Name: Ertelenmiş Büyüme İnhibisyon Tahlili Rekabet Bakteri kaynaklı Antimikrobiyal Etkisi belirlememize (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Öğrenin bakteri izolatları arasındaki rekabetçi inhibisyonu ertelenmiş büyüme inhibisyonu testiyle nicel ve nitel olarak değerlendirmeyi. Bu yöntem mikrobiyal topluluk dinamiklerini anlamak için değerli veriler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

JCM Unilever Plc (BB / L023040 / 1) ile BBSRC-IPA ödülü tarafından finanse edilmektedir. YY Yükseköğretim Doktora öğrencilik bir Suudi Arabistan Bakanlığı tarafından finanse edilmektedir.

Aşağıdaki yöntem önleyicisi üreten suşlar ile rakip suşları test etmek için 7,8 uyarlanmıştır. NOT: Bu protokol, bakteri kültürleri ile aerosol nesil içerir. Bu, sadece lokal onaylı güvenlik konuları uygulanması ile kapalı bir alanda gerçekleştirilebilir. Bir seviye 2 güvenlik kabini içinde agar plakaları üzerine kültür Püskürtme agar plakaları kirlenmesini ve çevresini en aza indirecektir. Bu aynı zamanda püskürtülen bakterilerin aerosol inhalasyon gelen araştırmacı koruyacak, bu araştırmacı çevreleme seviyesi 2 organizmaların kullanıldığı takdirde önemli bir husustur. Uygun kişisel koruyucu ekipman giyilmelidir. petri çevresi en atılabilir emici dokusu ile kaplıdır. UV ışığı kullanarak post-sprey dekontaminasyon tavsiye edilir. 1. Agar Plakaları hazırlanması <ol><li> manu uygun olarak beyin kalp infüzyon (BHI) agar hazırlayınfacturer talimatları. </li><li> sterilize etmek için, 121 ° C, otoklav, üreticinin tavsiyelerine uygun olarak 15 ila 20 dakika boyunca psi, ya da BHI agar otoklava. </li><li> Steril petri kutularının içine sterilize BHI agar 15 ml hacimde dökün ve ayarlamanızı sağlar. Not: Deney agar aynı stok kaynaklı olan her agar kullanılmak üzere olun ve her plaktaki agar aynı miktarda olduğu. Bu mevcut besin ve karşılaştırılabilirlik sağlayan plakalar arasındaki inhibitör difüzyon değişkenliği sınırlar. </li></ol> 2. Steril Broth hazırlanması <ol><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak, BHI suyu hazırlayın. </li><li> 28 ml&#39;lik bir cam şişe genel BHI 10 ml alikotları ekleyin. </li><li> sterilize etmek için, 15 psi, 20 dakika, ya da otoklav üreticinin tavsiyelerine göre 121 ° C&#39;de BHI suyu otoklav. NOT: suyu aut aynı partiden kaynaklanan deneyde kullanılan tüm suyu sağlayınsonuçlar varyasyonu neden olabilir besin varyasyonu sınırlamak için, aynı zamanda oclaved. </li></ol> 3. Hazırlanması Steril Vaporizer Şişe (ler) <ol><li> vapourizer şişe sökün. </li><li> Iç yabancı maddelerin temizlenmesi gece boyunca% 5 bir yüzey aktif temizleme ajanı vapourizer şişe kapağı ve vapourizer emmek için vapourizer ile% 5 yüzey aktif temizlik maddesi püskürtün. NOT: Yüzey aktif temizlik maddesi tutarken eldiven ve uygun kişisel koruyucu donanımlar kullanılmalıdır. </li><li> steril hava akış kaputun altında buharlaştırıcı, kapak ve şişe kurutun. </li><li> % 70 etanol ile şişeye doldurun, vapourizer yeniden takın ve vapourizer yoluyla etanol bazı sprey. </li><li> buharlaştırıcı kapağı koymak ve kullanıma kadar iç etanol ile saklayın. </li><li> aseptik olarak Steril BHI et suyu ile durulayın ve şişe vapourizer yoluyla suyu püskürtmek için hemen önce. NOT: Bu etanol aff önlerbölüm 6.3 şişeye ilave inokulum ecting. </li></ol> Bakteriyel Gece Kültür hazırlanması 4. (ler) <ol><li> Şerit yarışmacı ve suşlar önleyicisi steril BHI agar plakası üzerine yerleştirin ve yaklaşık 18 saat (bir gece) aerobik olarak 37 ° C&#39;de inkübe edin. NOT: Bu plaka, 4 ° C&#39;de depolandığında aynı hafta içinde birden çok kopya için kullanılabilen bakteri stok üretir. </li><li> 28 mi, evrensel şişe içinde gerekli rakip bakteri suşunun tek bir koloni ile steril BHI et suyu 10 ml inoküle. </li><li> orbital çalkalayıcı 250 rpm&#39;de çalkalanarak aerobik olarak gece boyunca 37 ° C de genel şişe inkübe edin. </li></ol> Önleyici üreten İzolatı 5. Nokta Kültürü <ol><li> 4. bölümde tarif edildiği gibi, gece boyunca kültürün (ler) hazırlayın. </li><li> Agar plakaları kapağındaki yoğunlaşma olmadan, tamamen kuru olduğundan emin olun, aşılamadan önce (pla kuluçka örneğin37 ° C&#39;de 60 dakika) için TE; Bu aşılama sitesinden plaka üzerinde yayılmasını inokulum engeller. </li><li> Pipet agar plakaları merkezi üzerine gece boyunca bir kültürü 25 ul. tamamen agar boyunca kültür sprey hava kabarcıklarını önlemek için pipet Medyumu kaçının. </li><li> kültür yayılmasını sınırlamak için kültür oda sıcaklığında kurumaya bırakın. aerobik bir gece boyunca 37 ° C &#39;de agar inkübe edin. </li></ol> 6. Hazırlama Testi Rakip Strain Sprey Aşı (lar) <ol><li> Yaklaşık 4 x 10 6 CFU ml -1 vermek üzere BHI suyu bölüm 4. SEYRELTİK gecede kültür 10 kat açıklandığı gibi gecede kültür hazırlayın ve OD 600 0.3 ± 0.05 süspansiyonu. NOT: 10 kat seyreltme, 4 x 10 6 CFU ml -1 tüm bakteri türlerinin vermek 1 x 10 arasında seri dilüsyonları kaplama yayılması gerekli seyreltme faktörünü hesaplamak olmaz <s&gt; -1 -1 x 10 -6 kadar. </li><li> steril plastik parfüm buharlaştırıcı şişeye seyreltilmiş kültür dökün. NOT: toplam hacim agar plakaları sayısı püskürtülen için gerekli olandan daha fazla olmalıdır. Yaklaşık plaka başına 250 ul 9 cm çaplı bir petri çanağı için uygundur. </li></ol> 7. Ertelenmiş büyüme inhibisyonu analizi <ol><li> Kültür önceden agar üzerine püskürtme için püskürtme mekanizması yerleştirildiğinden emin olmak için buharlaştırma şişelerin her birinden kültür püskürtülür. </li><li> agar üzerinde yaklaşık 15 cm&#39;lik bir mesafeden, tüm agar yüzeyi üzerine seyreltilmiş kültür yaklaşık 250 ul (tipik 50 mi buharlaştırıcı 3 spreyler) püskürtülür. aerobik bir gece boyunca 37 ° C &#39;de agar inkübe edin. spreyler aynı sayıda diğer plakaları için tekrarlayın. </li></ol> 8. Ertelenmiş Büyüme İnhibisyon Tahlili Sonuçları Yorumlama <ol><li> püskürtülen alanda ülkemizde büyüme inhibisyon zonu ölçüntor suşu (Şekil 1A - C, &quot;X&quot;, &quot;X&quot; için) (- C, &quot;Y&quot; ile &quot;Y&quot; Şekil 1A) inhibitörü yapımcısı merkez nokta çapı çıkarılarak milimetre. NOT: Şekil 1E bu veriler sunulabilir nasıl gösterir </li><li> inhibisyon bölgeleri için netlik puan kaydedin. Not: Bu görülen inhibisyon derecesi gösterir. Örnekler Şekil 1A gösterilmiştir - D, standardizasyon için kullanılabilir suşları temsilcisi sonuçları bölümünde önerilmektedir. Aşağıdaki ölçek, berraklığı puanlama için kullanılabilir: 0 bir berraklığı mı rakip suşun büyüme önlemesine bir bölge tanımlamak için. 1 puan temizleme bölümü içinde mevcut olan, sadece tek tek koloniler ile büyüme hemen hemen tam inhibisyon bölgesini tanımlamak için. 2 puan azaltılmış bir büyüme görülebilir bölge tanımlamak için, bu bölge içinde büyüme conakıcı veya yapışık yakın ama&gt;% 50 oranında yoğunluk azalır. 3 puan çok az büyüme azaltma açıklamak için, büyüme birleşen ve daha az% 50 oranında azaltılır, bir bölge hala görünür ve ölçülebilir. 4 puan, büyüme görünür bir inhibisyon ortaya koymaktır. 5 puan ise rakip suşunun büyüme testi önleyicisi üreten soyun yakın artış olduğunu ortaya koymaktır. Örnekler için Şekil 1&#39;e bakınız. Bu puanlar deneyci için subjektiftir. </li></ol> 9. çoğaltır <ol><li> Biyolojik en az üç kez tekrar deneyler elde edilen sonuçların tekrarlanabilirliğini belirlenmesi. NOT: çoğaltır farklı günlerde yapılması durumunda, ölçüm yapmak ve 4 ° C&#39;de, daha sonra inkübasyon çıkarıldıktan hemen sonra ya mağaza plakaları plakaları puan veya onları atmadan önce plakaların yüksek kaliteli fotoğraflar çekmek. Depolama veya plakaların fotoğrafları farklı günlerde arasındaki sonuçların kolay karşılaştırma sağlar, tonun gün / deneyler arasında tekrarlanabilir puanlama teyit için özellikle önemlidir. plakaların depolama sonuçlarını değiştirme potansiyeline sahip olduğunu unutmayın. NOT: net fotoğraflar yer plakaları için dik dağınık ışık bir alanda mat siyah arka plan üzerine kapaksız, yakın objektif (makro modu) nesneler üzerinde odaklama yeteneğine sahip yüksek çözünürlüklü bir kamera (≥8 MP) kullanın. Alternatif olarak, beyaz ışığa ayarlanır trans-ışığı ile bazı jel görüntüleme cihazları, yüksek kalite, yüksek tekrarlanabilir görüntüler üretebilir. </li></ol>

<ol><li>Bolnick, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+intraspecific+trait+variation+matters+in+community+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Ecol+Evol%22%5BJournal%5D)">Why intraspecific trait variation matters in community ecology.</a> Trends Ecol Evol. 26 (4), 183-192 (2011).</li>
<li>Christensen, G. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonism+between+Staphylococcus+epidermidis+and+Propionibacterium+acnes+and+its+genomic+basis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Antagonism between Staphylococcus epidermidis and Propionibacterium acnes and its genomic basis.</a> BMC Genomics. 17 (152), (2016).</li>
<li>Faust, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+co-occurrence+relationships+in+the+human+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Microbial co-occurrence relationships in the human microbiome.</a> PloS Comput Biol. 8 (7), (2012).</li>
<li>Frank, D. N., Feazel, L. M., Bessesen, M. T., Price, C. S., Janoff, E. N., Pace, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+nasal+microbiota+and+Staphylococcus+aureus+carriage%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The Human nasal microbiota and Staphylococcus aureus carriage.</a> PLoS One. 5 (5), e10598(2010).</li>
<li>Fredheim, E. G., Flaegstad, T., Askarian, F., Klingenberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonisation+and+interaction+between+S.+epidermidis+and+S.+aureus+in+the+nose+and+throat+of+healthy+adolescents%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Clin+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Colonisation and interaction between S. epidermidis and S. aureus in the nose and throat of healthy adolescents.</a> Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 34, 123-129 (2015).</li>
<li>Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+competition%3A+surviving+and+thriving+in+the+microbial+jungle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 15-25 (2010).</li>
<li>Libberton, B., Coates, R. E., Brockhurst, M. A., Horsburgh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+intraspecific+trait+variation+among+nasal+bacteria+shapes+the+distribution+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Evidence that intraspecific trait variation among nasal bacteria shapes the distribution of Staphylococcus aureus.</a> Infect Immun. 82 (9), 3811-3815 (2014).</li>
<li>Libberton, B., Horsburgh, M. J., Brockhurst, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+spatial+structure%2C+frequency+dependence+and+resistance+evolution+on+the+dynamics+of+toxin-mediated+microbial+invasions%5BTitle%5D)+AND+%22Evol+appl%22%5BJournal%5D)">The effects of spatial structure, frequency dependence and resistance evolution on the dynamics of toxin-mediated microbial invasions.</a> Evol appl. 8, 738-750 (2015).</li>
<li>Liu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+and+the+ecology+of+the+nasal+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus and the ecology of the nasal microbiome.</a> Sci Adv. 1, e1400216(2015).</li>
<li>Nascimento, J. S., Ceotto, H., Nascimento, S. B., Giambiagi-deMarval, M., Santos, K. R., Bastos, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriocins+are+alternative+agents+for+control+of+multiresistant+staphylococcal+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacteriocins are alternative agents for control of multiresistant staphylococcal strains.</a> Lett Appl Microbiol. 42, 215-221 (2006).</li>
<li>Park, B., Iwase, T., Liu, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+application+of+S.+epidermidis+prevents+colonization+by+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intranasal application of S. epidermidis prevents colonization by methicillin-resistant Staphylococcus aureus in mice.</a> PLoS One. 6 (10), e25880(2011).</li>
<li>Uehara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+interference+among+nasal+inhabitants%3A+eradication+of+Staphylococcus+aureus+from+nasal+cavities+by+artificial+implantation+of+Corynebacterium+sp%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hosp+Infect%22%5BJournal%5D)">Bacterial interference among nasal inhabitants: eradication of Staphylococcus aureus from nasal cavities by artificial implantation of Corynebacterium sp.</a> J Hosp Infect. 44, 127-133 (2000).</li>
<li>Wos-Oxley, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+poke+into+the+diversity+and+associations+within+human+anterior+nare+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">A poke into the diversity and associations within human anterior nare microbial communities.</a> ISME J. 4, 839-851 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Diğerlerinden ayıran, bu bakteri türleri rekabet protokolünün kritik bir safha, inhibitörün bir gece boyunca inkübasyon rakip izolatı eklenmesinden önce izole olduğu. Önleyicisi soyu önleyici bileşikleri üretmek için bu büyüme dönemi gerektirir. rakip suşu aynı ortamda üstüne bindirilmiş gibi, bu yöntem tam potansiyelini gözlemlemek için araştırmacı izin verir önleyicisi soyunun rakip suşunun büyüme müdahale etmek. Bunun bir sonucu olarak, bu deney, doğa ile ne yansıtmaktadır; bir izole tamamen niş yılında kurulmuş, ve diğer başarılı niş işgal edebilmek için herhangi bir inhibitör değişkenleri karşı gerekir. Yanlış yapıldığı takdirde hatalı sonuçlara neden büyük olasılıkla bu protokol iki bölümü vardır. Birincisi, buharlaştırıcı şişe eksik sterilizasyon tahlil içine bakteri kirlenmesine neden tanıtabilirsiniz. incusteril bir kap içinde aşama 3.6 buharlaştırıcı şişe yıkamak için kullanılan broth Bation tamamen sterilize edildi şişe teyit etmek için kullanılabilir. Ek sterilizasyon gerekli ise, örneğin, Virkon® dezenfekte edici çözeltiler Ek yıkama, aşama 3.2&#39;de tanımlanan yüzey etkili temizleme maddesinin yıkama, önce kullanılabilir. hatalı sonuçlara neden olabilir ikinci aşama rakip suşu (adım 6.1) seyreltme olduğunu. Seyreltme uygun değilse, inhibisyon net ölçümler kolayca tespit edilemez. Bu deney, önleyici üreten S. karşı Gram-pozitif ve Gram-negatif türler geniş bir yelpazesinde suşları gibi çeşitli nazal izolatları kullanılarak optimize edildi rakip suşu 7,8 olarak aureus SH1000. Bu daha sonra rakip ve inhibitörü üreten suşlar gibi çeşitli-koagülaz negatif ve koagulaz pozitif stafilokok kullanılarak test edilmiştir. rakip olarak yukarıda tarif edilenler dışındaki cins test ederkensuşu, inokulum için seyreltme bazı optimizasyon gerekli olabilir. berraklık puanları tekrarlar arasında anlamlı farklılık varsa, belirli bir optik yoğunluk olarak ayarlayarak rakip gerilme inokulum standardize etmek gerekli olabilir. Bununla birlikte, bu deney ayarlamak için gereken ve deney için işlem mümkündür suşları sayısının azaltılması olası zaman artar. Görme hızlı bir alternatif sağlayabilir bir McFarland standardı kullanılarak uygun bir OD kültürünü ayarlayarak. Bu tekniğin bir sınırlama sadece kültürlenebilir bakterilerin uygulanabilir bunun olmasıdır. Birçok çalışmada rekabet dışlama etkileşimleri 3,4,13 tahmin 16S rRNA sıralamasını kullanmak nedeni budur. Ancak, genetik ve metagenomic teknikler sadece tür düzeyinde topluluk üyelerini ayırt edebilir ve / veya belirli bir tür içi özellik varyasyonu için hesaba katmıyor. Bir özelde, dernek taranması mümkünBir bakteri türlerinin 5 varlığında ya da yokluğunda bir özelliği kodlamaktadır ar geni, ancak bu tür hariç ile bağlantılı olması muhtemel bir genin ön bilgi gerektirir. Bu tekniğin bir güvenlik dikkate bakterilerin aerosol üretimi nedeniyle, sadece bir seviye 2 güvenlik kabini ile laboratuarlarda kullanılan ya da benzer güvenlik önlemleri ile olabilir olmasıdır. intraspecific özellik değişimi için hesap ve bakteri aerosollerin üretemeyen izolatlar arasındaki rekabet test etmek için alternatif teknikler vardır. Böyle bir yöntem, aynı anda antagonizma deney 2 &#39;dir. Bu yöntemde, bir izolatın, bir aşı, bir agar plakası üzerine yayılır, ve birinci kuruduktan sonra, ikinci bir izole aşı En lekeli veya yaralanmıştır. Bu, hem inhibitör bileşikler üretirler ve ilk besin temizlemek için yarışan, suşlar doğrudan rekabet (eşzamanlı antagonizma) olarak bir ortam üretecektir. advantageşzamanlı antagonizma tahlil üzerinden ertelenmiş büyüme inhibisyonu testinin e inhibitörü izolatı her zaman tam rakip izolatı işgalinden önce kurulmakta olan rekabet avantajına sahip olmasıdır. Başka bir suş yerine iki izolat aynı anda 8 ilave olmaktan çok, ilave edilmeden önce, bir izolatın kurulacak çoğu niş olarak bu, çevrede ne olacağını daha yansıtıcı olduğunu. Başka bir alternatif döktü ziyade önleyici izolatı üzerinde püskürtülür olabilir üst agar izole rakibi eklemek olacaktır bakterilerin aerosol oluşumunu engellemek için. Bununla birlikte, üst agar eklenmiş hacmi plaka da kapsama sağlamak için yaklaşık olarak 3 ml olması gerekir. Bu hacim içinde, rakip izolat inhibitörü izolatı aynı ortam üzerinde büyüyen olmaz, bu yüzden azalmış besin muzdarip olmaz. Yarışmacı, aynı zamanda UNT bir önleyici bileşikler ile doğrudan temas halinde olmazil onlar üst agar içine yayılmış. Böyle bir deney, ertelenmiş inhibisyonu veya aynı anda antagonizmi olarak tarif edilememiştir. Benzer bir yöntem, daha önce klinik S. arasında basitrasin direnci düzeylerini değerlendirmek için kullanılmıştır aureus 10 ayırır. 10 tarif burada tarif edilen protokol ve arasındaki temel fark, duyarlı (0 puan inhibisyon netlik tamamlamak) ya da dirençli ikinci sadece gizli rakip suşları (hiçbir inhibisyon netlik kısmi skor 1-5). Ertelenmiş bir büyüme önleme deneyi Bu yüzden, aynı zamanda, çok ilaca dirençli patojenlere karşı aktif yeni antimikrobiyal aramak için daha özel bir antimikrobiyal, veya üretici direnç seviyeleri taranması için kullanılabilir. Ev sahibi mikroflora bakteriyel eden 9 istenmeyen temsilcilerinin ortadan kaldırmak için manipüle edilebilir olduğu ileri sürülmüştür. Corynebacterium türü ya Staph Uygulamaylococcus epidermidis önce S. ortadan kaldırmak için gösterilmiştir Nüfusun 11,12 önemli bir oranda burun içinde aureus kolonizasyonu. rekabetçi, burada anlatılan gibi teknikler vasıtasıyla ev sahibi bitki istenmeyen temsilcilerinin, dahil belirli suşlarından içine çalışmalar bu nedenle gelecekteki terapötik yol olabilir.

Topluluklarda yaşayan bakteriler, alan ve besin maddeleri için türler arası ve tür içi düzeyde rekabet ederler 6. Mikroplar arasındaki rekabet, genellikle bir topluluk içindeki belirli türlerin veya suşların dışlanmasına yol açabilir. Dışlama, belirli bir reseptör veya besin maddesi için rekabete veya topluluğun bir üyesi tarafından bir antimikrobiyal bileşiğin üretilmesine bağlı olabilir 6.
Rekabetçi dışlanmayı araştıran çalışmalar sıklıkla 16S rRNA dizilimi 3,4,13 kullanarak türlerin varlığını ve yokluğunu inceler. Bununla birlikte, tür içi özellik varyasyonu, örneğin antimikrobiyal peptit üretiminin varlığı veya yokluğu, bir türün diğerini inhibe etme yeteneğini büyük ölçüde etkileyebilir 1. 16S rRNA dizilimi aynı türün suşları arasında ayrım yapamadığından, tür içi özellik varyasyonu değerlendirilemez. Burada açıklanan teknik, diğer bakterileri dışlamak için bireysel suşların potansiyelini değerlendirmek için kullanılabilir. Bu yöntem daha önce Staphylococcus aureus inhibitör bakterilerinin varlığı ile bir nazal toplulukta S. aureus'un yokluğu arasında pozitif bir korelasyon göstermek için kullanılmıştır 7.
Ertelenmiş büyüme inhibisyonu (rekabet) testi, inhibitör suşu tarafından antimikrobiyal bileşiklerin üretimini veya besin rekabetini tanımlayabilir. Ayrıca, inhibitör suşunun varlığının aslında rakip suşun büyümesini iyileştirdiği pozitif etkileşimleri de tespit edebilir. Bu tahlil, kantitatif veriler (temizleme büyüklüğü bölgesi) ve nitel veriler (inhibisyon derecesi) oluşturmak için kullanılabilir, her ikisi de fenotip (özellik) ile rekabetçi dışlama arasındaki korelasyonları bulmak için bir topluluk içindeki bir türün varlığı veya yokluğuna ilişkin verilerin üzerine yerleştirilebilir.

<table><tbody><tr><td>Beyin kalp infüzyon suyu</td><td>Lab M</td><td>lab049</td><td>zengin genel amaçlı medya</td></tr><tr><td>agar-agar</td><td>Merck Milipore</td><td>101614</td><td></td></tr><tr><td>Petri kapları</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.001</td><td></td></tr><tr><td>Plastik parfüm buharlaştırıcı</td><td>bilinmiyor</td> <td>-</td> <td>10 cm yüksekliğinde, 3,5 cm çapında kapaklı şeffaf plastik sprey şişesi, bir süpermarketin</td></tr> <tr><td>seyahat bölümünden satın alındıArtık üretimde olmayan üniversal şişeler</td><td></td><td>, alternatif SLS BOT5006</td><td>28 ml cam silindirik şişe (~280 mm çap, 850 mm yükseklik), plastik vidalı kapaklı düz tabanlı</td></tr><tr><td>Decon 90</td><td>Decon&nbsp;</td><td></td><td>Yüzey Aktif Temizlik Maddesi&nbsp;</td></tr></tbody></table>

ertelenmiş büyüme İnhibisyon tahlili rekabet bakteri kaynaklı antimikrobiyal etkisi belirlememize

Deferred Growth Inhibition Assay to Quantify the Effect of Bacteria-derived Antimicrobials on Competition

Örneğin, inhibitör üreten bir suş, temel bir besin maddesi için rakibini geride bıraktığında veya rakibinin dirençli olmadığı antimikrobiyal bileşikler ürettiğinde, mikrobiyal topluluklarda rekabetçi dışlanma meydana gelebilir. Burada, bir bakterinin antimikrobiyal bileşiklerin üretimi veya besinler için rekabet yoluyla diğerinin büyümesini engelleme yeteneğini değerlendirmek için bir yöntem olan ertelenmiş bir büyüme inhibisyonu testini açıklıyoruz. Bu teknik, nazal izolatların belirli türlerin bir topluluktan dışlanması ile korelasyonunu araştırmak için kullanılmıştır. Bu teknik aynı zamanda lantibiyotik üreticilerini veya potansiyel olarak yeni antimikrobiyalleri taramak için de kullanılabilir. Tahlil, önce test inhibitörü üreten suşun gece boyunca bir agar plakası üzerinde kültürlenmesi, ardından test rakibi suşunun üzerine püskürtülmesi ve tekrar inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. İnkübasyondan sonra, inhibisyon derecesi, inhibisyon üreten suşun etrafındaki temizleme bölgesinin büyüklüğü boyunca ve inhibisyon bölgesinin berraklığını değerlendirerek kalitatif olarak kantitatif olarak ölçülebilir. Burada, ertelenmiş inhibisyon testi için protokolü sunuyoruz, deneyler arasındaki varyasyonu en aza indirmenin yollarını açıklıyoruz ve inhibisyon derecesini kalitatif olarak değerlendirmek için kullanılabilecek bir netlik ölçeği tanımlıyoruz.

Deney sonuçları, merkezi benekli önleyicisi üreten bir suş (Şekil 1) yakınındaki Kaplanmış rakip suşu bir fark olarak gözlemlenebilir olmalıdır. Bu farklılıklar, tam inhibisyon (Şekil 1A), kısmi inhibisyonu (Şekil 1B ve 1C), herhangi bir inhibisyonu (Şekil 1D) veya pozitif bir birlik olarak yorumlanabilir. Yaygın olarak kullanılan laboratuvar S. suşları epidermidis Tü3298 ve S. epidermidis Rp62A, ve S. epidermidis Rp62A ve S. aureus Newman sırasıyla Şekil 1b ve 1d kullanılmıştır. Biz bu suşlar bu protokolü test etmek için kullanılır olabileceğini düşündürmektedir. Test edilen türler bağlı olarak, tam inhibisyon ve kısmi inhibisyon muhtemelen antimikrobiyal peptitler, antibiyotiklere veya diğer yayılabilir bir büyüme inhibitör sonucudurinhibitör üreten bir suş tarafından üretilen rs. Kısmi inhibisyon da inhibitör suşu 6 ile rakip alımı nedeniyle gerginlik ya da besin ayrımı için azaltılmış besin durumu ile bağlantılı olmuştur. Aynı rakip suşuna karşı test edilen farklı inhibitör üreten suşlar arasında inhibisyon zonunun boyutu karşılaştırılması aşağıdakilerden herhangi farklılıkları gösterir: inhibitörü üreten bir suş tarafından üretilen antimikrobiyal miktarı; ortam içinden difüze inhibitörün özelliği; inhibitör tip üretilen ve inhibitörleri ile rakip suşu direnç seviyesi üretilmektedir. Aynı önleyicisi üreten suşuna karşı test edilen farklı rakip suşları arasında inhibisyon bölgesinin boyutu karşılaştırması önleyicisi üretilen için rakip karşı direnç seviyelerinin göstergesidir. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Sonuçlar kullanılan inhibitör zorlanma ve kullanılan rakip gerginlik bağlı olarak değişecektir. Aynı inhibitör ve rakip suşu kullanılarak tekrarlar ideal aynı netlik puanı (bölüm 8.2&#39;de açıklanan) olması gerekir, bu iyi bir teknik boyunca kullanılan olmuştur gösterir. Bakterilerin eksik uygulanması oluştu plakları kullanılmamalıdır. Örneğin test rakip kültürden ise inhibisyon bölgesinin daha büyük görünür ve tipik olarak (Şekil 2A) görülmektedir daha az belirgin bir kenar olacak seyreltilmiş; Bu herhangi bir karşılaştırmalı bölge ölçümlerinin güvenilirliğini etkileyecektir. Inhibitör üreten suş nokta tam bir gecede inkübasyon önce kuru değil ise, inhibitör zorlanma yaymak ve tipik bölge ölçümleri etkiler ama aynı zamanda netlik puanlama etkileyebilir açıkça tanımlanmış nokta (Şekil 2B), oluşturmayacak muhtemeldir. rakip suşu iseeşit biçimde, bu bakterilerin düzgün olmayan bir yayılma (Şekil 2C) yol açabilir püskürtülür. Rakip suşu çok konsantre olursa bu rakip suşu inhibitörü suşu (Şekil 2C) üstünde büyümeye olasıdır, aşırı durumlarda bu yarışmacı / inhibitör gerilme rolleri bazı ters yol açabilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54437/54437fig1.jpg" /> Şekil 1:. Büyüme inhibisyonuna ertelenmiş büyüme inhibisyonu analizi elde edilebilir niteliksel ve niceliksel sonuçların aralığı Sonuçlar (A) &#39;tam inhibisyon aralığında olabilir (0 puan), (B), kısmi inhibisyonu (1 puan) (D) hiçbir inhibisyon (4 puan) ile (C) kısmi engelleme (2 puan). Etiketler (Y) inhibitörü soylarının büyüme kenarları ve inhibisyon en dış kenarı gösterirbölgeleri (X). A fotoğraflandı levhalar için ölçümlerini göstermektedir, (E) &#39;de gösterildiği gibi 0 mm ilâ 10 mm&#39;den fazla inhibisyon aralığında alanın boyutu, A, B, C ve D Sonuçlar Son stafilokok izolatı (A ile gösterilmiştir C) ya da ortak laboratuar stafilokok S. izolatlarının epidermidis Tü3298 (önleyici) ve S. epidermidis Rp62A (rakip) (B), ve S. epidermidis Rp62A (önleyici) ve S. aureus Newman (rakip) (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54437/54437fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54437/54437fig2.jpg" /> Şekil 2: zayıf tekniğine tutarsız sonuçlar örnekleri Sonuçları eğer beklenenden farklı görünebilir (A. </strorakip zorlanma eşit püskürtülür değildi ve çok konsantre eğer ng&gt;) rakip suşu çok seyreltik olduğu, (B) inhibitörü suşu inkübasyon / plakaları önce tamamen kuru değildi kuru veya (C) değildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54437/54437fig2large.jpg" target="_blank">büyük halini görmek için tıklayınız bu rakamın.</a>

Ertelenmiş büyüme inhibisyonu testi, bir bakteri izolatının diğeri üzerindeki rekabet etkisini değerlendirmek için kullanılabilir. İnhibisyon, inhibitör üreten izolatın etrafındaki temizleme bölgesinin ölçülmesiyle ölçülür veya inhibisyonun görünür derecesinin belirlenmesiyle kalitatif olarak değerlendirilir.

Ertelenmiş Büyüme İnhibisyon Tahlili Rekabet Bakteri kaynaklı Antimikrobiyal Etkisi belirlememize

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential ...

Bu protokolün genel amacı, bir bakteriyel izolatın bir diğeri üzerindeki rekabetini hem nicel hem de nitel olarak incelemektir. Bu yöntem, bakteriyel topluluklar içindeki rekabetçi dışlama ile ilgili araştırmalarda temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, bir bakteriyel toplulukta meydana gelenleri yansıtmasıdır.İstilacı izolatların, istilanın başarılı olabilmesi için yerleşmiş izolatların inhibitör etkilerine karşı hayatta kalabilmeleri gerekir. Prosedürü, hastane biyolojisi bölümünden lisansüstü öğrencisi Emma Crankle gösterecektir. Başlamak için, üretici talimatlarına göre brain heart infusion veya BHI agar hazırlayın.Sterilize etmek için agarı 121 °C'de 15 psi basınçta 20 dakika boyunca otoklavlayın. Sterilize edilmiş BHI agarından 15 mL'lik alikotları steril petri kaplarına dökün ve agarın donmasını bekleyin. BHI besiyerini üretici talimatlarına göre hazırlayın ve 10 mL'lik alikotları 28 mL'lik cam universal şişelere aktarın.Ardından BHI besiyerini 20 dakika boyunca otoklavlayın. Buharlaştırıcı şişelerini hazırlamak için öncelikle şişelerin parçalarını sökün. Dahili kontaminantları gidermek için buharlaştırıcıdan %5'lik yüzey aktif temizleme maddesi püskürtün.Ardından vaporizer şişesini, kapağını ve vaporizer'ı temizleme ajanında gece boyunca bekletin. Ertesi gün, vaporizer'ı, kapağı ve şişeleri steril hava akışlı kabin altında kurutun. Daha sonra şişeleri doldurmak için %70 etanol kullanın.Ardından, buharlaştırıcıyı tekrar takın ve buharlaştırıcı aracılığıyla bir miktar etanol püskürtün. Buharlaştırıcının kapağını kapatın ve kullanım zamanına kadar içinde etanol olacak şekilde saklayın. Kullanmadan önce, şişeyi aseptik olarak durulamak için steril BHI besiyeri kullanın ve besiyerini buharlaştırıcı aracılığıyla püskürtün.Bakteriyel gece boyu kültürleri hazırlamak için, rakip ve inhibitör suşları steril bir BHI agar plakasına ekim yapın ve yaklaşık 18 saat boyunca 37 °C'de aerobik olarak inkübe edin. 28 mL'lik bir universal şişe içerisinde, 10 mL steril BHI besiyerine ilgili rakip bakteriyel suşun tek bir kolonisini inoküle edin. Kültürü bir universal orbital sarsıcısı ile 37 °C'de ve 250 RPM'de gece boyu inkübe edin.Ertesi gün, ekim işleminin plaka üzerinde yayılmasını önlemek için agar plakalarının tamamen kuru olduğundan ve kapaklarda yoğuşma bulunmadığından emin olun. Kültürün agar üzerine sıçramasına neden olabilecek hava kabarcıklarını önlemek için pipet pistonunu tamamen bastırmadan, gece boyunca büyütülen kültürden 25 µL'yi agar plakalarının merkezine pipetleyin. Kültürün yayılımını sınırlamak için oda sıcaklığında kurumaya bırakın.Ardından, agar plakalarını 37 °C'de aerobik olarak gece boyunca inkübe edin. Gece boyu kültürleme işleminden sonra, emici kağıtla kaplanmış ikinci düzey bir güvenlik kabini altında çalışarak, kültürü yaklaşık 4 × 10⁶ CFU/mL elde edecek şekilde BHI besiyeri ile on kat seyreltin. Daha sonra, seyreltilmiş kültürü steril plastik bir parfüm sprey şişesine boşaltın.Ertelenmiş büyüme inhibisyon testi gerçekleştirmek için, agar üzerine püskürtme işleminden önce kültürün püskürtme mekanizmasına yüklendiğinden emin olmak amacıyla kültürü her bir buharlaştırıcı şişe aracılığıyla püskürtün. Agarın yaklaşık 15 santimetre üzerinden, tüm agar yüzeyine yaklaşık 250 microliters seyreltilmiş kültür püskürtün. Plakaları 37 degrees Celsius sıcaklıkta aerobik olarak gece boyunca inkübe edin.Ertelemeli büyüme inhibisyonunu yorumlamak için, püskürtülen rakip suşun büyüme inhibisyon zonunu milimetre cinsinden ölçün ve inhibitör üreten suşun merkezdeki noktasının çapını çıkarın. Son olarak, metin protokolüne uygun olarak inhibisyon zonları için berraklık skorunu kaydedin. Bu şekilde gösterildiği gibi, analiz sonuçları, merkezde noktalanmış inhibitör üreten suşun yakınındaki üst üste bindirilmiş rakip suşta bir fark olarak gözlemlenmelidir.Farklar; tam inhibisyon, kısmi inhibisyon, inhibisyon olmaması veya pozitif ilişki şeklinde olabilir. Bu grafik, inhibitör üreten izolatlar arasındaki inhibisyon zonlarını karşılaştırmaktadır; bu durum, üretilen antimikrobiyal miktarın, inhibitörün ortamda difüzyon yeteneğinin, üretilen inhibitör tipinin veya rakip suşun inhibitörlere karşı direnç seviyesinin bir sonucu olabilir. Bu örnek, test edilen rakip kültürün çok seyreltik olması durumunda, inhibisyon zonunun tipik olarak gözlemlenenden daha geniş görüneceğini ve kenarlarının daha az belirgin olacağını göstermektedir.İnhibitör üreten suş noktası gece boyu inkübasyondan önce tamamen kurutulmazsa, inhibitör suş yayılacak ve tamamen tanımlanmış bir nokta oluşturmayacaktır. Alternatif olarak, rakip suş eşit şekilde püskürtülmezse, bu durum bakterilerin düzensiz yayılımına yol açabilir. Son olarak, rakip suş çok yoğunsa, inhibitör suşun üzerinde büyüyebilir ve uç durumlarda rakip ve inhibitör suş rollerinin tersine dönmesine neden olabilir.Bu teknik uzmanlaşıldığında, test edilen her izolat çifti için dört güne yayılmış toplam bir saat sürecektir. Bu prosedürü uygularken, deneyler arasında iyi bir tekrarlanabilirlik sağlayacak şekilde eşit püskürtme yapmayı hatırlamak önemlidir. Bu prosedürün ardından, inhibisyon verileri bir topluluktaki bakteriyel türlerin varlığına veya yokluğuna ilişkin taksonomik verilerle üst üste bindirilebilir.Böylece, inhibisyon etkilerinin bir türün bir ortamda kolonize olma yeteneğini etkileyip etkilemediğini belirlemek mümkün hale gelir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, topluluk mikrobiyomları alanındaki araştırmacıların, rekabetçi dışlamada antimikrobiyal peptit tahmini gibi özellik varyasyonlarının topluluk yapısı üzerindeki etkilerini incelemelerine olanak tanır. Bu videoyu izledikten sonra, bir bakteri izolatının bir diğerinin büyümesini rekabetçi bir şekilde inhibe etme yeteneğinin hem kalitatif hem de kantitatif olarak nasıl karşılaştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Aerosol halindeki bakterilerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman ikinci seviye bir güvenlik kabini içinde çalışmak ve uygun KKD kullanmak gibi önlemler alınmalıdır.

deferred-growth-inhibition-assay-to-quantify-effect-bacteria-derived

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kaynak: Speare, L., ve diğerleri. Vibrio fischeri İzolatları Arasındaki Rekabetçi Etkileşimleri Ölçmek için Coincubation Asword. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, bakteri suşlarının ortak bir ortamda nasıl rekabet ettiğini incelemek için kullanılan bir ortak inkübasyon testini göstermektedir. Bu etkileşimleri yönlendiren temasa bağlı veya temastan bağımsız öldürme gibi mekanizmaları tanımlamak için mikrobiyolojide yaygın olarak uygulanır.

Bakteri Suşları Arasındaki Rekabetçi Etkileşimleri İncelemek için Coincubation Testi

Bu video, tek hücre düzeyinde bakteri rekabetini incelemek için floresan mikroskobu tabanlı bir yöntemi göstermektedir. Bu yöntem, bakteri topluluklarının yapısı ve işlevi hakkında bilgi sağlar.

Bakteriyel Ko-İnkübasyon Testi: Tek Hücre Düzeyinde Spesifik Dışı Bakteriyel Rekabeti Görselleştirmek için Floresan Mikroskobu Tabanlı Bir Teknik

Bu video, bir bakteri türü tarafından üretilen antimikrobiyal bileşiklerin başka bir rakip bakteri türünü nasıl etkilediğini araştırmak için kullanılan ertelenmiş büyüme inhibisyonu testini göstermektedir.

Bakteri Kaynaklı Antimikrobiyal Bileşiklerin Etkisini Değerlendirmek için Ertelenmiş Bir Büyüme İnhibisyonu Testi

Bu video, bakterilere karşı test antibiyotiklerinin Minimum İnhibitör Konsantrasyonunu (MIC) belirlemek için mikrotitre plakası tabanlı bir yöntemi göstermektedir. Bir test antibiyotiğinin seri dilüsyonlarını içeren bir mikrotitre plakasına bakteriyel patojen Pseudomonas aeruginosa'nın bir süspansiyonu ve bakteriler tarafından pyomelanin üretiminin bir inhibitörü eklendikten sonra, oyukların optik yoğunluğu, antibiyotiğin minimum inhibitör konsantrasyonunu ve piyomelanin üretim inhibitörünün...

Bir Antibiyotiğin Minimum İnhibitör Konsantrasyonunu Değerlendirmek için Bir Mikrotitre Plaka Yöntemi

Biz aracılık bakteriyel rekabet izlemek için kalitatif bir testtir...

T6SS aracılı Bakteriyel Rekabet Monitör A Görsel Assay

Bakteriler yaşamları boyunca zararlı veya faydalı mutasyonlar biriktirebilir. Bir hücre popülasyonunda, yararlı mutasyonlar biriktirmiş bireyler, arkadaşlarını hızla geride kalabilir. Burada, floresan etiketli bireyleri kullanarak zaman içinde bakteri hücresi popülasyonunda tür içi rekabeti görselleştirmek için basit bir prosedür sunuyoruz.

Floresan Etiketli Suşların Cocultivation'ı ile Bakteri Hücre Popülasyonunda İntraspecies Rekabetini İzleme

(1) hücre içi bakteriyel bir patojeni hedefleyen ökaryotik hücre penetran antimikrobiyalleri aynı anda tanımlamak ve (2) ökaryotik hücre sitotoksisitesini değerlendirmek için yüksek verimli, gerçek zamanlı bir test geliştirilmiştir. Daha sonra aynı teknolojideki bir varyasyon, kolay, yüksek çözünürlüklü, doz yanıtı ve iki ve üç boyutlu sinerji çalışmalarını mümkün kılmak için dijital dağıtım teknolojisi ile birleştirildi.

Yüksek Verimli, gerçek zamanlı, Hücre içi Antimikrobiyal Aktiviteleri Çift okuma Test ve Ökaryotik Hücre Sitotoksisite

Diğer bakterilere karşı inhibe edici bileşiklerin üretimi için bakteri kültürlerini taramak için basit bir yöntem açıklıyoruz.

Yumuşak agar üst tabaka tekniği kullanımı bakteriyel olarak üretilmiş önleyici bileşiklerin taranması için

Bakteriler, interbakteriyel rekabetle uğraşmak için farklı mekanizmalar kodlayabilir. Burada, bakteriyel izolatlar ve karma bir nüfusun uzamsal yapısını nasıl etkilediğini arasında rekabetçi etkileşimleri karakterize etmek için kültür tabanlı bir protokol sunuyoruz.

Vibrio fischeri Izolatlar arasında rekabetçi etkileşimleri ölçmek için kokuluçak assay

Bu protokolde sunulan ortak kültür etkileşimi tahlilleri ucuz, yüksek iş ortası ve basittir. Bu tahliller, ortak kültürdeki mikrobiyal etkileşimleri gözlemlemek, etkileşim kalıplarını belirlemek ve insan ve çevresel patojenlere karşı mikrobiyal bir ilgi nin önleyici potansiyelini karakterize etmek için kullanılabilir.

Mikrobiyal Etkileşimlerin İncelemi için Yüksek İş-İş Ortağı Tahlilleri

Bu makalede, kokültürdeki bakteriyel rekabeti görselleştirmek ve ölçmek için tek hücreli floresan mikroskopisi kullanma yöntemi açıklanmaktadır.

Tek Hücreli Floresan Görüntüleme Kullanılarak Interbakteriyel Rekabetin Nicelemesi

Öğrenin bakteri izolatları arasındaki rekabetçi inhibisyonu ertelenmiş büyüme inhibisyonu testiyle nicel ve nitel olarak değerlendirmeyi. Bu yöntem mikrobiyal topluluk dinamiklerini anlamak için değerli veriler sunar.

Ertelenmiş Büyüme İnhibisyon Tahlili Rekabet Bakteri kaynaklı Antimikrobiyal Etkisi belirlememize

Daha fazla video keşfet