Hücre Kültürü Uygulamaları için Hidrojeller Işık aracılı Oluşumu ve Desenlendirme

Bu prosedürün genel amacı, sentetik polimer bazlı ekstra hücresel matrisler içinde hücreleri oluşturmak, modellemek ve kapsüllemektir. Bu yöntem, heterojen bir mikro ortamda hücre tepkilerini düzenleyen ekstra hücresel ipuçlarının tanımlanmasıyla ilgili kritik biyolojik soruları ele almak için kullanılabilir. Bu tekniğin ana avantajı, protokoller ve erişilebilir malzemeler kullanılarak hücre kapsülleme ve kültür için sağlam bir sentetik matrisin üretilmesidir.

Bu yöntem, kontrollü hücre kültürü için ve in vitro hücre yanıtını incelemek için kullanılabilir. İlaç dağıtımı ve doku mühendisliği dahil olmak üzere diğer sistemlere uygulanabilir. Metin protokolünde açıklandığı gibi hidrojel oluşumu için malzemeleri hazırlayın.

Tüm numunelerde nispeten eşit ışık yoğunluğu sağlamak için sıvı dolu ışık kılavuzunun ucuna bir kolimasyon lensi takın. İlgilenilen numuneleri kapsayacak bir nokta boyutu elde etmek için ışık kılavuzunun numunelere olan mesafesini ayarlayın. Desensiz hidrojeller yapmak için, steril kesilmiş bir şırınganın ucuna 10 ila 20 mikrolitre jel öncü solüsyonu pipetleyerek şırınga uçlarında kalıplanmış kalın hidrojeller hazırlayın.

Hacim ve şırınga çapına bağlı olarak yaklaşık 0,5 ila 1,5 milimetre kalınlığında şırınga başına tek bir jel yapın. Kauçuk contayı kaplamasız cam sürgünün kenarlarına yerleştirerek cam sürgü kalıplarında ince hidrojeller hazırlayın. Daha sonra, kaplanmamış cam slayt üzerine beş ila 10 mikrolitre jel öncü solüsyonu pipetleyin.

Ve yapışma önleyici ile kaplanmış cam slaytı jel solüsyonunun üzerine yerleştirin. Sabitlemek için cam kızakları küçük bağlayıcı klipslerle sabitleyin. Şırınga ucu kalıpları veya cam slayt kalıpları için jel yüzeyinde santimetre kare başına 10 miliwatt elde etmek için lamba yoğunluğunu ayarlayın.

Yoğunluğu tespit etmek için bir radyometre kullanma. Ve kalıpları lambanın altına yerleştirin. Jellerin tamamen polimerizasyonunu sağlamak için bir ila beş dakika boyunca ışık uygulayın.

Daha yüksek polietilen glikol tereftalat içeriğine sahip jeller için daha kısa bir polimerizasyon süresi kullanın. Ve daha düşük içeriğe sahip jellerin, yumuşak dokular aralığında moduli ile tamamen polimerize hidro jeller üretmesi için daha uzun bir süre. Şırınga ucu kalıplarından jelleri steril, işlenmemiş 48 oyuklu bir plakaya yerleştirin ve cam slaytları steril bir tabağa yerleştirin.

Desenli hidrojelleri hazırlamak için, öncü çözeltiyi metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın ve çözeltinin eşit şekilde karışmasını sağlamak için çözeltiyi kuvvetlice pipetleyin. Daha sonra, önceden şekillendirilmiş jelleri bir penton peptit ile lityum fosfat foto başlatıcı çözeltisine örtün ve 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, fazla bir çözeltiyi çıkarın.

Jeller bir şırınga ucunda kalıplanmışsa, desenleme için 48 oyuklu plakadan steril bir cam slayta dikkatlice aktarmak için bir spatula kullanın. İstenilen desene sahip bir fotoğraf maskesini doğrudan şırınga ve cam slaytla kalıplanmış jellerin üzerine yerleştirin. Optimum desen doğruluğu için maskenin yazdırılan kısmının jele temas ettiğinden emin olun.

Numuneleri lambanın altına yerleştirin ve bir dakika boyunca yayın. Desenlemeden sonra, şırınga ile kalıplanmış jelleri steril 48 kuyulu doku kültürü ile muamele edilmiş plakaya yerleştirin. Cam slaytlara yapıştırılan cam sürgü kalıplı jelleri steril bir kaba yerleştirin.

Planlanan deneylere göre kültürlenmiş ortam veya uygun tampon ile 15 dakika olmak üzere üç kez durulayın. Fotodesenli hidrojellerde serbest tiyollerin tespiti ve miktarının belirlenmesi için hazırlık yapmak için önce çözeltileri hazırlayın ve hesaplamaları metin protokolünde açıklandığı gibi yapın. Daha önce olduğu gibi desenlendirme için ince hidrojeller oluşturun.

Spesifik olarak, fazla serbest tiyol içeren jeller yapın ve tüm jeli ışıkla tamamen açığa çıkarmak için şeffaf bir kapak kayması kullanarak bu örneklerin yarısını penton peptid ile şekillendirin. Desenli ve desensiz jelleri 48 oyuklu bir plakanın kuyularına yerleştirin. Ellman'ın reaksiyon tamponu ile üç kez 15 dakika durulayın, böylece reaksiyona giren uç türlerin jelden difüzyonuna ve denge şişmesinin meydana gelmesine izin verin.

Durulama jellerine ekstra Ellman reaksiyon tamponu ekleyin, böylece reaksiyon tamponu ile şişmiş jel hacmi 20 mikrolitrenin katı olur. Örneğin, tahmin edilen şişmiş jel hacmi 15 mikrolitre ise, beş mikrolitre reaksiyon tamponu ekleyin. Tahmin edilen şişmiş jel hacmi 30 mikrolitre ise, 10 mikrolitre reaksiyon tamponu ekleyin.

Sistine standartlarını 20 mikrolitrenin katları halinde 48 oyuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına pipetleyin. Önceki adımda kullanılan hacme bağlı olarak. Örneğin, önceki adımda şişmiş bir jel hacmi ve ayrıca 40 mikrolitreye eşit ekstra reaksiyon tamponu varsa, her standarttan 40 mikrolitreyi tek tek boş kuyucuklara ekleyin.

Ardından, Ellman'ın reaktifini ve reaksiyon tamponunu seyreltin. Seyreltilmiş Ellman reaktifini standartlar ve numuneler içeren kuyucuklara ekleyin. 20 mikrolitrelik numune için, her oyuğa 183.6 mikrolitre çözelti ekleyin.

Ellman reaktifinin jelden serbest tiyollerle reaksiyonu üzerine üretilen sarı 2-Nitro-5-tiyobenzoik dianyonun yeterli difüzyonunu sağlamak için bir saat otuz dakika veya çözeltinin rengi görsel inceleme ile jellerin rengiyle eşleşene kadar bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin veya yerleştirin. Numunelerden ve standartlardan 100 mikrolitre çözelti alın ve 96 oyuklu bir plakanın kuyularına yerleştirin. Bir plaka okuyucuda 405 nanometredeki emiciliği okuyun.

Fotoğraf desenlerini görselleştirmek için, hidrojelin kenarlarını bir mendille nazikçe silerek fazla reaksiyon tamponunu çıkarın. Ellman'ın reaktifini doğrudan jelin yüzeyine pipetleyin. Hemen 10x'te bir ışık mikroskobunda veya renkli bir kamera ile stereo mikroskopta görüntü alın.

Hücreleri toplayın ve metin protokolünde açıklandığı gibi kapsülleme için hazırlayın. PBS'yi aspire ettikten hemen sonra, öncü çözelti içindeki peletlenmiş hücreleri mikrolitre başına beş bin hücrelik bir nihai konsantrasyona kadar askıya alın. Penton peptidi ile daha sonra reaksiyona girmek için uygun bir serbest tiyol konsantrasyonu bırakın.

Fotoğraf deseni isteniyorsa. Hidrojelleri daha önce olduğu gibi kalıplayın, polimerize edin ve şekillendirin. Reaksiyona girmemiş türleri ve fazla lityum fosfat foto başlatıcıyı çıkarmak için jelleri desenlemeden sonra büyüme ortamında 10 dakika boyunca üç kez durulayın.

Jelleri, daha fazla analiz için istenen zaman noktasına kadar 37 derece Celius ve yüzde beş CO2'de büyüme ortamında inkübe edin. Ortamı her 48 saatte bir veya uygulamalar tarafından belirlenen şekilde yenileyin. Kapsüllenmiş hücre canlılığını belirlemek için, önce büyüme ortamını jellerden çıkarın ve ortamın jellerden difüzyonuna izin vermek için PBS ile üç kez 15 dakika durulayın.

Bir mililitre steril PBS'ye iki mikrolitre çözülmüş iki milimolar etidyum homodimer-1 ve çözülmüş dört milimolar kalsiyum AN çözeltisinden 0.5 mikrolitre ekleyin. Tam karışımı sağlamak için girdap. 48 oyuklu plakadaki her bir şırınga kalıp jeline 300 mikrolitre ayakta çözelti ekleyin veya steril bir tabakta bir cam slayt üzerinde jelin yüzeyini kaplayacak kadar ekleyin.

Ve 45 dakika kuluçkaya yatırın. Fazla duran çözeltiyi çıkarın ve jellerdeki fazla boyayı çıkarmak için durulayın. Hücreleri konfokal bir mikroskopta görüntüleyin.

Veya 10x kapasiteli bir epifloresan mikroskobunda. Ve 488 nanometre uyarma ve 525 nanometre emisyon. Ellman's ile ölçülen desenli olmayan ve desenli hidrojellerin serbest tiyol konsantrasyonu, hidrojellerin başlangıçta bir dakika ve beş dakika boyunca polimeröz olduğunu istatistiksel olarak benzer serbest tiyol konsantrasyonlarına sahip olduğunu gösterdi, bu da bir dakika içinde hızlı reaksiyon ve tam jelleşmeyi gösterdi.

Penton peptitleri ile 30 dakika ve bir saat 30 dakika boyunca inkübe edilen jellerin müteakip toplu desenlenmesi, serbest tiyol konsantrasyonunda yüzde 60 ila 80 azalmaya sahiptir, bu da fazla tiyolün verimli bir şekilde modifikasyonunu gösterir. Maskelerle kaplı örneklerden parlayan ışığın oluşturduğu ve burada çizgilerle basılan fotoğraf desenleri, Ellman reaktifinin uygulanmasıyla iki boyutlu olarak gözlemlenebilir. Veya, sonraki görüntülemede floresan peptitlerin dahil edilmesiyle üç boyutta.

Hidrojeller içinde kapsüllenmiş yetişkin insan kök hücreleri, canlılık ve hidrotoksisite lekeleri ile tedavi edildi. Ve konfokal mikroskopi ile görüntülendi. Membran hasarı olmayan canlı hücreler yeşil olarak etiketlenir ve kapsüllemeden bir gün sonra hücrelerin hayatta kaldığını gösterir.

Hücreler, kapsüllenmeden altı gün sonra matris içinde yayılmaya başlar. Ek resimde gösterildiği gibi. Bu prosedürü denerken, kontaminantların veya mekanik döküntülerin eklenmesi yoluyla kapsüllemeden sonra hücrelere zarar gelmesini önlemek için steril ve dikkatli kullanım prosedürlerini sürdürmeyi unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, ekstra hücresel ortama yanıt olarak hücre fonksiyonunu ve kaderini incelemek için immün boyama akış sitometrisi ve gen ekspresyonları gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu teknik, biyoloji, biyomühendislik ve tıp alanlarındaki araştırmacıların, kullanıcı tanımlı özellik kontrolü ile sentetik hücre dışı matrislerde doku bölgesi erozyonu veya hastalık ilerlemesini incelemelerinin ve yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesine yönelik yolu açmaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, hücrelerin nasıl kapsülleneceğini iyi anlamalı ve kontrollü hücre kültürü çalışmaları için yumuşak matrisleri nasıl modelleyeceğinizi iyi anlamalısınız.