaksiyonu) gibi bir sonraki işlem aletleri makine gerektirir. 17,18 basit geliştirilmesi sonraki işlem olmadan platformu doğrudan çoklu nükleotid polimorfizmi sonuçlarını okumakyüksek ölçüde istenmektedir. Karşılaştırıldığında iyi kullanılan geleneksel, mikroakışkan kapalı sistemler, mikroakışkan cihazlar umut verici gibi net bir optik yol, örneğe erişmek için kolay bir yol, doğrudan çevre erişilebilirlik ve hiçbir kolaylıkla oluşturulan kavitasyon ya da ara yüzey tıkanıklığı gibi birçok avantaj sunar açık yüzey kanalı. 19 Daha önceki çalışma olan, bu platformun, damlacıklar aynı anda taşınan ve bir emme kuvveti kullanarak bir itici enerji müdahalesi olmaksızın manipüle edilebilir On açık yüzey damlacık manipülasyon (Şekil 2). 20 için basit bir pnömatik platformu tanıtıldı biyolojik ve kimyasal uygulamalarda büyük bir potansiyel. Bu pnömatik platformu, böylece AuNP problarının DNA hibridleşmesinden faydalanan aracılı büyüme kavramı kullanılarak kolorimetrik bir yaklaşım ile kombinasyon halinde MNT tespiti için DNA örneklerinin işleme yürütmek için kullanıldı. Bu çalışmada sunulan protokol açıklarAçık bir yüzey üzerinde pnömatik damlacık manipülasyon platformunda çoklu nükleotid polimorfizmlerinin basit bir görsel algılama. Bu çalışma çok nükleotid polimorfizmi çıplak gözle saptanabilir olduğunu doğrular; Önerilen pnömatik platformu biyolojik ve kimyasal uygulamalar için uygundur.

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD 184</td><td></td></tr><tr><td>tezgah üstü oyma makineleri</td><td>Roland DG</td><td>EGX-400</td><td></td></tr><tr><td>lazer kesim makinesi</td><td>Universal Laser Systems, Inc.</td><td>VLS 3.50</td><td></td></tr><tr><td>Oksijen plazma arıtma sistemi</td><td>Femto Science Inc. Kore</td><td>CUTE-MPR</td><td></td></tr><tr><td>solenoid valf</td><td></td><td></td><td>ev yapımı</td></tr><tr><td>vakum pompası</td><td>ULVAC KIKO, Inc.</td><td>DA-30D</td><td></td></tr><tr><td>13-nm AuNP çözeltisi</td><td>TAN Bead Inc., Tayvan</td><td>NG-13</td><td></td></tr><tr><td>DNA (5 'uçlu etiketli tiyol ile)</td><td>MDBio, Inc., Tayvan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>UniRegion&nbsp; Biyo-Teknoloji,. Tayvan</td><td>PBS001-1L</td><td></td></tr><tr><td>sodyum dodesil sülfat (SDS)</td><td>JT baker</td><td>4095-04</td><td></td></tr><tr><td>Hidroksilamin çözeltisi (NH2OH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>467804</td><td></td></tr><tr><td>Kloroaurik asit (HAuCl4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4022</td><td></td></tr><tr><td>sodyum klorür (NaCl)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>girdap karıştırıcı</td><td>Digisystem Laboratuvar Cihazları A.Ş.</td><td>VM-2000</td><td></td></tr><tr><td>santrifüj</td><td>Hermle Labortechnik GmbH.</td><td>Z 216 MK</td><td></td></tr></tbody></table>

bir pnömatik damlacık manipülasyon platformu multi-nükleotid polimorfizmlerinin görsel kolorimetrik tespiti

The Visual Colorimetric Detection of Multi-nucleotide Polymorphisms on a Pneumatic Droplet Manipulation Platform

çoklu nükleotid polimorfizmi (MNT) tespit etmek için basit ve görsel bir yöntem açık yüzeyi üzerinde bir pnömatik damlacık manipülasyon platformu üzerinde gerçekleştirilmiştir. kolorimetrik DNA tespiti için bu yaklaşım, altın nano parçacık probları (AuNP Probes) hibridizasyon aracılı büyüme dayanıyordu. AuNP büyüme boyutu ve düzenlemesi probları ile hibridize DNA numunelerinin sayısı hakimdir. Nanopartiküllerin spesifik büyüklük-ve biçime bağlıdır optik özelliklerine bağlı olarak, sondalar için örnek bir DNA fragmanı uyuşmazlıkları ayırt edilmesi mümkün olan. testleri, sırasıyla reaktifler ve DNA örnekleri ihtiva eden damlacıklar ile gerçekleştirilmiştir, ve esnek PDMS göre süperhidrofobik membran kontrol pnömatik emme ile taşınan ve pnömatik bir platform üzerinde karıştırıldı. Damlacıklar hiçbir yan eff ile son derece biyouyumlu olduğu önerilen pnömatik platformda açık yüzey üzerinde aynı anda ve tam teslim edilebilirdamlacıklar içindeki DNA örneklerinin vb. İki önerilen yöntemler birleştiren çoklu nükleotid polimorfizmi pnömatik damlacık manipülasyon platformunda bakışta tespit edilebilir; hiçbir ek cihaz gereklidir. sonuca platformda damlacıklar yükleme Prosedür mevcut yöntemlere göre çok daha az az 5 dakika alır. Ayrıca, bu kombine MNP bir tarama yaklaşımı, bir makro sistemin daha belirgin az Her işlem, sadece 10 ul numune hacmi gerekir.

Bu çalışmada, üç DNA örnekleri AuNP problarının DNA hibridizasyon dolayımlı büyüme ile tespit basit ve yeni bir yöntem kullanılarak test edildi. Prob DNA ve üç çeşit DNA örneklerinin dizileri, spesifik olarak, cDNA protokolün adım 1 &#39;de listelenmektedir, TMDNA (üç baz çiftli uyuşmaz DNA) ve SixMDNA (altı baz çiftli uyuşmaz DNA) (tam olarak komplementer DNA&#39;sını ölçmek amacıyla yapılan). burada test edilen DNA örneklerinin prob uyumsuzluklar DNA örnekleri orta segmentte hem de. <s...

Bu eser bir pnömatik damlacık manipülasyon platformunda çoklu nükleotid polimorfizmi tespit etmek için basit ve görsel bir yöntem sunar. Damlacık manipülasyon ve çoklu nükleotid polimorfizmlerinin tespiti de dahil olmak üzere önerilen yöntem, tüm deney ile, ileri araçların yardımı olmadan, 23 ° C civarındaki gerçekleştirilebilir.

Bir Pnömatik Damlacık Manipülasyon Platformu Multi-nükleotid Polimorfizmlerinin Görsel Kolorimetrik Tespiti

A simple and visual method to detect multi-nucleotide polymorphism (MNP) was performed on a pneumatic droplet manipulation platform on an open surface. ...

Bu prosedürün genel amacı, çok nükleotid polimorfizmlerini görsel olarak tespit eden basit bir yöntemi, pnömatik bir damlacık manipülasyon platformu ile birleştirmektir. DNA tespit platformu açık bir yüzey üzerindedir ve biyokimyasal araştırmacılar için kullanımı kolaydır. Genetik mutasyonları ve genetik hastalıkları tekrarlayan şekilde tespit etmek için basit bir araç araştırdık.Genetik varyasyonun hastalıklara nasıl yol açtığını anlamamıza yardımcı olma konusunda daha büyük bir potansiyele sahiptir. İki yeni ve basit yöntemi birleştirdik. Çok nükleotid polimorfizmi, pnömatik damlacık manipülasyon platformunda, herhangi bir ek cihaz gerektirmeden çıplak gözle tespit edilebilmektedir.Çok nükleotid polimorfizmini saptama yöntemi, grubumuzdaki doktora sonrası araştırmacı Tzu-Ming Wang tarafından gösterilecektir. Bu prosedüre başlamak için, metin protokolünde belirtildiği şekilde 100 µM konsantrasyonunda bir prob DNA çözeltisi hazırlayın. Ardından, prob DNA'yı mililitre başına bir OD'lik altın nanoparçacık çözeltisine ekleyin.SDS final konsantrasyonunu 0.01% ve PBS konsantrasyonunu 0.01 molar seviyesine getirin. Çözeltiyi 20 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, iki molar sodyum klorü

the-visual-colorimetric-detection-multi-nucleotide-polymorphisms-on

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Damlacık tabanlı mikroakışkan platformları kHz oranları ucuza pikolitrelik, kendi kendine bölümlere damarları oluşturmak mümkün olduğundan yüksek kapasiteli deney için umut vaat eden adaylardır. Hızlı, hassas ve yüksek çözünürlüklü floresans spektroskopik yöntemleri ile entegrasyon sayesinde, bu sistemler içinde üretilen bilgilerin büyük miktarda verimli, ayıklanır, harnessed ve kullanılan olabilir.

Mikroakışkan damlacık platformları için Floresan algılama yöntemleri

Bu videoda, dijital polimeraz zincir reaksiyonu veya dPCR ile hedef nükleik asitleri tespit etmek için emülsifiye edilmiş nano damlacıklar oluşturmak için adım adım bir prosedür sunuyoruz.

Damlacık Dijital Polimeraz Zincir Reaksiyonu: Nadir Tümör Mutasyonlarını Tespit Etmek için Nanodamlacık PCR Reaksiyonları Oluşturmak İçin Bir Yöntem

Bu video, bir DNA örneğindeki indel mutasyonunu tanımlamada dijital damlacık polimeraz zincir reaksiyonunun rolünü göstermektedir. ddPCR'nin yüksek hassasiyeti ve hassasiyeti, düşük seviyelerde bile bir numunede bulunan nadir mutasyonların doğru ve tutarlı bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Genomun farklı bölgelerindeki indel mutasyonlarını tanımlayabilir ve ölçebilir, mutasyon mekanizmaları ve bu mutasyonların işlevsel sonuçları hakkında değerli bilgiler sağlar.

Hedef Genlerde Indel Mutasyonu Tespiti için Dijital Damlacık Polimeraz Zincir Reaksiyonu

Bu video, klinik tanı ve prognoz için erken bir biyobelirteç olarak farklı beyaz kan hücresi popülasyonlarında metillenmiş DNA bölgelerinin eş zamanlı olarak ölçülmesi için multipleks damlacık polimeraz zincir reaksiyonu tekniğini göstermektedir.

Lökositlerde DNA Metilasyonunu Tespit Etmek için Multipleks Damlacık Polimeraz Zincir Reaksiyonu

Bu video, DNA örneklerindeki tek nükleotid varyasyonlarının tespiti için tüp içinde çip formatında dijital PCR'nin faydasını göstermektedir. Tek bir PCR reaksiyonu, bağımsız PCR reaksiyonları olarak işlev gören odalara bölünür ve odalardaki güçlendirilmiş hedeflerden gelen floresan sinyallerinin tespiti, numunedeki varyant alelin frekansını hesaplamak için kullanılır.

Tek nükleotid varyantlarının miktar tayini için tüp içinde çip tabanlı dijital PCR

Bu videonun amacı klinik ortamda nadir mutasyonları tespit etmek formalin ile fikse parafine gömülü (FFPE) referans standart hücre hatları ve dijital damlacık PCR (ddPCR) analizden otomatik DNA ekstraksiyon gerçekleştirmek için nasıl göstermektir. FFPE örneklerde mutasyonları tespit edilmesi FFPE örneklerinde ddPCR klinik faydasını ortaya koyar.

Dijital Damlacık PCR Formalin sabit Parafin gömülü Referans Standart Hücre Hatlarında BRAF V600E mutasyonları tespit etmek istihdam

Damlacık mikroakışkanlarında çok renkli floresan algılama, tipik olarak hacimli ve karmaşık epifloresan mikroskobu tabanlı algılama sistemlerini içerir. Burada, tek bir fotodetektör tarafından toplanan çok renkli verileri geçici olarak kodlamak için bir dizi optik fiber kullanan kompakt ve modüler çok renkli bir algılama şemasını açıklıyoruz.

Damlacık Mikroakiskan için renkli Floresan Algılama Optik Elyaf kullanma

Bu iletişim kuralı birden fazla Nükleik asitlerin kullanımı kolay bir tek, testinde görsel algılama için uygulanan küçük, kullanıma hazır bir kaset imalatı açıklar. Bu yaklaşım, kılcal bir dizi GDO hedefleri çok katmanlı ve yüksek verimli tespiti için kullanıldı.

Birden çok nükleik asit kapiller bir dizi görsel algılama

Burada, doğru bir şekilde birden fazla genetik değişiklikler hedef bölge teslim ddPCR ve hidroliz probları benzersiz bir çift kullanarak tek bir tepki olarak ölçmek için bir protokol mevcut.

Tek damlacık dijital polimeraz zincir tepkimesi mutasyonlar Hotspot bölgelerde kapsamlı ve eşzamanlı algılanması için

Epigenetik belirteçler beyaz kan hücresi (WBC) DNA metilasyon desenleri nicelik selektib yoluyla subtyping için kullanılır. Bu protokol, WBC diferansiyel sayımlarının hassas ve çok katlı metilasyona özgü hedef nicelemesine olanak sağlayan damlacık üretimi için termoplastik elastomer (TPE) tabanlı mikroakışkan bir cihaz kullanılarak çok katlı damlacık polimeraz zincir reaksiyonu (mdPCR) yöntemi ni sunar.

Hematolojik Tanı için Polimer Damlacık Jeneratör Cihazı ile Metilasyona Özgü Multipleks Damlacık PCR

Bu protokol, gRNA kaynaklı Cas9 bölünmesi ve DNA onarımının ardından hedef sahalarda homolog olmayan son birleştirme (NHEJ) olaylarının tanımlanması ve nicelleştirilmesi için analiz de dahil olmak üzere DNA ekstraksiyonundan dijital damlacık PCR (ddPCR) için deneysel kuruluma kadar adımları sağlar. Bu yöntemin diğer kullanımları arasında polimorfizm tespiti ve gen düzenleme varyant doğrulaması gibi uygulamalar yer almaktadır.

Genetiği Değiştirilmiş Anopheline Sivrisinek Popülasyonlarındaki Indels Mutasyonlarını Tespit Etmek için Dijital Damlacık PCR

Öğrenin, pnömatik damlacık manipülasyon platformu kullanarak çoklu nükleotid polimorfizmlerini görsel olarak tespit etme yöntemini. Bu basit ve erişilebilir teknik, biyokimyasal araştırmacılar için genetik mutasyonları incelemede kullanılır.

Bir Pnömatik Damlacık Manipülasyon Platformu Multi-nükleotid Polimorfizmlerinin Görsel Kolorimetrik Tespiti

Daha fazla video keşfet