Name: Tasarım ve Düşük Maliyetli kullanımı, Otomatik Morbidostat Bakterilerin Adaptif Evolution için antibiyotik ilaç Seçimi Altında (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Öğrenin, düşük maliyetli morbidostat kullanarak antibiyotik direncinin evrimsel yolunu karakterize etme yöntemini. Bakteri büyümesini sürekli izleyerek ilaç konsantrasyonunu dinamik olarak ayarlayın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, teorik analiz ve sayısal simülasyonda yararlı tartışmalar ve yardımları için Prof. Sze-Bi Hsu ve Bayan Zhenzhen'e teşekkür eder. Y. T. Y., MOST 103-2220-E-007-026 ve MOST 104-2220-E-007-011 hibe numaraları altında Bilim ve Teknoloji Bakanlığı'ndan ve 103N2042E1 hibe numaraları altında Ulusal Tsing Hua Üniversitesi'nden fon desteğini kabul etmek ister, 104N2042E1 ve 105N518CE1.

Morbidostat Cihaz 1. Montaj ve Ön test <ol><li> Morbidostat Meclisi <ol><li> 18 G şırınga iğne ile kültür flakon kapağı 3 delikler. ~ Uzunluğunda 7 cm polietilen boru üç parça kesin. kap polietilen boru bu üç parça yerleştirin. </li><li> polidimetilsiloksan (PDMS) karışım için döküm olarak hizmet kapağın kenarını sarmak için bant kullanın. bir kürdan ile elle karıştırma ile bir bileşenin 5 g ve 150 ml&#39;lik plastik bir kap içinde PDMS B bileşeninin 0.5 g karıştırın. 10 ml şırınga içine karışımı yerleştirin. <ol><li> şırınga ile kap PDMS karışımı dökün. 70 ° C&#39;de bir fırında 8 saat PDMS tedavi etmek için, tüm kapak fırında. </li></ol></li><li> Bir havya ile karbon direnci ile 24 ayar tel ve LED katot LED anot lehimleyin. 24 G teli ile bir 680 Ω karbon direnç lehim. Elektrik bandı kullanarak tel bağlantısı izole. </li><li> Yani24 G tel ve 100 kÊ karbon direnci ile photodetector verici ile photodetector kollektör lder. Elektrik bandı kullanarak tel bağlantısı izole. </li><li> kültür flakon tutucu ışık yayan diyot yerleştirin. Ek Şekil 2&#39;de devre şeması takip ederek, LED IR (örneğin, bir cep telefonu kamera) tespit edebilen bir dijital fotoğraf makinesi kullanılarak çalıştığından emin olun 5 V güç kaynağı ile diyot ve güç onu yayan ışık bağlayın. </li><li> Kültür şişe tutucu fotodetektör yerleştirin. Ek Şekil 2&#39;de devre şeması takip ederek, elektronik kontrol yönüyle voltajı ölçmek için foto detektör dirençlerin her iki tarafına kabloyu 5 V güç kaynağı ile fotodetektör ve güç bağlayın. </li><li> Manyetik karıştırıcı birim olarak görev soğutma fanı, şaftı üzerinde bir mıknatıs Tutkal. alignm Notkültür flakon fan ve kültür şişe ve mıknatıs arasındaki boşluk milin ent manyetik karıştırma ünitesinin düzgün fonksiyonu için çok önemlidir. </li><li> Mikro-pompalar, orta şişe ve atık şişe silikon tüp karşılık gelen parça içine kültür flakonun polietilen boru her parça bağlayın. 1 saat pompa açın ve toplam hacim pompa hızını belirlemek için kültür şişesine orta şişeden pompalanan ölçün. Tipik pompalama oranı seyreltme oranı D = 0.33 sa -1 kültür flakon hacmini çalışan bir 12 ml karşılık ~ 4 ml / saat, olması gerektiğini unutmayın. </li><li> Bir orta ölçekli (34 cm x 34 cm x 43.5 cm) çalkalama inkübatör bütün aksamını yerleştirin. </li></ol></li><li> Morbidostat ön test <ol><li> 5 V serin fan set güç kaynağı voltajı manyetik karıştırma çubuğu test etmek onun motoru başlatmak için. karıştırma işlemi görsel olarak kontrol edilebilir unutmayın. sürücü gerilimisoğutma fanı motoru tam darbe genişlik modülasyonu (PWM) tarafından kontrol edilir s. </li><li> Yabani tip E. bir dizi hazırlanması 600 optik yoğunlukları ile coli örnekleri genellikle 0.07 den kalibrasyonu 0.3 arasında değişen nm. Bir testi E. yerleştirin Kültür şişede coli numune ve fotodetektör voltajı kaydedin. <ol><li> Yeri ~ 100 plaka okuyucu aynı numunenin ul ve optik yoğunluk kaydedin. kalibrasyon eğrisini çizmek için optik yoğunluk verilerinin karşı fotodetektör voltajını kullanın. tipik optik yoğunluk bir birim değişikliği burada kullanılan önyargı düzeni ile fotodetektör olarak ~ 7.6 V değişiklik karşılık unutmayın. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Morbidostat Koşu <ol><li> Günlük Deneme Başlamadan Önce Hazırlık <ol><li> girişleri bölümünde olduğu gibi cihaz oluşturmak için iç çapı 1/32 inç ve dış çapı 3/32 inç üç ultra-kimyasala dayanıklı Tygon boru donanımları ile kültür flakon hazırlayın1.1 ve Ek Şekil 1&#39;de. </li><li> M9 minimal ortam (% 0.2 glukoz) ve trimetoprim (TMP) ilaç içeren bir ortam hazırlar. 121 ° C&#39;de bir otoklav içinde orta, orta şişe, ilaç orta şişe, atık şişe ve kültür flakon sterilize edin. Not: TMP, daha sonra Tablo 1 &#39;de konsantrasyonları ve ortam içeren TMP ilaç otoklava değildir elde etmek için kullanılan bir hazır bir çözümdür. </li></ol></li><li> Morbidostat Koşu <ol><li> Deneyin ilk gününde, donmuş vahşi tip 1 ml E. çözülme Oda sıcaklığında ve transfer ihtiva eden kültür şişesine hücreler 120 ul, 5 dakika boyunca coli MG1655 hücreler, M9 büyüme ortamı 12 ml. İlk günden sonra, dondurulmuş E. 1 ml çözülme coli 5 dakika ve transfer içeren yeni bir kültür şişesine hücrelerin 120 ul için önceki gün hücreleri ~ M9 büyüme ortamı 12 ml. </li><li> çalkalayıcı inkübatör açın ve tempe ayarlamak<html> Resim çalkalanarak 30 ° C&#39;ye kadar süreyle. </li><li> mikro-pompa, manyetik bir karıştırma birimi, ve optik yoğunluk ölçümü açarak morbidostat işlemi başlatır. NOT: Çalışma sırasında, bir geri besleme eşik algoritması ilaç enjeksiyonu kontrol etmek için kullanılır. ölçülen optik yoğunluk önceden belirlenmiş bir eşiği aştığında, ilaç enjeksiyon pompası açık olacak ve orta pompa kapalı olacaktır. Aksi takdirde, ilaç enjeksiyon pompası devre dışı kalır ve orta pompa açıktır. </li><li> mikrobiyal büyüme olmadığından emin olmak için zaman zaman gerilim izleyin. Not: Çünkü donma ve çözülme döngüsü, E. coli hücreleri, her gün büyüme sırasında yaklaşık 4 saatlik bir gecikme sergiler. </li><li> ~ 23 saat sonra, onun besleme gerilimini kapatarak mikro pompayı durdurun ve kültür şişesini çıkarmak. Kültür şişeye% 15 gliserol ekleyin ve depolama için -80 ° C&#39;de örnek dondurma. </li><li> Tekrarlayın 2.2.5 2.2.1 adımları. </li></ol></li></ol>le &quot;&gt; 3. Antibiyotik Duyarlılık Ölçümü 96 Kuyu Formatında NOT: antibiyotik direnci seviyesini belirlemek için 96 kuyu biçiminde bir plaka okuyucu büyüme hızı ölçümü yapın. <ol><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında, her gün, dondurulmuş numune çözülme ve • 15 mi M9 ortam ihtiva eden kültür şişesine hücre 15 ul transfer. Onları ~ 0.1 ulaştığı 600 nm&#39;de optik yoğunluk kadar büyümeye izin verin. 1 ml&#39;lik şişeler içine 15 ml ayırın ve Tablo 1 &#39;de gösterildiği gibi, istenen ilaç konsantrasyonları elde etmek için bu adımda TMP ilaç ekleyin. </li><li> Plaka okuyucu içinde her kuyuya adım 3.1 ve yerden numune 200 ul almak ve onları 12 saat 5 için büyümeye olanak sağlar. Dalga boyu 600 nm olduğunda optik yoğunluk ölçümü sırasında otomatik olarak kaydedilir. NOT: Her bir veri noktası için, üçlü ölçümler kaydedilir ve veri tutarlılığı sağlamak için ortalaması alınır. zamana karşı optik yoğunluk veri olabilir be büyüme oranı elde etmek için kullanılır. </li><li> IC 50 elde etmek için ilaç konsantrasyonuna karşı büyüme oranı verilerini çizilir. IC50 büyüme maksimal büyüme oranı 5 yüzde elli olan ilaç konsantrasyonu olarak tanımlanır unutmayın. </li></ol> Mikroakışkan Cihazlar 4. Tek Hücre Morfolojisi ve Antibiyotik Duyarlılık Ölçme <ol><li> Başka yerde 15 açıklandığı gibi PDMS katmanlı yumuşak litografi yoluyla mikroakışkan cihazların imalatı gerçekleştirin. <ol><li> Kontrol ve akış tabakaları için fotorezist kalıp yapmak fotolitografi kullanın. Kontrol katmanı için, bir çıplak silikon bir kalıp üretmek için negatif ışığa (~ 15 mikron yükseklik) ve pozitif ışığa (~ 8 mm yükseklik) kullandığını unutmayın. </li><li> sırasıyla, kontrol tabakası ve akış tabakası, 1: 1 ve 20: 5 çapraz bağlantı oranları PDMS karışımları hazırlayın. kabarcıkları uzaklaştırmak için vakum altında bir desikatör içinde karışımlarını koyun1 saat için. </li><li> (TMSC) buhar trimetilklorosilan silikon gofret kontrol katmanı fotorezist kalıpları Açığa. PDMS karışımı döküm ~ 6 mm kalınlığındaki kontrol katman olun (çapraz bağlama oranı 5: 1) denetim katmanı fotorezist kalıp üzerine silikon gofret. Fırında, 1 saat boyunca 80 ° C&#39;de 40 dakika boyunca kontrol katmanı fırında. </li><li> (: 1, sıkma devir 60 saniye boyunca 3.000 rpm çapraz bağlama oranı 20 ile) bir akış tabakası fotorezist kalıpta bir PDMS karışımı kaplama Spin akış katman olun. Fırında, 1 saat boyunca 80 ° C&#39;de 30 dakika boyunca akış tabakası fırında. </li><li> İstenilen yonga boyutu kontrol tabakası (genellikle 3 cm x 2 cm) kesilir ve elle kontrol tabakası kalkmasına bir jilet kullanın. Akış tabakasının üstüne denetim katmanı yerleştirin ve bir stereomikroskop altında bunları hizalayın. Fırın gece boyunca 80 ° C &#39;de hizalanmış montaj Cure. Daha sonra, bakiye TMCS çözmek için 5 saat için plastik bir kap içinde deiyonize su, 250 ml montaj emmek. </li><li> Daha sonra, 20 G iğne ile giriş delikler ve (PDMS çapraz Oranı 5 bağlama: sıkma devir 2.000 rpm sn 30, 1) boş bir PDMS tabaka ile kaplı bir cam slayt için tüm elastomer bağ 40 sn için hava plazma muamelesi ile 1.2 Torr hava basıncı. </li><li> PDMS gelen sitotoksik etkilerini azaltmak için 80 ° C&#39;de 36 saat boyunca yoğun pişirme yürütmek. Bu pişirme adımı bakteriyel hücrelere toksisite en aza indirmek için kritik olduğunu not edin. </li></ol></li><li> Chip Büyüme Deney üzerinde <ol><li> mikroakışkan cihazın içine yerleştirmeden önce, 1 saat süre ile, 1 saat, M9 ortam için deiyonize su ile yıkayın. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında, her gün, dondurulmuş numune çözülme ve taze M9 ortam ile yeni bir test tüpü inoküle. gece boyunca 37 ° C&#39;de çalkalamalı bir inkübatör içinde örnek yerleştirin. </li><li> M9 orta mikrobiyal örnek 10 kat sulandırmak ve 5 psi mikrobiyal örnek kabı baskı ile mikroakışkan cihazın içine yükleyin. Daha sonra, TMP ilaç yükü5 psi ilaç ortamı kap baskı çip halinde araç. 15 dakika mikroakışkan yonga üzerinde iki oda arasında Mikromekanik valfi harekete geçirerek mikrop ve ilaç arasındaki karıştırma yürütün. </li><li> ters mikroskop üzerine monte mikroskop inkübatör mikroakışkan çip yerleştirin. CCD kamera ile 8 saat boyunca saat ters mikroskop üzerine monte edilmiş bir büyüme odasında hücre görüntü elde. </li><li> Hücre görüntü verileri 18 bir eşik algoritma ile hücre sayıları hesaplamak için özel program komut dosyasını kullanın. hücre sayısı verileri genellikle üzerinde üç mikroakışkan odaları ortalama unutmayın. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Levy, S. B., Marshall, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+worldwide%3A+causes%2C+challenges%2C+and+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance worldwide: causes, challenges, and responses.</a> Nat. Med. 10, s122-s129 (2004).</li>
<li>Wang, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+in+vivo+evolution+of+multidrug+resistance+in+Staphylococus+aureus+by+whole+genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Pro.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Tracking the in vivo evolution of multidrug resistance in Staphylococus aureus by whole genome sequencing.</a> Pro. Natl. Acad. Sci. 104, 9451(2007).</li>
<li>Dragosits, M., Mattanovich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+laboratory+evolution+-+principles+and+applications+for+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factory%22%5BJournal%5D)">Adaptive laboratory evolution - principles and applications for biotechnology.</a> Microbial Cell Factory. 12, 64(2013).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+emergence+of+bacterial+antibiotic+resistance+in+connected+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironment.</a> Science. 333, 1764-1767 (2011).</li>
<li>Toprak, E., Veres, A., Michel, J. B., Chait, R., Hartl, D. L., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+paths+to+antibiotic+resistance+under+dynamically+sustained+drug+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection.</a> Nature Genetics. 44, 101-106 (2012).</li>
<li>Toprak, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+morbidostast%3A+an+automated+continuous+culture+device+for+studying+bacterial+drug+resistance+under+dynamically+sustained+drug+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Building a morbidostast: an automated continuous culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition.</a> Nature Protocol. 8, 555-567 (2013).</li>
<li>Rosenthal, A. Z., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Following+evolution+of+bacterial+antibiotic+resistance+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Following evolution of bacterial antibiotic resistance in real time.</a> Nature Genetics. 44, 11-13 (2012).</li>
<li>Young, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+antibacterial+resistance+selection+and+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">In vitro antibacterial resistance selection and quantitation.</a> Curr Protoc Pharmacol. , (2006).</li>
<li>Novick, A., Szilard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experiments+with+the+Chemostat+on+spontaneous+mutations+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 708-719 (1950).</li>
<li>Balagadde, F. K., You, L., Hansen, C. L., Arnold, F. H., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+monitoring+of+bacteria+undergoing+programmed+population+control+in+a+microchemostat%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat.</a> Science. 309, 137-140 (2005).</li>
<li>Groisman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+chemostat+for+experiments+with+bacterial+and+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells.</a> Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).</li>
<li>Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Use+of+Multiplexed+Chemostat+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays.</a> J. Vis. Exp. (72), e50262(2013).</li>
<li>Takahashi, C. N., Miller, A. W., Ekness, F., Dunham, M. J., Klavins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low+cost%2C+customizable+turbidostat+for+use+in+synthetic+circuit+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">A low cost, customizable turbidostat for use in synthetic circuit characterization.</a> ACS Synthetic Biology. , (2015).</li>
<li>Mohan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplexed+microfluidic+platform+for+rapid+antibiotic+susceptibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectrons%22%5BJournal%5D)">A multiplexed microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing.</a> Biosens Bioelectrons. 49, 118-125 (2013).</li>
<li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288, 113-116 (2000).</li>
<li>Kellogg, R. A., Gomez-Sjoberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKellogg%2C+RA+%22Nat.+Protocols%22">Nat. Protocols</a>. 9, 1713(2014).</li>
<li>Gu, G. Y., Lee, Y. W., Chiang, C. C., Yang, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nanoliter+microfluidic+serial+dilution+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">A nanoliter microfluidic serial dilution bioreactor.</a> Biomicrofluidics. 9, 044126(2015).</li>
<li>Gonzalez, R. C., Woods, R. E., Eddins, S. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGonzalez%2C+RC+%22Digital+image+using+Matlab+processing%22">Digital image using Matlab processing</a>. , Pearson Prentice Hall. Upper Saddle River, New Jersey. (2004).</li>
<li>Heikkila, E., Sundstrom, L., Huovinen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimethoprim+resistance+in+Escherichia+coli+isolates+from+a+geriatric+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Trimethoprim resistance in Escherichia coli isolates from a geriatric unit.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 34, 2013-2015 (1990).</li>
<li>Flensburg, J., Skold, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+overproduction+of+dihydrofolate+reductase+in+bacteria+as+a+response+to+the+use+of+trimethoprim%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Massive overproduction of dihydrofolate reductase in bacteria as a response to the use of trimethoprim.</a> Eur. J. Biochem. 162, 473-476 (1987).</li>
<li>Ohmae, E., Sasaki, Y., Gekko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+five-tryptophan+mutations+on+structure%2C+stability+and+function+of+Escherichia+coli+dihydrofolate+reductase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Effects of five-tryptophan mutations on structure, stability and function of Escherichia coli dihydrofolate reductase.</a> J. Biochem. 130, 439-447 (2001).</li>
<li>Smith, D. R., Calvo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+of+dihydrofolate+reductase+genes+from+trimethoprim-resistant+mutants+of+Escherichia+coli.+Evidence+that+dihydrofolate+reductase+interacts+with+another+essential+gene+product%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence of dihydrofolate reductase genes from trimethoprim-resistant mutants of Escherichia coli. Evidence that dihydrofolate reductase interacts with another essential gene product.</a> Mol. Gen. Genet. 187, 72-78 (1982).</li>
<li>Okumus, B., Yildiz, S., Toprak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluidic+and+microfluidic+tools+for+quantitative+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotech%22%5BJournal%5D)">Fluidic and microfluidic tools for quantitative systems biology.</a> Curr Opin Biotech. 25, 30-38 (2014).</li>
<li>Cho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+antimicrobial+susceptibility+test+based+on+single-cell+morphological+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis.</a> Sci. Transl. Med. 17, 267(2014).</li>
<li>Hsu, S. B., Waltman, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+a+model+of+two+competitors+in+a+chemostat+with+an+external+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22SIAM+J.+Applied+Math%22%5BJournal%5D)">Analysis of a model of two competitors in a chemostat with an external inhibitor.</a> SIAM J. Applied Math. , 528-540 (1992).</li>
<li>Fu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+biomass+productivity+and+cell+density+of+Chlorella+vulgaris+by+using+light-emitting+diode-based+photobioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Maximizing biomass productivity and cell density of Chlorella vulgaris by using light-emitting diode-based photobioreactor.</a> J. Biotech. 161, 242-249 (2012).</li>
<li>Peabody, V. G. L., Winkler, J., Kao, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+developing+tolerance+to+toxic+chemicals+in+microbial+systems+and+perspectives+on+moving+the+field+forward+and+into+the+industrial+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+in+Chem+Eng%22%5BJournal%5D)">Tools for developing tolerance to toxic chemicals in microbial systems and perspectives on moving the field forward and into the industrial setting.</a> Curr Opin in Chem Eng. 6, 9-17 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

düşük maliyetli bileşenleri Düşük ayak izi morbidostat cihaz gösterilmiştir. Cihaz tarafından kayıtlı ilaç direnç seviyesi artar önceki raporlarda 5 ile tutarlıdır. ilaç direnci evrimsel çalışmalar için tasarlanan cihaz, diğer birçok deneylere potansiyel uygulanabilir. İlk olarak, ilaç kaynaklı mutasyon Ayrıntılı bir klinik açıdan önemli antibiyotik büyük bir set için kurulabilir. Örneğin, çoklu ilaç direncinin evrimsel yolun sadece deneyde kullanılan ilaç sayısını artırarak ele alınabilir. Burada bildirilen ...

İlk antibiyotik ilaç penisilin tanıtılmasından bu yana, mikrobiyal antibiyotik direnci küresel bir sağlık sorunu 1 dönüşmüştür. Antibiyotik direnci elde edilmesi geriye in vivo olarak incelenebilir karşın, bu deneylerin koşulları genellikle bütün evrim 2 boyunca kontrol edilmez. Alternatif olarak, adaptif laboratuvar evrim bir antibiyotik ilaç 3&#39;ten çevresel streslere veya seçim baskısı altında bir mikrobiyal türlerin moleküler evrim ortaya çıkarabilir. Son zamanlarda, antibiyotik ilaç direncinin çok iyi kontrol evrimsel deneyler antibiyotik ilaç direnci ortaya çıkmasını aydınlatmıştır. Örneğin, Austin&#39;in grup düzgün tasarlanmış mikroakışkan bölmeli bir ortamda 4 hızlı çıkmasını gösterdi. Son zamanlarda geliştirilen morbidostat ilaç seçim baskısı 5,6 altında sistematik mutasyonlar neden olur. morbidostat, mikrobiyal SendaiSürekli neredeyse sabit nüfusu korumak için antibiyotik konsantrasyonunu ayarlar yon cihazı, mikrobiyoloji 7,8 kullanılan dalgalanma testi önemli bir ilerlemedir. dalgalanma testinde, bir antibiyotik ilaç yüksek bir konsantrasyonda enjekte edilir ve kalan mutantlar elenir ve sayılır. Bunun yerine, bir morbidostat içinde mikropların sürekli meydan ve çoklu mutasyonları elde edilir. Morbidostat kemostat, mikrobiyal nüfusu 9 sulandırarak sırasında sürekli olarak besinleri sağlayarak sabit bir nüfus tutar 1950 yılında Novick&#39;le ve Szliard tarafından icat bir kültür cihazına benzer çalışır. piyasaya sunulmasından bu yana, kemostat gelişmiş ve geliştirilmiştir. Güncel mikroakışkan chemostats nanoliter ve tek hücreli kapasiteleri ulaşmıştır. Bununla birlikte, bu cihazlar, bir çok mutasyon olayları 10,11 ile büyük hücre popülasyonunu gerektiren adaptif evrimi deneyler için uygun değildir. Son zamanlarda, mini~ 10 ml çalışma hacmine sahip chemostats da litre ölçek Biyoreaktörlerde ve mikroakışkan kemostat 12,13 arasındaki boşluğu doldurmak için geliştirilmiştir. Burada bir antibiyotik ilaç direnci çalışma için tasarım ve düşük maliyet, otomatikleştirilmiş morbidostat sunuyoruz. Önerilen modül minimum donanım gereksinimi ile bir mikrobiyoloji laboratuvarında bir çalkalama inkübatör kullanılabilir. Açık kaynak yazılım aynı zamanda kolayca metabolik mühendislik 3 olarak adaptif evrim özel uygulamalar, için özel olarak tasarlanmıştır. Son olarak, morbidostat antibiyotik duyarlılık testi 14 için multiplekslenmiş mikroakışkan platforma entegre edilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Çevresel Çalkalayıcı İnkübatör</td><td>BioSan</td><td>ES-20</td><td></td></tr><tr><td>Arduino Leonardo kartı</td><td>Arduino</td><td>Leonardo</td><td></td></tr><tr><td>680 Ohm Karbon Direnç</td><td>Digikey</td><td></td><td>Önyargı direnci LED</td></tr><tr><td>100k Ohm için Karbon direnç</td><td>Fototransistör için</td><td>Digikey</td><td></td> Bias direnci</tr><tr><td>940 nm ışık yayan diyot</td><td>Parlak LED Elektronik</td><td>BIR-BM13E4G-2</td><td>Optik yoğunluk ölçümü</td></tr><tr><td>940 nm fototransistör</td><td>Kodenshi&nbsp;</td><td>ST-2L2B</td><td>Optik yoğunluk ölçümü</td></tr><tr><td>Darlington çift IC Toshiba</td><td>Mouser</td><td>ULN2803APG</td><td>bu IC sürücüler mikro pompalar ve manyetik karıştırma ünitesi</td></tr><tr><td>5 V DC fırçasız fan</td><td>ADDA</td><td>AD0405LX-G70</td><td>özellikleri: 5 V besleme gerilimi ve 80&nbsp; yüksek lisans; </td></tr><tr><td>Piezoelektrik mikro pompa</td> www.jameco.com mevcut <td>CurieJet</td><td>PS15I-FT-5L</td><td>Basınç > 3&nbsp; kPa; Akış hızı >5 ml / dak</td></tr><tr><td>Tygon 3350 Saint</td><td>Gobain</td><td>ABW00001</td> Ayarlama <td>ID: 1/32 "OD: 3/32" L: 50'&nbsp;</td></tr><tr><td>Manyetik Karıştırma çubuğu</td><td>COWIE</td><td></td><td>konik şekil karartma: 10 &nbsp; mm x 4 mm</td></tr><tr><td>Cam sintilasyon 20 ml flakon</td><td>DGS</td><td></td><td>Pyrex cam 28 mm (çap) x 61 mm (yükseklik)</td></tr><tr><td>Kültür flakon tutucu</td><td></td><td></td><td>Özel olarak Poliformaldehitten yapılmıştır ve nbsp;</td></tr><tr><td>Cam şişeyi kapatmak için kullanılan</td> <td>Silikon</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgald 184</td></tr><tr><td>Orta şişe</td><td>VWR</td><td>66022-065</td><td></td></tr><tr><td>Difco M9 minimum tuz 5x</td><td>BD</td><td></td><td>Orta</td></tr><tr><td>Cadamino Asit</td><td>BD</td><td></td><td>Orta</td></tr><tr><td>glikoz</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar Bateriolojik</td><td>Oxoid</td><td></td><td>agar plakası için</td></tr><tr><td>Luria Bertani ortamı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ters mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td> Mikroakışkan ölçüm için kullanılan <td>Leica DMI-LED</td><td>40X objektif kullanın NA = 0.55</td></tr><tr><td>Mikroskop İnkübatörü</td><td>Canlı Hücre Aleti</td><td>Mikroakışkan ölçümü için kullanılan</td><td>CU-109</td></tr><tr><td>Solenoidal valfler</td><td>Pnömadin:</td><td>S10MM-31-12-3</td><td>Normalde açık 1.3 Watt 12 Vdc</td></tr><tr><td>USB arabirim kartı</td><td>Hobby Mühendislik</td><td>USBIO24-R Dijital I/O Modülü&nbsp;</td><td>mikroakışkan ölçümü için</td></tr><tr><td>Hava kompresörü</td><td>Rocker Scientific</td><td>ROCKER 440</td><td>Mikroakışkanlar için basınç kaynağı; Basınç 80 psi</td></tr><tr><td>Mikroakışkan kontrol için kullanılan</td><td>1/8" diken ValuePlastics.com MTLL230-1'e kadar erkek luer kilit bağlantı parçaları</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroakışkan kontrol için kullanılan</td><td>B-1</td><td>ValuePlastics.com</td> 1<td>/8" diken - 10-32 dişli bağlantı noktası</td></tr><tr><td>10-32 dişli bağlantı noktasına kadar dişi luer kilit bağlantı parçaları</td><td>ValuePlastics.com</td><td>Mikroakışkan kontrol için kullanılan</td><td>KFTL-1</td></tr><tr><td>NPN darlington transistör 500 mA, 40&nbsp; V (2N6427)</td><td>DigiKey.com</td><td>Mikroakışkan kontrol için kullanılan</td><td>2N6427GOS-ND</td></tr><tr><td>10 kOhm, karbon film direnci, mikroakışkan kontrol için kullanılan 0,25 W</td><td>DigiKey.com</td><td>P10KBACT-ND</td><td></td></tr><tr><td>Tantal kondansatör, 10&nbsp; &mu; F, 25 V, %10</td> <td>DigiKey.com</td><td>Mikroakışkan kontrol için kullanılan</td><td>478-1841-ND</td></tr><tr><td>Andor CCD kamera</td><td>Andor</td><td>Zyla 4.2 Plus SCMOS</td>, <td>çip üzerinde mikroakışkan görüntüleme için kullanılır</td></tr><tr><td>ELISA plaka okuyucu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>iki bileşenli Silikon&nbsp;</td><td>Mikroakışkan çip üretimi için kullanılan</td> <td>Momentive</td><td>RTV 615</td></tr><tr><td>SU-8 fotorezist</td><td>Mikroakışkan çip üretimi için kullanılan</td><td>Micrchem</td><td>SU8 2015</td></tr><tr><td>AZ4620 fotorezist</td><td>Clariant</td><td>AZ 4620</td><td>mikroakışkan çip üretimi için</td></tr><tr><td>kullanılır Mikroakışkan çip üretimi için kullanılan</td><td>plazma temizleyici</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC 32G</td></tr><tr><td>20 Gauge Şırınga İğnesi</td><td>BD</td><td></td><td>mikroakışkan çip üretimi için kullanılır</td></tr><tr><td>Labcycler</td><td>Sensoquest</td><td>Labcycler</td><td>PCR</td></tr><tr><td>DNA polimeraz</td><td>Toyobo</td><td>KDO Plus</td><td>PCR amplifikasyonu</td></tr><tr><td>Trimetoprim</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaka okuyucu</td><td>Biotek</td><td>Synergy H1 hibrit&nbsp;</td><td>Antibiyotik Direnç Ölçümü</td></tr></tbody></table>

tasarım ve düşük maliyetli kullanımı, otomatik morbidostat bakterilerin adaptif evolution için antibiyotik ilaç seçimi altında

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Biz antibiyotik direnci evrimsel yolu tanımlamak için düşük maliyetli, yapılandırılabilir morbidostat açıklar. morbidostat sürekli bakteri gelişimini izler ve dinamik onlar ilaç direnci elde etmek için geliştikçe sürekli bakteri meydan okumak için ilaç konsantrasyonunu ayarlayan bakteriyel kültür cihazdır. Cihaz ~ 10 ml çalışma hacmi bulunmaktadır ve tam otomatik ve optik yoğunluk ölçümü ve orta ve ilaç dağıtımı için mikro pompalar ile donatılmıştır. Platformu doğrulamak için, biz 1655 Escherichia coli MG trimetoprim direncinin aşamalı satın ölçüldü ve hücre morfolojisi ve antibiyotik duyarlılıklarının araştırmak için multiplekslenmiş mikroakışkan platformu cihazı entegre edilmiştir. yaklaşım antibiyotik ilaç direncinin laboratuvar çalışmalarına ölçekli yukarı ve metabolik mühendislik ve diğer bakteri kültürü deneylerinde gerilme geliştirmeleri için evrimi adaptif uzatılabilir olabilir.

Yukarıda açıklanan morbidostat Şekil 1&#39;de şematize edilmiştir. Deneysel evrim, antibiyotik duyarlılık testi ve hücre morfolojisi kontrolü dahil olmak üzere ortak morbidostat işlemleri, bir E. valide edildi (TMP) trimetoprimin maruz coli MG1655 kültürü, yaygın olarak kullanılan bir antibiyotik ilaç 5,6. TMP ilaç direnci çok belirgin adım adım artar uyarır ve mutasyonlar dihidrofolat redüktaz (DHFR) geni etrafında kümelenir. Bu nedenle, TMP...

İlaç konsantrasyonunu dinamik olarak ayarlayarak antibiyotik ilaç direncinin karakterizasyonunu sağlayan düşük maliyetli, yapılandırılabilir bir morbidostat tarif ediyoruz. Cihaz, çoğullanmış bir mikroakışkan platform ile entegre edilebilir. Yaklaşım, laboratuvar antibiyotik ilaç direnci çalışmaları için ölçeklendirilebilir.

Tasarım ve Düşük Maliyetli kullanımı, Otomatik Morbidostat Bakterilerin Adaptif Evolution için antibiyotik ilaç Seçimi Altında

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

Bu deneyin genel amacı, bakteriyel büyümeyi sürekli izleyen ve bakteriler ilaç direnci kazandıkça antibiyotik konsantrasyonunu dinamik olarak ayarlayan bir Morbidostat kullanarak antibiyotik direncinin evrimsel yolunu karakterize etmektir. Bu tekniğin temel avantajı, düzeneğin düşük maliyetli, kolayca erişilebilir elektronik bileşenlerden oluşması ve belirli amaçlar için kolayca yeniden yapılandırılabilmesidir. Prosedürleri, laboratuvarımın lisansüstü öğrencileri olan Po Cheng Liu ve Yi Tai Lee gösterecektir.Morbidostat'ı monte etmek için, öncelikle kültür şişesinin kapağına 18 gauge'lik bir iğne ile üç delik açarak başlayın. Yaklaşık yedi santimetre uzunluğunda üç adet polietilen tüp kesin ve bunları kapaktaki deliklere yerleştirin. Polidimetilsiloksan veya PDMS karışımı için kalıp görevi görmesi amacıyla kapağın kenarını bantla sarın.Ardından, 150 mililitrelik plastik bir kaba beş gram PDMS bileşen A ve 0,5 gram bileşen B ekleyin ve bir kürdan yardımıyla manuel olarak karıştırın. Karışımı 10 mililitrelik bir şırıngaya doldurun. Daha sonra, şırınga ile PDMS karışımını kapağın üzerine enjekte edin.PDMS'i kürlemek için tüm kapağı 70 °C'de sekiz saat boyunca fırınlayın. Ardından, bir

design-use-low-cost-automated-morbidostat-for-adaptive-evolution

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Burada, belirli bir hedef dizisi için, rastgele bir mutant kütüphane oluşturmak için basit bir protokol göstermektedir. Escherichia coli, in vivo olarak yapılan bu yöntem, yeni enzimatik faaliyetleri gelişmeye fonksiyonel seçimleri ile birleştiğinde nasıl kullanılabileceğini göstermek.

Proteinlerin Yönetmen Evolution Mutagenez ve Fonksiyonel Seçim Protokolleri E. coli</em

Kaynak: Liu, P.C., ve diğerleri. Antibiyotik ilaç seçimi altında bakterilerin adaptif evrimi için düşük maliyetli, otomatik bir morbidostat tasarımı ve kullanımı. J. Vis. Uzm. (2016)Bu video, trimetoprim antibiyotik stresi altında vahşi tip ve trimetoprim dirençli E. coli suşlarının büyümesini ve morfolojisini görselleştirmek ve karşılaştırmak için mikroakışkan bir çipin kullanımını göstermektedir.

Antibiyotik İlaç Direncini İncelemek için Mikroakışkan Çip Üzerinde Bakteri Üremesi

Kaynak: Jian, X., ve diğerleri, Mikrobiyal Mikrodamlacık Kültür Sistemi (MMC) Kullanılarak Otomatik Mikrobiyal Yetiştirme ve Uyarlanabilir Evrim. J. Vis. Uzm. (2022).Bu video, bakterilerin metanol toleransına doğru adaptif evrimini yönlendirmek için mikrobiyal bir mikro damlacık kültür sisteminin kullanımını göstermektedir. Sistem, tasarlanmış bakteri kültürlerini yüksek metanol stres ortamıyla karıştırarak ve bunları mikro damlacıklara bölerek, metanol stresi altında gelişmiş büyüme sergileyen...

Mikrobiyal Mikrodamlacık Kültür Sistemi Kullanılarak Bakterilerin Adaptif Evrimi

Hücre büyüme oranı düzenlenmiş bir süreç ve hücre fizyolojisi temel belirleyicisidir. Chemostats kullanılarak sürekli kültürü, hücre büyümesini ve ne kadar bu ağlar hücre büyümesini optimize etmek için moleküler evrim kontrol ağların çalışma kolaylaştırmak besin kısıtlaması hücre büyüme hızının dışsal kontrol edilmesini sağlar.

Mikrobiyal Systems Biyoloji Chemostats Kullanımı

Biz geliştirdi ve düşük maliyet için hazır parçalardan inşa minyatür chemostats küçük bir yer kaplayan dizi doğrulanmış. Fizyolojik ve deneysel evrim sonuçları büyük hacimli chemostats benzerdi. Ministat dizi geleneksel kemostat deneyler, fonksiyonel genomik ve kimyasal tarama uygulamaları için, kompakt, ucuz ve erişilebilir bir platform sağlar.

Multiplexed kemostat Diziler Tasarımı ve Kullanımı

Bakteriler yaşamları boyunca zararlı veya faydalı mutasyonlar biriktirebilir. Bir hücre popülasyonunda, yararlı mutasyonlar biriktirmiş bireyler, arkadaşlarını hızla geride kalabilir. Burada, floresan etiketli bireyleri kullanarak zaman içinde bakteri hücresi popülasyonunda tür içi rekabeti görselleştirmek için basit bir prosedür sunuyoruz.

Floresan Etiketli Suşların Cocultivation'ı ile Bakteri Hücre Popülasyonunda İntraspecies Rekabetini İzleme

Burada, biz kemostat kültür kullanarak koşullar altında mikroorganizmaların adaptif laboratuvar evrimini elde etmek için bir protokol mevcut. Ayrıca, gelişmiş soyunun genomik analiz tartışılmıştır.

Bir Kemostat kullanarak Mikroorganizmaların Adaptif Laboratuvarı Evolution Prosedürü

Burada multicopy plazmid rolü antibiyotik direncinin evrime sınamak için deneysel bir yöntem mevcut.

Multicopy plazmid rolü antibiyotik direnci gelişimi test

EVOLVER çerçevesi yüksek çözünürlüklü ve deneysel parametreler üzerinde dinamik kontrol ile yüksek verimlilik sürekli mikrobiyal kültür sağlar. Bu protokol, kullanıcıların birçok bireysel kültürde otomatik kontrolü programlama, ölçme, toplama ve deneysel verilerle gerçek zamanlı etkileşime girme konusunda rehberlik ederek karmaşık bir fitness deneyi yapmak için sistemin nasıl uygulanacağını gösterir.

EVOLVER kullanarak otomatik, yüksek verimlilik, sürekli hücre büyüme denemeleri tasarlama

Hücre içi M. tuberculosis büyümesinin hızlı ve etkili bir şekilde ölçülmesi, tüberküloza (TB) karşı gelişmiş tedavilerin sürdürülmesi için çok önemlidir. Bu protokol, aday konakçı tarafından yönlendirilen tedavilerle tedavi edilen makrofajlarda Mtb büyümesini ölçmek için otomatik bir sıvı kültür sistemi kullanan et suyu bazlı bir kolorimetrik tespit testini tanımlar.

Tüberküloz için Ev Sahibi Tarafından Yönlendirilen Tedavilerin Preklinik Testlerinde Kullanılmak Üzere Otomatik Bir Kültür Sistemi

Bu protokol, otomasyon destekli genetik kütüphane oluşturma ve değerlendirme yoluyla genetik olarak kodlanmış biyosensörlerin sistematik küresel optimizasyonu için bir yöntem sağlar. Bu, deneyleri kolaylaştırmak ve biyosensörleri belirli tasarım sonuçlarına göre ayarlamak için genetik bileşenlerin seçimini sağlamak için deney tasarımı metodolojileriyle birleştirilir.

Genetik Olarak Kodlanmış Biyosensör Tasarım Alanının Verimli Örneklenmesi, Deney Tasarımı ve Otomasyon İş Akışı ile Etkinleştirildi

Öğrenin, düşük maliyetli morbidostat kullanarak antibiyotik direncinin evrimsel yolunu karakterize etme yöntemini. Bakteri büyümesini sürekli izleyerek ilaç konsantrasyonunu dinamik olarak ayarlayın.

Tasarım ve Düşük Maliyetli kullanımı, Otomatik Morbidostat Bakterilerin Adaptif Evolution için antibiyotik ilaç Seçimi Altında

Daha fazla video keşfet