mikroakışkan Probe ile Canlı Hücre Katmanlar hızlı Subtractive Desenlendirme

Bu video makalesinde sunulan yöntemin temel amacı, hücreler arası etkileşimlerin in-situ spatiotemporal analizini kolaylaştırmak için mekansal olarak tanımlanmış hücre desenlerini hızlı bir şekilde oluşturmaktır. Sunulan strateji, mikroakışkan prob teknolojisinden yararlanmaktadır. Mikrofabrikasyonla üretilen prob başlığı, hücre monokatmanlarını desenlemek için biyolojik alt katmanlar üzerine nanolitre hacimlerde biyokimyasallar yerelleştirir.

MFP tabanlı bir desenleme tekniğinin temel avantajı, lokal lize sayesinde neredeyse anlık olması ve böylece oluşturulacak desenlerin gerçek zamanlı olarak modifiye edilmesine olanak tanımasıdır. Hücre desenleri oluşturmak için kullanılan diğer yöntemlerin, hücre desenlerinin başarısı gerçekten görülmeden önce uzun ve çok aşamalı protokoller gerektirdiğini fark ettiğimizde bu yöntem fikri ilk kez ortaya çıktı. Bir hücre yüzeyinde hidrodinamik akış sınırlaması ile stabil deneyler yürütmek için MFP parametrelerinin optimize edilmesi gerekir.

Bu amaçla, görsel gösterim kritik öneme sahiptir. Aditya Kashyap ve Julien Cors bu prosedürü uygulamalı olarak göstereceklerdir. Platformun operasyonel modülleri motorlu şırıngalar, motorlu tablalar ve bir kontrolcüden oluşmaktadır.

MFP, kafa ile substrat arasındaki boşluk mesafesini kontrol etmek için motorlu bir Z-sahnesine bağlanmıştır ve substrat tutucusu, tarama sistemini oluşturan X ve Y motorlu sahnelerine takılmıştır. MFP kafası, pompalama istasyonuna bağlanmak için akışkan yollarına, kafayı Z-sahnesine monte etmek için montaj deliklerine ve cilalanmış tepe noktasından çıkan kanallara sahiptir. Tepe noktası, hücre kültürü substratı ile eş düzlemli olacak şekilde ayarlanmıştır.

Pompalama istasyonunu ve sıvı taşıma düzeneğini hazırlamak için, canlı hücre deneylerinden önce ve sonra şırıngaları ve şırınga pistonlarını sonikasyonla ve ultrapure su içindeki %0,5 çamaşır suyu çözeltisiyle temizleyin. Bunları suyla iyice durulayın. Şırınga uçlarını tamamen bir su banyosuna daldırıp pistonu kullanarak emme işlemi yaparak şırıngaları suyla doldurun.

Şırınga şaftı, şırınganın çıkışındaki sızdırmazlık contasına temas ederken, sıvı tahliyesini su banyosu içerisinde gerçekleştirin. Şırınga kolonlarında hava kabarcığı görülmeyene kadar aspirasyon ve tahliye işlemine devam edin. Doldurulmuş şırıngaları, alt kilitli konnektörler kullanarak şırınga pompalarına bağlayın.

Sıvıyı şırıngadan, ya MFP başlığına ya da sıvı rezervuarlarına giden iki kapilerden birine yönlendirmek için pompalara monte edilmiş olan değiştirme valfini kullanın. Şırınga boyutuna bağlı olarak, dakikada yaklaşık 10 ile 50 µL akış hızında, şırıngalarda yaklaşık 10 µL su kalana kadar her iki kapileri de şırıngalardaki su ile temizleyin. MFP başlığını, standart temizlik için cam malzemeleri deterjanı veya daha titiz bir temizlik için %0,5 çamaşır suyu kullanarak beş dakika boyunca sonikasyonla temizleyin.

Apex kısmını suya daldırıp vialere vakum uygulayarak kanalları suyla temizleyin. Kanalları olası tıkanıklıklar için stereo mikroskop altında inceleyin ve gerekirse önceki adımı tekrarlayın. Ardından, temizlenmiş başlığı başlık tutucuya monte edin ve konnektörü başlığa vidalayın.

Temizlenmiş kılcal tüpleri, başlık kısımdaki kanal geçişleriyle bağlantı sağlayan uygun bir mikroakışkan konnektör adaptörüne yerleştirin. Metin protokolünde açıklandığı şekilde uç nokta kalibrasyonunu gerçekleştirmeden önce, başlık ile hücre monotabakası arasındaki boşluk mesafesinin kontrolü için kullanılan Z-sahnesine başlık tutucuyu vidalayın. Hücre içermeyen bir oda slaytının üzerine MFP başlığını getirip beş mikronluk adımlarla yavaşça indirerek kaba sıfır boşluk mesafesini belirleyin.

Probun substratla temas etmesi üzerine Newton halkaları gözlemlenmelidir. Bu kaba bir tahmindir. Hassas konum, prob ucunun substrata olan koplanarlığı ayarlandıktan sonra elde edilir.

Newton halkaları oluştuğunda, bunların simetrik olduğundan emin olun. Prob ucunun koplanarlığını sağlamak için, kafa ve Z- tablası arayüzündeki goniyometreyi kullanarak kafanın eğimini ayarlayın. MFP kafasını substrattan 20 mikron uzağa taşıyın ve eğimi goniyometre ile ayarlayın.

Newton halkaları temas anında simetrik olana kadar indirme, sıfırlama ve eğim ayarını tekrarlayın. Eğim ayarlandıktan sonra, simetrik Newton halkaları oluşturan Z pozisyonunu sıfıra ayarlayın. Ardından, metin protokolünde açıklandığı şekilde, iç enjeksiyon kanalı için işlem sıvısını ve dış enjeksiyon için gerekli olan ekstraksiyon tampon çözeltisini hazırlayın.

Şırınga pompalarına bağlı tahliye hattını kullanarak geri kalan suyu boşaltın ve şırıngalar dolana kadar gazı alınmış çözeltileri dakikada 40 µL hızla enjeksiyon şırıngalarına çekin. Bu işlem; şırıngaların, konnektörlerin ve kapillerlerin kabarcıksız şekilde doldurulmasını sağlar. Chamber slaytlar üzerinde hücre tek tabakaları hazırlamak için, hücreleri standart hücre kültürü protokollerini kullanarak T-flasklarda çoğaltın.

Kültür flasklarında hücre konfluensine ulaşıldığında, hücreleri tripsinizle ayırın ve toplayın. Patternleme için iki bölmeli lamların her birine santimetrekare başına 0,2 milyon hücre ekleyin. Hücre büyümesi ve canlılığı için bölmelerden birindeki hücreleri kontrol olarak kullanarak hücreleri 48 saat boyunca kültüre edin.

Hücreler oda slaytlarında konfluense ulaştığında, serumsuz ortamda hazırlanmış 10 µM konsantrasyonda 500 µL hücre takip boyası çözeltisi ile hücreleri 45 dakika boyunca inkübe edin. Bu işlem, desenleme sırasında hücrelerin görselleştirilmesi için yapılır. Etiketlenen hücreleri, her bir odayı bir pipet kullanarak nazikçe yıkayarak PBS ile temizleyin.

Ardından, desenleme deneyleri için hücreleri serum takviyeli ortamda kültüre edin. Hidrodinamik akış sınırlaması, bir işlem sıvısının eş zamanlı enjeksiyonu ve aspirasyonu kullanılarak sıvıları lokalize eder. Hiyerarşik sınırlamada, birden fazla işlem sıvısı sınırlanır ve dış HFC, örneği iç işlem HFC'sinden korur.

MFP'yi, cam lamdan 50 mikronluk bir boşluk mesafesinde kalacak şekilde hücre monotabakasının üzerine getirin. Bu boşluk mesafesi, hiyerarşik HFC'nin temasını sağlar ve aynı zamanda monotabaka yüzey ile kalınlık varyasyonlarını hesaba katar. I-iki üzerinden dakikada altı veya sekiz mikrolitre sodyum hidroksit enjekte edin.

Metin protokolündeki akış kurallarını kullanarak diğer akış hızlarını değerlendirin. Enjeksiyon şırıngalarını kullanarak QI-two ve QI-one enjeksiyon akış hızlarının oranını değiştirerek iç HFC boyutunu modüle edin. Örneğin, 150 ila 300 hücrelik bir sodyum hidroksit izi elde etmek için QI-two'yu 8 µL/dk'da sabit tutarken, QI-one'u 1,3 µL/dk ile 4 µL/dk arasında kullanın.

Ortamın buharlaşmasını ve hHFC çalışması sırasındaki aspirasyonu karşılamak için, MFP başlığındaki en dıştaki açıklıklardan dakika başına 20 µL akış hızıyla tam besiyeri enjekte edin. Hücre tek tabakalarını desenlemek için, sahne yazılımını, prob başlığının hücre tek tabakası üzerinde kullanıcı tanımlı desenlerde saniyede 10 µm tarama hızı ve 50 µm boşluk mesafesiyle tarayacak şekilde ayarlayın. İç içe geçmiş hHFC çalışır durumdayken ve tek tabaka ile temas halindeyken, desenli hücre uzaklaştırmasını gerçekleştirmek için MFP'yi istenen desenin yörüngesinde taratın.

İlk hücre tipinin uzaklaştırılmasından sonra kokültür için, daha önce yapıldığı gibi, boşlukları doldurmak amacıyla farklı bir hücre hattı ekleyin. Lizatın alt analizleri için örnekleme istasyonunu hazırlayın. Burada, üç boyutlu yazıcıyla basılmış sekizli şerit PCR tutucudan oluşan bir örnekleme istasyonu örneği gösterilmektedir.

Tüp tutucuyu, uygulamanın gerektirdiği sterilite düzeyine bağlı olarak %70 etanol veya diğer yüzey dekontaminanları ile silin. Tüp tutucuyu alt tabaka tutucusuna sabitlemek için tüp tutucu üzerindeki manyetik klipsi kullanın. Örnekleme istasyonu hazırlandıktan sonra, MFP başlığını tek tabakadan 100 mikron uzaklığa konumlandırın.

hHFC'yi çalıştırmaya, iç enjeksiyon kanalı için işlem sıvısı olarak 50 millimolar sodyum hidroksit çözeltisini; QI-one için dakika başına bir mikrolitre, QI-two için dakika başına altı mikrolitre, QA-one için dakika başına eksi-yedi mikrolitre ve QA-two için dakika başına eksi-17,5 mikrolitre akış hızıyla başlayın. Akış sınırlaması stabilize olduğunda, hHFC ile seçilen hücre alt popülasyonunda sodyum hidroksit tabanlı lokal lizis gerçekleştirmek için prob başlığını 50 mikronluk bir boşluk mesafesine indirin. Alt popülasyonun lizisi tamamlandığında, başlığı örnekleme istasyonundaki tüplere doğru yönlendirin.

Toplanan lizatı doğrudan PCR tüplerine boşaltın. Lizatı, metin protokolünde açıklandığı şekilde işledikten sonra, cihaz tedarikçisi tarafından belirlenen standart bir qPCR iş akışına yükleyin. Hiyerarşik HFC'deki enjeksiyon sıvılarının oranı kontrol edilerek, hücre yüzeyi ile temas eden iz alanı boyutu modüle edilir.

Akış hızları, hücre lizi için dominant mekanizmanın kayma kuvvetinden ziyade kimyasal etki olması için seçilmiştir. Bu durum, hesaplamalı akışkanlar dinamiği kullanılarak kayma kuvvetinin belirlenmesiyle doğrulanmıştır. Burada, MFP ile tarama yörüngesi programlaması yoluyla bir hücre adacıkları ızgarasının oluşturulması gösterilmektedir.

Enjeksiyon sıvısı oranının kullanılarak ayak izi boyutunun modülasyonu, hücre uzaklaştırma çözünürlüğünün kontrol edilmesini sağlar. Bu yöntem, birden fazla hücre popülasyonunun ardışık kokültürü için kullanılabilir ve böylece karmaşık hücre-hücre etkileşim desenleri oluşturabilir. İşleme sıvısı olarak sodyum hidroksit kullanılması, lizatı hücrelerin PCR tabanlı analizi ile uyumlu hale getirir.

Burada, tanımlanan yöntem kullanılarak lize edilen beş ve bir ayak izinden DNA içeriği quantify edildi. Bu teknikten uzmanlaşmış olduğunda, hücrelerde 30 dakikadan kısa sürede gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü uygularken, kanalların ve kapilerlerin hava kabarcıklarından arındırıldığından emin olmak önemlidir, çünkü bu durum HFC'yi olumsuz etkileyebilir.

Korozif bir kimyasal çözelti olan sodyum hidroksit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman koruyucu gözlük ve laboratuvar önlüğü gibi önlemler alınmalıdır. Bu prosedürün ardından, hücrelerin geometrik kısıtlaması nedeniyle hangi proteinlerin aşırı eksprese olduğu gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla, hücreleri immün boyama veya MFP aracılı lizle DNA-RNA dizileme yoluyla lokal olarak analiz edebiliriz. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, moleküler biyoloji alanındaki araştırmacıların doku oluşumu ve dejenerasyonu sırasında hücre içi ve hücreler arası sinyallemeyi incelemelerinin önünü açabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, yerel işlemleme için MFP'de kurulan hücre tek tabakalarını çıkarma yöntemiyle nasıl desenleyeceğiniz ve hücre ko-kültürlerinden karmaşık geometriler nasıl oluşturacağınız konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.