Dokunmatik uyarılmış Yanıt ve Hareket Deneyleri kullanarak Zebra balığı kas Performans ve fonksiyonunu değerlendirmek için

Bu prosedürün genel amacı, dokunma ile uyarılmış tepki ve yüzme tahlilleri kullanarak zebra balıklarında kas performansını ve işlevini değerlendirmektir. Bu yöntem, zebra balığı hastalıklı modellerde bozulmuş kas performansının veya nörodejeneratif kusurların belirlenmesi gibi nöro-müsküler araştırma alanındaki soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, zebra balığı hastalıklı modellerde kas performansını değerlendirmek için otomatik bir yüksek verimli yöntem sağlamasıdır.

Testi gerçekleştirmek için, yaklaşık 25 mililitre embriyo ortamı ile doldurulmuş bir petri kabını, yaklaşık 28 santigrat dereceye ayarlanmış aydınlatılmış, sıcaklık kontrollü bir aşamaya yerleştirin. Yüksek hızlı kamerayı çanağın üzerine monte edin. Video kayıt yazılımını başlatın ve yüksek yüzme hızlarının yakalanabilmesini sağlamak için yakalama hızını saniyede 1.000 kare olarak ayarlayın.

Embriyoyu petri kabının ortasına, görüş alanında açıkça görülebilecek şekilde yerleştirin. Kaydet'e basın ve ardından embriyoya başın üstünde künt bir iğne ile hafifçe dokunarak mekanosensoriyel bir uyaran verin. Embriyo görüş alanından yüzerek çıktığında veya dinlenmeye geri döndüğünde kaydı durdurun.

Aynı larvaların testini esas olarak alışkanlık için tekrarlayın veya bazı hastalıklı modellerde kas zayıflığını teşvik edin, bu da dokunsal uyarana yanıtın azalmasına neden olur, bu nedenle her embriyo yalnızca bir kez test edilmelidir. Yüzme davranışını ölçmek için yazılımı başlatın ve AVI video dosyasını açmak için Arka Plan Çıkarma Modülümüzle tek larva hareketini seçin. Menü çubuğundan serbest el veya çokgen aracını seçin ve mekanosensoriyel uyaranı iletmek için kullanılan sondayı hariç tutarken, filmin hem balığın orijinal konumunu hem de yüzdüğü alanı kapsayan bölgesini seçin.

Menü çubuğunda Deney'e tıklayın ve Yürüt'ü seçin. İstendiğinde, ham veri analizi dosyasını PHR formatında istenen konuma kaydedin. Ardından, analize başlamak için Başlat'a tıklayın.

Balık görüş alanından yüzerek çıktıktan veya video klip sona erdikten sonra, Deney Menüsü altındaki Durdur'a tıklayarak analizi sonlandırın ve sonuçları gösteren bir pencere görünecektir. Maksimum hızlanma değerini elde etmek için pencerenin sağına kaydırın. Sonuçlar açılır menüsünün altındaki Anlık Sonuçları Dışa Aktar düğmesine tıklayarak verileri dışa aktarın.

Uygun Ham Veri Analizi dosyasını seçin ve açmak için tıklayın. Bu, bir elektronik tablo programında açılabilen hedef klasöre bir metin dosyası kaydeder. Test larvalarını, her kuyucuk için bir tane olmak üzere 48 oyuklu bir plakaya yerleştirin.

Ardından, kabarcık olmadığından emin olmak için kuyuları kuyunun üst kısmının hemen altına kadar suyla doldurun. Plakaları bir saat boyunca 28 santigrat derecede saklayın. Plakayı, karanlıkta larvaları algılayabilen bir kızılötesi dijital kamera ile donatılmış bir kayıt odasına yerleştirin.

Sirkadiyen ritimler ve dış çevresel uyaranlar zebra balığı yüzme davranışını önemli ölçüde etkileyebilir. Günün saati ve aydınlatma koşullarının standartlaştırılması ve su sıcaklığının sıkı bir şekilde düzenlenmesi gerekir. Yazılımı başlatın ve İzleme Modülünü seçin.

Dosya altında, Yeni Protokol Oluştur'a tıklayın ve bu örnekte 48 olan deney için kullanılan kuyu sayısını düzenleyin. Ardından, Parametreler'e tıklayın ve Protokol Parametreleri'ni ve ardından Zaman'ı seçerek deney süresini ve entegrasyon süresini 10 dakikaya ayarlayın. Ayrıca Protokol Parametreleri'nde, Seçenekler'i tıklatın ve numeroskop onay kutusunun seçili olduğundan emin olun.

Kayıt alanlarını ayarlamak için, tüm ızgarayı vurgulayın ve kuyucuklardan birine çift tıklayın. Alanları Çiz düğmesine tıklayın ve sol üst, sağ üst ve sol alt kuyucukların etrafını çizin ve Oluştur'a tıklayın. Yazılım daha sonra her bir kuyunun konumunu belirleyecektir.

Bu noktada, ölçek çubuğunu da çizin ve Gruba Uygula'ya tıklayın. Tamamlandığında, Alanları Çiz düğmesine tıklayın. Ardından, bu durumda siyah olan balığın rengini seçin ve Algılama Eşiği çubuğunu, arka plan olmadan yalnızca balık hareketlerinin vurgulandığı bir düzeye kaydırın.

Hareketsizliği ve küçük, büyütülmüş hareketleri algılamak için Hareket Eşiklerini girin. Bu örnekte, saniyede altı milimetrelik bir hareketsizlik eşiği ve saniyede 30 milimetrelik bir aktivite patlaması eşiği kullanılmıştır. Parametreler Menüsüne ve ardından Hafif Sürüş ayarlarına tıklayın ve odanın ışık yoğunluğunu %0 olarak ayarlayınKayıt odası kapısını kapatın ve video kaydına başlayın.

Deney, ekrandaki zamanlayıcı ile belirtildiği gibi 10 dakika içinde tamamlanacaktır. Tamamlandığında, Deneme açılır menüsünü tıklayın ve Durdur'u seçin. Sonuçları içeren bir iletişim kutusu görüntülenecektir.

Sonuçları Excel kullanarak incelemek için, İçeren klasörü aç'a tıklayın ve ortaya çıkan klasörde görünen dosyayı açın. Son olarak, kaydedilen hareket değerlerinin balığın yüzme hareketlerini doğru bir şekilde gösterip göstermediğini incelemek için video tekrar oynatılabilir. Bu, video dosyasında gözlemlenen hareketin yazılım tarafından oluşturulan hareket profili ile karşılaştırılmasıyla elde edilebilir.

Dokunma ile uyarılmış bir test sırasında alınan bir zebra balığı embriyosunun anlık görüntüleri, uyaranın uygulanmasından sonraki ilk 0.2 saniye boyunca bir bireyin tipik hareketini gösterir. Burada, şekil, miyopatik bireylere karşı vahşi tipte patlama yüzme kaçış tepkisinin ilk 0.2 saniyesi için bir hızlanma profilini göstermektedir. Bu zaman penceresinde ivmenin her iki suşta da zirve yaptığı görüldü ve en yüksek maksimum ivme, iskelet kasının kuvvet üretme kapasitesi ile orantılıdır.

Yabani tip ve miyopatik suşlar için maksimum ivme değerlerinin ortalaması alındı. Miyopatik balık, kas fonksiyonunun azaldığını gösteren maksimum hızlanmada önemli bir azalma gösterdi. Embriyoların 10 dakikalık hareket testleri, hem vahşi tip hem de miyopatik embriyoların hareket modellerini ve tiplerini kaydetti ve yüzme hareketlerinin diyagramatik temsillerini oluşturdu.

Yeşil çizgilerle temsil edilen yavaş hareket ve kırmızı çizgilerle temsil edilen hızlı hareket dönemlerinin yanı sıra siyah çizgilerle temsil edilen hareketsizlik dönemleri de haritalandı. Yabani tip bireyler, test süresi boyunca daha az aktif olan miyopatik bireylerin aksine, nispeten aktif olmayan dönemler ile yüksek aktivite seviyeleri gösterdi. Bu, yabani türün miyopatik balıklara karşı ortalama hareket sayısı ve kat ettiği mesafedeki önemli farklılıklara yansımıştır.

Bir kez ustalaştıktan sonra, dokunma ile uyarılmış tepki testi 15 balık için 15 dakika içinde gerçekleştirilebilir ve hareket testleri 48 balığa kadar yaklaşık 10 dakika içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, aktivitelerini etkileyebileceğinden embriyoları dikkatli bir şekilde ele almak önemlidir. Bu prosedürü takiben, kas patolojisi ile ilgili ek soruları yanıtlamak için immünoetiketleme veya elektron mikroskobu gibi diğer teknikler uygulanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, erken zebra balığı gelişiminde kas performansını nasıl ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.