mikroakışkan Probe ile Canlı Hücre Katmanlar hızlı Subtractive Desenlendirme

Bu video makalesinde sunulan yöntemin birincil amacı, hücreden hücreye etkileşimlerin yerinde uzay-zamansal analizini kolaylaştırmak için uzamsal olarak tanımlanmış hücre modellerini hızlı bir şekilde oluşturmaktır. Sunulan strateji, mikroakışkan prob teknolojisinden yararlanmaktadır. Mikrofabrikasyon prob kafası, hücre tek katmanlarını modellemek için biyolojik substratlar üzerinde nanolitre hacimlerde biyokimyasalları lokalize eder.

MFP tabanlı bir desenleme tekniğinin ana avantajı, yerel lizis sayesinde neredeyse anlık olması ve oluşturulacak desenlerin gerçek zamanlı olarak değiştirilmesine izin vermesidir. Bu yöntem için ilk olarak, hücre kalıpları oluşturmak için diğer yöntemlerin, hücre kalıplarının başarısını görmeden önce uzun, çok adımlı protokoller gerektirdiğini fark ettiğimizde aklımıza geldi. Bir hücre yüzeyinde hidrodinamik akış hapsi ile kararlı deneyler yapmak için MFP parametrelerinin optimize edilmesi gerekir.

Bu amaçla, görsel gösteri kritik öneme sahiptir. Aditya Kashyap ve Julien Cors bu prosedürü gösterecekler. Platformun operasyonel modülleri motorlu şırıngalar, motorlu tablalar ve bir kontrolörden oluşur.

MFP, kafa ile alt tabaka arasındaki boşluk mesafesini kontrol etmek için motorlu bir Z-kademesine bağlanır ve alt tabaka tutucu, tarama sistemini oluşturan X ve Y motorlu kademelere bağlanır. MFP kafası, pompa istasyonuna bağlanmak için akışkan yollara, kafayı Z aşamasına monte etmek için montaj deliklerine ve cilalı tepeden çıkan kanallara sahiptir. Apeks, hücre kültürü substratına eş düzlemli olarak ayarlanır.

Pompa istasyonunu ve sıvı işleme aparatını hazırlamak için, canlı hücre deneylerinden önce ve sonra ultra saf suda sonikasyon ve% 0.5 ağartma çözeltisi ile şırıngaları ve şırınga pistonlarını temizleyin. Onları suyla iyice durulayın. Şırıngaları, uçlarını tamamen bir su banyosuna batırarak ve pistonu kullanarak aspire ederek suyla doldurun.

Su banyosu içindeyken şırınga mili şırınganın çıkışındaki contaya temas edecek şekilde sıvıyı boşaltın. Şırınga kolonlarında hava kabarcığı görülmeyene kadar aspire etmeye ve temizlemeye devam edin. Doldurulmuş şırıngaları, alt kilit konektörleri kullanarak şırınga pompalarına bağlayın.

Sıvıyı şırıngadan MFP kafasına veya sıvı rezervuarlarına giden iki kılcal damardan birine yönlendirmek için pompalara monte edilmiş anahtar valfini kullanın. Şırıngalarda yaklaşık 10 mikrolitre su kalana kadar, şırınganın boyutuna bağlı olarak dakikada yaklaşık 10 ila 50 mikrolitre akış hızında her iki kılçığı da şırıngalardan su ile temizleyin. MFP kafasını standart temizlik için cam eşya deterjanı veya sıkı temizlik için% 0,5 çamaşır suyu kullanarak beş dakika boyunca sonikasyon ile temizleyin.

Tepeyi suya batırarak ve yollara vakum uygulayarak kanalları suyla temizleyin. Kanalları stereo mikroskop altında olası engeller açısından inceleyin ve gerekirse önceki adımı tekrarlayın. Ardından, temizlenmiş kafayı kafa tutucuya monte edin ve konektörü kafaya vidalayın.

Temizlenen kılcal damarları, kafadaki kanal yollarıyla arayüz oluşturan uygun bir mikroakışkan konektör adaptörüne yerleştirin. Metin protokolünde açıklandığı gibi uç nokta kalibrasyonunu gerçekleştirmeden önce, kafa ile hücre tek tabakası arasındaki boşluk mesafesinin kontrolü için kullanılan kafa tutucuyu Z aşamasına vidalayın. MFP kafasını hücresiz bir oda kızağının üzerine getirerek ve beş mikronluk adımlarla yavaşça inerek kaba bir sıfır boşluk mesafesi elde edin.

Alt tabaka ile prob teması üzerine, Newton halkaları gözlenmelidir. Bu kaba bir tahmindir. Prob tepesinin alt tabakaya eş düzlemliliği ayarlandıktan sonra doğru bir konum elde edilmelidir.

Oluşturulduğunda, Newton halkalarının simetrik olduğundan emin olun. Prob tepesinin eş düzlemliliğini sağlamak için, kafa ve Z aşamasının arayüzünde bir açıölçer kullanarak kafanın eğimini ayarlayın. MFP kafasını alt tabakadan 20 mikron uzağa taşıyın ve açıölçeri kullanarak eğimi ayarlayın.

Newton'un halkaları temas halinde simetrik olana kadar iniş, sıfırlama ve eğim ayarını tekrarlayın. Eğim ayarlandıktan sonra, simetrik Newton halkaları üreten Z konumunu sıfıra ayarlayın. Ardından, metin protokolünde açıklandığı gibi, iç enjeksiyon kanalı için işleme sıvısını ve dış enjeksiyon için gerekli ekstraksiyon tamponu çözeltisini hazırlayın.

Şırınga pompalarına bağlanan drenaj hattını kullanarak, kalan suyu boşaltın ve gazı alınmış solüsyonları şırıngalar dolana kadar dakikada 40 mikrolitre hızla enjeksiyon şırıngalarına aspire edin. Bu, şırıngaların, konektörlerin ve kılcal damarların kabarcıksız bir şekilde doldurulmasını sağlar. Hücre tek katmanlarını hazne slaytları üzerinde hazırlamak için, standart hücre kültürü protokollerini kullanarak hücreleri T-şişelerinde genişletin.

Kültür şişelerinde hücre birleşmesine ulaşıldığında, hücreleri tripsinize edin ve toplayın. Desenleme için iki odacıklı slaytların her birinde santimetre kare başına 0.2 milyon hücre tohumlayın. Hücre büyümesi ve canlılığı için bir kontrol olarak odalardan birindeki hücreleri kullanarak hücreleri 48 saat boyunca kültürleyin.

Oda slaytları üzerinde hücre birleşmesine ulaşıldığında, hücreleri serum içermeyen ortamda hazırlanan 10 mikromolar konsantrasyonda 500 mikrolitre hücre izleyici boya çözeltisi ile 45 dakika inkübe edin. Bu, desenleme sırasında hücre görselleştirme için yapılır. Etiketli hücreleri, her bir hazneyi bir pipet kullanarak nazikçe yıkayarak PBS ile yıkayın.

Daha sonra, modelleme deneyleri için hücreleri serum takviyeli ortamda kültürleyin. Hidrodinamik akış hapsi, bir işleme sıvısının eşzamanlı enjeksiyonu ve aspirasyonunu kullanarak sıvıları lokalize eder. Hiyerarşik hapsetmede, birden fazla işleme sıvısı sınırlandırılır ve dış HFC, numuneyi iç işleme HFC'sinden korur.

MFP'yi hücre tek tabakası üzerinde cam slayttan 50 mikronluk bir boşluk mesafesine kadar hareket ettirin. Bu boşluk mesafesi, hiyerarşik HFC'nin temasını sağlar ve ayrıca tek katmanlı yüzey ve kalınlık değişimini de hesaba katar. Sodyum hidroksitin I-iki ile dakikada altı veya sekiz mikrolitre enjeksiyonu.

Metin protokolündeki akış kurallarını kullanarak diğer akış hızlarını değerlendirin. Enjeksiyon şırıngalarını kullanarak QI-iki ve QI-bir enjeksiyon akış hızlarının oranını değiştirerek iç HFC'nin boyutunu modüle edin. Örneğin, dakikada 1,3 mikrolitre ile dakikada dört mikrolitre arasında bir QI kullanın, QI iki dakikada sekiz mikrolitreye sabitlenmiş olarak, 150 ila 300 hücrelik bir sodyum hidroksit ayak izi elde edin.

hHFC'nin çalışması sırasında ortamın buharlaşmasını ve aspirasyonu hesaba katmak için MFP kafasındaki en dıştaki açıklıklardan dakikada 20 mikrolitrelik bir akış hızında tam ortam enjekte edin. Hücre tek katmanlarını modellemek için, sahne yazılımını, prob kafasını hücre tek katmanı üzerinde kullanıcı tanımlı desenlerde saniyede 10 mikronluk bir tarama hızında ve 50 mikronluk bir boşluk mesafesinde tarayacak şekilde ayarlayın. İç içe geçmiş hHFC çalışır durumda ve tek katmanla temas halindeyken, desenli hücre çıkarımını gerçekleştirmek için MFP'yi istenen desenin yörüngesiyle tarayın.

İlk hücre tipi çıkarmadan sonra bir kokültür için, daha önce olduğu gibi boşlukları doldurmak için farklı bir hücre hattı tohumlayın. Numune alma istasyonunu lizatın aşağı akış analizi için hazırlayın. Burada, üç boyutlu baskılı sekiz şeritli bir PCR tutucusu içeren bir örnekleme istasyonu örneği gösterilmektedir.

Tüp tutucuyu, uygulama için istenen sıkılığa bağlı olarak %70 etanol veya diğer yüzey dekontaminantları ile silin. Alt tabaka tutucusuna takmak için tüp tutucu üzerinde manyetik bir klips kullanın. Numune alma istasyonunu hazırladıktan sonra, MFP kafasını tek katmandan 100 mikron uzağa yerleştirin.

QI-one için dakikada bir mikrolitre, QI-two için dakikada altı mikrolitre, QA-one için dakikada eksi yedi mikrolitre ve QA-two için dakikada eksi 17.5 mikrolitre akış hızına sahip iç enjeksiyon kanalı için işleme sıvısı olarak hHFC'yi 50 milimolar sodyum hidroksit çözeltisi ile çalıştırmaya başlayın. Akış hapsi stabilize olduktan sonra, hHFC ile seçilen hücre alt popülasyonunda sodyum-hidroksit bazlı lokal lizis gerçekleştirmek için prob kafasını 50 mikronluk bir boşluk mesafesine indirin. Alt popülasyonun parçalanması tamamlandıktan sonra, kafayı örnekleme istasyonundaki tüplere doğru yönlendirin.

Toplanan lizatı doğrudan PCR tüplerine atın. Lizatı metin protokolünde açıklandığı gibi işledikten sonra, lizatı cihazın tedarikçisi tarafından belirlenen standart bir qPCR iş akışına yükleyin. Hiyerarşik HFC'deki enjeksiyon sıvılarının oranı kontrol edilerek, hücre yüzeyi ile temas eden ayak izinin boyutu modüle edilir.

Akış hızları, hücre lizizi için baskın mekanizma olan kesme yerine kimyasal etki olacak şekilde seçildi. Bu, hesaplamalı akışkanlar dinamiği kullanılarak kesmenin belirlenmesiyle doğrulandı. Burada, MFP ile yörünge programlamasını tarayarak bir hücre adaları ızgarasının oluşturulması gösterilmektedir.

Enjeksiyon sıvısı oranı kullanılarak ayak izi boyutunun modülasyonu, hücre çıkarma çözünürlüğünün kontrolüne izin verir. Bu yöntem, birden fazla hücre popülasyonunun sıralı kokültürü için kullanılabilir, bu nedenle hücreden hücreye etkileşimlerin karmaşık modellerini oluşturur. Sodyum hidroksitin bir işleme sıvısı olarak kullanılması, lizatı hücrelerin PCR bazlı analizi ile uyumlu hale getirir.

Burada, DNA içeriği, tarif edilen yöntem kullanılarak parçalanan beş ve bir ayak izinden ölçüldü. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik hücreler üzerinde 30 dakikadan daha kısa sürede gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü denerken, HFC'yi olumsuz etkileyebileceğinden, kanalların ve kılcal damarların hava kabarcıklarından arınmış olduğundan emin olmayı unutmamak önemlidir.

Aşındırıcı bir kimyasal çözelti olan sodyum hidroksit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman koruyucu gözlük ve laboratuvar önlüğü gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın. Bu prosedürü takiben, hücrelerin geometrik hapsedilmesi nedeniyle hangi proteinlerin aşırı eksprese edildiği gibi ek soruları yanıtlamak için MFP aracılı lizis ile immünoboyama veya DNA-RNA dizilimi ile hücreleri lokal olarak analiz edebiliriz. Geliştirildikten sonra, bu teknik, moleküler biyoloji alanındaki araştırmacıların doku oluşumu ve dejenerasyonu sırasında hücreler arası ve hücre dışı sinyalleri keşfetmelerinin önünü açabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, yerel işleme için MFP'de kurulan hücre tek katmanlarını nasıl eksiltici bir şekilde modelleyeceğinizi ve hücrelerin kokültürlerinin karmaşık geometrilerini nasıl yapacağınızı iyi anlamış olmalısınız.