İdrar yolu enfeksiyonu küçük bir hayvan modeli: erkek ve dişi farelerin transüretral Kateterizasyon

Bu deneysel yaklaşımın genel amacı, idrar yolu enfeksiyonuna karşı bağışıklık tepkisini araştırmak ve erkek ve dişi hayvanlar arasında doğrudan karşılaştırmayı önlemektir. Bu yöntem, erkeklerin ve kadınların idrar yolu enfeksiyonuna nasıl tepki verdiği ile ilgili mukozal immünolojinin temel sorularını yanıtlamaya yardımcı olabilir. En büyük avantajı, enfeksiyonun doğal kök yoluyla kurulmasıdır.

Bu yöntem için ilk olarak, erkek farelerin mesanesinin yerleştirilmesinin imkansız olduğunun ne sıklıkla belirtildiğini not ettikten sonra aklımıza geldi. Bu yöntem idrar yolu enfeksiyonu hakkında fikir verecek olsa da, mesane kanseri gibi diğer hastalık çalışmalarına da uygulanabilir. Başlamak için, enfekte olacak her fare grubu için bir pediatrik intravenöz erişim kanülü hazırlayın.

Dahili yay mekanizmasını kullanarak, iğnesinin her bir kanülünü üreticinin talimatına göre ayırın. Sadece plastik intravenöz kanülü koruyarak iğneleri atın. Kateterleri yaklaşık 25 ila 30 dakikalık bir UV döngüsü için laminer akış başlığında sterilize edin.

Metin protokolüne göre gece boyunca üropatojenik e coli veya UPEC kültürüne girdikten sonra, bakteri süspansiyonunu bir dakika boyunca 17.000 kez g'de bir masa üstü mikrosantrifüjde döndürün ve elde edilen bakteri peletini iki kez 10 ila sekizinci CFU'da yeniden süspanse edin PBS'de mililitrede. Her enfeksiyon için tam inokulumu belirlemek için bir süspansiyon alikotunu seri olarak seyreltin ve uygunsa LB agar üzerine antibiyotiklerle plaka ekleyin. Bakteri aşısını bir mililitrelik bir şırıngaya çekin ve kateteri şırınganın ucuna takın.

Havayı çıkarmak için şırıngaya dokunun ve damlatmaya başlamadan önce kateterdeki ölü hava boşluğunu doldurmak için pistona basın. Dişi bir fareyi onaylanmış bir protokole göre uyuşturduktan sonra, hayvanı sırtüstü yatırın ve idrar kesesini boşaltmak için alt karın bölgesine orta basınç uygulayın. Tam mesaneler, cildin altında, iliak tepeler arasında bir bezelye gibi hissedilir.

Mesane boşaldığında, baskın olmayan elinizi kullanarak, başparmağınızı kuyruğuna ve aynı elin parmağını farenin karnına yerleştirin ve fareyi sıkıca yerinde tutmak için zıt yönlere hafif bir baskı uygulayın. Daha sonra, kateterin ucunu üretral deliğe fareye dik olarak yerleştirin, daha sonra, hafif bir basınçla, göbek üretral delikle buluşana kadar kateteri üretraya kaydırın ve aynı anda şırıngayı çalışma yüzeyine paralel olacak şekilde indirin. Kateter yerleştirildikten sonra, karın derisini farenin kafasına doğru çok nazikçe çekmek için farenin karnında duran baskın olmayan elin parmağını kullanın.

Üretral deliğin hareket etmeyeceğini unutmayın. Bununla birlikte, kateterler vajina içindeyse, doku kateterden yukarı ve uzağa hareket edecektir. Kateterin göbeği üretral deliğe dayalıyken, 15 mikrolitre bakteri aşısını yavaşça dağıtın.

Yavaş bir kurulum hızı, böbreğe vezikoüreteral reflüyü en aza indirir. Sızıntıyı önlemek için kateteri yavaşça çıkarın. Daha sonra hayvanı sırtüstü pozisyonda kafesine yerleştirin.

Erkek fareleri aşılamak için, farenin dış genital organlarına kraniyal ve kaudal olarak iki başparmak forseps yerleştirin. Bezin penisini tamamen ortaya çıkarmak için prepusu geri çekin. Ardından, penis dışarıdan konumlandırıldıktan sonra, başparmak forsepslerini serbest bırakın.

Organı nazikçe ama gergin bir şekilde tutarak hayvana dik olarak çıkıntılı penisi stabilize etmek için forsepsleri yeniden konumlandırın. Daha sonra üretral meatusun ucundaki küçük açıklıktan kateteri dikkatlice yerleştirin ve gerginliği nazikçe korumak için forseps kullanarak nazikçe penise yönlendirin. Kateterlerin göbeği penisin ucuyla buluştuğunda, penisin pozisyonunu korurken 50 mikrolitre aşıyı çok yavaş bir şekilde dağıtın.

Damlatma kalitesini, burada gösterildiği gibi önceden belirlenmiş bir damlatma kalite puanına göre not edin. Aşının sızmasını önlemek için kateteri beş saniye boyunca yavaşça geri çekin. Fareyi sırtüstü pozisyonda kafesine yerleştirin.

Hayvan, anestezik uygulandıktan 30 ila 45 dakika sonra iyileşmeye başlamalıdır. Fareleri onaylanmış bir protokole göre feda ettikten sonra, kürkün neden olduğu kontaminasyonu en aza indirmek için karnı iyice nemlendirmek için %70 Epinal kullanın. Makas kullanarak, farenin karnının alt üçte biri boyunca iki santimetrelik bir kesi yapın ve mesaneyi ve istenen diğer organları aseptik olarak çıkarın.

Organları, bir mililitre steril PBS içeren beş mililitrelik polipropilen geçmeli kapaklı tüplere aktarın ve tüm örnekleri buz üzerinde tutun. Elde tutulan bir homojenizatör ile neredeyse hiç katı doku kalmayana kadar organları homojenize edin. İyi homojenize olmayan parlak, bej-beyaz yağ dokusunu atın.

Ardından, homojenizatörü her deney veya organ grubu arasında yıkamak için Epinal'i ve ardından PBS'yi kullanın. Homojenize organ süspansiyonunun seri dilüsyonlarını hazırladıktan sonra, uygun olduğunda antibiyotiklerle LB agar plakaları üzerinde plaka seyreltmeleri yapın ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Mesane dokusu üzerinde akış sitometrisi yapmak için, bu videoda daha önce gösterildiği gibi mesaneyi izole ettikten sonra, dokuyu iyice kıymak için makas kullanın.

Sindirim tamponu içeren tüp başına bir kıyılmış mesane ekleyin. Daha sonra kıyılmış dokuyu sindirim tamponunda yıkamak için tüpü sallayın ve tüm mesaneler kesilip kıyılana kadar buz üzerinde tutun. Kıyılmış mesaneleri 37 santigrat derecede 60 ila 75 dakika boyunca her 15 dakikada bir beş saniye boyunca elle kuvvetlice çalkalayarak inkübe edin.

Doku, ıslak kağıt mendili andıran camsı şeffaf bir görünüme sahip olduğunda sindirim tamamlanır. İki ila üç mililitre buz gibi soğuk akış sitometri tamponu ekleyerek sindirim enzimlerini etkisiz hale getirin ve yavaşça karıştırın. Ardından tüpleri buzun üzerine yerleştirin.

Tek hücreli bir süspansiyon sağlamak ve herhangi bir bağ dokusunu çıkarmak için, tüpün içeriğini 15 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirilmiş 100 mikrometrelik bir filtreden geçirin. Ardından, bir şırınga pistonunun ucuyla, kalan dokuyu filtreden hafifçe bastırın. Filtreyi ek iki mililitre akış sitometrisi tamponu ile yıkayın ve numuneleri buz üzerinde tutun.

Numuneleri yedi dakika boyunca 200 kez g ve dört santigrat derecede santrifüjleme ile yıkayın. Peletleri, mililitre başına beş mikrograma seyreltilmiş Fc bloğu içeren 100 mikrolitre akış sitometri tamponunda yeniden süspanse edin ve 96 Kuyulu yuvarlak bir alt plakaya aktarın. 10 ila 15 dakika sonra, her numuneye 100 mikrolitre istenen antikor kokteyli ekleyin.

Daha sonra numuneleri ışıktan korunan buz üzerinde 30 ila 45 dakika inkübe edin. Numuneleri yedi dakika boyunca 200 kez g ve dört santigrat derecede santrifüjleme ile yıkayın. Son olarak, hücre peletlerini 200 mikrolitre akış sitometrisi tamponunda yeniden süspanse edin ve numuneleri, bir akış sitometresinde elde edilmeden hemen önce, beş mililitrelik bir polistiren tüp üzerinde 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin.

Bu şekil, 24 saat boyunca enfekte olmuş farelerden elde edilen temsili verileri göstermektedir. Bakteriyel yük, enfeksiyondan 24 saat sonra erkek ve dişi fareler arasında eşdeğerdi. Enfeksiyon anında aşı kaybının enfeksiyonun oluşumunu etkileyip etkilemediğini belirlemek için, her bir damlatma, biri en optimal olmak üzere, bir ila beş arasında bir ölçekte puanlandı.

Bakteriyel kolonizasyon, enfeksiyondan 24 saat sonra belirlendi. Parametrik olmayan bir Kruskal-Wallis testi ile değerlendirilen farklı damlatma puanlarına sahip hayvanlardan elde edilen CFU'lar arasında, her bir sütunun ortalama sıralaması ile karşılaştırılan ve bir Dunn testi kullanılarak çoklu karşılaştırmalar için düzeltme yapılan istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmadı. Enfeksiyon sırasında önemli miktarda bakteri aşısı sızıntısına neden olan suboptimal damlatmaların, 24 saatte bakteri kolonizasyonunu önemli ölçüde etkilemediği sonucuna varılabilir.

Daha da önemlisi, optimal olmayan damlatma sıklığı uygulama ile azalacaktır. Son olarak, saf hayvanlarda bulunan CD45 pozitif bağışıklık hücrelerinin sayısı dişi ve erkek fareler arasında farklı olmasa da, enfekte dişi farelerin mesanelerine infiltrasyonda istatistiksel olarak anlamlı bir artış olmuştur. Kateterizasyon girişiminde bulunurken yavaş ve yumuşak hareketler kullanmak önemlidir.

Gelişmesiyle birlikte, bu teknik, erkek ve dişi hayvanların mesanesindeki bağışıklıkta cinsiyete dayalı farklılıkları keşfetmemize yardımcı oldu.