Name: Koruyucu etkinliği ve Pulmoner Bağışıklık Tepkisi Fare Subkutan ve Burun BCG İdaresi ardından (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Keşfedin fare modelinde burun içi ve deri altı BCG aşılamasının koruyucu etkinliğini ve akciğer bağışıklık yanıtlarını. Bu yöntem, tüberküloza karşı IL17 aracılıklı immün parametreleri belirlemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, "İspanya Ekonomi ve Rekabet Edebilirlik Bakanlığı" [hibe numarası BIO2014-5258P], "Avrupa Komisyonu" tarafından H2020 programları [hibe numaraları TBVAC2020 643381] tarafından desteklenmiştir.

Tüm fareler kontrol edilen koşullar altında tutulur ve hastalık belirtisi gözlendi. Deneysel çalışma Deney hayvanlarının korunması ve yetkili yerel etik kurul onayı ile Avrupa ve ulusal direktifleri ile anlaşma yapılmıştır. BCG Danimarka ve Sayısallaştırılmış Gliserin Stoklar ve Mycobacterium tuberculosis H37Rv 1. hazırlanması NOT: anlatılan tüm protokoller BSL3 koşulları altında gerçekleştirilmiştir. <ol><li> BCG Danimarka da H37Rv soylarının çözülme dondurulmuş gliserol stokları ve Tween-80% 0.05 (h / h) ve ADC (albümin, dekstroz, katalaz),% 10 (h / h) ile desteklenmiş 7H9 ortamı, 10, 10 ml 100 ul inokülasyon. </li><li> Kültür log fazı büyümesinde kadar 37 ° C&#39;de bir hafta süreyle statik koşullar altında inkübe edilir. </li><li> taze ortam 200 ml 10 ml kültür aktararak bakteri kültürü büyütmek. 20 ek inkübestatik koşullar altında gün. </li><li> x g, 2500, 15 dakika boyunca 50 ml&#39;lik santrifüj tüplerine ve santrifüj aktarın. </li><li> süpernatantlar atın ve artık hacmi bakteriyel pelletini. (- Tüp başına 15 10) her tüp steril 3 mm çaplı cam boncuklar ekle. </li><li> Vortex şiddetle sırayla 1 dakika boyunca bakteri kümeleri ayırmak için. Tween-80% 0.05 ile 10 ml PBS, her pelletini (h / h). </li><li> En büyük bakteriyel agrega ve cam boncuklar yerleşmek için izin 10 dakika tüpleri bırakın. </li><li> Tek bir yeni bir 50 ml&#39;lik santrifüj tüpüne (geri kazanılan son hacmi 38 mi), küçük kümeleri ve tek bir bakteri ve transfer birimleri ihtiva eden 4 tüplerinin her birinden süpernatan 9.5 ml yeniden elde. 400 x g&#39;de 10 dakika boyunca santrifüj. </li><li> % 15 bir son gliserol konsantrasyonunun elde edilmesi, tek bir taze 50-ml santrifüj tüpü içinde (esas olarak tek bir bakteri ihtiva eden) süpernatanın 35 ml yeniden elde etmek ve gliserol ile% 50 (h / h) 15 ml PBS ilave (h / h). </li><li> yavaşça karıştırınve dondurma için uygun tüplerde 1 ml alikotlar içinde dağıtın. -80 ° C&#39;de saklayın (bir çok yaklaşık 50 alikotları gliserol stok sağlar). </li><li> gliserol stokları ölçmek için, dondurma işleminin, bir gliserol gün çözülmesi ve PBS 900 ul ihtiva eden ayrı bir 1.5 ml tüpler içinde yedi ila on kat seri dilüsyonları gerçekleştirmek. </li><li> Levha 55 mm çapında Petri tabaklarına hazırlanan ADC,% 10 (h / h) ile desteklenmiş 7H10 katı agar ortamında 10, her seyreltme oranından 100 ul. </li><li> Dikkatle 3 mm çaplı cam boncuk (plaka başına yakl. 10) ekleyin ve hafifçe eşit agar plaka üzerinde hacmini dağıtmak için plakayı sallayın. boncuk atın ve parafilm agar plaka mühür. </li><li> 37 ° C&#39;de 21 gün boyunca inkübe tek koloniler doğru bir şekilde ayırt edilebilir seyreltiler halinde koloni oluşturan birimler (CFU) sayımı için bakteriyel konsantrasyonunu belirlemek. </li></ol> 2. Fare Aşılama <ol><li> Önceden sayısal BCG gliserol çözülme ve hazırlık PBS içinde seyreltinİki süspansiyonlardır. Hayvan başına doz dikkate son hacim hesaplayın deri altı uygulama için 100 ul (subkutan aşılama için ml başına 10 7 cfu) ve burun (intranazal aşılama için 2.5 x 10 7 CFU) 40 ml. </li><li> izofluran ve oksijen karışımı ile fareler anestezi kemirgenler için özel bir anestezi iş istasyonu kullanımı. Anestezi odasında fareler korumak için anestezi ve% 2 uyarmak için izofluran% 5 kullanın. (Diğer kabul anestezi yöntemi kullanılır). </li><li> Deri altına uygulama için bir aşı bakteriyel süspansiyon (10 7 cfu / ml), 1 ml bir 26 G iğne ile bir 1 ml şırınga doldurun. hava kabarcıklarını çıkarın. </li><li> Laminer akış kaput içinde yüzüstü pozisyonda düz bir yüzey üzerinde bir anestezi fare yerleştirin ve fare kanadını Deri altına aşı 100 ul (10 6 CFU / doz) geri aşılamak. kafes fare dönün ve prope sağlamak için monitörrly anestezi kurtarır. </li><li> Her fare idaresi arasında şırınga iğnesi değiştirin. Yukarıda açıklandığı gibi hava kabarcıkları kaldırıldı. </li><li> Burun içi uygulama için, kaput içinde yatar pozisyonda bir anestezi fare yerleştirin. </li><li> Bir mikropipet ile 2.5 x 10 7 CFU / ml süspansiyon 20 ul alır. Fare hacim nefes izin damla arasındaki süreyi bırakarak, aşı damla-by-damla tüm hacim tevdi kadar iki burun delikleri arasında koyun Not:. fareler, bu işlem sırasında solunum sıkıntısı muzdarip olabilir onlar bırakılmalıdır böylece mümkün olduğunca önlemek için bir sonraki yönetmek için önce her damla asimile. </li><li> Başka bir 20 ul mikropipet yeniden doldurmak ve işlemi tekrarlayın. Fare ilk aşılamadan sonra anestezi uyanmak başlarsa, önce ikinci bir anestezi odasına yerleştirin. kafes fare dönün ve düzgün kurtarır eminanesteziden. </li></ol> H37Rv Gerinim 3. Fare intranazal meydan <ol><li> önceden miktarı H37Rv gliserol çözülme ve ml başına 2500 CFU bakteriyel süspansiyon hazırlamak için PBS içinde seyreltin. hayvan başına doz dikkate son hacim hesaplayın 40 ul. </li><li> 2.5 açıklandığı gibi H37Rv intranazal inoküle - 2.7. Fare başına nihai meydan dozu 10 2 CFU / 40 ul. </li></ol> Akciğerler uyarılmış bağışıklık tepkisinin 4. Analizi <ol><li> Akciğer hücresel süspansiyon Not: akciğer aşıyla indüklenen adaptif bağışıklık tepkisinin değerlendirilmesi, tek bir hücre süspansiyonunun oluşturulmasını gerektirir. Bu amaç için, bu tür gentleMACS bir doku Dissociator kullanımı. <ol><li> servikal dislokasyon (ya da diğer kabul insani metodoloji) ile fare Kurban ve fare göz kırpma refleksinin yok onaylamak için gözü dokunmadan ölü olduğundan emin olun. </li><li> Laminer akış kaput içinde, l ayıklamakSteril makas ve forseps kullanarak ve temiz bir yüzeye koyun ungs. Temiz akciğerler trakea ve bağ dokusu çıkarılması ve (işleme kadar buz üzerinde muhafaza) PBS ile 1.5 ml tüp akciğerlere aktarın. </li><li> PH 7.4, 150 mM NaCI, 5 mM KCI, 1 mM MgCI2 ve 1.8 mM CaCl2, 10 mM HEPES-NaOH 5 ml içeren organ dissosiyasyon (Cı-ayıracı tüp) için uygun bir tüp içinde akciğerlere yerleştirin hücresel bir süspansiyon oluşturmak üzere tampon. </li><li> Kollajenaz D, 100 mg / ml 100 ul (2 mg / ml nihai konsantrasyon) ve DNase I 20,000 IU / ml, 40 ul (160 lU / ml nihai konsantrasyon ekleyin. Not: Kollajenaz D veya DNasel stok çözeltileri, sırasıyla, 2, 1 mM (h / h), 20 mM Tris-HCI pH 7.5 Y MgC liyofilize PBS enzimler ya da gliserol% 50 eritilerek hazırlanır. </li><li> Doku dissociator tüpü yerleştirin ve akciğer parçalanması için önceden tanımlanmış bir program m_lung_01 kullanın. 30 dakika için bir su banyosu içinde 37 ° C &#39;de tüp inkübe edin. </li><li> Yeri incie dissociator tüp ve tek hücre süspansiyonu içine tam akciğer homojenizasyon için önceden tanımlanmış bir program m_lung_02 kullanın. </li><li> 50 ml santrifüj tüpüne yerleştirilmiş bir 70-mikron naylon hücre süzgecinden hücresel süspansiyon geçirin. RPMI 1640 ortamı 10 ml süzgeç yıkayın. </li><li> Santrifüj hücreleri, 400 x g&#39;de 5 dakika boyunca ve supernatant atın. </li><li> , Tampon yokedici eritrositlerin 1 ml ilave edilir vorteks ile karıştırılır ve oda sıcaklığında 1 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 400 x g, 5 dakika boyunca RPMI 1640 ortamı, santrifüj hücreleri 10 ml. </li><li> tam RPMI 1640 ortamında 0.5 mL içinde süspanse hücreleri,% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal buzağı serumu (FCS), 2 mM L-Glutamın, 100 ug / mL streptomisin, 100 IU / ml penisilin ve 50 uM 2-merkaptoetanol desteklenmiştir. Not: FCS 30 dakika 56 ° C&#39;de inkübe edilerek inaktive edildi. </li><li> Hücrelerin sayısı ve 10 7 hücre / ml nihai hücre yoğunluğu ulaşmak için tam RPMI 1640 ortamı ilave edin. NOT: hücre sayımı için, otomatik hücre sayacı kullanmak. </li><li> U tabanlı, 96-çukurlu, steril plaka hücre süspansiyonu 100 ul dağıtma (10 6 hücre / oyuk). </li><li> Ticari H37Rv saflaştırılmış protein türevi 15 ug / ml (PPD) (5 ug / ml nihai konsantrasyon) ile desteklenmiş tam RPMI 1640 ortamı göz 50 ul / ekleyin. </li></ol></li><li> ELISA ile sitokin tespiti için supernatant toplanması <ol><li> 4.1.14 37 ° C&#39;de 48 saat% 5 CO2 plaka inkübe edin. </li><li> 5 400 x g&#39;de dakika ve süpernatant 100 ul kurtarmak için santrifüj plaka. </li><li> -80 ° C&#39;de saklayın. </li><li> sırasıyla IFNy için deney tamponu ve IL17A belirlenmesinde Üst fazlar, 1/10 ve 1/2 seyreltilir. üreticinin talimatlarına (ELISA Geliştirme kitleri) göre, ticari ELISA kitleri ile sitokin konsantrasyonları belirleyin. </li></ol></li><li> Sitokin tespiti için hücre içi boyamaAkış sitometrisi ile CD4 + üreten hücrelerde <ol><li> 4.1.14 37 ° C &#39;de, 18 saat ve% 5 CO2 plaka inkübe edin. </li><li> her bir (10 ug / ml son konsantrasyon) Brefeldin 1 mg / ml (DMSO içinde çözülmüş stok), 1.5 ul ekleyin ve altı saat daha inkübe edilir. </li><li> 3200 xg&#39;de 1 dakika boyunca 4.3.2 plaka santrifüj ve supernatant atın. </li><li> % 10 FCS (1/500) ile RPMI 1640 içinde seyreltilmiş anti-fare CD4-FITC, 50 ul ve yeniden süspanse hücreler 4 ° C&#39;de 10 dakika inkübe edilir. </li><li> , 3200 x g&#39;de 1 dakika boyunca 4.3.4 plaka santrifüj süpernatan atılır ve 100 ul / göz sabitleme çözeltisi ilave edilir. 20 dakika boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> permeabilizasyon solüsyonundan 150 ul / yıkama ile hücreler iki kez yıkanır. Not: 10x konsantre stok 1x çalışma çözeltisi hazırlamak için deiyonize su içinde seyreltilmiştir. </li><li> anti fare IFNy-APC, anti-fare IL17A-APC.Cy7 50 ul hücreleri tekrar permeabil içinde seyreltilmişleştirilmesi çözeltisi (1/250 hem antikorlar). </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. </li><li> permeabilizasyon solüsyonundan 150 ul / yıkama ile hücreler iki kez yıkanır. </li><li> Akış sitometri edinimi için PBS 200 ul yeniden süspanse hücreleri. </li></ol></li></ol> Bronchoalveolar Lavage immünglobulinlerin 5. Analizi (BAL) <ol><li> BAL örnekleri elde edilmesi <ol><li> servikal dislokasyon (ya da diğer kabul insani metodoloji) ile fare Kurban ve fare göz kırpma refleksinin yok onaylamak için gözü dokunmadan ölü olduğundan emin olun. </li><li> Emin tamamen çıkarılması için değil, yapım uygun hassas steril forseps ve makas kullanılarak trakea Açığa ve trakea küçük bir kesim yapmak. BAL örneği kontamine olabilir kanamaya neden özen gösterin. </li><li> trakea içine buz soğukluğunda PBS 800 ul steril 1 ml şırınga bağlı bir kanül tanıtılması. </li><li> PBS akciğer ve r yavaşça inoküleAkciğer çöküşü önlemek için çok yavaş şırınga en pistonu geri çekerek ecover BAL hacmi. NOT: 500 600 ul Kurtarma tatmin edicidir. </li><li> 1.5 ml tüp içine BAL hacmi aktarın ve bu kanın (işleme kadar buz üzerinde muhafaza) ile kontamine değil belirten BAL renksiz kalır onaylayın. </li><li> yeni bir tüpe 5 400 x g&#39;de dakika ve Süpernatant santrifüjleyin BAL örnekleri. </li><li> -80 ° C&#39;de saklayın süpernatantlar. </li></ol></li><li> BAL süpernatanlarında IgA Belirlenmesi Not: Kullanılan bütün ayıraçlar oda sıcaklığında yer almaktadır. <ol><li> M. (10 ug / ml) PBS içinde seyreltilmiş PPD 100 ul kat yüksek protein bağlanması polistiren düz tabanlı 96 oyuklu plakalar Tüberküloz özel IgA belirlenmesi, ya da toplam IgA belirlenmesi için PBS içinde 10 kez seyreltildi BAL yüzer 100 ul. </li><li> 4 ° C&#39;de bir gece boyunca inkübe edilir. </li><li> Süpernatantı atın ve d kağıt havlu üzerine plakayı dokununry. 200 ul / PBS kuyunun ile yıkayın. </li><li> 200 ul / gözenek bir sığır serum albümini (BSA) PBS-Tween-80% 0.05 (h / h) (bloke edici tampon) (ağ / hac)% 1 ile bloklayın. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. </li><li> 200 ul / PBS-Tween-80% 0.05 (h / h) (yıkama tampon maddesi) oyuk bir kez yıkayın. </li><li> PPD kaplı oyuklara içinde seyreltilmemiş BAL yüzer 100 ul ekle. Oda sıcaklığında iki saat inkübe edilir. NOT: Toplam IgA belirlenmesi PPD özgü IgA paralel olarak yapılır, Bu kuluçka sırasında 100 ul yıkama tamponu ile toplam IgA kuyu bırakın. </li><li> Yıkama buffer.0170004 200 ul / oyuk ile üç kez yıkayın </li><li> yaban turpu peroksidazı (HRP), 100 ul ekle tamponu (1 / 10,000) engelleme seyreltilmiş anti-fare IgA konjüge edilmiş. </li><li> 1 saat, oda sıcaklığı inkübe edin. </li><li> Yıkama tamponu, 200 | il / oyuk ile beş kez yıkayın. </li><li> 3,3, 100 ul / yuva ekleyin &#39;, 5,5&#39;-tetrametilbenzidin (TMB). t, oda sıcaklığında 20 dakika inkübeO karanlık. </li><li> 100 ul / kuyucuk H2 SO 4 0.5 N ekleyin. 450 nm bir dalga boyunda bir spektrofotometre plaka okuyun. </li></ol></li></ol> akciğerlerde 6. Bakteriyel yük belirlenmesi <ol><li> Akciğer homojenizasyon ve kaplama <ol><li> Dört hafta mücadeleden sonra, servikal dislokasyon (ya da diğer kabul insani metodoloji) ile fare feda ve fare göz kırpma refleksinin yok onaylamak için gözü dokunmadan ölü olduğundan emin olun. </li><li> Laminer akış kaput içinde düz ve dezenfekte yüzeyde sabit yatar pozisyonda fare yerleştirin. </li><li> bir kesi yapmak ve göğüs alanı görünür bırakmak için göğüs bölgesinden deri kaldırmak. </li><li> kaburga kesip ve steril makas ve forseps kullanarak akciğer ve kalp hasat. temiz bir yüzeye organları yerleştirin. </li><li> Kalp, trakea ve bağ dokusu kaldırarak akciğerler temizleyin ve iyonu giderilmiş su, 1 ml ile 1.5 ml tüp akciğerlere aktarmak(Işleme kadar buz üzerinde muhafaza). </li><li> iyonu giderilmiş su, 1 ml ihtiva eden, - (Ayıraç tüpü M), organ homojenizasyon için uygun bir tüp içine, her bir fare akciğerlerine aktarmak için steril forseps kullanın. </li><li> Doku dissociator tüpü yerleştirin ve akciğerleri homojenleştirme önceden tanımlanmış bir program RNA_1 kullanın. </li><li> 900 ul seyreltilmiş, akciğer homojenatı, 100 ul ile başlayarak, 1.5 ml tüpler içinde beş ila on kat seri dilüsyonları yapılır. </li><li> Levha seyreltileri 1.11-1.14 tarif edildiği gibi. </li></ol></li><li> PCR ile BCG ve H37Rv arasındaki farklılaşma NOT: burun içi yoldan BCG ile aşılanmış grubuna karşılık gelen 6.1.6 den plakalar, biz CFU aşı haiz koruyucu etkinliği geldi değerlendirmek için düşünülen sağlamak için BCG ve H37Rv arasında bir seçici PCR ile kolonilerin temsili bir dizi analiz benzersiz H37Rv için. RD9 Bu PCR hedefleri büyütme, BCG ve M. tu farklı bir genomik bölgetüberküloz, H37Rv için 2618 bp&#39;lik ve BCG 11 465 bp&#39;lik bir fragmanı verir. <ol><li> PCR tüpleri (9 ul / numune) dağıtmak sonra belirtilen numune başına hacimleri ile tüm örnekler için bir master miks stok hazırlayın ve. NOT: Tampon 5x: 2 ul. İleri primer 25 uM (GTGTAGGTCAGCCCCATCC): Taq polimeraz, ul 5 birimleri / 0.32 ul: 0.32 ul astar 25 mcM (GCCCAACAGCTCGACATC) Ters 0.04 ul, Deiyonize H 2 O: 6,32 ul. </li><li> steril bir kürdan ile bir koloni dokunun ve ana karışımı içeren bir PCR tüpünde numune ile kürdan batırın. </li><li> Aşağıdaki programı ile PCR çalışması: 10 dak 95 ° C (bu adım bakteriyel bozulma tetiklemek için), 10 dakika 95 ° C, 1 dakika, 95 ° C &#39;de 35 döngü (30 saniye (bu adım bakteriyel bozulma tetiklemek için) 58 ° C ve 4 dakika 72 ° C&#39;de). </li><li> parçaları görselleştirmek için etidyum bromür ve çalışma örnekleri ile% 1 agaroz jel PCR örnekleri yükleyin. </li&gt; </ol></li></ol>

<ol><li>Zumla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+WHO+2014+global+tuberculosis+report--further+to+go%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Glob+Health%22%5BJournal%5D)">The WHO 2014 global tuberculosis report--further to go.</a> Lancet Glob Health. 3 (1), e10-e12 (2015).</li>
<li>Mangtani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+by+BCG+vaccine+against+tuberculosis%3A+a+systematic+review+of+randomized+controlled+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Protection by BCG vaccine against tuberculosis: a systematic review of randomized controlled trials.</a> Clin Infect Dis. 58 (4), 470-480 (2014).</li>
<li>Aguilo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+Mycobacterium+bovis+BCG+vaccination+confers+dose-dependent+superior+protection+compared+to+that+of+subcutaneous+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Pulmonary Mycobacterium bovis BCG vaccination confers dose-dependent superior protection compared to that of subcutaneous vaccination.</a> Clin Vaccine Immunol. 21 (4), 594-597 (2014).</li>
<li>Chen, L., Wang, J., Zganiacz, A., Xing, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+intranasal+mucosal+Mycobacterium+bovis+BCG+vaccination+confers+improved+protection+compared+to+subcutaneous+vaccination+against+pulmonary+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Single intranasal mucosal Mycobacterium bovis BCG vaccination confers improved protection compared to subcutaneous vaccination against pulmonary tuberculosis.</a> Infect Immun. 72 (1), 238-246 (2004).</li>
<li>Giri, P. K., Verma, I., Khuller, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+efficacy+of+intranasal+vaccination+with+Mycobacterium+bovis+BCG+against+airway+Mycobacterium+tuberculosis+challenge+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect%22%5BJournal%5D)">Protective efficacy of intranasal vaccination with Mycobacterium bovis BCG against airway Mycobacterium tuberculosis challenge in mice.</a> J Infect. 53 (5), 350-356 (2006).</li>
<li>Lagranderie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCG-induced+protection+in+guinea+pigs+vaccinated+and+challenged+via+the+respiratory+route%5BTitle%5D)+AND+%22Tuber+Lung+Dis%22%5BJournal%5D)">BCG-induced protection in guinea pigs vaccinated and challenged via the respiratory route.</a> Tuber Lung Dis. 74 (1), 38-46 (1993).</li>
<li>Gopal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-17-dependent+CXCL13+mediates+mucosal+vaccine-induced+immunity+against+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Interleukin-17-dependent CXCL13 mediates mucosal vaccine-induced immunity against tuberculosis.</a> Mucosal Immunol. 6 (5), 972-984 (2013).</li>
<li>Khader, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-23+and+IL-17+in+the+establishment+of+protective+pulmonary+CD4%2B+T+cell+responses+after+vaccination+and+during+Mycobacterium+tuberculosis+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-23 and IL-17 in the establishment of protective pulmonary CD4+ T cell responses after vaccination and during Mycobacterium tuberculosis challenge.</a> Nat Immunol. 8 (4), 369-377 (2007).</li>
<li>Aguilo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+but+Not+Subcutaneous+Delivery+of+BCG+Vaccine+Confers+Protection+to+Tuberculosis-Susceptible+Mice+by+an+Interleukin+17-Dependent+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Pulmonary but Not Subcutaneous Delivery of BCG Vaccine Confers Protection to Tuberculosis-Susceptible Mice by an Interleukin 17-Dependent Mechanism.</a> J Infect Dis. , (2015).</li>
<li>Middlebrook, G., Cohn, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriology+of+tuberculosis%3A+laboratory+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Public+Health+Nations+Health%22%5BJournal%5D)">Bacteriology of tuberculosis: laboratory methods.</a> Am J Public Health Nations Health. 48 (7), 844-853 (1958).</li>
<li>Brosch, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+evolutionary+scenario+for+the+Mycobacterium+tuberculosis+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A new evolutionary scenario for the Mycobacterium tuberculosis complex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (6), 3684-3689 (2002).</li>
<li>Kaushal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+vaccination+with+attenuated+Mycobacterium+tuberculosis+induces+strong+central+memory+responses+and+protects+against+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mucosal vaccination with attenuated Mycobacterium tuberculosis induces strong central memory responses and protects against tuberculosis.</a> Nat Commun. 6, 8533(2015).</li>
<li>Lochhead, J. J., Thorne, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+delivery+of+biologics+to+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Intranasal delivery of biologics to the central nervous system.</a> Adv Drug Deliv Rev. 64 (7), 614-628 (2012).</li>
<li>Lochhead, J. J., Wolak, D. J., Pizzo, M. E., Thorne, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+transport+within+cerebral+perivascular+spaces+underlies+widespread+tracer+distribution+in+the+brain+after+intranasal+administration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Rapid transport within cerebral perivascular spaces underlies widespread tracer distribution in the brain after intranasal administration.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 35 (3), 371-381 (2015).</li>
<li>Griffiths, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholera+toxin+enhances+vaccine-induced+protection+against+Mycobacterium+tuberculosis+challenge+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cholera toxin enhances vaccine-induced protection against Mycobacterium tuberculosis challenge in mice.</a> PLoS One. 8 (10), e78312(2013).</li>
<li>Hirota, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+Th17+cells+in+Peyer%27s+patches+is+responsible+for+the+induction+of+T+cell-dependent+IgA+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of Th17 cells in Peyer's patches is responsible for the induction of T cell-dependent IgA responses.</a> Nat Immunol. 14 (4), 372-379 (2013).</li>
<li>Jaffar, Z., Ferrini, M. E., Herritt, L. A., Roberts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+lung+mucosal+Th17-mediated+responses+induce+polymeric+Ig+receptor+expression+by+the+airway+epithelium+and+elevate+secretory+IgA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: lung mucosal Th17-mediated responses induce polymeric Ig receptor expression by the airway epithelium and elevate secretory IgA levels.</a> J Immunol. 182 (8), 4507-4511 (2009).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Tüberküloza karşı mevcut aşı olan BCG, tarihte en yaygın uygulanan aşı olmasına rağmen, tüberküloz dünya çapında bulaşıcı hastalıklardan kaynaklanan ölüm ve morbiditenin önde gelen nedenlerinden biri olmaya devam etmektedir. Bu paradoks, bu aşının sorumlu bulaşma şekli olan akciğer tüberkülozuna karşı korunmaması ile açıklanmaktadır. Hastalığın pulmoner formlarına karşı etkili yeni aşılama yaklaşımlarına, küresel olarak hastalık bulaşması üzerinde en büyük etkiye sahip olacakları için acilen ihtiyaç vardır.
<p class=...

Tüberküloz (TB) TB endişe verici küresel bir sağlık sorunudur 1 yapan dünyada HIV fazla ilişkili ölümüne yol önde gelen bulaşıcı hastalıklardan biri olan ve çoklu ilaç dirençli suşlar yükselen artış ile birlikte olduğunu. Yeni tanı araçları, daha etkili ve daha az toksik ilaçlar ve yeni, güvenli ve etkili bir TB aşıları özellikle gelişmekte olan ülkelerde, acil ihtiyaç vardır. zayıflatılmış Basil Calmette-Guerin (BCG) şu anda dünya çapında 1970&#39;lerden beri doğumda intradermal tatbik edilmiştir TB, karşı tek lisanslı aşı edilir. BCG çocuklarda hastalık (menenjit ve miliyer TB) şiddetli formları önlemede etkili kabul edilir, ancak hastalık bulaşma 2 sorumlu akciğer TB karşı tutarsız etkinlik göstermiştir. TB enfeksiyonunun doğal yolunu taklit Pulmoner aşılama, yerel ana bağışıklık yanıtını emişli için cazip bir yaklaşımı temsil etmektedirs. Deri altı veya deri içi yoldan 3-6 ile karşılaştırıldığında, bu bağlamda, farklı alakalı TBC hayvan modellerinde çeşitli klinik öncesi işleri pulmoner immünizasyondan sonra daha fazla aşı etkinliğini göstermiştir. Bununla birlikte, pulmoner aşılama aracılığı ile ortaya koruyucu mekanizmalar tam olarak anlaşılmış değildir. Son yıllarda, birçok eserler IL17 mukozal aşı kaynaklı koruyucu etkinliği için yoksun fare modellerinde olduğu gibi, TB-spesifik mukozal bağışıklık yanıtının önemli bir faktör olarak IL17 aracılı tepki doğru çekmişlerdir 7,8 bozulur. Yakın zamanda BCG DBA / 2 fareleri, deri altından BCG aşısı sonra 9 koruma eksikliği ile karakterize edilen, bir fare türü korumalı intranazal ilk kez ortaya koymuştur. Bu sonuçlar solunum TB aşı intradermal BCG pulmon karşı etkisiz olarak kabul edilir endemik ülkelerde TB oranının azaltılmasında daha etkili olabileceğini öne sürdüli TB.

<table><tbody><tr><td>Middlebrook 7H9 et suyu</td><td>BD</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook ADC Zenginleştirme</td><td>BD</td><td>211887</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Scharlau</td><td>TW00800250</td><td></td></tr><tr><td>3 mm çaplı Cam</td><td>Boncuklar Scharlau</td><td>038-138003</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H10 Agar</td><td>BD</td><td>262710</td><td></td></tr><tr><td>1 ml şırınga 26GA 0,45 x 10 mm</td><td>BD</td><td>301358</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS ayrıştırıcı</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>C tüpler</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>M tüpler</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz D</td><td>Roche</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Applichem</td><td>A3778,0100</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70 &mikro; m Hücre Süzgeci</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>Kırmızı Kan Hücresi Parçalama Tamponu</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Takviyesi</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100x konsantre</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin Çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>100x konsantre</td></tr><tr><td>Fetal Buzağı Serumu</td><td>Biyolojik Endüstriler</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Asa 2.0 El Tipi Otomatik Hücre Sayacı</td><td>Millipore</td><td>PHCC20040</td><td></td></tr><tr><td>Scepter Hücre Sayacı Sensörleri, 40 & m</td><td>Millipore</td><td>PHCC40050</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium Tuberculosis - Tüberkülin PPD</td><td>Statens Serum Institut (SSI)</td><td>2390</td><td></td></tr><tr><td>Fare IFN-&gama; ELISA geliştirme kiti&nbsp;</td><td>Mabtech</td><td>3321-1H</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL17A ELISA geliştirme kiti&nbsp;</td><td>Mabtech</td><td>3521-1H</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651</td><td></td></tr><tr><td>FITC Sıçan Anti-Fare CD4</td><td>BD</td><td>553047</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix / Cytoperm Kiti</td><td>BD</td><td>555028</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 Sıçan Anti-fare IL-17A</td><td>BD</td><td>560821</td><td></td></tr><tr><td>APC Fare Anti-fare IFNg</td><td>BD</td><td>554413</td><td></td></tr><tr><td>LAKRYMAL ZEYTİN LUER KİLİT 0.60 x 30 mm. 23G x 1 1/4 inç</td><td>UNIMED</td><td>27.134</td> BAL yüksek proteinli bağlayıcı polistiren düz tabanlı 96 oyuklu plakalar <td>için trakea kanülü olarak kullanılır</td></tr><tr><td>MAXISORP</td><td>NUNC</td><td>430341</td><td></td></tr><tr><td>Albümin, sığır serumundan</td><td>Sigma</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Keçi Anti-Fare IgA (&alfa;-zincire özgü)&eksi; Peroksidaz antikoru</td><td>Sigma</td><td>A4789</td><td></td></tr><tr><td>3,3&asal;,5,5&prime;-Tetrametilbenzidin (TMB)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T0440</td><td></td></tr><tr><td>MyTaq DNA Polimeraz</td><td>Bioline</td><td>BIO-21107</td><td>Kit, Tampon 5x İçerir</td></tr></tbody></table>

koruyucu etkinliği ve pulmoner bağışıklık tepkisi fare subkutan ve burun bcg İdaresi ardından

Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

İntradermal BCG aşılamasının küresel kapsamına rağmen, tüberküloz dünyadaki en yaygın bulaşıcı hastalıklardan biri olmaya devam etmektedir. Klinik öncesi veriler, akciğer tüberkülozu aşılarını, bulaşmadan sorumlu olan akciğer hastalığını önlemek için umut verici bir strateji olarak teşvik etmiştir. Bu çalışmada, fare modelinde intranazal BCG aşılamasının deri altı ile karşılaştırıldığında faydalarını göstermek için kullanılan metodolojiyi açıklıyoruz. Verilerimiz, intranazal BCG uygulamasını takiben daha fazla koruyucu etkinlik göstermiştir. Ek olarak, sonuçlarımız pulmoner aşılamanın akciğerlerde Th1 ve Th17 yanıtları dahil olmak üzere daha yüksek bir bağışıklık tepkisini tetiklediğini ve ayrıca solunum solunum yollarında immünoglobulin A (IgA) konsantrasyonunda bir artışı tetiklediğini göstermektedir. Verilerimiz, Mycobacterium tuberculosis tehdidi sonrası akciğerlerde koruyucu etkinlik ile IL17 üreten hücrelerin varlığı arasındaki ilişkiyi göstermektedir ve bu sitokinin pulmoner aşılamanın sağladığı koruyucu yanıtta bir rol oynadığını düşündürmektedir. Son olarak, fare modelinde solunum yolu aşılamasını incelemek için geliştirdiğimiz, BCG dışındaki diğer tüberküloz aşılarına da tahmin edilebilen, mukozal yanıtı veya intratrakeal veya aerosol gibi diğer pulmoner uygulama yollarını hedefleyen küresel iş akışını detaylandırıyoruz.

deri altı ve burun içi: Bu çalışma, BCG iki uygulama yollarının karşılaştırmasını tarif eder. Subkutan rota dünya çapında BCG için geçerli klinik rota intradermal, karşılaştırılabilir. Aşının burun içinden yol M. enfeksiyonunun doğal yolunu taklit amaçlar amaç tüberküloz, akciğerlerde, doğrudan bu patojenin başlıca hedef organ immün tepkisini indüklemek için. Şekil 1 takip iş akışını açıklar....

Burada, fare modelinde BCG ile intranazal ve subkutan bağışıklamanın neden olduğu koruyucu etkinliği ve akciğer immün yanıtını karşılaştırmak için izlenen metodolojiyi detaylandırıyoruz. Sonuçlarımız, pulmoner aşılamanın faydalarını göstermekte ve aşı kaynaklı korumada IL17 aracılı yanıtın rolünü önermektedir.

Koruyucu etkinliği ve Pulmoner Bağışıklık Tepkisi Fare Subkutan ve Burun BCG İdaresi ardından

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

Bu prosedürün genel amacı, intranazal bir challenge'a karşı aşının koruyucu etkinliği ve aşı ile indüklenen lokal akciğer immün yanıtı da dahil olmak üzere, tüberküloz immünizasyonu sonrası akciğerlerdeki immün yanıtları incelemektir. Bu metodoloji, optimal akciğer immün koruması için pulmoner aşılar tarafından tetiklenen savunmacı akciğer immün yanıtlarının belirlenmesi de dahil olmak üzere, tüberküloz aşısı alanındaki temel sorularımıza yanıt vermeye yardımcı olabilir. Bu metodolojinin bir avantajı, hayvanlardan elde edilen akciğer immün yanıtının, koruyucu etkinlik ile paralel olarak bireysel olarak değerlendirilmesidir.koruma ile ilişkili spesifik immün parametrelerin belirlenmesine olanak tanır. BCG aşısının deri altı uygulaması için, öncelikle 26 gauge iğne uçlu bir mililitrelik şırıngayı bir mililitre BCG aşı süspansiyonu ile doldurun ve hava kabarcıklarını giderin. Ardından, anestezi uygulanmış bir fareyi Laminar akışlı kabin içerisinde pron pozisyonda yerleştirin ve hayvanın arka flank bölgesine deri altı yoluyla 100 µL bakteri inoküle edin.İntranazal uygulama için, bir mikro-pipete 20 µL BCG süspansiyonu çekin ve anestezi altındaki fareyi kapüşon içinde sırt üstü pozisyon

protective-efficacy-pulmonary-immune-response-following-subcutaneous

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, farelerde Bordetella pertussis enfeksiyonuna karşı aselüler boğmaca aşısının etkinliğini test etmek için bir protokol açıklıyoruz. Aşılamadan sonra, fareler enfeksiyona maruz bırakıldı ve doku homojenatları, aşının neden olduğu koruyucu bağışıklığın bir okuması olarak bakteri kolonilerini analiz etmek için kültürlendi.

Bir fare modelinde bakteriyel enfeksiyona karşı aşı ile indüklenen bağışıklığın değerlendirilmesi

Bu video, farelerde intranazal BCG bağışıklamasını gösterir, hem doğuştan gelen hem de adaptif bağışıklık tepkilerini aktive eder, akciğerde yerleşik bellek T hücrelerinin ve efektör B hücrelerinin gelişmesine yol açar ve böylece Mycobacterium enfeksiyonlarına karşı korumayı artırır.

Bir Fare Modelinde BCG ile İntranazal Bağışıklama

Profilaktik ve terapötik aşılama çoğu zaman düğümleri ve bağışıklık hücrelerinin dolayısıyla kötü katılımını lenf nedeniyle aşının hafta drenaj güçlü bağışıklık tepkilerini uyarmak için başarısız olur. Lenf düğümlerine aşı doğrudan enjeksiyon ile, sözde lenf sistemi içi enjeksiyon, aşı etkinliği güçlü geliştirilebilir ve aşı doz azaltılabilir.

Fare intralenfatik immünoterapi ve Aşılama

Bu çalışma, farelerde akut pnömokok pnömonisine karşı koruma sağlamak için akciğerlerde doğuştan gelen bağışıklık tepkisini artırmak için dil altı immünoterapisinin kullanılmasının rahatlığını göstermektedir.

Alternatifi olarak dilaltı immünoterapi Akut Solunum Enfeksiyonları Karşı Koruma tetikleyebilecek

Uzun süreli kültürlenmiş interferon-γ enzime bağlı immünospot deneyi merkezi bellek tepkilerinin bir ölçüsü olarak kullanılır ve koruyucu, anti-mikobakteriyel aşı cevabı ile bağıntılı olduğu ortaya konmaktadır. Bu testte, periferal kan tek-çekirdekli hücreleri, mikobakteriyel antijenlerin ve interlökin-2, 14 gün için, etkinleştirme farklılaşma ve merkezi bellek T hücrelerinin genişlemesi ile stimüle edilir.

Sığırlarda Efektör ve hafıza T Hücre Yanıtları değerlendirilmesi için uzun vadeli kültürlü İnterferon-γ Enzim-linked immünospot Testi Uygulaması

Bakteriyel bir yüzey hızlı antijen görüntülemek için yeni bir teknik olan yüzey biotinylation proteinler füzyon monomeric avidin ile ilgi maruz takip içerir sunulur. BCG seçili antijenleri ile başarıyla yükleme yüzey dekorasyon geleneksel genetik yaklaşımlar yerine düşündüren onun immünojenisite geliştirir.

Eksojen antijenleri Mycobacterium bovis BCG aşısı Avidin-biotin sistemi ile sigara genetik yüzey dekorasyon ile ifade

İnterferon-gamma ELISpot tahlil için eskiden şiling şimdi domuz PBMCs gelişimi bulaşıcı hastalıklar çalışmak için son derece alakalı bu modelde T hücreli yanıt karakterizasyonu sağlar. DNA aşıları intradermal teslimatla ilişkili T hücre yanıtları ölçmek için tahlil başvurdum.

En iyi duruma getirilmiş Interferon-gamma ELISpot tahlil ölçü birimi T hücre yanıtları sonrasi hipererjik eskiden şiling şimdi domuz modelinde

Burada etkinliği ve ana bilgisayar bağışıklık yanıtı aşı vivo içinde değerlendirilmesi için zarif bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralı eğitim viral, bakteriyel aşı modelleri veya paraziter patojenler için adapte edilebilir.

Ana bilgisayar-patojen yanıt ve aşı etkinliği farelerde değerlendirilmesi

Bu protokol, Mycobacterium smegmatis'in (Msm) aksenik kültürlerinden doğal mikobakteriyel hücre dışı veziküllerin (mEV'ler) zenginleştirilmesini ve mCherry (kırmızı floresan raportör) içeren rekombinant MsmEV'lerin nasıl tasarlanabileceğini ve zenginleştirilebileceğini detaylandırır. Son olarak, Mycobacterium tuberculosis'in EsxA proteinini içeren MsmEV'lerin zenginleştirilmesiyle yeni yaklaşımı doğrulamaktadır.

Mikobakterilerin Doğal ve Rekombinant Hücre Dışı Veziküllerinin Zenginleştirilmesi

Burada, C57BL/6 farelerde deneysel otoimmün ensefalomiyeliti aktif olarak indüklemek için alternatif bir protokol sunuyoruz, ısıyla öldürülen Mycobacterium avium alt türü paratüberkülozu içeren tamamlanmamış Freund adjuvanında asılı duran immünojenik epitop miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG)35-55'i kullanıyoruz.

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Sırasında Otoantijenlerin İmmünojenitesinin Arttırılmasında Mycobacterium Paratuberculosis'in Adjuvan Aktivitesi

Koloni oluşturan birimlerin (CFU) belirlenmesi, görünür koloniler oluşturması haftalar sürebilen Mycobacterium tuberculosis de dahil olmak üzere bakterilerin miktarını belirlemek için altın standart tekniktir. Burada, artan zaman verimliliği, azaltılmış laboratuvar alanı ve reaktif maliyeti ve orta ve yüksek verimli deneylere ölçeklenebilirlik ile CFU belirleme için bir mikro-CFU'yu açıklıyoruz.

Tüberküloza Karşı Aşıların Etkinlik Değerlendirmesi için Mikro Koloni Oluşturan Birim Testi

Keşfedin fare modelinde burun içi ve deri altı BCG aşılamasının koruyucu etkinliğini ve akciğer bağışıklık yanıtlarını. Bu yöntem, tüberküloza karşı IL17 aracılıklı immün parametreleri belirlemeye yardımcı olur.

Koruyucu etkinliği ve Pulmoner Bağışıklık Tepkisi Fare Subkutan ve Burun BCG İdaresi ardından

Daha fazla video keşfet