Ertelenmiş Büyüme İnhibisyon Tahlili Rekabet Bakteri kaynaklı Antimikrobiyal Etkisi belirlememize

Bu protokolün genel amacı, bir bakteriyel izolatın bir diğeri üzerindeki rekabetini hem nicel hem de nitel olarak incelemektir. Bu yöntem, bakteriyel topluluklar içindeki rekabetçi dışlama ile ilgili araştırmalarda temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, bir bakteriyel toplulukta meydana gelenleri yansıtmasıdır.

İstilacı izolatların, istilanın başarılı olabilmesi için yerleşmiş izolatların inhibitör etkilerine karşı hayatta kalabilmeleri gerekir. Prosedürü, hastane biyolojisi bölümünden lisansüstü öğrencisi Emma Crankle gösterecektir. Başlamak için, üretici talimatlarına göre brain heart infusion veya BHI agar hazırlayın.

Sterilize etmek için agarı 121 °C'de 15 psi basınçta 20 dakika boyunca otoklavlayın. Sterilize edilmiş BHI agarından 15 mL'lik alikotları steril petri kaplarına dökün ve agarın donmasını bekleyin. BHI besiyerini üretici talimatlarına göre hazırlayın ve 10 mL'lik alikotları 28 mL'lik cam universal şişelere aktarın.

Ardından BHI besiyerini 20 dakika boyunca otoklavlayın. Buharlaştırıcı şişelerini hazırlamak için öncelikle şişelerin parçalarını sökün. Dahili kontaminantları gidermek için buharlaştırıcıdan %5'lik yüzey aktif temizleme maddesi püskürtün.

Ardından vaporizer şişesini, kapağını ve vaporizer'ı temizleme ajanında gece boyunca bekletin. Ertesi gün, vaporizer'ı, kapağı ve şişeleri steril hava akışlı kabin altında kurutun. Daha sonra şişeleri doldurmak için %70 etanol kullanın.

Ardından, buharlaştırıcıyı tekrar takın ve buharlaştırıcı aracılığıyla bir miktar etanol püskürtün. Buharlaştırıcının kapağını kapatın ve kullanım zamanına kadar içinde etanol olacak şekilde saklayın. Kullanmadan önce, şişeyi aseptik olarak durulamak için steril BHI besiyeri kullanın ve besiyerini buharlaştırıcı aracılığıyla püskürtün.

Bakteriyel gece boyu kültürleri hazırlamak için, rakip ve inhibitör suşları steril bir BHI agar plakasına ekim yapın ve yaklaşık 18 saat boyunca 37 °C'de aerobik olarak inkübe edin. 28 mL'lik bir universal şişe içerisinde, 10 mL steril BHI besiyerine ilgili rakip bakteriyel suşun tek bir kolonisini inoküle edin. Kültürü bir universal orbital sarsıcısı ile 37 °C'de ve 250 RPM'de gece boyu inkübe edin.

Ertesi gün, ekim işleminin plaka üzerinde yayılmasını önlemek için agar plakalarının tamamen kuru olduğundan ve kapaklarda yoğuşma bulunmadığından emin olun. Kültürün agar üzerine sıçramasına neden olabilecek hava kabarcıklarını önlemek için pipet pistonunu tamamen bastırmadan, gece boyunca büyütülen kültürden 25 µL'yi agar plakalarının merkezine pipetleyin. Kültürün yayılımını sınırlamak için oda sıcaklığında kurumaya bırakın.

Ardından, agar plakalarını 37 °C'de aerobik olarak gece boyunca inkübe edin. Gece boyu kültürleme işleminden sonra, emici kağıtla kaplanmış ikinci düzey bir güvenlik kabini altında çalışarak, kültürü yaklaşık 4 × 10⁶ CFU/mL elde edecek şekilde BHI besiyeri ile on kat seyreltin. Daha sonra, seyreltilmiş kültürü steril plastik bir parfüm sprey şişesine boşaltın.

Ertelenmiş büyüme inhibisyon testi gerçekleştirmek için, agar üzerine püskürtme işleminden önce kültürün püskürtme mekanizmasına yüklendiğinden emin olmak amacıyla kültürü her bir buharlaştırıcı şişe aracılığıyla püskürtün. Agarın yaklaşık 15 santimetre üzerinden, tüm agar yüzeyine yaklaşık 250 microliters seyreltilmiş kültür püskürtün. Plakaları 37 degrees Celsius sıcaklıkta aerobik olarak gece boyunca inkübe edin.

Ertelemeli büyüme inhibisyonunu yorumlamak için, püskürtülen rakip suşun büyüme inhibisyon zonunu milimetre cinsinden ölçün ve inhibitör üreten suşun merkezdeki noktasının çapını çıkarın. Son olarak, metin protokolüne uygun olarak inhibisyon zonları için berraklık skorunu kaydedin. Bu şekilde gösterildiği gibi, analiz sonuçları, merkezde noktalanmış inhibitör üreten suşun yakınındaki üst üste bindirilmiş rakip suşta bir fark olarak gözlemlenmelidir.

Farklar; tam inhibisyon, kısmi inhibisyon, inhibisyon olmaması veya pozitif ilişki şeklinde olabilir. Bu grafik, inhibitör üreten izolatlar arasındaki inhibisyon zonlarını karşılaştırmaktadır; bu durum, üretilen antimikrobiyal miktarın, inhibitörün ortamda difüzyon yeteneğinin, üretilen inhibitör tipinin veya rakip suşun inhibitörlere karşı direnç seviyesinin bir sonucu olabilir. Bu örnek, test edilen rakip kültürün çok seyreltik olması durumunda, inhibisyon zonunun tipik olarak gözlemlenenden daha geniş görüneceğini ve kenarlarının daha az belirgin olacağını göstermektedir.

İnhibitör üreten suş noktası gece boyu inkübasyondan önce tamamen kurutulmazsa, inhibitör suş yayılacak ve tamamen tanımlanmış bir nokta oluşturmayacaktır. Alternatif olarak, rakip suş eşit şekilde püskürtülmezse, bu durum bakterilerin düzensiz yayılımına yol açabilir. Son olarak, rakip suş çok yoğunsa, inhibitör suşun üzerinde büyüyebilir ve uç durumlarda rakip ve inhibitör suş rollerinin tersine dönmesine neden olabilir.

Bu teknik uzmanlaşıldığında, test edilen her izolat çifti için dört güne yayılmış toplam bir saat sürecektir. Bu prosedürü uygularken, deneyler arasında iyi bir tekrarlanabilirlik sağlayacak şekilde eşit püskürtme yapmayı hatırlamak önemlidir. Bu prosedürün ardından, inhibisyon verileri bir topluluktaki bakteriyel türlerin varlığına veya yokluğuna ilişkin taksonomik verilerle üst üste bindirilebilir.

Böylece, inhibisyon etkilerinin bir türün bir ortamda kolonize olma yeteneğini etkileyip etkilemediğini belirlemek mümkün hale gelir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, topluluk mikrobiyomları alanındaki araştırmacıların, rekabetçi dışlamada antimikrobiyal peptit tahmini gibi özellik varyasyonlarının topluluk yapısı üzerindeki etkilerini incelemelerine olanak tanır. Bu videoyu izledikten sonra, bir bakteri izolatının bir diğerinin büyümesini rekabetçi bir şekilde inhibe etme yeteneğinin hem kalitatif hem de kantitatif olarak nasıl karşılaştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Aerosol halindeki bakterilerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman ikinci seviye bir güvenlik kabini içinde çalışmak ve uygun KKD kullanmak gibi önlemler alınmalıdır.