Name: Dijital Holografik Mikroskop ile multimodal Kantitatif Faz Görüntüleme Doğru Bağırsak İltihabı ve Epitel Yara Şifa Değerlendirdi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Keşfedin dijital holografik mikroskopi ile bağırsak iltihabının ve epitel yara iyileşmesinin lekesiz, otomatik kuantitatif görüntülenmesini. Bu yöntem Caco-2 hücreleri ve kolon dokularında objektif analiz sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

El yazmasını düzelttiği için Faekah Gohar'a teşekkür ederiz. Uzman teknik yardım için Sonja Dufentester ve Elke Weber'e teşekkür ederiz.

Tüm hayvan deneyleri Alman Hayvanları Koruma Kanunu uyarınca, bölgesel etik kurul (Landesamt für Natur, Çevre und Verbraucherschutz, LANUV, Almanya) tarafından onaylanmıştır. Münster Üniversitesi yerel etik kurul histolojik ve mikroskop analizi için insan dokularının kullanılmasını onayladı. 1. Hayvanlar ve Malzeme <ol><li> Yerel hayvan bakımı mevzuatına göre kadın ya da 20 gr 25 tartmak gerekli DSS-duyarlı suş erkek fareler ve evin kullanın. Kemirgenler için özel chow sağlamak ve su ad libitum içme otoklava. </li><li> Otoklavlanmış musluk suyu ile 5 gün: dekstran sülfat sodyum (36,000-50,000 Da DSS, molekül ağırlığı) ağırlık / hacim% 3 uygulanmasıyla, akut DSS kolit başlatmak. NOT: DSS gücü üretici ve toplu bağlı oldukça değişkendir. , Hastalık aktivitesinin uyarılması için ilk tedarikçisi tarafından sağlanan DSS test hangi da içinily vücut ağırlığı, güvenilir ve objektif bir göstergedir. </li><li> Kolon doku örneklerinin histolojik değerlendirme için, deney sonunda CO 2 insuflasyon (veya ulusal ve kurumsal rehberlere tarafından belirtildiği gibi) fareler euthanize. </li></ol> 2. Deneysel Kurulum DSS-kolit ve In-vitro Yara İyileşmesi Tahliller <ol><li> Hücre kültürü ve yara iyileşmesi testinin kurulması. <ol><li> 37 ° C&#39;de% 95 nem ve% 5 CO2 ortamında Caco-2 hücreleri, büyütün. % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin ile RPMI ortamı kullanın. </li><li> Yüksek kültür eki ile 35 mm Petri tabaklarda 4 x 10 5 hücre / cm2 yoğunluğunda Tohum Caco-2 hücreleri (bkz, Şekil 4A). NOT: insert yaralı bölgeyi temsil eden tanımlanmış hücre boş alan analiz edilecek ayrılmış iki hücre kaplı alanları oluşturur. </li><li> iki gün sonra, ortam seedin değiştirmeörn. Önce, otomatik pipet kullanılarak hücre artıkları ile arta kalan ortam aspire gerçekleştirmek fosfat tamponlu tuzlu su, 100 ul (PBS) ile yıkayın ve taze RPMI ortamı ya da serum yoksun orta ekleyin. </li><li> yara iyileşmesi davranış değişiklikleri tespit etmek için 20 ng EGF / ml serum ya da 2 ug mitomisin C / ml serum ile takviye edilmiş serum yoksun ortamında (% 0.1 FBS) içinde 24 saat süre ile kültür hücreleri. 24 saat boyunca kontrol hücrelerine normal RPMI ortamı ekleyin. </li><li> Kültür 24 saat sonra, kaldırma ve adım 3.4 de tarif edildiği gibi kültür ekleri atmak ve dhm gerçekleştirin. </li></ol></li><li> Akut DSS kolit indüksiyon <ol><li> (Ağırlık / hacim) DSS çözeltisi% 3 elde etmek için su otoklava 100 ml DSS hazırlanan, 3 g. 7 gün boyunca fareler ad libitum içme suyu yerine bu çözüm sağlar. fare / günlük DSS çözeltisi 5 ml hesaplayın. Kontrol farelerde ad libitum için DSS olmadan otoklavlanmış su sağlar. </li></ol></li><li> Kemirgen ve insan kolon cryostatic kesit hazırlanması<ol><li> Deneyin sonunda CO2 üfleme ile fareler öldürülür. </li><li> Laparotomi 23 tarafından hayvanların karın teşrih. dikkatle cımbız kullanarak tüm kolon çıkarın ve cerrahi makas kullanarak İleal ve rektal ucunu kesti. rektal sonuna kadar çekal boylamasına bir makasla kolon kesin ve kolon açın. PBS 24 ile yıkama ardından cımbız kullanarak örnekten tüm dışkı çıkarın. </li><li> içeriye kavisli mukoza ile rektal sonuna kadar çekal boylamasına tomurcuk bir pamuk ile tüm kolon yuvarlayarak İsviçre rulo hazırlayın. uygun kesme ısısı (OCT), bileşik kolonik örnekleri gömme ve sonraki kullanıma kadar -80 ° C&#39;de donduruldu tutun. </li><li> uygun kesme ısısı OCT bileşiği cerrahi numunenin insan kolon dokusunun yerleştirme ve sonraki kullanıma kadar -80 ° C&#39;de donduruldu tutun. </li><li> Bir cryoto yardımıyla Ekim-bileşik gömülü dokulardan 7 mikron kalınlığında kesilmiş bölümlerimuayene beni hemen önce. NOT: Optimum numune kalınlığı sebat ve soruşturma altında doku tipinin saçılma özelliklerine bağlıdır. nedeniyle kantitatif DHM faz kontrast görüntülerde ışık saçılması kolon doku, gürültü&gt; 10 mikron neden önemli bir artış dilim kalınlığı kullanılarak açıklanan deneyler için kalınlığı örnekleri &lt;5 mikron cryo kesme işleminden hasar kaynaklı eserler için daha yüksek bir risk gösterirken. </li><li> Bir bardak nesne taşıyıcı slayta bölümleri aktarın. </li></ol></li></ol> 3. Teknik Donanım, Dijital Hologram Edinme ve Değerlendirme Yazılım ve Prosedürler <ol><li> kantitatif hücre ve doku görüntüleme için dijital holografik mikroskop <ol><li> Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi, canlı hücre görüntüleme 25 için bir off-eksenli Mach-Zehnder dijital holografik mikroskopi sistemi kullanın. Mikroskop ile donatılmış olduğundan emin olun10X mikroskop objektifi 35 mm bir çapı olan bir cam bir nesne taşıyıcısı slaytlar ve Petri kutularına için bir tutucu ile birlikte, bir mikroskop aşamasında bir ısıtma odası kantitatif faz görüntüleme 25 fizyolojik 37 ° C sıcaklık ve yazılım korumak için. Not: Örneğin, Kemper ve ark 26 ile Langehanenberg diğ 27 de tarif edildiği gibi... NOT: Alternatif olarak, parlak bir alan mikroskobu ve canlı hücrelerin nicel faz görüntüleme ve disseke doku slaytları gerçekleştirme yeteneğine sahip benzer bir sistemi kullanın. </li><li> Temiz mikroskop lensi ve lens temizleme kağıdı ve toz veya diğer kirlilikler kaldırmak için mikroskop üreticisi tarafından tavsiye edildiği gibi bir temizlik maddesi (örneğin, etanol) ile kondansatör. </li><li> beyaz ışık aydınlatma &quot;konulu&quot; &quot;parlak bir alan&quot; görüntüleme modu ve anahtarı seçin, DHM mikroskop görüntü elde etme yazılımını başlatın. Köhler-illumin sağlamak(Alternatif olarak, standart bir görüntü elde etme yazılımı bu aşamada kullanılabilir) görüntü tedarik yazılımı canlı görüntüleme penceresinde örnek gözlemlerken mikroskop üretici tarafından tavsiye edildiği gibi örnek yapımı. NOT: Görüntü yoğunluğu görüş alanı içinde homojen dağıtılması gerekmektedir ve örnek pozisyon mikroskop odak sürücü ile optik yeniden odaklanma sırasında hareket etmemelidir. </li><li> Lazer ışığı &quot;konulu&quot; beyaz ışık aydınlatması ve anahtarı &quot;kapalı&quot; açmak &quot;DHM&quot; görüntüleme modunu seçin. Lazer ışığı ile aydınlatma homojen olup olmadığını kontrol edin (yani, ışık şiddeti homojen DHM mikroskop görüntüleme toplama yazılımı canlı görüntüleme penceresinde dağıldığı) ve off-eksen taşıyıcı girişim saçak deseni yeterli kontrast ile görüntülenir gözlemleyin çekilen görüntüler (dijital hologramlar). </li></ol></li><li> görüntüleme için kriyostat kesitleri hazırlanmasıDHM ile <ol><li> (Kalınlık, cam obje taşıyıcı üzerine kriyostat bölümü: 7 mikron, 2.3 de açıklandığı gibi) numune alın dondurucu. RT ve normal atmosfer, yaklaşık 5 dakika boyunca numune Defrost. </li><li> tamamen tamponu ile kaplanana kadar, bir pipet kullanılarak, doku bölümünün üzerine orta gömme kütlesi olarak 100 ul fosfat tamponlu tuz (PBS) - 50 ekleyin. Temiz bir cam kapak slip (cam kalınlığı 170 mikron) ile örnek örtün. NOT: Aşırı kurutma kırılma indeksi önemli değişiklikler ve örnek saçılma özelliklerini uyarabilir. </li><li> Cam taşıyıcı ve kapak kayma alt ışık saçılması neden olabilir toz ve diğer kirleticilerden temizlenir emin olun. Örnek parlak bir alan mikroskobu ve DHM ile soruşturma için hazırdır. </li></ol></li><li> DHM doku bölümlerinin kantitatif faz görüntüleme <ol><li> Dijital holografik mikroskop açın görüntüleme için 10X mikroskop merceği seçin. i başlatBüyücü edinimi DHM mikroskop yazılım ve parlak dosya görüntüleme modunu seçin. </li><li> mikroskop objektif bakan kapak kayma ile, mikroskop lamı tutucu) 2&#39;de açıklandığı gibi doku slayt yerleştirin. </li><li> DHM mikroskop parlak alan aydınlatma &quot;konulu&quot; anahtarı. mikroskop aşaması ile örnek yerleştirin ve ilgi doku alanı canlı izleme penceresinde görünür olduğundan emin olun. mikroskop odak sürücüsünü kullanarak görüntü netliğini iyileştirmek. Not: yanısıra ilgi alanı, doku olmayan sürgünün bir alan, görüş alanında mevcut olmalıdır. </li><li> görüntü elde etme yazılımı kullanarak keskin odaklanmış örnek parlak bir alan görüntü yakalamak. </li><li> Seç &quot;DHM&quot; görüntüleme modu, lazer ışığı aydınlatma &quot;konulu&quot; beyaz ışık aydınlatması &quot;kapalı&quot; açmak ve kapatmak. 3 milisaniyenin altında hologram kayıt için &quot;pozlama süresi&quot; seçtiğinizden emin hologr gözlemlemekaphic eksen dışı girişim saçaklar görüntüleme toplama yazılımı canlı görüntüleme penceresi yeterli kontrast görünür ve bir dijital hologram yakalamak. </li><li> parlak bir alan görüntüler ve farklı örnek alanların dijital hologramlar yeterli sayıda kaydedildi kadar 3.3.5 - Tekrar 3.3.3 adımları. Hologram satın alma artık tamamlanmıştır. </li></ol></li><li> DHM görüntüleme için yara iyileşmesi tahlilleri hazırlanması <ol><li> DHM ölçümler sırasında sabit sıcaklık koşulları temin etmek üzere 3 saat önce deney başlamadan göre - 1 DHM mikroskop Petri kabı ısıtma odasına açın. </li><li> Gerekli ekipman (2.3 anlatılan yara iyileşmesi tahlil için Petri kabı) ile tezgah hazırlayın pipetler, cımbız, Petri kabı için cam kapak, 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES), fizyolojik hücre kültür ortamının tamponlu steril bir ortamda numune hazırlama için sıcaklık (37 ° C). NOT: </strong&gt; Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM)% 10 fetal dana serumu (FCS), 20 mM HEPES (4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit) ve 850 mg / L NaHCO 3 oluşmaktadır. </li><li> Petri kabı, plastik kapağı çıkarın ve bir pipet ile hücre kültür ortamı çıkarın. cımbız kullanarak Petri kabı alttan çıkartın. </li><li> Ölü hücreleri ve yara alanında kalan hücre bileşenleri (örneğin, serum) ortadan kaldırmak amacıyla tamponlu 1 mi HEPES hücre kültürü ortamı ile 2 kez - Örnek 1 yıkayın. 2 ml HEPES tamponlu hücre kültür ortamı ekleyin ve cam kapaklı Petri kabı kap. </li><li> cam kapak ve Petri kabı alt toz ve diğer kirleticilerden temizlenmiş olduğundan emin olun. Örnek DHM ile zaman atlamalı gözlem için hazırdır. </li></ol></li><li> DHM in vitro yara iyileşmesi sürekli modelli izleme <ol><li> önce 3 saat - DHM mikroskop yaklaşık 1 Petri kabı ısıtma odasına açınDeneyin başlamasından DHM ölçümler sırasında sabit sıcaklık koşulları temin etmek üzere. </li><li> Dijital holografik mikroskop &quot;konulu&quot; anahtarı, görüntüleme için 10X mikroskop merceği seçin. DHM mikroskop görüntü elde etme yazılımını başlatın ve &quot;aydınlık alan&quot; görüntüleme modunu seçin. Petri kabı ısıtma haznesi fizyolojik bir sıcaklık (37 ° C) çalıştığından emin olun. </li><li> DHM mikroskop etüvde 4&#39;te tarif edildiği gibi hazırlanmıştır yara iyileşme testi ile petri) yerleştirin. </li><li> parlak bir alan görüntüleme modunu seçin ve DHM mikroskop görüntü elde etme yazılımı canlı izleme penceresinde gözlemlerken mikroskop aşaması ile örnek yerleştirin. numunenin istenen alan keskin beyaz ışık aydınlatma altında odaklı görünür gözlemleyin. </li><li> Beyaz altında numune farklı alanlarda parlak bir alan görüntüler (yara alan ve konfluent hücreleri ile çevresinde) Yakalamagörüntü elde etme yazılım ve belge görünümü, hücre yoğunluğu ve homojenlik ışık aydınlatma. </li><li> DHM mikroskop &quot;parlak bir alan&quot; görüntüleme modunu seçin. DHM mikroskop görüntü elde etme yazılımı ile canlı izleme penceresinde beyaz ışık aydınlatma altında uygun bir yara alanı seçin. yara alan ölü hücreler ve hiçbir serum kalıntılarından serbest olduğundan emin olun ve her iki taraf da tercihen düz sınırları tek bir homojen hücre tabakası içerir emin olun. </li><li> DHM mikroskop görüntü elde etme yazılımı ile parlak bir alan görüntüleme modunda ilk yara alanının beyaz ışık görüntü yakalamak. </li><li> lazer aydınlatma &quot;konulu&quot; &quot;DHM&quot; modunu ve anahtarı seçin, beyaz ışık aydınlatması &quot;kapalı&quot; konuma getirin. hologram kayıt için aşağıdaki 3 msn bir pozlama süresi (parazit saçaklar t görüntü elde etme yazılımı canlı görüntüleme penceresi yeterli kontrast görünür holografik off-ekseni gözlemlemek seçinO mikroskobu DHM) ve dijital hologram yakalamak. </li><li> görüntü elde etme yazılımı ile DHM modunda örnek hologramı Yakalama ve görüntü kalitesini kontrol etmek için DHM mikroskop yeniden yazılımı ile kantitatif faz görüntüyü yeniden. </li><li> DHM mikroskop görüntü elde etme yazılımı ile time-lapse Hologram edinimi için - (5 dk örneğin, 3) uygun bir gecikme zamanı seçin. </li><li> örnek, yalnızca hologram edinimi sırasında lazer ışığı ile aydınlatılmış olduğu görüntü elde etme yazılımı time-lapse edinimi modunu seçin. </li><li> yara iyileşmesi testinin time-lapse DHM gözlem başlatın. </li><li> Amaçlanan süre sonra time-lapse edinimi durdurmak parlak bir alan görüntüleme modunu seçmek ve beyaz ışık görüntüleme altında numunenin son görünümünü belgelemek. </li></ol></li><li> disseke dokuların dijital hologramlar yeniden ve ölçmek için bir parametre olarak ortalama kırılma endeksi belirlemekdoku yoğunluğu <ol><li> Kemper ve ark., 26. ve Langehanenberg ve ark., 27 de tarif edildiği gibi, örneğin, DHM mikroskop, bir yazılım ile kesilerek dokuların dijital hologramlar kantitatif faz görüntüleri yeniden. </li><li> Çıkarları (ROI) 19 uygun seçilmiş bölgelerde farklı doku katmanları (epitel, submukoza, stroma) ortalama faz kontrast Δφ belirleyin. </li><li> Bir refraktometre kullanılarak veya alternatif literatürden uygun bir değer kullanarak gömme ortamın kırılma indeksi belirleyin. (tipik gömme ortamı için kırılma indisi değerleri: n Su = 1.334 28, N Fosfat tuz (PBS) = 1.337 29, N, hücre kültür ortamı = 1,337-1,339 29,30 tamponlu). </li><li> Ortalama faz kontrast 19 değerleri farklı doku katmanlarının kırılma indeksleri hesaplayın <img alt="denklem 1"src = &quot;/ files / ftp_upload / 54460 / 54460eq1.jpg&quot; /&gt; (1) NOT: Denklem. Kesilmiş, doku kalınlığı d (burada 7 um): 1 λ (λ = 532 nm Burada) lazer ışığının dalga boyu ve n, ortam burada gömülü maddenin (kırılma endeksi: orta = N PBS n bir Abbe-Refraktometre tarafından belirlenen = 1.337). </li></ol></li><li> Yeniden ve seri gözlem yara iyileşme time-lapse dijital hologramlar değerlendirmek <ol><li> DHM mikroskop yazılımı 26,27 ile yara iyileşmesi gözlem sırasında elde edilen zaman atlamalı hologram serisi kantitatif faz görüntüleri yeniden. </li><li> maksimum faz kontrast görüntü kantitatif faz görüntülerin her dizi normalleştirmek. </li><li> Her olabilir görüntü bölütleme nicel DHM faz görüntüler hücreler tarafından kapsanan alan: C, belirlemeözgür yazılım hücre profiler kullanılarak oluşturulan (www.cellprofiler.org 31). </li><li> Konum: C hücreler Δφ hücresinin ortalama faz kontrast hesaplayın. </li><li> Konum: C 15 ortalama faz kontrast Δφ hücreden hücre kuru kütle DM almak <img alt="denklem 2" src="/files/ftp_upload/54460/54460eq2.jpg" /> (2) NOT: 2 DM hücresel kuru kitle gösterir Denklem, S c hücreleri ve α = 0.002 m 2 / kg tarafından işgal edilmiş bir alan sunuyor. </li><li> Tamamlayıcı hücre kırılma indisi n, hücre ve hücre kültür ortamı n ortamın kırılma endeksi belirlemek. 30 anlatıldığı gibi asılı hücrelerden ayrı deneysel n hücre belirleyin ve bir refraktometre ile n orta ölçün. Alternatif n hücresinin 30 ve orta 29,30 n için literatür değerleri kullanabilirsiniz. </li><li> L, Δφ hücresi n hücre ve n orta 26,32 ortalama hücre Kalınlığı d hücre hesaplamak <img alt="denklem 3" src="/files/ftp_upload/54460/54460eq3.jpg" /> (3) NOT: Denklem. 3 Parametre d hücre λ, lazer ışık ışık dalga boyu ortalama hücre kalınlığı belirtir; ise, Δφ hücre ortalama faz kontrast gösterir ve hücre ve n orta n ayrılmaz hücresel refraktif indeks ve çevresindeki ortamın kırılma indeksi vardır. </li></ol></li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu DHM murin kolit modellerinde histolojik hasar ve insan kolon doku numuneleri ex vivo doğru değerlendirilmesini sağladığını gösterir. Ayrıca, DHM sürekli olarak aynı anda, hücresel değişiklikler hakkında çok modlu bilgi temin ederken epitel yara iyileşmesi takip göstermiştir. DHM olarak, dijital yakalanan hologramların yeniden sayısal 32 gerçekleştirilir. Bu nedenle, parlak bir alan mikroskobu, Zernike faz kontrast ve diferansiyel girişim kontrast mikroskobu ile karşılaştırıldığında, DHM i...

İltihaplı bağırsak yani hastalığı (IBD), ülseratif kolit (UC) ve Crohn hastalığı (CD), mide bağırsak 1 idiopatik enflamatuar hastalıklardır. IBD altta yatan patofizyoloji ve potansiyel yeni ilaçlar ya da yeni tanı yaklaşımları değerlendirmeye Araştırma özellikle önem taşımaktadır. Hem temel araştırma ve İBH hastalarının klinik yönetiminde, bağırsak mukoza dikkat 2,3 odağı haline gelmiştir. Mukoza bakterilere, epitel hücreleri, bağırsak, bağışıklık sisteminin çeşitli hücre bileşenleri arasındaki etkileşim bağırsak 4,5 homeostazı orkestra hangi anatomik sınırları temsil etmektedir. Ancak, İBH hastalarında, kontrolsüz ve kalıcı bağırsak iltihabı nihayet kendisi yerel inflamasyon 6 sinirlendiren epitel bariyer fonksiyonunun bozulması ile sonuçlanacak olabilir ülserasyonlar veya darlık gibi algılanabilir hasarı, mukozal yol açar. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; epitel şifa inflamasyon aşağıdaki epitel rejenerasyonu için bu nedenle çok önemlidir ama aynı zamanda gastrointestinal cerrahi 7 sonrasında gastrointestinal ülser veya anastomoz kaçağı iyileşmesi için temel gereklilik olduğunu yara. Epitel şifa deneyleri şifa in vitro yara simüle ve bağırsak iltihabı 8,9 sıçan modellerinde olabilir yara. Hem in vitro ve in vivo yaklaşımlar deneysel değerlendirmenin doğruluğu sınırlayan sakıncaları var. In vitro deneyleri, klasik çizik deneyleri gibi, floresan kromoforlar ile uzun süren boyama yöntemleri veya transfeksiyon gerektirir. Genellikle 10 otomatik olamaz hücre proliferasyonu ve göçü devamlı olmayan izleme ile sınırlıdır. Dekstran sodyum sülfat (DSS) bağlı kolit in vivo modeller, sık olarak görülen önemli değişiklik, kısmen dayanıklı okumaları eksikliği laboratuvar belirteçleri de, mauygunsuz kral gibi belirteçler kolit şiddetini 11,12 değerlendirmek için. Iltihaplı mukozasında histolojik analiz şu anda hala kolit şiddetini belirlemek için en geçerli yöntemdir ancak bu, in vitro epitel yara iyileşme deneyleri gibi, boyama gerektirir ve araştırmacının uzmanlık 13 bağlıdır. En son dijital holografik mikroskobu (DHM), kantitatif faz mikroskobu 14 bir varyantı, in vitro ve in vivo 15 epitel yara iyileşmesinin değerlendirilmesi için yararlı bir araç olarak tespit edilmiştir. DHM (OPD) optik yol uzunluğu gecikme ölçümü doku yoğunluğunun değerlendirilmesini sağlar hangi umutları yeni kanser tanısı 16-18 ve inflamasyon ile ilgili doku değişikliklerinin 19 ölçümü. Ayrıca, DHM hücre kalınlığı, hücre kaplı yüzey alanı ve hücre içi (protein) içerik miktarının belirlenmesi ile hücre morfolojisi dinamikleri izlenmesine olanak sağlar <sup&gt; 15,20. İn vitro tahlillerde, DHM fizyolojik süreçleri, örneğin, hücre hacmi ve kalınlık 21,22 değişimlerinin değerlendirilmesiyle hücresel su geçirgenliğinin analiz edilmesini sağlar. Ayrıca, DHM ölçümleri araştırmacı-ilişkili örnek önyargı engeller otomatik hale getirilebilir. Burada, bağırsak iltihabı bir murin modelinde DHM kullanımını göstermek ve ayrıca bir etiket içermeyen in vitro deneyi olarak yara iyileşmesi kantitatif kontrolü için, insan doku numuneleri analizlerine dhm uygulanır. İlk olarak, IBD insanlardan, kolitli farelerin ve doku bölümleri farklı kolon duvar tabakalarının enflamatuar alterasyonların değerlendirir. DHM kantitatif faz görüntüleme işlemini anlattıktan sonra, biz edinilen sayısal faz görüntüler değerlendirilmesini tarif de mikroskop bileşenleri, doku kesitlerinin hazırlanması ve kullanımına ilişkin ayrıntılı yönergeler sağlar. Daha sonra, DHM UTI olabileceğini göstermekin vitro epitel yara iyileşmesi sürekli multimodal izlenmesi için lized ve hücre tabakası kalınlığı, kuru kütlesinin ve hücresel hacmi gibi hücresel özelliklerinin analizini açıklar ilaca bağlı ve fizyolojik hücre değişiklikler hakkında fikir verir.

<table><tbody><tr><td><güçlü >Reaktifler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azoksimetan (AOM)</td> <td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Almanya</td><td>A5486</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Kültürü Şişesi</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Almanya</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>Costar Stripette</td><td>Corning Inc., New York, ABD</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran sülfat sodyum (DSS)</td> <td>TdB Danışmanlığı, Uppsala, İsveç</td><td>DB001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Ham'ın F12</td><td>PAA Laboratuvarları - Pasching - Avusturya</td><td>E15-813</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Almanya</td><td>SPR3196</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Almanya</td><td>E 9884</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 50 ml</td><td>BD Biosciences, Erembodegem, Belçika</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>İzopentan (2-Metilbütan)</td> <td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Almanya</td><td>M32631-1L</td><td></td></tr><tr><td>Metilen mavisi</td><td>Merck, Darmstadt, Almanya</td><td>1159430025</td><td></td></tr><tr><td>Mitomisin C</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Almanya</td><td>M4287</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Slaytları</td><td>G. Menzel, Braunschweig, Almanya</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Tek Doku Bileşiği&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sakura, Zoeterwonde, Hollanda</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep/Amfoterisin B</td><td>Lonza, Verviers, Belçika</td><td>1558</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin, PBS</td><td>Lonza, Verviers, Belçika</td><td>4629</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza, Verviers, Belçika</td><td>3626</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür %0,9</td> <td>Braun, Melsungen, Almanya</td><td>5/12211095/0411</td><td></td></tr><tr><td>Standart diyet</td><td>Altromin, Lage, Almanya</td><td>1320</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura, Leiden, Hollanda</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin EDTA</td><td>Lonza, Verviers, Belçika</td><td>7815</td><td></td></tr><tr><td>Vitro &ndash; Clud</td><td>R. Langenbrinck, Teningen, Almanya</td><td>04-0002&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &micro;-Tabak 35 mm, Kültür Insertli, high</td><td>ibidi GmbH, Münih, Almanya</td><td>81176</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Tabaklar için kapak, cam uçlu</td><td>ibidi GmbH, Münih, Almanya</td><td>80050<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICROM HM550</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, ABD</td><td>46320</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Dijital holografik mikroskop</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Bileşen</güçlü></td><td><güçlü>Model<güçlü></td><td>güçlü<güçlü>Şirket</güçlü></td><td></td></tr><tr><td>Ters Mikroskop</td><td>iMIC</td><td>Fotonik Kadar, Graefelfing, Almanya</td><td></td></tr><tr><td>Lazer</td><td>Pusulası 315M</td><td>Coherent GmbH, Lübeck, Almanya</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop lensi</td><td>Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3</td><td>Zeiss, Göttingen, Almanya</td><td></td></tr><tr><td>CCD kamera</td><td>DMK 41BF02</td><td>Görüntüleme Kaynağı, Bremen, Almanya</td><td></td></tr></tbody></table>

dijital holografik mikroskop ile multimodal kantitatif faz görüntüleme doğru bağırsak İltihabı ve epitel yara Şifa değerlendirdi

Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing

Örneğin, iltihabik bağırsak hastalığı, sıklığı, Crohn hastalığı ve ülseratif kolit, son yıllarda önemli ölçüde artmıştır. IBD etyolojisi bilinmemektedir ve mevcut tedavi stratejileri bağışıklık sisteminin baskılanması belirsiz dayanmaktadır. Özellikle belirgin IBD yönetimini geliştirmek olabilir bağırsak iltihabı ve epitel yara iyileşmesini hedefleyen tedavilerin geliştirilmesi, ancak bu iltihabi değişikliklerin doğru bir algılama gerektirir. Şu anda, potansiyel ilaç adayları, genellikle in vivo veya in vitro hücre kültürü bazlı tekniklerle hayvan modelleri kullanılarak değerlendirildi. Histolojik muayene genellikle örnek özelliklerini değiştirebilir ve ayrıca, bulguların yorumlanması araştırmacı uzmanlığı ile değişebilir hücreleri veya ilgi dokulara lekeli olması gerektirir. Dijital holografik mikroskobu (DHM), optik yol uzunluğu gecikme tespitine dayanan sağlar,leke bırakmayan kantitatif faz kontrast görüntüleme. Bu sonuçlar, doğrudan mutlak biyofizik parametreleri ile ilişkili olduğu için izin verir. Bu kırılma endeksi ölçümü göre DHM doku yoğunluğundaki değişiklikler ölçümü, kolitli farelerin ve insanlardan elde edilen kolon doku örneklerinin farklı tabakalarda, boyama olmaksızın, iltihaplı değişiklikler ölçmek için gösterilmektedir. Ayrıca, bu tür kuru kütle ve göç hücrelerin tabaka kalınlığı gibi yaralı alan ve morfolojik parametrelerin eş zamanlı tayini basit otomatik belirlenmesi yoluyla DHM kullanılarak in vitro mümkün epitel yara iyileşmesi sürekli multimodal etiket ücretsiz izleme göstermektedir. Sonuç olarak, DHM değerli, roman ve kantitatif aracı olası parametreler için mutlak değerler ile bağırsak iltihabı değerlendirilmesi için, in vitro epitel yara iyileşmesinin basitleştirilmiş miktarının temsil ve bu nedenle öteleme tanı u için yüksek bir potansiyele sahiptirse.

Dijital Holografik Mikroskopi için DHM Görüntüleme için tipik Kurulum (DHM) Şekil 1 B gösterildiği gibi parlak alan görüntüleme ve kantitatif DHM faz kontrast görüntüleme gerçekleştirmek için, biz ters bir mikroskop uygulamalı. 25 daha önce tarif edildiği gibi sistem, bir DHM modülü ekleme ile modifiye edilmiştir. Mach-Zehnder yapılandırması <strong...

Anti-inflamatuar etkilerin doğru değerlendirilmesi, inflamatuar barsak hastalığının tedavisi için potansiyel yeni ilaçların değerlendirilmesi için son derece önemlidir. Dijital holografik mikroskopi, murin ve insan kolon dokusu örneklerinde inflamasyonun değerlendirilmesinin yanı sıra in vitro epitelyal yara iyileşmesinin otomatik multimodal değerlendirmesini sağlar.

Dijital Holografik Mikroskop ile multimodal Kantitatif Faz Görüntüleme Doğru Bağırsak İltihabı ve Epitel Yara Şifa Değerlendirdi

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The ...

Bu çalışmanın genel amacı, in vitro epitelyal yara iyileşmesinin multimodal değerlendirmesi için bağırsak iltihabı kolon dokusu örneklerinin otomatik lekesiz kantitatif faz kontrast görüntülemesini sağlamak için dijital holografik mikroskopi veya DHM kullanmaktır. Bu yöntem, gastrointestinal inflamasyon ve yara iyileşmesi alanındaki hastalık aktivitesi, iltihaplı insan ve deniz ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; Bu tekniğin temel avantajı, hücre ve dokunun fiziksel parametrelerle lekesiz ve objektif bir şekilde tespit edilmesine ve ölçülmesine izin vermesidir. Prosedürleri göstermek, Biyomedikal Teknoloji Merkezi'nden bir teknisyen olan Fittest Ketelhut olacak.Hücre kültürünü kurun, dört kez on ila beşinci, Caco, 37 santigrat derecede% 95 nemde ve yüzde beş karbondioksitte FBS ve antibiyotiklerle desteklenmiş RPMI ortamında yüksek kültür ekleri ile donatılmış 35 milimetre Petri kaplarında santimetre kare iki hücre inkübe edin. İki gün sonra, hücreleri ilgilenilen ajanla tedavi edin ve kültürleri 24 saat daha inkübatöre geri koyun. Ertesi gün, süpernatanı aspire edin ve ekleri çıkarmak için cımbız kullanın.Ölü hücreleri ve kalan hücresel bileşenleri yara bölgesinden çıkarmak için kültürü bir mililitre HEPES tamponlu hücre kültürü ortamı ile bir ila iki kez yıkayın. Ardından, iki mililitre taze HEPES tamponlu ortam ekleyin ve kabı kapatın. Şimdi Petri kabını dijital holografik mikroskoba yerleştirin ve 10 x objektifi seçin.Görüntü alma yazılımını açın ve parlak alan görüntüleme modunu seçin. Isıtma odasını 37 santigrat dereceye ayarlayın ve kültürü ısıtma odasına yerleştirin. Ardından, canlı izleme penceresinde tek bir devasa hücre tabakası ve her iki tarafta ölü hücre veya serum içermeyen düz kenarlı uygun bir yara görüntülenene kadar görüntüleme alanını hareket ettirin.İlk yara bölgesinin beyaz ışıklı bir görüntüsünü yakalayın. Ardından, beyaz ışık aydınlatmasını kapatın ve dijital holografik mikroskopi modunu seçin. Lazer aydınlatmasını açın ve hologram kaydı için üç milisaniyeden daha kısa bir pozlama süresi seçin.Holografik erişim dışı girişim saçakları yeterli bir kontrastla görünüyorsa, bir örnek hologram yakalayın ve görüntü kalitesini kontrol etmek için yeniden yapılandırma yazılımıyla nicel bir faz görüntüsünü yeniden oluşturun. Ardından, uygun son noktada kaydı durdurarak yaranın hızlandırılmış bir DHM gözlemini başlatın ve beyaz ışık aydınlatması altında numunenin son bir görüntüsünü elde edin. Akut Dekstran Sodyum Sülfat veya DSS kolit indüksiyonu için, farelerin ablibidimine 100 mililitre otoklavlanmış su içinde çözülmüş üç gram DSS sağlayın.Yedi gün sonra, kontrol ve tedavi edilen hayvanlardan İsviçre haddelenmiş kolon örneklerinin yedi mikrometre kalınlığında bölümlerini elde edin. Her bölümü 50 ila 100 mikro litre PBS'ye daldırın ve numuneleri ayrı cam kapak fişleri ile kaplayın. Slaytların alt kısımlarının toz ve diğer kirlerden arınmış olduğunu onaylayın.Ardından, ilk slaydı mikroskop tablasına yerleştirin ve ilgilenilen doku alanı görünene kadar görüş alanını ayarlayın. Numuneyi keskin bir odağa getirin ve görüntü elde etme yazılımında parlak bir alan görüntüsü yakalayın. Ardından, DHM görüntüleme modunu seçin ve lazer ışığı aydınlatmasına geçin.Üç milisaniyenin altında bir pozlama süresi ayarlayın ve holografik kapalı erişim girişim saçaklarının canlı görüntüleme penceresinde yeterli kontrastla göründüğünü onaylayın. Ardından, dokunun dijital hologramını yakalayın. Endoskopik olarak orta ila şiddetli kolit kanıtları arasında kolon duvarı kalınlaşması, vasküler patern değişiklikleri, lif nedüdasyonları ve mukozal yüzey granülaritesi bulunur.Kolonik kesitlerin konvansiyonel histolojik değerlendirmesi, ağırlıklı olarak submukozada bulunan kontrol hayvanlarına karşı tedavi edilen DSS'nin kolon duvarında belirgin bir ödem olduğunu ortaya koymaktadır. Karşılık gelen kantitatif DHM faz kontrast görüntüleri ve ilgili kırılma indisi haritaları da, epitelyal menstroma yoğunluklarında gözle görülür farklılıklar olmaksızın bu doku değişikliklerinin özellikle doğal boyanmamış doku örneklerinde belirgin olduğunu göstermektedir. Kolitik farelerin epitel, submukoza ve stromasında kırılma indisi, sağlıklı kontrollere kıyasla önemli ölçüde azalır ve deney hayvanlarında nispi vücut ağırlığı kaybı ile kırılma indisi arasında önemli bir korelasyon vardır.Burada, 45 saat boyunca dijital holografik mikroskopi ile bir yara iyileşme testinin temsili sürekli izlenmesi gösterilmektedir. İyileşme süreci boyunca hücre kaplı yüzey alanının, ortalama hücre kalınlığının ve hücresel kuru kütlenin hesaplanmasına izin vermek. DHM'nin epitelyal yara iyileşmesinin sürekli izlenmesine izin verirken, aynı zamanda sitokin kaynaklı hücre değişiklikleri hakkında biyo çekirdek bilgi sağladığını gösterdik.Ayrıca, kırılma indeksi değişikliklerinin ölçümü yoluyla DHM ile kolit modellerinde ve insan kolon dokusu örneklerinde histolojik hasarın doğru bir şekilde değerlendirilmesini gösteriyoruz. DHM, optik yol uzunluklarının gecikmesinin tespitine dayandığından, doku yoğunluğu, kuru kütle veya hücresel kalınlık gibi mutlak biyofiziksel parametreler lekesiz kantitatif faz kontrast görüntüleme ile analiz edilebilir. DHM'nin yaygın araştırma mikroskopları ile doruk noktasına ulaşması ve tekniğin sağlamlığı, bu yöntemin hücre biyolojisi ve dijital patolojide rutin uygulamalarının önünü açmaktadır.Bu videoyu izledikten sonra, biyomedikal laboratuvar ortamında canlı hücre kültürlerinin dokularının analizi için dijital holografik mikroskopinin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. Sonuç olarak, DHM, inflamasyon mutlak parametrelerinin değerlendirilmesinin yanı sıra, translasyonel tanısal kullanım için yüksek potansiyele sahip epitelyal istemli in vitro miktarın basitleştirilmiş bir şekilde ölçülmesi için değerli, yeni ve kantitatif bir araç oluşturur.

multimodal-quantitative-phase-imaging-with-digital-holographic

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Zayıf yaymalı nesnelerin üç boyutlu yerleri benzersiz standart bir mikroskop için küçük bir değişiklik içerir dijital inline holografik mikroskobu (DIHM) kullanılarak tespit edilebilir. Bizim yazılım üç boyutlu pozisyon ve bir mikroskopik faz nesnenin geometrisine vermek üzere Rayleigh-Sommerfeld geri yayılma ile birlikte basit bir görüntüleme buluşsal kullanır.

Zayıf-saçılma Konular Dijital Inline Holografik Mikroskop (DIHM)

Parlak alan ve diferansiyel girişim kontrast görüntülerinin bir kombinasyonu aracılığıyla hücresel kütle, hacim ve yoğunluğun kantitatif ölçümlerini gerçekleştirmek için standart bir optik mikroskobun kullanımını açıklıyoruz.

Nicel Optik Mikroskopi: Hücresel biyofizik ölçümü Standart Optik Mikroskop ile Özellikleri

Küçük hayvan görüntüleme teknikleri seri tetkikler ve in vivo terapötik müdahaleyi sağlar. Son zamanlarda, uygulamaların kapsamı önemli genişletmiştir ve şu anda kolon tümör gelişiminin değerlendirilmesi, yara iyileşmesi ve enflamasyon izleme içerir. Bu protokol kemirgen endoskopi bu çeşitli potansiyel uygulamaları göstermektedir.

Murin için Endoskop In Vivo Karsinojenez ve bağırsak Değerlendirilmesi Multimodaller Görüntüleme Yara İyileşmesi ve İltihap

Hedef özgü probları protein ifade çeşitli hastalık (Örneğin, iltihap, enfeksiyon ve tumorigenesis) gibi moleküler mekanizmaları analiz etmek için yenilikçi bir araç temsil eder. Bu çalışmada, bağırsak makrofaj infiltrasyonu F4/80 özel tomografi Floresans aracılı kullanarak kolit, fare modeli üç boyutlu bir nicel tomografik değerlendirilmesi açıklar.

Floresan-aracılı tomografi algılama ve fare bağırsak iltihabı makrofaj ile ilgili miktar

Biz GFP etiketli γδ IELS görselleştirmek için bir yöntem açıklamak, ters dönen disk konfoksel mikroskobu tarafından murine ince bağırsak intravital görüntüleme kullanarak. Bu teknik, 4 h 'ye kadar mukoza içindeki canlı hücrelerin takibini sağlar ve çeşitli bağırsak immün-epitelyal etkileşimleri araştırmak için kullanılabilir.

Murine Ince bağırsak INTRAEPİTELYAL lenfosit intravital görüntüleme

İntravital mikroskopiden yararlanan burada sunulan yöntem, canlı hayvanlarda bağırsak epitel hücresi dökülmesinin gerçek zamanlı olarak görüntülenmesidir. Bu nedenle anestezili farelerin topikal lekeli bağırsak mukozası (acriflavine ve rhodamineB-dextran) konfokal mikroskopi kullanılarak tek hücreçözünürlüğe kadar görüntülenir.

İntravital Mikroskopi Tabanlı Bir Yaklaşım Bağırsak Geçirgenliği ve Epitel Hücre Dökülme Performansını Değerlendirmek için

Ücretsiz bilgisayar destekli bir sistem kullanılarak bağırsak iltihabının sistematik olarak puanlanması, ülser ve enflamatuar değişikliklerin varlığı ile karakterize kolit modellerindeki histopatolojik değişiklikleri nicel olarak karşılaştırmak için güçlü bir araçtır. Histolojik kolit skoru değerlendirmesi klinik gözlemleri güçlendirir ve veri yorumlamayı kolaylaştırır.

Murine Dextran Sodyum Sülfat Kaynaklı Kolit Modelinde Bağırsak İltihabı İçin Sistematik Puanlama Analizi

Burada, lazerle indüklenen yaralama üzerine bağırsak görüntülerini elde etmek için bir yöntem sunuyoruz. Fare bağırsağını bir multifoton lazere maruz bırakarak, tek veya birden fazla kript (ler) in kaybı yerel olarak indüklenir. Hasarlı bölgeyi aylar boyunca tekrar tekrar görüntüleyerek, bağırsak iyileşmesinin gerçek zamanlı dinamikleri yakalanır.

Bağırsak Yeniden Şekillenmesini İncelemek için Lazer Ablasyon ve İntravital Mikroskopi

Düşük tutarlı holotomografi kullanarak organoidlerin yüksek çözünürlüklü, etiketsiz ve üç boyutlu görüntülenmesi için adım adım bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, canlı organoidlerde yapısal dinamiklerin ve ilaç yanıtlarının gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesini sağlayan organoid kültür hazırlama, görüntüleme elde etme ve hesaplamalı görüntü analizini detaylandırır.

Düşük Tutarlı Holotomografi ile Bağırsak Organoidlerinin Etiketsiz, Yüksek Çözünürlüklü 3D Görüntüleme ve Makine Öğrenmesi Analizi

Bu çalışma, salgılanan mukusu ölçmek için tam montajlı bağırsak dokuları ve çoklu foton mikroskobu kullanan bir 3D görüntüleme yöntemi sunarak, karbamoilkolin klorür gibi uyaranlara yanıt olarak mukus dinamiklerinin hassas hacimsel analizini ve görselleştirilmesini sağlar.

Tam Montajlı Doku Görüntüleme Kullanılarak Bağırsak Mukusunun Üç Boyutlu Miktar Tayini

Keşfedin dijital holografik mikroskopi ile bağırsak iltihabının ve epitel yara iyileşmesinin lekesiz, otomatik kuantitatif görüntülenmesini. Bu yöntem Caco-2 hücreleri ve kolon dokularında objektif analiz sağlar.

Dijital Holografik Mikroskop ile multimodal Kantitatif Faz Görüntüleme Doğru Bağırsak İltihabı ve Epitel Yara Şifa Değerlendirdi (Video) | JoVE Journal

Dijital Holografik Mikroskop ile multimodal Kantitatif Faz Görüntüleme Doğru Bağırsak İltihabı ve Epitel Yara Şifa Değerlendirdi

Daha fazla video keşfet