Name: Yenidoğan Kardiyak iskeleleri: Rejeneratif Çalışmaları Roman Matrisler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Keşfedin yenidoğan fare kalp dokusundan kardiyak iskeleler oluşturma yöntemini rejeneratif kardiyoloji araştırmaları için. Bu teknik hücre-matriks etkileşimlerini incelemeye ve yenidoğan ekstraselüler matriksin benzersiz özelliklerini keşfetmeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, figürlerin hazırlanması için Bayan Cynthia DeKay'e minnetle teşekkür eder.

Tüm fare deneyleri ABD Hayvan Refahı Yasası uyarınca yapılmış ve Minnesota Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. Fare Kalp İzolasyon 1. Yöntem <ol><li> tek kullanımlık bıçak ile kafaları kesilmek suretiyle bir yenidoğan fare Euthanize. </li><li> % 70 etanol ile toraks çubukla. </li><li> # 5 forseps bir çift ile yanal cildi çekerken standart makas ile göğüs duvarından onu uzak keserek göğüs cildi parçalara ayır. </li><li> Karın duvarından keserek makas ile sternum sadece alt karın Perfore. makasla göğüs iki tarafında kaburga olsa kesim sırasında 5. forseps ile kılıç şeklinde sürecini kavratmak, vücuttan rostrally sternum geri çekin. göğüs kafesi kalbi ortaya çıkarmak için forseps ile superior yansıtılır. </li><li> Açık açık teşhir, 5. forseps ile yanal çekerek timus iki ana lob teşrihAort kemer yanı sıra kaval ve pulmoner venler. </li><li> 10 cm yaylı makas ile aortik arktan önemli arterler, aorta kendisi transect. Kalbin taban ve brakiyosefalik arter arasında aort saklayın. trakea ve özefagus ayıran, öne kalbi yansıtmak için # ile 5 forseps kopmuş gemilerin uçlarını kavrayın. </li><li> 10 cm yaylı makas ile, kalbin her iki tarafta da akciğer ve kalp arasında keserek, pulmoner damar ve diğer büyük damarlar transeksiyonu. damarlar drenaj sağlamak için açık kalır. </li><li> büyük damarların kesik kenarlarından tutarak, 5. forseps ile mediastinumdan kalbi çıkarın. kateterizasyon için steril fosfat tamponlu tuz (PBS) ihtiva eden bir 60 mm kültür çanağı kalbi yerleştirin. </li></ol> Langendorff perfüzyonu ile Decellularization 2. Yöntem <ol><li> önceden kateter hazırlayınız. 4 cm&#39;lik bölümünü çizmekPE küçük bir alkol alevinde 50 boru küçük, daha ince kateteri oluşturun. Boyutları karşılamak için bir bıçak ile biter süs (Yaklaşık. Yakl. 500 mikron OD bir flanş ile 300 mikron dış çap OD) Şekil 1&#39;de gösterildiği. Bu çekme her iki tarafında iki simetrik kateterleri sağlayacaktır. </li><li> İnce ucunda açılış üzerine flanş eritmek için, kısaca ateşe hortumun kesik ucunu yönlendirin. </li><li> PBS ile 12 ml şırınga doldurun ve şırınga 3-yollu stopcock koyarak kateter monte edin. stopcock bir 22 G x 1 iğne ekleyin ve septum boyunca iğne sürücü. Iğne (Şek. 1) üzerine çizilmiş PE boru kateteri kaydırın. </li><li> tüm hava kabarcıkları bertaraf edildiğini güvence PBS ile monte parçaları sulamak. </li><li> aort kapak geçmiş uzanan değil, izole kalp aort içine, yukarıda özetlenen ve 7-0 sütür bir kravat Arter olarak hazırlanan kateteri, yerleştirin. t flanşı istirahatO sıkı bir mühür yapmak ve kateter çıkmasını kalbi önlenmesi, kravat karşı proksimal kateter. </li><li> nazikçe PBS içeren şırınga kullanarak kalbi perfüze iken, büyütme altında kateterizasyon gözlemleyin. Orada hiçbir sızıntı sistemde ve gizli kan kaldırılır gibi doku homojen blanches emin olun. </li><li> giriş adaptörü boynuna septum yerleştirin ve cam üzerinde tarafı katlanarak mühür. </li><li> Şekil l&#39;de gösterildiği gibi, 20 mm Hg basıncı üreten bir sütun üretilmesi için yeterli uzunlukta bir hat ile distile su içinde% 1 sodyum dodesil sülfat (SDS), 60 ml (DH 2 O) ile dolu hazne takın. 1. 1 mm Hg ilişkisine dayalı sıvı sütunu yüksekliği baskısı hesaplayın 1,3595 cm H 2 O eşittir Dikkat: SDS tahriş edici özelliklere sahip son derece yün tozdur. İletişim kaçınılmalıdır. Uygun koruyucu giysi kullanılarak toz anlaştım. </li><li> 14 saat boyunca,% 1 SDS ile kalp serpmek. Kalp gözlemlenebilir kalan doku ile görünüş olarak saydam olacak. </li><li> Kalan SDS çözeltisi musluk sistemi kadar yıkayın ve 10 ml dH 2 O ile değiştirin 1x penisilin streptomisin (LTR yükseltici) durumunda ihtiva eden 60 ml PBS ve ardından 10 mi dH 2 O ve ardından (damıtılmış su içinde seyreltilmiş), 10 ml% 1 Triton X-100 ile kalp, serpmek. </li><li> 4 ° C&#39;de 1x Pen-Strep ile PBS içinde kalp saklayın. amaçlanan sonrası decellularization uygulama daha sonra aorta kateter sağlanmalıdır perfüzyon gerektiriyorsa, aksi takdirde dikiş kravat kesmek ve kateter çıkarın. </li></ol> 3. DNA tayini <ol><li> 50 mM KCI 200 ug / ml proteinaz K ile hücresizleştirilmiş ECM veya bir kalp atım bir özetini Hazırlama, 2.5 mM MgCI, 10 mM Tris (pH 8.3) içinde bir 2,% 0.45 Tween 20. </li><li> Doku çözünene kadar çalkalanarak 55 ° C&#39;de doku inkübe,4-5 saat. </li><li> Tahlili 4,11 bağlanma DNA ile homojenat DNA içeriği nicelleştirmektedir. </li></ol> 4. Sabitleme ve Doku Kesit <ol><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBS içinde% 4 paraformaldehid hücresizleştirilmiş, recellularized veya kontrol P3 kalpleri düzeltildi. </li><li> PBS 3x doku yıkayın. </li><li> batar kadar 4 ° C &#39;de 0.1 M fosfat tamponu içinde% 7.5 sükroz, bir solüsyon içerisinde bulunan dokunun yerleştirin. </li><li> batar kadar, yine 4 ° C &#39;de 0.1 M fosfat tamponu içinde% 15 sakroz çözüm değiştirin. </li><li> 37 ° C doku, sıcak% 15 sakaroz ve 0.1 M fosfat tampon maddesi içinde bir jelatin çözeltisi ile hacminin yarısı yerine ve bir gece boyunca dengelenmeye. jelatin konsantrasyonu% 1,% 2.5,% 5 ile adım adım artan ve son olarak% 7.5 iki kat. </li><li> Taze% 7.5 jelatin kullanan cryomolds örnekleri yerleştirin. decellularized numunelerin şeklini geri, sıvı jelatin t olarak odalarına perfüze edilebilirO kalpler kalıplanmıştır. sıvı azot üzerinde cryomolds yüzen ile dondurun. -80 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Kriyostat ile kesilir (10 mikron kalınlığında) kesitler. bölüm yüzeyine yakın slayt getirin ve bölüm nedeniyle elektrostatik tedavi slaytlar üzerinde yüke yüzeye bıçak kapalı hareket gözlemlemek. bir gecede slaytlar kurulayın ve gelecek analizi için -80 ° C&#39;de saklayın. </li><li> dondurucu Slayt çıkarmak Oda sıcaklığına ve daha sonra jelatin çözmek için 37 ° C &#39;de 20 dakika süre ile PBS içeren bir Coplin kavanoza yerleştirin. </li><li> Hematoksilen ve Eosin ile Adım 4.7 kesilen bölümleri Leke. Bir Coplin kavanoza yerleştirin kayar. 1.5 dakika boyunca maddesi mavileştirici 1 dakika boyunca musluk suyu, 3 dakika boyunca tampon, 1.5 dakika boyunca musluk suyu, 45 sn için hematoksilen Adım 4.8&#39;de sulu slaytlar Açığa,% 80 etanol, 1 dakika boyunca, Alkol Eosin Y 8 saniye, 1 dk 3x 1 dakikada, 1 dakika 2x% 100 etanol maddesi temizleme (ksilen yerine)% 80 etanol, reçine ile lamelgöre montaj ortamı. mikroskopik slaytlar inceleyin. </li><li> nemli bir oda içinde hidratlanmış slaytlar koyarak bu kolajen IV, ECM yapısal proteinler kalp ECM, leke ECM proteininde reaktivite tutma teyit ve% 0.1 Triton ile fosfat tamponlu tuzlu su içinde% 10 normal eşek serumu (NDS) ile tedavi edilmesi için -X100 oda sıcaklığında 1 saat (RT) (PBST). Doku bölümleri kapsayacak şekilde yeterli hacme kullanın. </li><li> % 5 NDS / PBST bir ampirik olarak tespit seyreltme de tercih birincil antikor ile çözüm değiştirin. Örneğin, kolajen IV antikoru 1 ile seyreltildi: 150. 4 ° C&#39;de bir gece boyunca inkübe edilir. </li><li> PBST 3x ile slaytlar yıkayın ve bir floresan boya ile konjuge seçim ikincil antikor uygulayın. bir ampirik olarak tespit miktarda antikor sulandırmak. Oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. PBS 3x yıkayın. </li><li> DAPI DAPI içeren mounti kullanılarak hücre çekirdeğinin olmaması doğrulamak için gibi bir DNA bağlayıcı boya ile slaytlar LekeKapak slaytlar kayma sırasında orta ng. </li><li> 400X&#39;lik 50 bir floresan mikroskop ile slaytlar inceleyin. </li></ol> Recellularization 5. P1 Neonatal Fare Ventriküler Kardiyomiyositler <ol><li> % 70 etanol ile her yavru Sprey ve tek kullanımlık bıçak ile başını kesmek. </li><li> toraks göğüs boşluğu maruz küçük steril makas ile orta hatta bölünmüş ise başparmak ve işaret parmağı arasındaki her yavru tutun. o büyük damarların ve sadece ventriküler doku bırakarak kulakçıklar serbest kesilir iken kalp göğüs serbestçe çıkıntı izin basınç uygulayın. </li><li> 20 ml buz gibi soğuk Kalsiyum, bütün kalpler toplanana kadar, 20 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (CBFHH) sahip bikarbonat bilgilerini Hank tamponlu tuzlu su çözeltisi içeren 50 ml&#39;lik bir tüp içine doğrudan her kalp yerleştirin. </li><li> CBFHH aspire ve boru taze CBFHH (buz soğukluğunda) 10-15 ml ekleyin. t doku dönen dokuyu yıkayıno tüp birkaç kez. </li><li> 60 mm plastik Petri kabı içine kalpleri içeren solüsyon süzün. </li><li> uzakta yaylı makas ile kalpleri onu kırparak buz üzerinde büyütme altında kalpleri herhangi gizli atriyal doku teşrih. homojen büyüklükte küçük parçalar halinde ventriküller kadar kıyma. 5. forseps ile çanak herhangi ayrılmış olmayan ventriküler doku çıkarın. </li><li> steril mikro karıştırma çubuğu içeren küçük steril şişenin içine doku parçaları aktarmak için gerekli olduğu gibi CBFHH çözümünün kadar Pipet. </li><li> Doku flakon dibine tortu ve CBFHH çözüm kaldırmak için izin verin. </li><li> CBFHH bir enzim çözeltisi 1.75 mg / ml tripsin, 20 ug / ml DNaz II 50 ml hazırlayın. Pipet 5 Bu enzim solüsyonu ve bir manyetik karıştırıcı ile kıyılmış ventriküler doku ve yer ihtiva eden bir tübe ekleyin. 8 dakika boyunca, oda sıcaklığında sabit bir oranda (340 rpm) karıştırılır. NOT: karıştırma eylem nazik olun ve henüz izin vermelidirbulamaç durdurulması için. </li><li> karıştırma plakasından şişe çıkarın ve bulamaç 3 dakika tortu izin verir. öncelikle kan hücreleri ve doku artıkları içerdiğinden pipetleyin, ilk sindirmek süpernatant atın ve. </li><li> Pipetleyin ikinci 5 ml enzim çözeltisi kısım ve sindirerek ventrikül ekleyin. 8 dakika boyunca karıştırın ve bir diğer 3 dakika için tortu sağlar. Önceki digests başlamadan, iki adet 50 ml tüpler (1 ve 2 ile) hazırlanması Her biri 12 ml buz gibi soğuk fetal sığır serumu (FBS). Her bir tüp üzerinde bir 40 mikron hücre süzgeç yerleştirin. Pipet tüp 1 filtre aracılığıyla bu yüzer. </li><li> FBS içeren iki tüp arasında sindirmek süpernatant yerleştirilmesini alternatif, sindirim sürecini bir ek 8 kez tekrarlayın. Her bir tüp içinde eşit hacimlerde sağlamak için tüpler 1 ve 2 arasında eşit Son süpernatant bölün. NOT: Her toplama tüpü şimdi hücre süspansiyonu 32.5 ml toplam hacmi içerecektir. </li><li> tüpler içerirler santrifüj4 ° C&#39;de 6 dakika boyunca 150 x g&#39;de süpernatan ing. </li><li> Sindirim alikotları toplarken, plaka başına (% 10 FBS, 1 x Pen-Strep, 1 x L-glutamin ile Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)) ortam 6 ml beş 100 mm doku kültürü plakaları hazırlamak. Ortamı dengelenmeye 30 dakika için 37 ° C,% 5 CO2 seviyesinde bu alikotları inkübe edin. </li><li> Her iki toplama tüpleri hücreleri birleştiren CBFHH enzim karışımı aspire ve yukarıda hazırlanan kültür ortamı 30 ml tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> 100 mm levhaların her hücre süspansiyonu 6 ml dönün ve 37 ° C&#39;de 45 dakika inkübe edilir. </li><li> (Fibroblast fraksiyon yemekler bağlı başlamış ve eğer istenirse ayrı ayrı yetiştirilebilir) inkübasyonun sonunda, 5 yeni yemeklere yıkanarak yapışmayan hücreler transferi ve 45 dakika boyunca tekrar inkübe edin. </li><li> Ön kaplama ikinci tur sonunda, yemekler medya ve yapışmaz hücreleri toplamak ve 150 ° C&#39;de medya dönmeye6 dakika xg. </li><li> (Perfüzat 100 ul Yapı başına 4.0 x 10 5 hücre), yaklaşık istenen konsantrasyona hücreleri getirmek için fazla ortamı dışarı çekilmesi. Sayımı ve veya canlılık testi 14 için bir numuneyi çıkarın. </li></ol> P3 Kalp Matrix 6. Biyoreaktör Recellularization <ol><li> bir gecede hücrelerin eklemeden önce kültür ortamı (Adım 5.15 bakınız) ile izole kalp matrisi ön işleme tabi. </li><li> Şekil l&#39;de gösterildiği gibi, bir Langendorff sistemi elemanları bir araya getirin. 2. Cam parçaları Otoklav ve etilen oksit sterilite sağlamak için plastik parçaları sterilize edin. sistemin çeşitli alt birimleri destek standına monte edilmeden önce, bir laminar akış başlığı içinde monte edilebilir. Dolaşan su banyosu ve ısıtılmış su akış yolu açıklık amacıyla çıkarılmıştır. </li><li> doku kültür ortamı 120 ml monte sistemi doldurun (Adım 5.15 bakınız). </li><li> 60 mm cul Kademe 2.14 den kateterize kalp matrisi yerleştirinbüyütme altında ture bulaşık kateter Adım 5.20 hücre süspansiyonu ile yüklü x 1 iğne 22 g ile 1 ml şırınga bağlanıp. Bu montaj kalbi embolizan önlemek için hava kabarcıkları serbest olduğundan emin olun. </li><li> Yavaşça koroner arterler ile kalp matriks içine hücre süspansiyonu 100 ul serpmek. Tamamlandığında, şırınga / iğne kombinasyonu ayırın. NOT: Yaklaşık bir yavaş perfüzyon. min başına 20 ul kalbi transit, damarların dışarı akan hücreleri önlemek için gereklidir. </li><li> biyoreaktör kalp kavanoz kapağının alt kısmında Luer bağlantısına sabitlenmiş bir 22g künt saplama, saplama üzerine kateter itin. </li><li> Peristaltik pompayı Şekil 2&#39;de belirtildiği gibi işlemin akışı gözlemleyin. Hazneden işlemin akışı Aşama 2.5 aort yerleştirilen kateter (Şek. 2 kırmızı yolu) kabarcık kapanı vasıtasıyla pompa yoluyla. damar dışına kalp dolaşım akışını gözlemlemekMedya rezervuar apeks, çevrimli gelen s ve damla. Not: perfüzyon akış hızı, yapısı damar direnci ve kalp boyutu ancak 100 ul 50 oranında bireysel etkenlere bağlıdır / dakika için iyi bir başlangıç ​​noktasıdır. ara zaman noktalarında, fonksiyonel değerlendirmeler yürütülebilir. Neonatal recellularized kalp boyutu ölçeği bu gerçekleştirilebilir ama optik tabanlı sistemler yetişkin fare kalplerinde kullanılmıştır gibi davranış yenerek ölçmek için kullanılabileceğini belirledik, değerlendirme sınırlar. 4 yapı uzatılmış için perfüze edilebilir (23 saat kadar) süreler. </li></ol>

<ol><li>Yusen, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Registry+of+the+International+Society+for+Heart+and+Lung+Transplantation%3A+Thirty-second+official+adult+lung+and+heart-lung+transplantation+report--2015%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-second official adult lung and heart-lung transplantation report--2015.</a> J Heart Lung Transplant. 34 (10), 1264-1277 (2015).</li>
<li>Go, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics--2014+update%3A+A+report+from+the+american+heart+association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics--2014 update: A report from the american heart association.</a> Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).</li>
<li>Kapelios, C. J., Nanas, J. N., Malliaras, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogeneic+cardiosphere-derived+cells+for+myocardial+regeneration%3A+current+progress+and+recent+results%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Allogeneic cardiosphere-derived cells for myocardial regeneration: current progress and recent results.</a> Future Cardiol. 12 (1), 87-100 (2016).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion+decellularized+matrix%3A+Using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Perfusion decellularized matrix: Using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).</li>
<li>Porrello, E. R., Olson, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neonatal+blueprint+for+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A neonatal blueprint for cardiac regeneration.</a> Stem Cell Research. 13 (3 Pt B), 556-570 (2014).</li>
<li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+regenerative+potential+of+the+neonatal+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart.</a> Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).</li>
<li>Polizzotti, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuregulin+stimulation+of+cardiomyocyte+regeneration+in+mice+and+human+myocardium+reveals+a+therapeutic+window%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Neuregulin stimulation of cardiomyocyte regeneration in mice and human myocardium reveals a therapeutic window.</a> Sci Transl Med. 7 (281), 281ra45(2015).</li>
<li>Jesty, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-kit%2B+precursors+support+postinfarction+myogenesis+in+the+neonatal%2C+but+not+adult%2C+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (33), 13380-13385 (2012).</li>
<li>Ambrosy, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Global+Health+and+Economic+Burden+of+Hospitalizations+for+Heart+Failure%3A+Lessons+Learned+From+Hospitalized+Heart+Failure+Registries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">The Global Health and Economic Burden of Hospitalizations for Heart Failure: Lessons Learned From Hospitalized Heart Failure Registries.</a> J Am Coll Cardiol. 63 (12), 1123-1133 (2014).</li>
<li>Roger, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Executive+Summary%3A+Heart+Disease+and+Stroke+Statistics-2012+Update+A+Report+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics-2012 Update A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 125 (22), 188-197 (2012).</li>
<li>Kennedy-Lydon, T., Rosenthal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+regeneration%3A+epicardial+mediated+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+B%22%5BJournal%5D)">Cardiac regeneration: epicardial mediated repair.</a> Proc R Soc B. 282 (1821), 2147-2172 (2015).</li>
<li>Williams, C., Sullivan, K., Black, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partially+Digested+Adult+Cardiac+Extracellular+Matrix+Promotes+Cardiomyocyte+Proliferation+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthcare+Mat%22%5BJournal%5D)">Partially Digested Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Cardiomyocyte Proliferation In Vitro.</a> Adv Healthcare Mat. 4 (10), 1545-1554 (2015).</li>
<li>Borg, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+extracellular+matrix+components+by+neonatal+and+adult+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Recognition of extracellular matrix components by neonatal and adult cardiac myocytes.</a> Dev Biol. 104 (1), 86-96 (1984).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immnol%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr Protoc Immnol. 111, A3-B1-3 (2015).</li>
<li>Gilbert, T. W., Freund, J. M., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+DNA+in+biologic+scaffold+materials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Quantification of DNA in biologic scaffold materials.</a> J Surg Res. 152 (1), 135-139 (2009).</li>
<li>Akhyari, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quest+for+an+optimized+protocol+for+whole-heart+decellularization%3A+a+comparison+of+three+popular+and+a+novel+decellularization+technique+and+their+diverse+effects+on+crucial+extracellular+matrix+qualities%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities.</a> Tissue Eng Part C Methods. 17 (9), 915-926 (2011).</li>
<li>Lu, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repopulation+of+decellularized+mouse+heart+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Repopulation of decellularized mouse heart with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular progenitor cells.</a> Nat Commun. 4 (2307), 1-11 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Kalbin tekrarlanan perfüzyonları bu tekniğin bağımlılığı bir emboli kaçınma başarılı bir sonuç önemli bir bileşeni yapar. Adımlar 2,8-2,14 arasında çözümün değişikliklere Adımlar 2,2-2,6 kalbin ilk kateterizasyon itibaren, hangi taviz miyokard içine perfüzat akışını hava kabarcıklarının giriş izin verebilir manipülasyonlar vardır. Nedeniyle yenidoğan kalp küçücük boyutuna, damarsal bile dakikalık kabarcıklar böylece eksik decellularization render, bir teknik infarkt neden olabilir. Buna ek olarak, daha sonraki yıkama ad...

Kalp yetmezliği yaygın ve ölümcül olduğunu. Bu organlara kan akışını bozar ve vücut karşılanmamış metabolik taleplerini bırakır kalp, azalmış kontraktilite ile sonuçlanan ilerleyici bir hastalıktır. 5,7 milyon Amerikalı kalp yetmezliği olduğu tahmin ve Amerika Birleşik Devletleri&#39;nde 9 hastanede birincil nedenidir edilir. Amerika Birleşik Devletleri&#39;nde kalp yetersizliğinde hastaların tedavisinde kolektif maliyet yıllık 9-10 başına 300 $ milyar doları aşmaktadır. son dönem kalp yetmezliği için tek kesin tedavi ortotopik kalp naklidir. Her yıl, 100.000&#39;den fazla verici kalplerinde Birleşik Devletler 1-2&#39;de kalp nakli işlemleri için gerekli olduğu tahmin edilmektedir. Nedeniyle donörlerin sınırlı sayıda için, sadece yaklaşık 2.400 nakli ABD 2 her yıl yapılmaktadır. Açıkçası, bu organ yetersizliği diğer stratejiler nakline için ek organları üretmek için gerekli olarak ele alınması gerekenreddi ve kullanım süresi bağışıklık bastırılması ile ilişkilidir komplikasyonları önlemek için yon ve ideal olarak, bu organlar otolog olabilir. Memeli yetişkin kardiyomiyositlerde yaralanması üzerine sınırlı bir rejeneratif kapasitesini göstermek ama son kanıtlar memeli yenidoğan kalpleri yaralanma 5-8 aşağıdaki olağanüstü rejeneratif kapasitesini korumak olduğunu göstermektedir. Özellikle, kısmi cerrahi rezeksiyon sonrasında bir rejeneratif pencere doğum ve doğum sonrası gün arasında bulunmuştur 7. Bu rejeneratif dönemi fibrotik skar eksikliği, neovaskülarizasyon oluşumu, epicardium gelen anjiyogenik faktörlerin salınımı, kardiyomyosit çoğalması 5-8 ile karakterizedir 11. Bu zaman reaktif pencere biyoyapay kalbin gelişiminde malzemenin yeni bir kaynak olarak yenidoğan kalp kullanarak potansiyel sağlar. hücre dışı matris cardiomyocyt teşvik etmek için önemli ipuçları sağlamak için bilinene çoğalması ve büyümesi. Yenidoğan ve yetişkin matrisler 12 ve yenilenmesini teşvik etme yeteneği moleküllerin durumu belirgin farklılıklar 13 araştırılmıştır. Hücresizleştirilmiş yetişkin matrisler hücre yeniden popüle bir ECM iskele ve biyosentetik bir kalp üretimi temin etmek üzere çeşitli çalışmalarda kullanılmıştır. kök hücre teknolojileri bu çalışmalar ve yeni keşifler, hızla ilerleyen ederken, birkaç engeller yerine getirilmesi için henüz. Örneğin, matris duvara matrisin doğal yapısını, hücre entegrasyon korunmasında sınırlamalar ve yeteneği bu yaklaşımın başarısı çoğalmasına ve büyüme tüm sınır desteklemek. Üstün rejeneratif özellikler yenidoğan kalp atfedilen olsa da, böyle bir doku kullanarak pratik yönleri onun keşif sınırlıdır. Yenidoğan kalp gösterdi rejeneratif kapasitesi dayanarak, bir geliştirerek yeni matris geliştirdikP3 fare kalp için Decellularization tekniği. Daha önce 6 belirlenir, ancak kalp hasat, decellularize ve recellularize için yeterince büyük olduğu gibi kardiyak rejenerasyon pencere içinde olduğu gibi P3 kalp bu çalışmalar için seçildi. Bu çalışmanın amacı, bir yenidoğan fare kalp bir matris oluşturmak fizibilite göstermektir. Çalışmalarımız ECM yapısal ve proteinli bütünlüğünü koruyarak bir dakika, yenidoğan kalp decellularizing fizibilitesi için kanıt. Biz de MCherry ifade eden kardiyomiyositlerinin bu kalp ECM recellularize yeteneğini göstermek ve recellularization aşağıdaki çeşitli kardiyak belirteçlerin ifadesi için bu kardiyomiyositlerde inceledik. Bu teknoloji, bir biyosentetik kalbin gelişiminde neonatal matrisin üstünlük denemeden geçirilmesine izin verecektir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Fare kalbi izolasyonu için malzemeler</güçlü></td></tr><tr><td>P1 fare yavruları (gösterildiği gibi; B6; D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J)</td><td>Jackson Laboratories</td><td>21577</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>60 mm Kültür kabı</td><td>BD Falcon</td><td>353004</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su pH 7.4 (steril)</td><td>Hidroksilon</td><td>SH30256.01</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Bıçak</td><td>Stanley</td><td>28-510</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Standart Makas</td><td>Moria Bonn (Güzel Bilim Araçları)</td><td>14381-43</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Yaylı Makas 10 cm</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>15024-10</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Vannas Yaylı Makas - 3 mm Kesici Kenar</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>15000-00</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>#5 Forseps</td><td>Kukla (Güzel Bilim Aletleri)</td><td>11295-00</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td colspan="4">2. Hücre dışı bırakma malzemeleri</güçlü></td></tr><tr><td>Giriş adaptörü</td><td>Chemglass</td><td>CG-1013</td><td>otoklavlanabilir</td></tr><tr><td>Septum</td><td>Chemglass</td><td>CG-3022-99</td><td>otoklavlanabilir</td></tr><tr><td>1/8 inç. ID x 3/8 OD C-Flex boru</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06422-10</td><td>otoklavlanabilir</td></tr><tr><td>Erkek luer - 1/8 "hortum dikeni adaptörü</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K33</td><td>otoklavlanabilir</td></tr><tr><td>Dişi luer 1/8" hortum dikeni adaptörü</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K26</td><td>otoklavlanabilir</td></tr><tr><td>Prolene 7-0 cerrahi sütür&nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>8648G</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Halka standı</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47807</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Kelepçe</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-769-6Q</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Kelepçe normal tutucu</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-754Q</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>60 cc şırınga namlusu&nbsp;</td><td>Coviden</td><td>1186000777T</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Beher</td><td>Kimble</td><td>14000250</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>22 G x 1 Şırınga İğnesi</td><td>BD</td><td>305155</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>12 cc şırınga</td><td>Coviden</td><td>8881512878</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>3 yollu durdurma musluğu</td><td>Smith Medical</td><td>MX5311L</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>PE50 boru</td><td>BD Clay Adams Intramedic</td><td>427411</td><td>Isı ile şekillendirilebilir olmalıdır. Polietilen önerilir.</td></tr><tr><td>% 1 SDS</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td>Ultra saf sınıf önerilir. Taze çözelti hazırlayın ve kullanmadan önce sterilize edin.</td></tr><tr><td>% 1 Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>%10'luk bir stoktan taze solüsyon hazırlayın ve kullanmadan önce filtreyle sterilize edin.</td></tr><tr><td>Steril dH2O</td><td>Hyclone</td><td>SH30538.02</td><td>veya MilliQ sistemi arıtılmış su.</td></tr><tr><td>1x Pen/Strep</td><td>Corning CellGro</td><td>30-001-Cl</td><td>veya eşdeğeri &nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">3. DNA kantitasyonu için malzemeler< / güçlü ></td></tr> <tr><td>Proteinaz K</td><td>Fisher</td><td>BP1700</td><td>>30 U / mg aktivitesi</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>MgCl 2 &#183; 6H2O</td><td>Mallinckrodt</td><td>5958-04</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Tris baz/hidroklorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503/T5941</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Pico-Green dsDNA test kiti</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr>, <td colspan="4">4 okumak için florimetre gerektirir. Doku </güçlü></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>veya domuz</td></tr><tr><td>derisinden eşdeğer Jelatin Tip A'nın</td> sabitlenmesi ve kesitlenmesi için yöntem <td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td>, <td>300 çiçek veya daha büyük</td></tr><tr><td colspan="4">5 olmalıdır. Doku histolojisi için yöntem< / güçlü ></td></tr> <tr><td>Kriyokalıplar 10 x 10 x 5 mm</td><td>Tissue-Tek</td><td>4565</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Hacker / Bright</td><td>Model OTF</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Mikroskop Slaytları & nbsp; 25 x 75 x 1 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-19</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Hematoksilen 560 &nbsp;</td><td>Surgipath/Leica Selectech&nbsp;</td><td>3801570</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Surgipath/Leica Selectech&nbsp'yi</td> <td>tanımlayın</td>;<td>3803590</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Mavi tampon&nbsp;</td><td>Surgipath/Leica Selectech&nbsp;</td><td>3802915</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Alkolik Eozin Y 515&nbsp;</td><td>Surgipath/Leica Selectech&nbsp;</td><td>3801615</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Formül 83 Ksilen ikamesi&nbsp;</td><td>CBG Biyoteknoloji&nbsp;</td><td>CH0104B</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Permount Montaj Ortamı&nbsp;</td><td>Fisher Kimya&nbsp;</td><td>SP15-500</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Kollajen IV Antikoru</td><td>Rockland</td><td>600-401-106.1</td><td>veya eşdeğeri</td></tr> <tr><td>&-Aktinin Antikoru</td><td>Abcam</td><td>AB9465</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>mCherry Antikoru</td><td>Abcam</td><td>AB205402</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>NKX2.5 Antikoru</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>SC-8697</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Eşek anti-fare AF488 Antikor</td><td>Yaşam Teknolojisi</td><td>A21202</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Eşek anti-tavuk AF594 Antikor</td><td>Jackson İmmünoaraştırma</td><td>703-585-155 &nbsp;</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Eşek anti-keçi CY5 Antikoru</td><td>Jackson İmmünoresearch&nbsp;</td><td>705-175-147</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Fab Fragment Keçi Anti-Tavşan IgG (H + L) AF594</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-587-003</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr>DAPI <td>ThermoFisher</td><td>P36930</td><td>veya eşdeğeri</td> <td>ile Prolong Gold Antifade Mountant</td></tr> <tr><td colspan="4">6. Neonatal ventriküler kardiyomiyositlerin ön kaplama< / güçlü ></td></tr> <tr><td>HBSS (Ca, Mg Free)</td> kullanılarak izolasyonu <td>Hyclone</td><td>SH30031.02</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td> <td>Corning CellGro</td><td>25-060-Cl</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Hücre Süzgeci</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>50 ml tüp</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Primeria 100 mm </td><td>plakalar Corning</td><td>353803</td><td>Primeria yüzeyi, daha yüksek bir miyosit saflığını teşvik eden fibroblast bağlanmasını artırır</td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Difco</td><td>215240</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>DNase II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8764</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>DMEM (Delbecco'nun Minimal Esansiyel Ortamı)</td> <td>Hyclone</td><td>SH30022.01</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>B12 Vitamini&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V6629</td><td>veya muadili</td></tr><tr><td>Fibronektin kaplı plakalar&nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>354501</td><td>veya muadili</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu&nbsp;</td><td>Hidroklon</td><td>SH30910.03</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Kalp biyoreaktör cam eşyalar</td><td>Radnoti Cam Teknolojisi</td><td>120101BEZ</td><td>Otoklavlama veya gaz ile sterilize edilebilir olmalıdır.</td></tr></tbody></table>

yenidoğan kardiyak iskeleleri: rejeneratif Çalışmaları roman matrisler

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

Son dönem kalp yetmezliğinin tek kesin tedavisi ortotopik kalp naklidir. Her yıl, Amerika Birleşik Devletleri'nde 100,000'de kalp nakli prosedürleri için 2'den fazla donör kalbe ihtiyaç duyulduğu tahmin edilmektedir1-2. Sınırlı sayıda bağışçı nedeniyle, ABD'de her yıl yalnızca yaklaşık 2.400 nakil gerçekleştirilmektedir2. Hücre tedavisi çalışmalarından mekanik yardımcı cihazların implantasyonuna kadar çok sayıda yaklaşım, kalbin kendini onarması veya başarısız kalbi dinlendirmesi için tek başına veya kombinasyon halinde ikna edilmesi girişiminde bulunmuştur3. Bu çabalara rağmen, ventriküler destek cihazları hala büyük ölçüde transplantasyona köprü kurmak amacıyla kullanılmaktadır ve hücre tedavilerinin faydası, bazı iyileştirici vaatlerde bulunsalar da, hala klinik çalışmalarla sınırlıdır. Ek olarak, doğrudan ksenotransplantasyon denenmiş ancak immün rejeksiyon nedeniyle başarı sınırlı kalmıştır. Açıktır ki, transplantasyon için ek organlar üretmek için başka bir strateji gereklidir ve ideal olarak, bu organlar rejeksiyon ve ömür boyu immünosupresyon ile ilişkili komplikasyonlardan kaçınmak için otolog olacaktır. Hücreden arındırma, doğal hücre dışı matrisi (ECM) veya yapı iskelesini ortaya çıkarmak için yerleşik hücreleri dokulardan çıkarma işlemidir. Perfüzyon decellularizasyonu, dokunun mekanik özelliklerinin büyük bir kısmını olduğu gibi bırakırken, dokunun üç boyutlu yapısının tam olarak korunmasını sağlar4. Bu iskeleler, araştırma modelleri ve muhtemelen nakil için çok ihtiyaç duyulan organları oluşturmak için sağlıklı hücrelerle yeniden popülasyon için kullanılabilir. Olağanüstü kardiyak rejeneratif yetenekleri koruduğu bilinen yenidoğan farelerden (P3) alınan iskeleleri5-8 deterjan aracılı hücre gidermeye maruz bıraktık ve bu iskeleleri murin kalp hücreleri ile yeniden doldurduk. Bu çalışmalar, yenidoğan kalp yapısının mühendisliğinin fizibilitesini desteklemektedir. Ayrıca, erken doğum sonrası kalplerin ECM'sinin, gelişmiş yeniden hücreselleştirme stratejileriyle sonuçlanacak ipuçlarını barındırıp barındıramayacağının araştırılmasına izin verirler.

decellularization Ortalama olarak, bu protokolü kullanarak bir P3 kalp Decellularization zamanı yaklaşık 14 saattir. P3 yenidoğan için 23 mg, ortalama kalp ağırlığı verilmiş. Acellularity Şekil 3a tamamen bozulmamış P3 yenidoğan kalp (bütün montaj). Şekil 3b. Decellularization aşağıdaki aynı kalp gösterir 4a Şekiller ve sırasıyla bozulmamış ve de...

Bu çalışmalarda, biz rejeneratif çalışmalarda kullanılmak üzere yeni, yenidoğan murin kardiyak iskeleleri için bir yöntem sağlamak.

Yenidoğan Kardiyak iskeleleri: Rejeneratif Çalışmaları Roman Matrisler

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

Bu metodolojinin genel amacı, rejeneratif çalışmalarda kullanılmak üzere neonatal mirian kalp dokusundan yeni iskeleler üretmektir. Bu yöntem, rejeneratif kardiyolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Ekstraselüler matris, proliferasyon kapasitesine sahip kalp dokusundan türetildiği için hücre-matris etkileşimlerinin incelenmesi için yeni bir model sunar.Bu tekniğin temel avantajı, neonatal hücre dışı matrisin yeniliklerinin keşfedilmesine olanak tanımasıdır. Prosedürü, laboratuvarımdaki bir teknisyen olan Stefan Kren uygulamalı olarak gösterecektir. Prosedüre başlamadan önce, daha küçük ve daha ince bir kateter oluşturmak için dört santimetrelik bir PE 50 tüp kesitini küçük bir alkol alevi üzerinden geçirin.PO'nun her iki yanından iki simetrik kateter elde etmek için uçları uygun boyutlarda kesin ve tüpün kesik ucunu, ince uçtaki açıklığa bir flanş eriterek sabitlemek için kısa süreliğine alevde tutun. Ardından, 12 mililitrelik bir şırıngayı PBS ile doldurun ve şırıngaya üç yollu bir musluk yerleştirin. Musluğa 22 gauge bir iğne takın ve iğneyi septumdan geçirin.Ardından, PE tüp kateteri iğnenin üzerine kaydırın ve düzeneği PBS ile yıkayın. Kateter düzeneği hazır olduğunda, neonatın göğüs bölgesini %70 etanol ile silin. Daha sonra, beş numara bir pens ile dokuyu yanlara doğru çekerken, standart bir makas kullanarak cildi göğüsten kesin.Ardından, sternumun hemen altından karın duvarını delin ve pensle ksifoid çıkıntıyı kavrayın. Göğsün her iki yanındaki kaburgaları keserken sternumu vücuttan rostral olarak geri çekin ve göğüs kafesini üst tarafa doğru açın. Kalp görünür olduğunda, aort arkı ile kaval ve pulmoner venleri açığa çıkarmak için timusun iki ana lobunu diseke edecek şekilde yanlara doğru çekin.10 santimetrelik yaylı makas kullanarak, aort arkundan çıkan ana arterleri ve aortun kendisini kesin. Kalbi, trakea ve özofagustan ayırıp öne doğru yansıtmak için kesilen damarların uçlarını tutun; ardından akciğerler ile kalp arasını ve kalbin her iki yanını keserek pulmoner vaskülatürü ve diğer ana venleri kesin. Daha sonra, ana damarların kesilen uçlarını tutarak kalbi mediastinumdan çıkarın ve kalbi steril PBS içeren 60 milimetrelik bir kültür kabına yerleştirin.Kalbi deselülerize etmek için, kültür kabını bir diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin ve kateter düzeneği iğnesini, aort kapakçığını geçmeyecek şekilde aortanın içine yerleştirin. İğneyi 7-0 sütürle bir kez bağlayarak sabitleyin, kateterin falanjını proksimal olarak bağın üzerine yaslayarak sıkı bir sızdırmazlık sağlayın ve kalbi nazikçe PBS ile perfüze edin. Sızıntı yoksa, latent kan uzaklaştırıldıkça doku homojen bir şekilde beyazlaşacaktır.Septumu giriş adaptörünün boyun kısmına yerleştirin ve septumun kenarlarını camın üzerine doğru katlayın. Ardından, 20 mmHg basınç üretecek uzunlukta bir hat aracılığıyla, distile su içinde %1 Sodyum dodesil sülfat içeren 60 mililitrelik bir rezervuar bağlayın ve kalbi 14 saat boyunca SDS ile perfüze edin. Perfüzyon sonunda, kalp, gözle görülür herhangi bir doku kalmamış şekilde şeffaf hale gelecektir.Sistemi musluğa kadar kalan SDS çözeltisiyle yıkayın ve rezervuarı 10 mililitre deiyonize su ile doldurun. Ardından kalbi sırasıyla 10 mililitre %1 Triton X-100, 10 mililitre deiyonize su ve penisilin ile streptomisin içeren 60 mililitre PBS ile perfüze ederek yıkayın. Son perfüzyondan sonra kalbi, PBS ve antibiyotikler içerisinde dört santigrat derecede saklayın.Dokuyu yeniden hücrelendirmek için, kateterlenmiş kalp matrisini bir diseksiyon mikroskobu altında 60 milimetrelik bir kültür kabına aktarın ve ilgili hücrelerle doldurulmuş 22 gauge iğne uçlu bir mililitrelik şırıngayı katetere bağlayın. Düzenekte hava kabarcığı bulunmadığını doğrulayın ve koroner arterler aracılığıyla kalp matrisine dakikada 20 mikrolitre hücre süspansiyonu ile nazikçe perfüzyon yapın. 100 mikrolitre hücre iletildiğinde, şırıngayı ayırın ve kateteri, bir biyoreaktör kalp kavanozu kapağının alt kısmındaki luer bağlantısına sabitlenmiş 22 gauge küt bir uç üzerine itin.Şimdi, perisaltik pompayı çalıştırın ve akışın rezervuardan pompa aracılığıyla hava kabarcığı tuzağına, oradan katetere doğru ilerlediğini; kalp sirkülasyonunun ise venlerden çıkıp apeksden damladığını ve medya rezervuarına geri döndüğünü doğrulayın. Bu görüntülerde, sağlam ve deselülarize edilmiş kalplerin hematoksilin ve eozin boyaması gösterilmektedir. Deselülarize edilmiş kalpte hematoksilin pozitif çekirdeklerin yokluğuna ve eozinofilik yapıların azaldığına dikkat edin.Sağlam ve deselülarize edilmiş neonatal kalplerdeki neonatal hücre dışı matris içeriğini değerlendirmek için yapılan immünboyama, kollajen IV'ün hem sağlam hem de deselülarize kalpte güçlü bir şekilde eksprese edildiğini ve bu proteinin lokalizasyonunun hücre uzaklaştırma sonrası korunduğunu, buna karşın DAPI pozitif çekirdeklerin etkili bir şekilde uzaklaştırıldığını göstermektedir. Deterjan tabanlı deselülarizasyonun diğer dokularda kullanıldığı raporlarla tutarlı olarak, deterjan tabanlı deselülarizasyon sonrası neonatal kalplerde DNA içeriği de azalmıştır. Bu görüntülerde, sol ventrikül duvarına göç etmiş reselülarize kardiyomiyositler gözlemlenebilir.Perfüzyondan sonraki 23 güne kadar, göç eden bu hücreler kardiyak progenitör hücre markerları, mCherry, farklılaşmış kardiyomiyosit markerları veya DAPI için pozitif olabilir ve hücrelerin çoğunluğu dört markerın tamamını eksprese eder. Uzmanlaşıldığında, bu teknik doğru şekilde yürütülürse 34 saatte tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, perfüzyon aparatı yoluyla hava girişine izin vererek kalpte emboli oluşturmamaya dikkat etmek önemlidir.Bu prosedürün ardından, in vitro ortamda proliferatif greftler veya hatta 3D kalpler oluşturmak için jel üretimi ve 3D baskı kullanılabilir. Bu teknik, araştırmacıların kardiyak rejenerasyonu teşvik etmelerinin yolunu açabilir. Bu videoyu izledikten sonra, neonatal fare kalbinin nasıl deselülerize ve reselülerize edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Sodyum dodesil sülfat ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın; kuru toz halindeki reaktifle çalışırken N-95 maske veya çeker ocak gibi önlemler her zaman alınmalıdır.

neonatal-cardiac-scaffolds-novel-matrices-for-regenerative-studies

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Enjektabl bir matris jel decellularized doku hazırlanması ve sıçan miyokardın içine enjekte...

Miyokard Doku Mühendisliği Biyolojik Türetilmiş Enjektabl Malzeme imalatı

Bu protokolde, kılcal kuvvet litografisi kullanılarak iki farklı polimerik malzemeden yapılmış biyomimetik kardiyak hücre kültürü substratının imalatını gösteriyoruz.  Açıklanan yöntemler, in vitro ve in vivo uygulamalar için makroskopik kardiyak dokuların yapısını ve işlevini tasarlamak için ölçeklenebilir, uygun maliyetli bir teknik sağlar.

Kardiyak Doku Mühendisliği kılcal Kuvvetleri Litografi

Karmaşık dokunun son derece organize yapılarının oluşturulması için, birden fazla materyal ve hücre tipini entegre bir kompozitte bir araya getirmek gerekir.  Bu kombinatoryal tasarım, güçlü bir fibröz matris tabanı içeren iki farklı biyolojik olarak türetilmiş materyal ve yeni damar oluşumunu arttırmak için endotel hücreleri ile organa özgü katmanlı hücre tabakalarını içerir.

Doku Mühendisliği: Katmanlı Hücre Sheets teslimi için bir Multisellüler 3D İskele İnşaatı

Bu protokol, doğum sonrası 1. gün farelerinin sol ventrikülünde miyokard enfarktüsünün cerrahi indüksiyonu ile yüksek oranda tekrarlanabilir bir kardiyak rejenerasyon modelini tanımlar. Yöntem, hipotermik anestezinin indüksiyonunu ve sol ön inen koroner arterin ligasyonunu içerir.

Yenidoğan Farelerde Miyokard Enfarktüsü, Kalp Rejenerasyon Bir Model

Bu iletişim kuralı tam decellularization insan Miyokardiyum, hücre dışı matriks bileşenlerinin koruma sırasında açıklar. Microparticles ve cytoprotective kendi kendine montaj hidrojel üretiminde hücre dışı matriks sonuçlarının daha fazla alay.

İnsan kalp dokusu hücre dışı matriks hidrojel Vitro ve In Vivo uygulamaları için kendi kendine montaj doğru işlenmesi

Kardiyak hücre dışı Matriks (ECM) anahtar süreçlerinde doku ve organların fizyolojik hayatı boyunca remodeling kalıcı süre alacak moleküllerinin karmaşık bir ağdır. Fetal ve yetişkin kalplerin standart decellularization 3D bir bağlamda yerel mimari ve biyomekanik özellikleri yakalayarak karşılaştırmalı deneysel çalışmalar hem dokuların izin verir.

Vitro çalışmalar için 3D benzeri platformlar olarak Fetal ve yetişkin kalp doku karşılaştırılabilir Decellularization Explants

Bu iletişim kuralı tatmin edici yapısal bütünlüğü ve zaman uyumlu dayak davranışı ile üç boyutlu iskele ücretsiz kalp doku oluşturmak için net bir kalıp tabanlı yöntemini açıklar.

Net kalıp tabanlı yöntemi iskele ücretsiz üç boyutlu kalp doku oluşturma

Decellularized kıkırdak elde edilen iskele osteokondral doku yeniden oluşturmak için kılavuz kıkırdak onarım için bir iskele ve bir araç olarak kullanılabilir. Bu yazıda ayrıntılı decellularization işlemini açıklar ve bu iskele tüp bebek ayarları'nda kullanmak için öneriler sunar.

Decellularized matris kıkırdak elde edilen iskele imalatı

Burada, yüksek verimli, çok boyutlu bir formatta kültürlenmiş, insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerden kardiyak sferoidlerin (CSs) üretilmesi ve kriyoprezervasyonu için bir dizi protokol sunulmaktadır. Bu üç boyutlu model, hastalık modellemesi, yüksek verimli taramalar için sağlam bir platform olarak işlev görür ve kriyoprezervasyondan sonra işlevselliğini korur.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyak Sferoidlerin Üretimi, Yüksek Verimli Taraması ve Biyobankacılığı

Bu çalışma, kritik aort darlığı veya hipoplastik sol kalp sendromu gibi konjenital kardiyak defektlerde görüldüğü gibi, endotelyal-mezenkimal geçişe bağlı fibrozun bir hayvan modelini sunar, bu da ayrıntılı histolojik doku değerlendirmesine, düzenleyici sinyal yollarının tanımlanmasına ve tedavi seçeneklerinin test edilmesine olanak tanır.

Endotelyal-mezenkimal geçiş çalışması için yenidoğan heterotopik sıçan kalp nakli modeli

Yetişkin insan kalbinden izole edilen fibroblastlar, miyokarda özgü hücre dışı matrisi üretmek için jelatin kaplı tabaklar üzerinde birleşecek şekilde kültürlendi. Hücreden arındırmadan sonra, bu substrat diğer kardiyak hücrelerin ve hücre-matris etkileşimlerinin kültürü ve incelenmesi için kullanılabilir.

Kültür Çanağı Kaplaması için Yetişkin İnsan Fibroblastlarından Kardiyak Hücre Dışı Matriks Üretimi

Keşfedin yenidoğan fare kalp dokusundan kardiyak iskeleler oluşturma yöntemini rejeneratif kardiyoloji araştırmaları için. Bu teknik hücre-matriks etkileşimlerini incelemeye ve yenidoğan ekstraselüler matriksin benzersiz özelliklerini keşfetmeye olanak tanır.

Yenidoğan Kardiyak iskeleleri: Rejeneratif Çalışmaları Roman Matrisler

Daha fazla video keşfet