Tasarım ve Düşük Maliyetli kullanımı, Otomatik Morbidostat Bakterilerin Adaptif Evolution için antibiyotik ilaç Seçimi Altında

İlaç konsantrasyonunu dinamik olarak ayarlayarak antibiyotik ilaç direncinin karakterizasyonunu sağlayan düşük maliyetli, yapılandırılabilir bir morbidostat tarif ediyoruz. Cihaz, çoğullanmış bir mikroakışkan platform ile entegre edilebilir. Yaklaşım, laboratuvar antibiyotik ilaç direnci çalışmaları için ölçeklendirilebilir.

Bu deneyin genel amacı, bakteri üremesini sürekli olarak izleyen ve bakteriler ilaç direnci kazandıkça antibiyotik konsantrasyonunu dinamik olarak ayarlayan bir Morbidostat kullanarak antibiyotik direncinin evrimsel yolunu karakterize etmektir. Bu tekniğin ana avantajı, kurulumun düşük maliyetli, kolayca bulunabilen elektronik bileşenlerden yapılmış olması ve belirli araçlar için kolayca yeniden yapılandırılabilmesidir. Prosedürleri gösterecek olan Po Cheng Liu ve Yi Tai Lee, her ikisi de laboratuvarımın yüksek lisans öğrencileri.

Morbidostat'ı monte etmek için, kültür şişesinin kapağına üç delik açmak için 18 gauge bir iğne kullanarak başlayın. Yaklaşık yedi santimetre uzunluğunda üç parça polietilen boru kesin ve bunları kapaktaki deliklere yerleştirin. Polidimetilsiloksan veya PDMS karışımı için döküm görevi görmesi üzere kapağın kenarını sarmak için bant kullanın.

Daha sonra 150 mililitrelik plastik bir kaba beş gram A bileşeni ve 0.5 gram PDMS bileşeni B ekleyin ve manuel olarak karıştırmak için bir kürdan kullanın. Karışımı 10 mililitrelik bir şırıngaya yükleyin. Ardından, şırınga ile PDMS karışımını kapağa enjekte edin.

PDMS'yi iyileştirmek için tüm kapağı sekiz saat boyunca 70 santigrat derecede pişirin. Ardından, bir havya kullanarak LED anodu 24 gauge tel ile ve LED katodu karbon dirençle lehimleyin. Ardından 680 Ohm'luk bir karbon direnci 24 gauge tel ile lehimleyin.

Kablo bağlantısını yalıtmak için elektrik bandı kullanın. Fotoğraf dedektörünün kollektörünü 24 gauge tel ile ve foto dedektörün yayıcısını 100 Ohm karbon dirençle lehimleyin. Ardından kablo bağlantısını yalıtmak için elektrik bandı kullanın.

Işık yayan diyotu kültür şişesi tutucusuna yerleştirin. Burada gösterilen devre şemasını takip ederek, ışık yayan diyotu bağlayın ve ona güç sağlamak için beş voltluk bir güç kaynağı kullanın. IR'yi algılayabilen bir dijital kamera kullanarak LED'in çalıştığından emin olun. Şimdi fotoğraf dedektörünü kültür şişesi tutucusuna yerleştirin.

Ardından şemayı takip ederek fotoğraf dedektörünü bağlayın ve güç sağlamak için beş voltluk bir güç kaynağı kullanın. Kabloyu fotoğraf dedektörü dirençlerinin her iki tarafına bağlayın ve elektronik kontrol panosundaki voltajı ölçün. Manyetik karıştırma ünitesi olarak görev yapan soğutma fanının şaftına bir mıknatıs yapıştırın.

Manyetik karıştırma ünitesi mıknatıs ve soğutma fanından oluştuğundan, fanın rafını kültür şişesine hizalamak çok önemlidir. Ayrıca, kültür şişesi ile mıknatıs arasındaki mesafe, kararlı çalışmayı sağlamak için çok kritiktir. Kültür şişesinin her bir polietilen boru parçasını, mikro pompalar, orta boy şişeler ve atık şişesi için ilgili silikon boru parçasına bağlayın.

Pompayı bir saat boyunca açın ve pompa hızını belirlemek için orta şişeden kültür şişesine pompalanan toplam hacmi ölçün. Tipik pompalama hızı saatte yaklaşık dört mililitre olmalıdır, bu da kültür şişesinin 12 mililitrelik bir çalışma hacmi için saatte 0.33'e eşit olan D seyreltme oranına karşılık gelir. Kurulum tamamlandığında, tüm düzeneği orta büyüklükte bir çalkalama inkübatörüne yerleştirin.

Morbidostat'ı önceden test etmek için, manyetik karıştırma çubuğunu test etmek üzere motorunu başlatmak için soğutma fanının güç kaynağı voltajını beş volta ayarlayın. Bir dizi E-coli numunesi hazırladıktan ve metin protokolüne göre bir kalibrasyon eğrisi çizdikten sonra, giriş girişlerinin cihazı oluşturması için iç çapı 132 inç ve dış çapı 332 inçten oluşan yedi santimetre uzunluğunda üç adet ultra kimyasala dayanıklı Tygon hortumu ile kültür şişesini hazırlayın. % 0.2 glikoz ve Trimetoprim veya TMP ilacını içeren M9 ile M9 minimal ortamını hazırlayın.

Daha sonra orta, orta şişeyi, ilaç orta şişesini, atık şişesini ve kültür şişesini 121 santigrat derecede bir otoklavda sterilize edin. Deneyin ilk gününde, bir mililitre donmuş yabani tip E-coli MG1655 hücresini oda sıcaklığında beş dakika boyunca çözdürün ve 120 mikrolitre hücreyi yaklaşık 12 mililitre M9 büyüme ortamı içeren bir kültür şişesine aktarın. Çalkalama inkübatörünü açın ve sıcaklığı sallama olmadan 30 santigrat dereceye ayarlayın.

Mikro pompayı, manyetik karıştırma ünitesini ve optik yoğunluk ölçümünü açarak Morbidostat işlemini başlatın. Yaklaşık 23 saat sonra, besleme voltajını kapatarak mikro pompayı durdurun ve kültür şişesini çıkarın. Kültür şişesine% 15 gliserol ekleyin ve numuneleri saklamak için eksi 80 santigrat derecede dondurun.

Bu deneylerin her birinin başında yeni bir kültür şişesine geçmek de biyotin oluşumlarını önlemek için önemlidir. Aksi takdirde, biyotin oluşumu iki veya üç gün içinde ortaya çıkabilir. Günlük donmuş numuneyi oda sıcaklığında beş dakika çözdürdükten sonra, yeni bir test tüpünü taze M9 ortamı ile aşılayın.

Numuneyi gece boyunca 37 santigrat derecede çalkalanan bir inkübatöre yerleştirin. Ertesi gün, mikrobiyal numuneyi on kat seyreltmek için M9 ortamını kullanın ve mikrobiyal numune kabına beş PSI'da basınç uygulayarak mikroakışkan cihaza yükleyin. Ardından, M9'a TMP kabı ile beş PSI'da basınç uygulayarak TMP içeren ortamı çipe yükleyin.

Mikroakışkan çip üzerindeki iki oda arasındaki mikro mekanik valfi 15 dakika boyunca harekete geçirerek mikrop ve ilaç arasındaki karışımı gerçekleştirin. Son olarak, mikroakışkan çipi ters çevrilmiş mikroskop üzerine monte edilmiş mikroskop inkübatörüne yerleştirin. Bir CCD kamera ile, sekiz saat boyunca her saat başı büyüme odasında hücre görüntüleri elde edin.

Hücre numarası verilerini metin protokolüne göre hesaplayın. Deneysel evrim, antibiyotik duyarlılık testi ve hücre morfolojisi kontrolü dahil olmak üzere yaygın Morbidostat operasyonları, antibiyotik TMP'ye maruz bırakılan bir E-coli MG1655 kültürü kullanılarak geçersiz kılındı, bu da dihidrofolat redüktaz veya DHFR geni etrafında kümelenmiş mutasyonlarla ilaç direncinde belirgin bir adım bazında artışa neden oldu. Her gün, mikropun önceden ayarlanmış optik yoğunluk eşiğinin üzerine çıkması ve burada gösterildiği gibi ilaç enjeksiyonunu tetiklemesi beklenir.

İlaç enjeksiyonunun büyümeyi engellemesi ve sonuç olarak optik yoğunluğu azaltması beklenir. Bu grafik, IC50'yi belirlemek için yapılan bir deneyde antibiyotik ilaç direncindeki zamansal artışı göstermektedir. İlaç direnci, yaklaşık 12 gün içinde mililitre başına yaklaşık 1500 kat artarak 1.000 mikrograma yükseldi.

Önceki bulgularla tutarlı. Son gün mutantındaki DHFR nokta mutasyonları Sanger dizilemesi ile ölçüldü ve bu tabloda listelenmiştir. Çoklu mutasyonlarla ilaç direncinin kazanılması, Morbidostat'ın yararlılığını kanıtlamaktadır.

Agar plakaları içeren ilaç üzerindeki seçim sadece tek mutasyonu verme eğilimindedir. Bu şekil, çeşitli TMP konsantrasyonlarında çip üzerindeki büyüme eğrilerini göstermektedir. Mutant örnekler, antibiyotik ilaç direncinde önemli bir artış olduğunu göstermektedir.

Bu teknik, geliştirildikten sonra araştırmacıların gerçek bir kontrol laboratuvarı ortamında antibiyotik ilaç direncinin konumunu incelemelerinin yolunu açtı. Bu prosedürü takiben, antibiyotik ilaçların maruziyeti nedeniyle morfolojinin hala değişmesi gibi ek soruları yanıtlamak için mikroakışkan tek hücre ölçümü gibi başka ölçümler de yapılabilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu cihaz, bir bakteri belirtisinin yetiştirilmesi veya bir bakteri suşunun maliyet tolerans seviyesinin artırılması gibi tüm bakteri kültürü deneyleri için kolayca yeniden yapılandırılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, gerçek bir kontrol uyarlanabilir laboratuvar evrim deneyinde antibiyotik ilaç direncinin kazanılmasını nasıl inceleyeceğinizi iyi anlamalısınız. İlaca dirençli bakterileri mikrobiyolojik uygulama için biyo güvenlik kurallarına göre kullanmayı unutmayın. Bakterilerin temel eğitimini içeren bir deney için özel izin gerekebilir.