Dijital Holografik Mikroskop ile multimodal Kantitatif Faz Görüntüleme Doğru Bağırsak İltihabı ve Epitel Yara Şifa Değerlendirdi

Bu çalışmanın genel amacı, in vitro epitelyal yara iyileşmesinin multimodal değerlendirmesi için bağırsak iltihabı kolon dokusu örneklerinin otomatik lekesiz kantitatif faz kontrast görüntülemesini sağlamak için dijital holografik mikroskopi veya DHM kullanmaktır. Bu yöntem, gastrointestinal inflamasyon ve yara iyileşmesi alanındaki hastalık aktivitesi, iltihaplı insan ve deniz ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; Bu tekniğin temel avantajı, hücre ve dokunun fiziksel parametrelerle lekesiz ve objektif bir şekilde tespit edilmesine ve ölçülmesine izin vermesidir. Prosedürleri göstermek, Biyomedikal Teknoloji Merkezi'nden bir teknisyen olan Fittest Ketelhut olacak.

Hücre kültürünü kurun, dört kez on ila beşinci, Caco, 37 santigrat derecede% 95 nemde ve yüzde beş karbondioksitte FBS ve antibiyotiklerle desteklenmiş RPMI ortamında yüksek kültür ekleri ile donatılmış 35 milimetre Petri kaplarında santimetre kare iki hücre inkübe edin. İki gün sonra, hücreleri ilgilenilen ajanla tedavi edin ve kültürleri 24 saat daha inkübatöre geri koyun. Ertesi gün, süpernatanı aspire edin ve ekleri çıkarmak için cımbız kullanın.

Ölü hücreleri ve kalan hücresel bileşenleri yara bölgesinden çıkarmak için kültürü bir mililitre HEPES tamponlu hücre kültürü ortamı ile bir ila iki kez yıkayın. Ardından, iki mililitre taze HEPES tamponlu ortam ekleyin ve kabı kapatın. Şimdi Petri kabını dijital holografik mikroskoba yerleştirin ve 10 x objektifi seçin.

Görüntü alma yazılımını açın ve parlak alan görüntüleme modunu seçin. Isıtma odasını 37 santigrat dereceye ayarlayın ve kültürü ısıtma odasına yerleştirin. Ardından, canlı izleme penceresinde tek bir devasa hücre tabakası ve her iki tarafta ölü hücre veya serum içermeyen düz kenarlı uygun bir yara görüntülenene kadar görüntüleme alanını hareket ettirin.

İlk yara bölgesinin beyaz ışıklı bir görüntüsünü yakalayın. Ardından, beyaz ışık aydınlatmasını kapatın ve dijital holografik mikroskopi modunu seçin. Lazer aydınlatmasını açın ve hologram kaydı için üç milisaniyeden daha kısa bir pozlama süresi seçin.

Holografik erişim dışı girişim saçakları yeterli bir kontrastla görünüyorsa, bir örnek hologram yakalayın ve görüntü kalitesini kontrol etmek için yeniden yapılandırma yazılımıyla nicel bir faz görüntüsünü yeniden oluşturun. Ardından, uygun son noktada kaydı durdurarak yaranın hızlandırılmış bir DHM gözlemini başlatın ve beyaz ışık aydınlatması altında numunenin son bir görüntüsünü elde edin. Akut Dekstran Sodyum Sülfat veya DSS kolit indüksiyonu için, farelerin ablibidimine 100 mililitre otoklavlanmış su içinde çözülmüş üç gram DSS sağlayın.

Yedi gün sonra, kontrol ve tedavi edilen hayvanlardan İsviçre haddelenmiş kolon örneklerinin yedi mikrometre kalınlığında bölümlerini elde edin. Her bölümü 50 ila 100 mikro litre PBS'ye daldırın ve numuneleri ayrı cam kapak fişleri ile kaplayın. Slaytların alt kısımlarının toz ve diğer kirlerden arınmış olduğunu onaylayın.

Ardından, ilk slaydı mikroskop tablasına yerleştirin ve ilgilenilen doku alanı görünene kadar görüş alanını ayarlayın. Numuneyi keskin bir odağa getirin ve görüntü elde etme yazılımında parlak bir alan görüntüsü yakalayın. Ardından, DHM görüntüleme modunu seçin ve lazer ışığı aydınlatmasına geçin.

Üç milisaniyenin altında bir pozlama süresi ayarlayın ve holografik kapalı erişim girişim saçaklarının canlı görüntüleme penceresinde yeterli kontrastla göründüğünü onaylayın. Ardından, dokunun dijital hologramını yakalayın. Endoskopik olarak orta ila şiddetli kolit kanıtları arasında kolon duvarı kalınlaşması, vasküler patern değişiklikleri, lif nedüdasyonları ve mukozal yüzey granülaritesi bulunur.

Kolonik kesitlerin konvansiyonel histolojik değerlendirmesi, ağırlıklı olarak submukozada bulunan kontrol hayvanlarına karşı tedavi edilen DSS'nin kolon duvarında belirgin bir ödem olduğunu ortaya koymaktadır. Karşılık gelen kantitatif DHM faz kontrast görüntüleri ve ilgili kırılma indisi haritaları da, epitelyal menstroma yoğunluklarında gözle görülür farklılıklar olmaksızın bu doku değişikliklerinin özellikle doğal boyanmamış doku örneklerinde belirgin olduğunu göstermektedir. Kolitik farelerin epitel, submukoza ve stromasında kırılma indisi, sağlıklı kontrollere kıyasla önemli ölçüde azalır ve deney hayvanlarında nispi vücut ağırlığı kaybı ile kırılma indisi arasında önemli bir korelasyon vardır.

Burada, 45 saat boyunca dijital holografik mikroskopi ile bir yara iyileşme testinin temsili sürekli izlenmesi gösterilmektedir. İyileşme süreci boyunca hücre kaplı yüzey alanının, ortalama hücre kalınlığının ve hücresel kuru kütlenin hesaplanmasına izin vermek. DHM'nin epitelyal yara iyileşmesinin sürekli izlenmesine izin verirken, aynı zamanda sitokin kaynaklı hücre değişiklikleri hakkında biyo çekirdek bilgi sağladığını gösterdik.

Ayrıca, kırılma indeksi değişikliklerinin ölçümü yoluyla DHM ile kolit modellerinde ve insan kolon dokusu örneklerinde histolojik hasarın doğru bir şekilde değerlendirilmesini gösteriyoruz. DHM, optik yol uzunluklarının gecikmesinin tespitine dayandığından, doku yoğunluğu, kuru kütle veya hücresel kalınlık gibi mutlak biyofiziksel parametreler lekesiz kantitatif faz kontrast görüntüleme ile analiz edilebilir. DHM'nin yaygın araştırma mikroskopları ile doruk noktasına ulaşması ve tekniğin sağlamlığı, bu yöntemin hücre biyolojisi ve dijital patolojide rutin uygulamalarının önünü açmaktadır.

Bu videoyu izledikten sonra, biyomedikal laboratuvar ortamında canlı hücre kültürlerinin dokularının analizi için dijital holografik mikroskopinin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. Sonuç olarak, DHM, inflamasyon mutlak parametrelerinin değerlendirilmesinin yanı sıra, translasyonel tanısal kullanım için yüksek potansiyele sahip epitelyal istemli in vitro miktarın basitleştirilmiş bir şekilde ölçülmesi için değerli, yeni ve kantitatif bir araç oluşturur.