F9 NADİR-LacZ Hücre tabanlı Muhabir Test kullanma E8.5 Embriyolar ve Neurosphere Kültürleri Bağıl Retinoik Asit Düzeylerinin Kantitatif Ölçümü

Bu prosedürün genel amacı, hücre tabanlı bir raporlayıcı analiz kullanarak E8.5 fare embriyoları veya yetişkin nörosfer kültürleri gibi doku preparasyonlarındaki bağıl retinoik asit seviyelerini kantitatif olarak ölçmektir. RA sinyal yolu iyi tanımlanmış olsa da, RA'nın doğrudan histolojik ölçümü teknik olarak mümkün değildir. Bu analiz, genetik mutasyonların RA seviyelerini nasıl etkileyebileceğine dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, çeşitli doku örneklerindeki geniş bir RA konsantrasyon aralığını ölçebilme yeteneğiyle oldukça hassas ve çok yönlü olmasıdır. Bu yöntem, çeşitli doku örneklerindeki RA seviyelerinin belirlenmesine yönelik doğrudan bilgi sağlayabildiği gibi, RA seviyelerindeki değişimleri izleyerek RA metabolik enzimlerinin varlığını veya yokluğunu belirlemek gibi diğer çalışmalara da uygulanabilir. Herhangi bir deneye başlamadan önce, F9 RARE-LacZ hücrelerinin RA'ya verdiği yanıtı test edin. 96 kuyucuklu plakaya ekilmiş F9 RARE-LacZ hücrelerine bir nanomolar all-trans RA ekleyin.

Ardından, plakayı inkübe edin ve 37 °C'de gece boyunca kültüre edin. Ertesi gün LacZ boyaması gerçekleştirin ve hücrelerde mavi çökelek olup olmadığını kontrol edin. Eğer renk hücreler genelinde homojen değilse, hücreleri subclonlama işlemine geçin.

Seçilen kültürleri, her 10 mililitrede 100.000 hücre olacak şekilde 10 santimetrelik kaplara bölüştürün. İki günlük kültürleme süresinin ardından, her kuyucuğuna 500 mikrolitre %0,2 jelatin içeren 24 kuyucuklu bir plaka hazırlayın ve plakayı 30 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin. Ardından jelatini uzaklaştırın ve kuyucukları 500 mikrolitre distile su ile iki kez durulayın.

Şimdi, kuyucuklara 500 µL F9 RARE-LacZ hücre kültür ortamı ekleyin. Ardından, steril bir P10 pipet ucu kullanarak F9 hücre kolonilerini seçin ve her birini bir kuyucuğa aktarın. Üç veya dört günlük kültürleme süresinden sonra, kolonileri iki adet jelatin kaplı 24 kuyucuklu plakaya, biri test etmek diğeri ise çoğaltmak için bölün.

İki günlük daha kültürlemeden sonra, bir adet 24 kuyucuklu plakanın her kuyucuğuna bir nanomolar RA ekleyin ve gece boyunca kültüre edin. Ertesi gün, yüksek yanıt verenleri test etmek için LacZ boyaması gerçekleştirin ve ilgili kültürü genişletin. E8.5 embriyolarının hasadından veya nörosferlerin disosyasyonundan bir gün önce, 96 kuyucuklu bir plakayı her kuyucuk için 100 µL %0,2 jelatin ile kaplayın ve plakayı 30 dakika boyunca bekletin.

Ardından, jelatini aspire edin ve kuyucukları 200 microliter distile su ile iki kez durulayın. Sonrasında, 10 centimeter kaplarda tutulan seçilmiş F9 RARE-LacZ hücrelerini tripsinizleyin. Daha sonra, G418 içermeyen kültür ortamı kullanarak 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna 100, 000 hücre ekin.

Her bir embriyoyule birlikte kültürlemek için yeterli sayıda kuyucuk doldurun veya nörosferlerle çalışıyorsanız genotip başına üç kuyucuk hazırlayın. Ayrıca standart eğri için 24 kuyucuk hazırlayın. Ardından, plakayı 24 saat boyunca inkübe edin.

Embriyonik hücre ko-kültürü için, E8.5 embriyolarının diseksiyonuna başlayın. Ardından, yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe 10 mikrolitre tripsin ekleyin ve geniş ağızlı P20 pipet ucu kullanarak tüm embriyoyu tüpe aktarıp tüpü buza yerleştirin. Tüm embriyolar izole edildikten sonra, dokuları ayrıştırmak için tüm tüpleri 37 derece Celsius'ta beş dakika inkübe edin.

Beş dakika sonra, her tüpün içeriğini bir P20 pipet ucuyla nazikçe tritüre edin ve 10 µL'yi F9 RARE-LacZ hücrelerinin bulunduğu hazırlanmış 96 kuyucuklu plakanın bir kuyucuğuna aktarın. Plakayı gece boyunca kültüre edin. Nörosfer ko-kültürleri için, bir nörosfer kültürünü 15 mL'lik tüplere aktararak başlayın.

Tüpleri 200 g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantın bir mililitresi hariç tamamını uzaklaştırın. Ardından, içeriği bir P1000 pipetle tritüre edin. Şimdi, ayrışmış hücrelerin yoğunluğunu belirlemek için küçük bir hacim kullanın.

Ardından, 100.000 disosiye nörosfer hücresini F9 RARE-LacZ hücrelerinin üzerine ekleyin. Her nörosfer kültür tipinden üç kuyucuğa yükleme yapın. Şimdi, standart eğri için kuyucukları hazırladığınızdan emin olun.

Üç paralel şeklinde, F9 RARE-LacZ kültür ortamında yedi farklı konsantrasyonda seri dilüsyon ile hazırlanan 100 µL all-trans RA çözeltilerini ekleyin. İşlem görmemiş hücrelerden oluşan negatif kontrolleri dahil edin. Son olarak, tamamen doldurulmuş 96 kuyucuklu plakayı gece boyunca kültüre edin.

Ertesi gün, besiyerini uzaklaştırın ve kuyuk başına 100 µL %2,5 glutaraldehit kullanarak kültürleri fikse edin. Plakayı oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Daha sonra, fiksatif maddesini uzaklaştırın ve kuyukları, yıkama başına 10 dakika boyunca 200 µL PBS ile iki kez yıkayın.

Ardından, kuyucukları her yıkama için 10 dakika boyunca 200 µL LacZ yıkama solüsyonu ile üç kez yıkayın. Üçüncü yıkama sırasında, folyoya sarılmış 15 mL'lik bir tüp içerisinde X-gal boyama solüsyonunu hazırlayın. Ayrıca, 96 kuyucuklu plaka için nemlendirilmiş bir hazne hazırlayın.

Şimdi, her kuyucuğa 200 µL X-gal boyama çözeltisi ekleyin. Plakayı nemlendirilmiş hazneye yerleştirin ve 37 °C'de inkübe edin. İnkübasyonun ardından, LacZ boyama çözeltisini uzaklaştırın ve yerine 200 µL PBS ekleyin.

Ardından, 610 nanometrede absorbansı ölçün ve plakanın görüntüsünü alın. F9 RARE-LacZ raporlayıcı hücre hattı, RA'ya beta-galaktosidazın orantılı bir indüksiyonu ile kantitatif olarak yanıt veren aderent embriyonik karsinoma hücrelerinden oluşur. Bu hücreler aynı zamanda epitelyal bir morfolojiye sahiptir.

G418 seçilimi ile kültüre edilmelerine rağmen, bu hücrelerin RA'ya verdiği yanıt birkaç pasaj sonra zayıflayacaktır. Bu nedenle, RA'ya karşı güçlü ve homojen yanıt veren hücrelerin sağlanması için periyodik subklonlama gereklidir. Gpr161'deki vl mutasyonu için homozigot olan E8.5 embriyolarının, azalmış embriyonik RA sinyali göstermesi beklenmektedir. Disosiye edilmiş embriyoların F9 RARE-LacZ hücreleri ile gerçekleştirilen bu tanımlanmış ko-kültür testi kullanılarak bu beklenti doğrulanmıştır.

Nörosfer kültürlerindeki RA'yı test etmek için vahşi tip yetişkin türevli nörosferlerin F9 RARE-LacZ hücreleri ile ko-kültürü de kullanılmıştır. E8.5 evresi hücrelerine kıyasla görülen artan boyanma, nörosfer kültürlerinin homojenliğinden kaynaklanıyor olabilir. RA seviyeleri için bir standart eğri oluşturularak, RA seviyesi vahşi tip nörosfer kültürlerinde ve E8.5 embriyolarında ölçülebilir hale getirilmiştir.

Bu prosedürü uygularken, RA'ya güçlü yanıt veren F9 RARE-LacZ hücrelerini periyodik alt klonlama yoluyla sürdürmeyi unutmayın. Ayrıca, homojen dağılımı ve tutarlı RA ölçümünü kolaylaştırmak için örneğinizi iyice ayrıştırdığınızdan emin olun. Bu prosedürün ardından, genetik mutasyonların RA seviyeleri üzerindeki etkileri incelenebilir ve daha sonra RA sinyal yolağının hangi bileşenlerinin doğrudan etkilendiğini araştırmak için diğer yöntemler uygulanabilir.