Tasarım ve Düşük Maliyetli kullanımı, Otomatik Morbidostat Bakterilerin Adaptif Evolution için antibiyotik ilaç Seçimi Altında

Bu deneyin genel amacı, bakteriyel büyümeyi sürekli izleyen ve bakteriler ilaç direnci kazandıkça antibiyotik konsantrasyonunu dinamik olarak ayarlayan bir Morbidostat kullanarak antibiyotik direncinin evrimsel yolunu karakterize etmektir. Bu tekniğin temel avantajı, düzeneğin düşük maliyetli, kolayca erişilebilir elektronik bileşenlerden oluşması ve belirli amaçlar için kolayca yeniden yapılandırılabilmesidir. Prosedürleri, laboratuvarımın lisansüstü öğrencileri olan Po Cheng Liu ve Yi Tai Lee gösterecektir.

Morbidostat'ı monte etmek için, öncelikle kültür şişesinin kapağına 18 gauge'lik bir iğne ile üç delik açarak başlayın. Yaklaşık yedi santimetre uzunluğunda üç adet polietilen tüp kesin ve bunları kapaktaki deliklere yerleştirin. Polidimetilsiloksan veya PDMS karışımı için kalıp görevi görmesi amacıyla kapağın kenarını bantla sarın.

Ardından, 150 mililitrelik plastik bir kaba beş gram PDMS bileşen A ve 0,5 gram bileşen B ekleyin ve bir kürdan yardımıyla manuel olarak karıştırın. Karışımı 10 mililitrelik bir şırıngaya doldurun. Daha sonra, şırınga ile PDMS karışımını kapağın üzerine enjekte edin.

PDMS'i kürlemek için tüm kapağı 70 °C'de sekiz saat boyunca fırınlayın. Ardından, bir havya kullanarak LED anotunu 24 gauge tel ile ve LED katotunu karbon dirençle lehimleyin. Son olarak, 680 Ohm karbon direnci 24 gauge bir tel ile lehimleyin.

Kablo bağlantısını yalıtmak için elektrik bandı kullanın. Fotodedektörün kolektörünü 24 gauge kablo ile, emitörünü ise 100 Ohm karbon direnç ile lehimleyin. Ardından, kablo bağlantısını yalıtmak için elektrik bandı kullanın.

Işık yayan diyotu kültür şişesi tutucusuna yerleştirin. Burada gösterilen devre şemasını takip ederek ışık yayan diyotu bağlayın ve onu beslemek için beş voltluk bir güç kaynağı kullanın. IR tespit edebilen dijital bir kamera kullanarak LED'in çalıştığından emin olun. Şimdi foto detektörü kültür şişesi tutucusuna yerleştirin.

Ardından diyagramı takip ederek foto detektörü bağlayın ve onu beslemek için beş voltluk bir güç kaynağı kullanın. Elektronik kontrol kartı üzerindeki voltajı ölçmek için teli foto detektör dirençlerinin her iki tarafına bağlayın. Manyetik karıştırıcı ünitesi görevi gören soğutma fanının miline bir mıknatıs yapıştırın.

Manyetik karıştırma ünitesi mıknatıs ve soğutma fanından oluştuğu için, fan rafının kültür tüpüyle hizalanması büyük önem taşımaktadır. Ayrıca, stabil çalışmayı sağlamak adına kültür tüpü ile mıknatıs arasındaki mesafe oldukça kritiktir. Kültür tüpünün her bir polietilen borusunu; mikro pompalar, besiyeri şişeleri ve atık şişesi için ilgili silikon boru parçalarına bağlayın.

Pompa hızını belirlemek için pompayı bir saat boyunca çalıştırın ve besiyeri şişesinden kültür tüpüne pompalanan toplam hacmi ölçün. Tipik pompalama hızı, kültür tüpünün 12 milliliter çalışma hacmi için D eşittir 0,33/saat seyreltme hızına karşılık gelen, yaklaşık olarak saatte dört mililitre olmalıdır. Kurulum tamamlandığında, tüm düzeneği orta boy bir çalkalamalı inkübatöre yerleştirin.

Morbidostat'ı ön test etmek için, manyetik karıştırma çubuğunu test etmek amacıyla soğutma fanının güç kaynağı voltajını, motoru çalıştırmak için beş volta ayarlayın. Metin protokolüne uygun olarak bir dizi E-coli örneği hazırlayıp bir kalibrasyon eğrisi çizdikten sonra; cihaz girişlerini oluşturmak için iç çapı 1/32 inç ve dış çapı 3/32 inç olan, yedi santimetre uzunluğunda üç adet ultra kimyasal dirençli Tygon boru ile kültür şişesini hazırlayın. %0,2 glukoz içeren M9 minimal besiyeri ile Trimethoprim veya TMP ilacı içeren M9 besiyeri hazırlayın.

Ardından besiyerini, besiyeri şişesini, ilaçlı besiyeri şişesini, atık şişesini ve kültür tüpünü otoklavda 121 °C'de sterilize edin. Deneyin ilk gününde, dondurulmuş bir mililitre vahşi tip E-coli MG1655 hücrelerini oda sıcaklığında beş dakika boyunca çözdürün ve hücrelerin 120 µL'sini yaklaşık 12 mL M9 büyüme besiyeri içeren bir kültür tüpüne aktarın. Çalkalamalı inkübatörü açın ve sıcaklığı çalkalama olmadan 30 °C'ye ayarlayın.

Mikro pompayı, manyetik karıştırıcıyı ve optik yoğunluk ölçüm sistemini açarak Morbidostat işlemini başlatın. Yaklaşık 23 saat sonra, besleme voltajını kapatarak mikro pompayı durdurun ve kültür tüpünü çıkarın. Kültür tüpüne %15 gliserol ekleyin ve saklama için örnekleri -80 °C'de dondurun.

Biotin oluşumunu önlemek için bu deneylerin her birinin başında yeni bir kültür tüpüne geçmek de önemlidir. Aksi takdirde, iki veya üç gün içinde biotin oluşumu meydana gelebilir. Günlük dondurulmuş numuneyi oda sıcaklığında beş dakika boyunca çözdürdükten sonra, taze M9 medyum içeren yeni bir test tüpüne inoküle edin.

Numuneyi 37 °C'de bir çalkalamalı inkübatöre gece boyunca yerleştirin. Ertesi gün, mikrobiyal numuneyi on kat seyreltmek için M9 besiyeri kullanın ve mikrobiyal numune kabına 5 PSI basınç uygulayarak numuneyi mikroakışkan cihaza yükleyin. Ardından, TMP içeren besiyerini, TMP'li M9 kabına 5 PSI basınç uygulayarak çipe yükleyin.

Mikroakışkan çip üzerindeki iki oda arasındaki mikro mekanik valfi 15 dakika boyunca çalıştırarak mikrop ve ilaç arasındaki karıştırma işlemini gerçekleştirin. Son olarak, mikroakışkan çipi ters mikroskoba monte edilmiş mikroskop inkübatörüne yerleştirin. Bir CCD kamera ile büyüme odasındaki hücre görüntülerinden sekiz saat boyunca her saat başı örnekler alın.

Hücre sayısı verilerini metin protokolüne göre hesaplayın. Deneysel evrim, antibiyotik duyarlılık testi ve hücre morfolojisi kontrolü dahil olmak üzere yaygın Morbidostat işlemleri, dihidrofolat redüktaz veya DHFR geni çevresinde kümelenmiş mutasyonlarla ilaç direncinde belirgin ve kademeli bir artışa neden olan TMP antibiyotiğine maruz bırakılmış bir E-coli MG1655 kültürü kullanılarak geçersiz kılınmıştır. Mikroorganizmanın her gün, önceden belirlenmiş optik yoğunluk eşiğinin üzerinde büyümesi ve burada gösterildiği gibi ilaç enjeksiyonunu tetiklemesi beklenmektedir.

İlaç enjeksiyonunun büyümeyi inhibe etmesi ve sonuç olarak optik yoğunluğu azaltması beklenmektedir. Bu grafik, IC50 değerini belirlemeye yönelik bir deneyde antibiyotik ilaç direncinin zamana bağlı artışını göstermektedir. İlaç direnci, yaklaşık 12 gün boyunca yaklaşık 1500 kat artarak 1, 000 micrograms per milliliter seviyesine ulaşmıştır.

Önceki bulgularla tutarlıdır. Son gün mutantındaki DHFR nokta mutasyonları Sanger dizileme ile ölçülmüş ve bu tabloda listelenmiştir. Çoklu mutasyonlarla ilaç direncinin kazanılması, Morbidostat'ın kullanışlılığını kanıtlamaktadır.

İlaç içeren agar plakları üzerindeki seçim, genellikle yalnızca tek bir mutasyona yol açma eğilimindedir. Bu şekil, farklı TMP konsantrasyonlarındaki çip üzeri büyüme eğrilerini göstermektedir. Mutant örnekler, antibiyotik ilaç direncinde anlamlı bir artış göstermektedir.

Geliştirilmesinin ardından bu teknik, araştırmacıların gerçek bir kontrol laboratuvarı ortamında antibiyotik ilaç direncini incelemelerinin önünü açmıştır. Bu prosedürü takiben, antibiyotik ilaçların maruziyetine bağlı olarak morfolojisinin değişip değişmediği gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla mikroakışkan tek hücre ölçümü gibi diğer ölçümler gerçekleştirilebilir. Uzmanlaşıldığında bu cihaz, tek bir bakteri türünün kültüre edilmesi veya bir bakteri suşunun tolerans seviyesinin artırılması gibi tüm bakteri kültürü deneyleri için kolayca yeniden yapılandırılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, gerçek bir kontrollü adaptif laboratuvar evrim deneyiyle antibiyotik ilaç direnci kazanımının nasıl inceleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. İlaç dirençli bakterileri, mikrobiyolojik uygulamalar için geçerli olan biyogüvenlik kurallarına uygun şekilde yönetmeyi unutmayın. Bakterilerin temel eğitimi ile ilgili bir deney için özel izin gerekebilir.