Name: Lazer destekli Hayvancılık Zigotlann Sitoplazmik Mikroenjeksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Öğrenin, lazer destekli sitoplazmik mikroenjeksiyon yöntemiyle hayvancılık zigotlarına genom düzenleme araçlarının etkili teslimatını. Bu teknik, gen fonksiyonu çalışmaları ve transgenik hayvan üretimi için güvenilir bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu teknikle ilgili çalışmalar NIH/NICHD RO1 HD070044 ve USDA/NIFA Hatch projeleri W-3171 ve W-2112 tarafından desteklenmektedir.

1. Mikropipet Üretimi <ol><li> enjeksiyon mikropipet <ol><li> borosilikat cam kapiller (: 1,0 mm, iç çapı (ID): dış çap (DÇ) 0.75 mm) koyun, bir mikropipet çektirmenin (sağ ve sol kılcal sahipleri merkezinde) ve kilitleyin. </li><li> uzun uzantılar ile ince ucu ile sonuçlanır böylece cam kapiller çekmek için uygun bir program kullanın. (Örnek: Isı: 825; çekin: 30; Hız: 120; Süresi: 200; Basınç: 500). </li><li> Dikkatle cihazdan çekti pipetler kaldırmak ve yatay konumda bir microforge üzerine yerleştirin. </li><li> çekti pipet ve odak noktası haline cam boncuk ile Microforge ısıtıcı iplik getir. İstenilen kalınlığı ölçümü ve ısıtıcı Filament hedef iç çapı (5 mikron) ulaşıncaya kadar yatay pipet taşımak için mercek reticle kullanın. </li><li> yaklaşık% 45 ısı ayarlama ve filamanın dokunur şekilde hafifçe aşağı pipet getirmek. kısaca ısıtıcı etkinleştirin. Bu Whasta hafifçe filamanın yapışır, böylece pipet eritmek ve soğutma üzerine, pipet düz bir kesim üreten temas noktasında kıracak. Not: Çok yüksek sıcaklıklar pipet bend yapacak ve böylece düz bir kesim mümkün olmayacak ve çok düşük sıcaklıklarda pipet (Şekil 1A) eritmek için yeterli olmayacaktır çünkü uygun sıcaklık ayarı bu adımda anahtarıdır. </li><li> Isıtıcı filament yaklaşık 10 mikron uzak konumlandırarak pipet yakın yaklaşık 30 ° açı yapar. % 60 sıcaklığını ayarlamak ve ısıtıcı etkinleştirin. Not: Bu filament üzerinde pipet viraj. Bu açı, enjektör (Şekil 1B) içine monte edildiğinde iğnenin ucu püskürtme plakasının yüzeyine paralel olacak şekilde tercih edilir. </li><li> Bunlar son derece keskin ve kırılgan olduğu gibi dikkatli mikroenjeksiyon pipetler anlaştım. </li></ol></li><li> Holding mikropipet <ol><li> Bir borosilic yerleştirin(: 1,0 mm, ID: OD 0.75 mm) cam kapiller yedik (sağ ve sol kılcal sahiplerinin merkezinde) Mikropipet çektirmenin ve kilitleyin. </li><li> uzun hatta konik ve paralel duvarlar ile ince ucu ile sonuçlanır böylece cam kapiller çekmek için uygun bir programı kullanın (: Heat: Örnek 815; çekin: 20; Velocity: 140; Zaman: 175; Basınç: 200). </li><li> Dikkatle çektirmenin cihazdan çekti pipet kaldırmak ve yatay konumda Microforge tutucu üzerine yerleştirin. Isıtıcı lif ve pipet üzerinde odağı ayarlayın. </li><li> pipet çapını ölçmek ve filamanın üzerinde çapı 180 mikron ulaşıncaya kadar pipet taşımak için mercek reticle kullanın. </li><li> Belirtilen boyutta bir elmas uç kalem ile cam kapiller işaretleyin ve sonra yavaşça camı kırmak için çekti ucunda basın. Bu, düz bir kesim (Şekil 1C) ile sonuçlanmalıdır. </li><li> filaman yakın olan ucu ile dikey bir konuma pipet getirin. sıcaklığı ayarlayın<html> % 60 microforge evi. </li><li> Yangın lehçe o 40 mikron bir kimliği ulaşıncaya kadar standart teknikler 7 kullanarak pipet ucu. Kimliği (Şekil 1D) kontrol etmek için mercek reticle kullanın. </li><li> pipet üzerinde bir açı yapar. <ol><li> yaklaşık 10 mikron uzaklıkta filamanın ve uzak ucu 5 mm geri yatay konuma pipet getirin. Yaklaşık% 60 sıcaklığını ayarlamak ve filamanın üzerinde pipet bend ısıtıcı etkinleştirin. (Yaklaşık 30 O) arzu edilen bir açı elde edilene kadar ısıtma devam edin. Açı görsel (Şekil 1E) kontrol edin. Not: Pipet, genellikle enjeksiyon tabağın tabanına göre 60 ° bir açı ile yaklaşık mikroenjektör monte edilir. onun orta düzleminde embriyo doğru enjeksiyon için gerekli olan çanak tabanına paralel şekilde pipet ucu bükülür. </li></ol></li></ol></li></ol>le &quot;&gt; 2. Mikromanipülatör Kurulumu <ol><li> mikroenjektörler tamamen yağ ile yüklü olduğundan ve sistemde hiçbir hava kabarcığı olduğunu (mikroenjektör kabarcıklar enjeksiyon ince kontrol edilmesini önlemek) kontrol edin. </li><li> mikromanipülatörler orta konumda olduğundan emin olun. Bu pipetler geniş bir hareket aralığı sağlayacak. </li><li> Sol mikromanipülatör tutucuya yerleştirin tutma pipet ve sağ mikromanipulasyon tutucu içine enjeksiyon pipet yerleştirin. </li><li> Yağ kılcallık tarafından pipetler girmek ve sistem mikroenjektör kontrollerini kullanarak pipet içinde yukarı ve aşağı hareket ettirerek yağı düzgün çalışıp çalışmadığını kontrol etmek için izin verin. Not: iğne içinde yağ hiçbir hareket yoksa, bir yapışmasına neden olabilir. Bu durumda, yeni bir iğne kullanınız. </li><li> görüş mikroskop alanının merkezi haline pipetler getirmek için mikromanipülatör denetimlerini kullanın. 4X büyütme kullanarak, mikropipet uçları (doğru açıda p olduğunu kontrol edinçanak alt) için arallel. Not: iğne Doğru kurulum başarılı bir enjeksiyon için ve sonuç tutarlılığı için anahtardır. </li><li> Üreticinin kalibrasyon kılavuzuna aşağıdaki lazer sistemi kalibre edin. </li></ol> Enjeksiyon Dish 3. Hazırlama (Şekil 2) <ol><li> 100 mm petri kabı kapağının merkezine,% 20 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş ısıtıldı (37 ° C), SOF-HEPES (malzeme bölümünde ayrıntılı olarak bileşimin) içindeki bir 50 ul damla yerleştirin. solüsyonu 2 ul damla enjeksiyon damla yakın enjekte edilecek - 1 yerleştirin. embriyolar RT aşağıda soğumasını etmediğinden emin olun. Not: Bu protokolde enjeksiyon siteyi görselleştirmek ve daha sonra takip edebilmek için enjekte çözüm Dekstran-Kırmızı boya katacak. </li><li> mineral yağ, yaklaşık 10 ml kullanılarak enjeksiyon plaka damla örtün. </li><li> ters mikroskop aşamasında enjeksiyon çanak yerleştirin ve pip getirmekEnjeksiyon damla içine ettes. iğneler damla içindeki odak olup olmadığını kontrol edin. mikromanipülatör denetimlerini kullanarak gerektiği gibi kendi yüksekliğini ayarlayın. </li><li> Enjeksiyon damla üst tarafında - (20 saat sonrası fertilizasyon (hpf) 17) 30 zigot - Bir microdispenser kullanarak, yaklaşık 20 yükleyin. Enjeksiyon damla embriyo sayısı kişi bunları enjekte etme hızı tarafından belirlenmektedir, ki böylece, oda sıcaklığında enjeksiyon gerçekleştirin. 30 dakika içinde enjekte edilebilir olanlarına göre daha fazla embriyolar yüklemeyin. <ol><li> microdispenser içine embriyolar yüklemek için, tam pistonu bastırın ve embriyoları içeren çözelti içine ucu batırın. Dokunmatik embriyolar cam kapiller ucu (seferde bir) ile aldı ve yavaş yavaş piston böylece her embriyo kılcal girer serbest olması. tüm embriyolar toplanır veya microdispenser kapasitesi dolana kadar bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Yüklenen embriyolar serbest tüm hacim co kadar pistonu hafifçe bastırmak içinembriyolar ntaining kılcal salınır. </li></ol></li></ol> 4. Mikroenjeksiyon <ol><li> 4X objektif kullanarak, negatif basınç (emme) uygulanarak enjeksiyon pipetine enjekte edilecek çözelti yüklenir. 3 zigot - 2 enjekte etmek yeterli bir çözüm yükleyin. Sonra enjeksiyon damlasına kadar hareket ettirin. </li><li> ucu bir zigot yakın alır bu yüzden enjeksiyon damla içinde holding pipet hareket ettirin. zigot 20X amaca tutma pipet ve değişime onarılır böylece tutma mikroenjektör ile negatif basınç (aspirat) uygulayın. </li><li> zigot tutma pipet takıldıktan sonra, yavaşça ayırarak olmadan etrafında embriyo hareket enjekte pipet kullanarak kalitesini kontrol edin. Kaliteli zigot iki kutup bedenlere sahip (tek görülür bazen rağmen) ve homojen bir sitoplazma olmalıdır. Anormal zigot (Şekil 3A) enjekte etmeyin. </li><li> Gerekirse, uygun bir enjeksiyon için embriyo yeniden konumlandırmakyer. İyi bir konumlama olan ZP ve PM arasında biraz boşluk var, bu yüzden PM lazer zarar almaz olacaktır. </li><li> Enjeksiyon pipet yavaşça enjeksiyon yerinde zigot dokunarak embriyonun orta düzlemde konumlanmasına dikkat edin. Bu orta düzleminin üzerinde değil, iğne embriyo yerine ponksiyon dönmesini sağlamak eğiliminde olacaktır. gerektiği gibi enjeksiyon pipet yüksekliğini ayarlayın. </li><li> Bir lazer (Şekil 3B) kullanılarak ZP bir delik sağlayın. <ol><li> lazer yazılım yer deliği (embriyo tutma pipet bağlı olduğu yere karşı tarafında) yapılacaktır ZP lazer retikül kullanılması. Yangın butonuna lazer kontrol penceresi tıklayın kullanma. Deliğin boyutu PM zarar vermeden geçmesi iğne ZP bir açılış oluşturmak için yeterince büyük olduğundan emin olun (Örnek: 0.662 msn Pulse genişliği / 6.9 mikron Delik boyutu). </li></ol></li><li> iğne geçirinve ZP delikten PM ile temas. İğne embriyo (Şekil 3C) içine yolu ¾ kadar ileri pipet itmeye devam edin. </li><li> Bu tutarlı bir enjeksiyon hacmini kontrol etmek için kullanılacak şekilde, çözelti, yağ ara yüzeyinde menisküsün konumunu dikkate alınmalıdır. </li><li> PM ve sitoplazma enjeksiyon iğnesi içine aspire edilen sonuçlanacaktır enjeksiyon pipet üzerinde negatif basınç (aspirat) uygulayın. iğne içine sitoplazma hareketi hızlandırır kadar veya enjeksiyon solüsyonu ile karıştırma sitoplazma içeriği görülebilir zaman devam ediyor. Bu PM (Şekil 3D) kırılma gösterecektir. </li><li> çözüm yağı interfaz menisküs başlangıç ​​noktasına geçmiş bir zigot çapı eşdeğer ilerlemiştir kadar pozitif basınç (enjekte) uygulayarak zigot sitoplazmaya solüsyonu ardından sitoplazmik içeriğin geri enjekte edilir. Not: Bizim koşullarda, bu Repreyaratabilecek enjekte çözeltisi (Şekil 3E), yaklaşık 7 Pl. </li><li> Bir 4X amaca Değişim ve enjeksiyon damla alt tarafına enjekte embriyo / s taşıyın. tutma mikroenjektör pozitif basınç uygulayarak embriyo serbest bırakın. Enjekte / olmayan enjekte edilen embriyoların takip ve verimli çalışmanıza yardımcı olmak için üst tarafta olmayan enjekte edilen embriyolar ve damla alt tarafında enjekte olanları tutun. </li></ol> 5. Embriyo Kurtarma ve Enjeksiyon Sonuçları <ol><li> Önceden ısıtılmış SOF-HEPES ile yeni bir tabağına yaklaşık 200 ul 3 damla sağlayın. Bir microdispenser (yukarıda anlatıldığı gibi) kullanılarak enjekte embriyolar toplayın. 3 SOF-HEPES yoluyla damla taşıyarak enjekte embriyolar yıkayın. </li><li> Mikroenjeksiyon sırasında parçalanmış embriyoların saymak ve atın. İlki bütün ZP doldurun, şeffaf görünür beri bir parçalanmış zigot sağlam bir birinden rahatlıkla ayırt edilebilir ve genellikle sitoplazmik vardır: NotEmbriyonun dışarıya sızıntı içeriği. </li><li> İsteğe bağlı olarak, bir floresan mikroskop kullanılarak mikroenjeksiyon verimliliğini kontrol edin. UV ışığı maruziyeti sonraki gelişimini etkileyebilir embriyo hasarına neden olabileceğini unutmayın. </li><li> 38.5 ° C &#39;de, mineral yağ altında 4 mg / ml sığır serumu albümini (BSA) ile desteklenmiş, potasyum simpleks optimizasyonu ortamı 50 ul damlalar (KSOM) 25 enjekte edilen embriyoların Kültür gruplan, doyma noktasına kadar,% 5 havadaki CO2 ve nem. </li><li> enjeksiyondan iki gün sonra,% 5 FBS ile kültür ortamı Ek. </li><li> enjeksiyondan sonra blastosist (BL) oranlarını 7 gün kontrol edin. blastosist embriyolar / o damla kültür embriyo sayısının toplam sayısı olarak BL oranlarını hesaplayın. </li></ol>

<ol><li>McEvoy, T., Coull, G., Broadbent, P., Hutchinson, J., Speake, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+composition+of+lipids+in+immature+cattle%2C+pig+and+sheep+oocytes+with+intact+zona+pellucida%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Fertil%22%5BJournal%5D)">Fatty acid composition of lipids in immature cattle, pig and sheep oocytes with intact zona pellucida.</a> J Reprod Fertil. 118 (1), 163-170 (2000).</li>
<li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+efficiency+of+introducing+foreign+DNA+into+mice+by+microinjecting+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (13), 4438-4442 (1985).</li>
<li>Ross, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parthenogenetic+activation+of+bovine+oocytes+using+bovine+and+murine+phospholipase+C+zeta%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Parthenogenetic activation of bovine oocytes using bovine and murine phospholipase C zeta.</a> BMC Dev Biol. 8 (1), (2008).</li>
<li>Canovas, J., Cibelli, J. B., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jumonji+domain-containing+protein+3+regulates+histone+3+lysine+27+methylation+during+bovine+preimplantation+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Jumonji domain-containing protein 3 regulates histone 3 lysine 27 methylation during bovine preimplantation development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2400-2405 (2012).</li>
<li>Bogliotti, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4+Developmental+outcomes+and+effiency+of+two+CRISPR%2FCas9+microinjection+methods+in+bovine+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Fertil+Dev%22%5BJournal%5D)">4 Developmental outcomes and effiency of two CRISPR/Cas9 microinjection methods in bovine zygotes.</a> Reprod Fertil Dev. 27 (1), 94-94 (2015).</li>
<li>Bakhtari, A., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DPPA3+prevents+cytosine+hydroxymethylation+of+the+maternal+pronucleus+and+is+required+for+normal+development+in+bovine+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">DPPA3 prevents cytosine hydroxymethylation of the maternal pronucleus and is required for normal development in bovine embryos.</a> Epigenetics. 9 (9), 1271-1279 (2014).</li>
<li>Yaul, M., Bhatti, R., Lawrence, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+process+of+polishing+borosilicate+glass+capillaries+used+for+fabrication+of+in-vitro+fertilization+%28iVF%29+micro-pipettes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Evaluating the process of polishing borosilicate glass capillaries used for fabrication of in-vitro fertilization (iVF) micro-pipettes.</a> Biomed Microdevices. 10 (1), 123-128 (2008).</li>
<li>Sutter Instrument. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Pipette+Cookbook+2015+P-97+%26+P-1000+Micropipette+Pullers%22">Pipette Cookbook 2015 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers</a>. , Sutter Instrument. 
 <a target="_blank" href="www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf">www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf</a> (2015).</li>
<li>Sutter Instrument. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22P-97+Flaming%2FBrownTM+Micropipette+Puller+Operation+Manual+Rev.+2.30+-+DOM+%2820140825%29%22">P-97 Flaming/BrownTM Micropipette Puller Operation Manual Rev. 2.30 - DOM (20140825)</a>. , 
 <a target="_blank" href="www.sutter.com/manuals/P-97-DOM_OpMan.pdf">www.sutter.com/manuals/P-97-DOM_OpMan.pdf</a> (2014).</li>
<li>Cibelli, J. B., Lanza, R. P., Campbell, K. H. S., West, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCibelli%2C+JB+%22Principles+of+cloning%22">Principles of cloning</a>. , Academic Press. (2002).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+reporter+gene+after+microinjection+of+mammalian+artificial+chromosomes+into+pronuclei+of+bovine+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Expression of a reporter gene after microinjection of mammalian artificial chromosomes into pronuclei of bovine zygotes.</a> Mol Reprod Dev. 60 (4), 433-438 (2001).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

zigot Mikroenjeksiyon memeli embriyolarının içine çözümleri tanıtmak için köklü bir yöntemdir. türleri ve Deneyin amacı göre bazı farklılıklar ile, bu teknik genel olarak kullanılabilir. Biz bir künt uç mikropipet girişinde yardımcı olmak için bir lazer kullanarak intrasitoplazmik mikroenjeksiyon nasıl gerçekleştirileceğini gösterir. (Örneğin sığır, koyun ve domuz gibi) bazı hayvan türlerinin zigot, embriyo içinde bir kez enjeksiyon pipet görselleştirme engelleyen, karanlık bir sitoplazma var. Ayrıca, plazma membranlar,...

1-hücre embriyoların Sitoplazmik mikroenjeksiyon çok güçlü bir tekniktir. Bu, örneğin, gen fonksiyonu çalışma ya da gen düzenlenmiş hayvanlar oluşturmak için, gen, çıkıntılara üretilmesi için embriyo herhangi bir çözüm sunmak için de kullanılabilir. En tarımsal-ilgili çiftlik hayvanı zigot kendi sitoplazma opak ve 1 karanlık kılan çok yüksek yağ asidi kompozisyonu var. Onlar da oldukça esnek plazma zarı (PM) var. Bu özellikler kemirgen türleri zorlu ve sık sık yanlış kullanılan geleneksel pronüklear / sitoplazmik enjeksiyon kullanılarak mikroenjeksiyon yapmak. Sonuçlar, daha kolay olan ve aynı zamanda daha yüksek canlılığı 2&#39;de elde edilen, enjekte edilen embriyolar için daha az zarar yana Sitoplazmik mikroenjeksiyon pronükleer mikroenjeksiyon fazla avantajlara sahiptir. Bu protokolün genel amacı çiftlik hayvanı zigot sitoplazması içine çözümler sunmak için başarılı bir yöntem ortaya koymaktır. yapabilmek içinBesi embriyoların yüksek verimle sitoplazmik mikroenjeksiyon, bir lazer, bir küt uç cam iğne mikroenjeksiyon için kullanılan zona pellucida (ZP) ve daha sonra bir delik oluşturmak için kullanılır. Bu strateji enjeksiyon sırasında embriyo üzerinde baskılı mekanik zararı azaltmayı hedefliyor. Sonra, enjeksiyon iğnesi içinde sitoplazmik içeriğin aspirasyon çözümü embriyo sitoplazmaya teslim edilmesini sağlamak PM verimli ve güvenli kırılmasına izin verir. Bu teknik başarıyla zigotik sitoplazma 3,4 içine siRNA teslim etmek ve kümelenmiş düzenli interspaced kısa palindromik tekrarı (CRISPR) / CRISPR ilişkili sistem 9 (Cas9) sistemi 5 ile mutasyon üretmek için sığır embriyolarının kullanılmıştır. Ayrıca sığır cumulus-kapalı oosit 6 enjekte etmek (küçük değişikliklerle) uygundur. Burada, bir boya teslim eden enjeksiyon protokol açıklar, herhangi des enjekte uygulanabilir olabilirzigot içine IRED çözüm ve bu tekniği kullanarak en az erimesine yol açar ve erken embriyo gelişimini etkilemediğini göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>Mikropipet çektirme Sutter</td><td>Aleti</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Cam kılcal</td><td>Sutter aletleri</td><td>B100-75-10</td><td>Bu kılcal damarlar, pipetleri tutmak ve enjekte etmek için kullanılır. Filamentsiz herhangi bir kalın/standart duvar borosilikat boru kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-9</td><td>10X büyütme lensi ile donatılmıştır.</td></tr><tr><td>Mikromanipülatör</td><td>Nikon / Narishige</td><td>NT88-V3</td><td></td></tr><tr><td>Ters mikroskop</td><td>Nikon</td><td>TE2000-U</td><td>4X, 20X lensler ve bir lazer sistemi ile donatılmıştır.</td></tr><tr><td>Lazer</td><td>Araştırma Cihazları</td><td>7-47-500</td><td>Satürn 5 Aktif lazer.</td></tr><tr><td>Mikrodispenser</td><td>Drummond</td><td>3-000-105</td><td>Mikrodispenser embriyoları hareket ettirmek için kullanılır. Bir p10 pipeti de kullanılabilir, ancak mümkün olduğunca minimum hacimde yükleme yapılabilir.</td></tr><tr><td>100 x 15 mm kültür kabı</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td>Enjeksiyon plakasını yapmak için çanağın kapağını kullanın, çünkü daha alçak duvarlara sahiptirler ve mikromanipülatörün konumlandırılmasını ve hareket etmesini kolaylaştıracaktır. 60 mm'lik bir kültür kabının kapağı da kullanılabilir.</td></tr><tr><td>35 mm kültür kabı</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>Bu kaplar 50 & mu'daki embriyoları kültürlemek için kullanılır; l mineral yağ ile kaplı damlalar. Alternatif olarak, 4 kuyulu bir tabak da kullanılabilir. Embriyoları kültürlemek için seçilen çanak ne olursa olsun, embriyoları onlara transfer etmeden önce her zaman en az 4 saat inkübatörde dengelenmeleri gerekir.</td></tr><tr><td>Kuluçka Makinesi</td><td>Sanyo</td><td>MCO-19AIC</td><td>38.5 &�'ye ayarlanabilen herhangi bir kuluçka makinesi; C,% 5 CO2 koşulları kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td>Kültür damlalarında ve yıkamalar sırasında embriyoları görselleştirmek için kullanılır. 10X büyütmeli herhangi bir stereomikroskop kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Kontrol Ünitesi HT</td><td>Minitube</td><td>12055/0400</td><td>Stereomikroskoba bağlı ısıtma sistemi.</td></tr><tr><td>Isıtmalı Mikroskop Aşaması</td><td>Minitüp</td><td>12055/0003</td><td>Stereomikroskoba bağlı ısıtma sistemi.</td></tr><tr><td>Dextran-Red</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1828</td><td>Enjekte etmek için steril 10 mg / ml çözelti kullanılır.</td></tr><tr><td>Mineral Oil</td><td>sigma</td><td>M8410</td><td>Mineral yağı oda sıcaklığında tutun ve&nbsp folyo kağıt kullanarak ışıktan koruyun.</td></tr><tr><td>KSOMaa Evolve</td><td>Bovine Zenit</td><td>ZEBV-100</td><td>4 mg / ml BSA ile desteklenmiştir. Embriyo kültürü için KSOM plakaları, kullanımdan önce en az 4 saat inkübatörde dengelenmelidir.</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini-Bio</td><td>100-525</td><td>Kök hücre nitelikli bir FBS kullanın.</td></tr><tr><td>Zigotlar</td><td></td><td></td><td>Zigotlara 17-20 hpf enjekte edilir ve in-vitro- veya in-vivo türevi olabilir.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>Nihai konsantrasyon: 107.7 mM. SOF-HEPES ortamının bileşeni.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>Nihai konsantrasyon: 7.16 mM. SOF-HEPES ortamının bileşeni.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>Nihai konsantrasyon: 1.19 mM. SOF-HEPES ortamının bileşeni.</td></tr><tr><td>MgCl2 6H2O</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td>Nihai konsantrasyon: 0.49 mM. SOF-HEPES ortamının bileşeni.</td></tr><tr><td>Sodyum DL-laktat</td><td>Sigma</td><td>L4263</td><td>Nihai konsantrasyon: 5.3 mM. SOF-HEPES ortamının bileşeni.</td></tr><tr><td>CaCl<alt>2</alt>-2H<alt>2</alt>O&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>Nihai konsantrasyon: 1.71 mM. SOF-HEPES ortamının bileşeni.</td></tr><tr><td>D-(&eksi;)-Fruktoz&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F3510</td><td>Nihai konsantrasyon: 0,5 mM. SOF-HEPES ortamının bileşeni.</td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>Nihai konsantrasyon: 21 mM. SOF-HEPES ortamının bileşeni.</td></tr><tr><td>MEM-NEAA</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>Nihai konsantrasyon: 1x. SOF-HEPES ortamının bileşeni.</td></tr><tr><td>BME-EAA</td><td>Sigma</td><td>B6766</td><td>Nihai konsantrasyon: 1x. SOF-HEPES ortamının bileşeni.</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Nihai konsantrasyon: 4 mM. SOF-HEPES ortamının bileşeni.</td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>Sigma</td><td>P4562</td><td>Nihai konsantrasyon: 0.33 mM. SOF-HEPES ortamının bileşeni.</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050</td><td>Nihai konsantrasyon: 1 mM. SOF-HEPES ortamının bileşeni.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-3311</td><td>Nihai konsantrasyon: 1 mg / ml. SOF-HEPES ortamının bileşeni.</td></tr><tr><td>Gentamisin</td><td>Sigma</td><td>G-1397</td><td>Nihai konsantrasyon: 5 & mu; g/ml'dir. SOF-HEPES ortamının bileşeni.</td></tr><tr><td>Embriyo transferi için su</td><td>Sigma</td><td>W1503</td><td>SOF-HEPES ortamının bileşeni.</td></tr><tr><td>SOF-HEPES ortamı</td><td>Laboratuvarda</td><td></td> üretilmiştir <td>pH 7.3 - 7.4, 280 & 10 mO. 22 & mu ile sterilize edilmiş filtre; M filtre buzdolabında 4 ° C'de saklanabilir; 1 ay boyunca C. 37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu.</td></tr></tbody></table>

lazer destekli hayvancılık zigotlann sitoplazmik mikroenjeksiyon

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Tek hücreli embriyolara sitoplazmik mikroenjeksiyon çok güçlü bir tekniktir. Örnek olarak, yetişkin bir organizmanın her hücresinde bulunacak genetik modifikasyonlar yaratabilen genom düzenleme araçlarının sunulmasını sağlar. Preimplantasyon embriyolarında gen fonksiyonunu incelemek için siRNA, mRNA'lar veya bloke edici antikorlar vermek için de kullanılabilir. Kemirgenlerde kullanılan embriyoları mikroenjekte etmek için geleneksel teknik, embriyoya ilerletildiğinde doğrudan plazma zarına nüfuz eden çok ince bir mikropipetten oluşur. Bu teknik çiftlik hayvanlarına uygulandığında genellikle düşük verimle sonuçlanır. Bunun temel nedeni, farelerin ve sıçanların aksine, sığır, sığır ve domuz zigotlarının çok koyu bir sitoplazmaya ve plazma zarının enjeksiyonu ve penetrasyonu sırasında görselleştirmeyi zorlaştıran oldukça elastik bir plazma zarına sahip olmasıdır. Bu protokolde, sığır zigotlarının sitoplazmasına çözeltilerin verilmesi için koyun ve domuz embriyoları için de başarılı olduğu kanıtlanmış uygun bir mikroenjeksiyon yöntemi tanımlanmıştır. İlk olarak, zona pellucida'da bir delik oluşturmak için bir lazer kullanılır. Daha sonra künt uçlu bir cam mikropipet delikten sokulur ve iğnenin ucu embriyonun yaklaşık 3/4'üne ulaşana kadar ilerletilir. Daha sonra, plazma zarı, iğne içindeki sitoplazmik içeriğin aspirasyonu ile kırılır. Son olarak, aspire edilmiş sitoplazmik içerik ve ardından ilgilenilen çözelti embriyonik sitoplazmaya geri enjekte edilir. Bu protokol, sığır ve küçükbaş zigotlara %100 verimlilik, minimum lizis ve normal blastokist gelişim oranları ile farklı solüsyonların verilmesi için başarıyla kullanılmıştır.

Lazer destekli sitoplazmik mikroenjeksiyon hayvancılık zigot sitoplazması içine çözümler sunmak için güçlü ve güvenilir bir protokoldür. 3 önce ve enjeksiyon yanı sıra tekniğin genel hatlarıyla sonra zigot genel hatlarını göstermektedir. Dekstran, kırmızı püskürtme ve enjeksiyon verimliliği ve doğruluk izleme sitesi sağlamak için çözelti enjekte olarak kullanılır. Çözeltinin başarılı dağıtım boya homojen olarak sitoplazmada dağıtıldığı bir en son enjekte...

Bu protokol, çiftlik hayvanı zigotlarında sitoplazmik mikroenjeksiyonun nasıl yapılacağını gösterir. Bu teknik, nakavt hayvanlar oluşturmak için genom düzenleme araçları gibi tek hücreli embriyoya herhangi bir çözelti vermek için kullanılabilir.

Lazer destekli Hayvancılık Zigotlann Sitoplazmik Mikroenjeksiyon

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

Bu prosedürün genel amacı, bir lazer yardımıyla küt uçlu bir iğne kullanarak çözeltileri çiftlik hayvanı zigotlarının sitoplazmasına etkili bir şekilde iletmektir. Bu yöntem, araştırma ve hayvan transgenez alanında kullanılmaktadır; CRISPR Cas9 sistemi gibi bir genom düzenleme aracıyla ilişkilendirildiğinde, gen fonksiyonlarını ve transgenik hayvanları incelemek için çok basit ve güvenilir bir yolla yeni inekler oluşturulabilir. Bu tekniğin temel avantajı, herhangi bir çözeltinin büyük hayvan zigotlarının sitoplazmasına iletilmek için kullanılabilmesidir.Becerikli bir kişinin enjeksiyon verimliliği, hayvan karaciğerindeki lomotil oranlarını minimize eder. İlk olarak, borosilikat cam bir kapileri bir mikro pipet çekiciye yerleştirip sabitleyerek enjeksiyon mikro pipetini hazırlayın. Kapileri, uzun bir konik yapıya sahip ince bir uç oluşturacak şekilde çekmek için uygun bir program kullanın.Ardından, çekilmiş pipetleri cihazdan dikkatlice çıkarın ve yatay konumda bir mikroforja yerleştirin. Çekilmiş pipeti ve cam boncuğuyla birlikte mikroforj ısıtıcı filamanı odağa getirin. İstenilen kalınlığı ölçmek için oküler retikülünü kullanın ve ısıtıcı filaman beş mikrometre hedef iç çapa ulaşana kadar pipeti yatay olarak hareket ettirin.Isıyı yaklaşık %45'e ayarlayın ve pipeti filamente değecek şekilde nazikçe indirin. Ardından, ısıtıcıyı kısa süreliğine çalıştırın. Bu işlem pipeti hafifçe eritecek ve filamente yapışmasını sağlayacaktır; soğuma gerçekleştiğinde ise pipet temas noktasından kırılarak düz bir kesik oluşturacaktır.Bu adımda doğru sıcaklığı ayarlamak kritik öneme sahiptir. Çok yüksek sıcaklıklar pipetin bükülmesine neden olurken, çok düşük sıcaklıklar pipeti kesmek için yeterli olmayacaktır. Ardından, pipet ucunu ısıtıcı filamanla arasında yaklaşık 10 µm mesafe olacak şekilde konumlandırarak, uç kısmında yaklaşık 30 derecelik bir açı oluşturun.Sıcaklığı %60'a ayarlayın ve pipetin filament üzerinde istenen açıda bükülmesi için ısıtıcıyı etkinleştirin. Burada gösterilen ayarları kullanarak, uzun ve düzenli bir daralma ile paralel duvarlara sahip ince uçlu bir mikro-pipet oluşturacak şekilde cam kapilar çekin. Çekilen pipeti cihazdan dikkatlice çıkarın ve mikroforge tutucusuna yatay konumda yerleştirin.Pipet çapını ölçmek için oküler retikülü kullanın ve pipet çapı filament üzerindeyken 180 µm değerine ulaşana kadar pipeti hareket ettirin. Cam kılcal boruyu elmas uçlu bir kalemle işaretleyin ve ardından camı kırmak için çekilmiş uca hafifçe bastırın. Bu işlem düz bir kesimle sonuçlanmalıdır.Ardından, pipeti ucu filamente yakın olacak şekilde dikey konuma getirin. Mikroforge sıcaklığını %60'a ayarlayın ve standart teknikleri kullanarak, iç çap hedef boyuta ulaşana kadar pipetin ucunu ateşle cilalayın. Pipetin iç çapını ölçün; bu çapın 40 µm olması gerekir.Önceki ile aynı prosedürü kullanarak, ucu 30 derecelik bir açıyla bükün. Tutucu pipeti sol mikro-manipülatör tutucuya ve enjeksiyon pipetini sağ mikro-manipülasyon tutucuya yerleştirin. Ardından, enjeksiyon pipetini yağ ile doldurun.Pipetleri mikroskobun görüş alanının merkezine getirmek için mikro-manipülatör kontrollerini kullanın. 4X büyütme kullanarak, mikro-pipet uçlarının kabın tabanına paralel olacak şekilde doğru açıda olduğunu kontrol edin. 100 mm'lik bir petri kabının kapağının merkezine, %20 FBS ile desteklenmiş 37 °C SOF-HEPES çözeltisinden 50 µL'lik bir damla yerleştirin.Ardından, enjekte edilecek solüsyondan bir ila iki mikrolitre damlayı, enjeksiyon damlasının yakınına yerleştirin. Sonra, damlaları ve enjeksiyon plakasını yaklaşık 10 mililitre mineral yağ ile kaplayın. Plakayı mikroskop tablasına yerleştirin ve mikrodispenser kullanarak enjeksiyon damlasının üst kısmına yaklaşık 20 ila 30 zigot yükleyin.4X objektif kullanarak, mikroenjektöre negatif basınç uygulayıp enjekte edilecek çözeltiyi enjeksiyon pipetine yükleyin. İki ila üç zigotu enjekte etmeye yetecek miktarda çözelti yükleyin ve ardından enjeksiyon damlasına geçin. Enjeksiyon damlası içinde, tutma pipetinin ucunu bir zigota yaklaştıracak şekilde hareket ettirin.Zigotun tutma pipetine sabitlenmesi için tutma mikro-enjektörü ile negatif basınç uygulayın. Zigot güvenli bir şekilde sabitlendiğinde, 20X objektife geçin. Enjeksiyon pipetinin, zigota enjeksiyon bölgesinden hafifçe dokunarak embriyonun orta düzleminde konumlandığını kontrol edin.Orta düzlemde değilse, iğne embriyoyu delmek yerine döndürme eğiliminde olacaktır. Ardından, deliğin açılacağı bölgede lazeri zona pellucida'ya dik olarak yerleştirmek için yazılımı kullanın. Doğru şekilde konumlandırıldığında, lazer kontrol penceresini kullanın ve FIRE düğmesine tıklayın.Delik boyutunun, iğnenin plazma membranına zarar vermeden geçebilmesi için zona pellucida'da yeterli büyüklükte bir açıklık oluşturduğundan emin olun. Enjeksiyon iğnesini zona pellucida'daki delikten geçirin ve plazma membranla temas ettirin. İğne, embriyonun 3/4'üne kadar girene dek pipeti ileri doğru itmeye devam edin.Çözelti-yağ ara yüzeyindeki menisküsün konumunu gözlemleyin. Bu, enjeksiyon hacminin tutarlı bir şekilde kontrol edilmesi için kullanılacaktır. Plazma membranını ve sitoplazmayı enjeksiyon iğnesine çekmek için enjeksiyon pipetine negatif basınç uygulayın.İğne içindeki sitoplazma hareketi hızlanana veya sitoplazma içeriğinin enjeksiyon çözeltisiyle karıştığı görülene kadar devam edin. Bu durumlar plazma membranının yırtıldığını gösterecektir. Çözelti-yağ ara yüzeyindeki menisküs, başlangıç noktasının ötesinde bir zigot çapı kadar ilerleyene kadar pozitif basınç uygulayarak önce sitoplazmik içeriği, ardından çözeltiyi zigotun sitoplazmasına geri enjekte edin.Ardından, 4X objektife geçin ve enjekte edilen embriyoyu enjeksiyon damlasının alt tarafına taşıyın. Tutucu mikro-enjektöre pozitif basınç uygulayarak embriyoyu serbest bırakın. Enjekte edilen embriyoları bir mikro-dağıtıcı kullanarak toplayın.Enjekte edilen embriyoları, beraberindeki metin protokolünde açıklandığı gibi üç damla SOF-HEPES içinde hareket ettirerek yıkayın ve kültüre edin. Solüsyonun başarılı bir şekilde iletildiği, enjeksiyon bölgesini, enjeksiyon verimliliğini ve doğruluğunu izlemek için kullanılan dexion red'in görüldüğü floresan görüntüde belirgindir. Burada boya, bu teknik kullanıldığında tipik olduğu üzere sitoplazmaya homojen bir şekilde dağılmıştır.Bu protokol, sığır ve koyun zigotlarında minimum lizis oranlarına sahiptir. Mikroenjeksiyon sonucunda sığır veya koyunlarda enjekte edilen embriyoların çok azı lizis olmuştur. Ayrıca, hem sığır hem de koyun embriyoları için kontrol grubuna kıyasla enjekte edilen gruplarda blastokist gelişim oranları arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark yoktur.Bu teknik ustalığın kazanıldığı aşamada, dakikada iki embriyo hızında gerçekleştirilebilir. El becerisine dayalı enjeksiyon verimliliği, hayvan blastokist oranlarını minimize eder. Bu videoyu izledikten sonra, çiftlik hayvanı zigotlarında lazer destekli intrasitoplazmik mikroenjeksiyonun nasıl yapılacağını kavramış olmalısınız.Ayrıca, etkili bir iletim sağlamak amacıyla plazma membranının yırtılmasını garanti altına almak için pozitif ve negatif emme basıncının nasıl kullanılacağı da açıklanmaktadır.

laser-assisted-cytoplasmic-microinjection-in-livestock-zygotes

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Mikroenjeksiyon döllenmiş zebrafish embriyolar içine yabancı maddeler tanıtmak için bir köklü ve etkili bir yöntemdir. Burada, mRNA aşırı ekspresyonu gerçekleştirmek için sağlam bir mikroenjeksiyon tekniği ve morfolino oligonükleotid gen devirme çalışmaları zebrafish göstermektedir.

Zebra balığı Embriyolar mRNA ve morfolino Antisens Oligonükleotidler Mikroenjeksiyon.

Bu video morfolino veya mRNA sonraki gelişimi sırasında spesifik gen ürünlerinin seviyesini azaltmak veya artırmak için tek hücreli aşamada zebrafish embriyoların nasıl enjekte edilebilir gösterir.

Gen Fonksiyon Analiz Zebra balığı Embriyolar Mikroenjeksiyon

Bu videoda, bileşikleri Zebra balığı yumurta sarısı kesesine vermek için bir Embriyo mikroenjeksiyon tekniği açıklanmaktadır.

Embriyo Mikroenjeksiyonu: Zebra Balığı Sarısı İçine Bir Bileşik Verme Tekniği

Bu videoda, lentiviral gen iletimini kolaylaştırmak için fare döllenmiş yumurtalarında zona pellucida'nın koruyucu tabakasının lazer destekli nüfuzunu gösteriyoruz. Lentivirus, genomlarına istikrarlı bir şekilde entegre edilmiş bir ilgi genine sahip transgenik hayvanların üretilmesini sağlar.

Lazer Destekli Lentiviral Gen Dağıtımı: Lentiviral Gen Dağıtımını Kolaylaştırmak için Fare Döllenmiş Yumurtalarını Geçirgen Hale Getirme Tekniği

Mikroenjeksiyon yumurtalar, embriyo ve çeşitli türlerin hücrelerine DNA yapıları, mRNA, morfolino antisens oligonükleotidler veya diğer tedaviler sunmak için kullanılan bir tekniktir.

Deniz Kestanesi Zigotlar Yüksek Randımanlı Microinjections

Morphant embriyolar üretme yöntemleri gelişim düzenleyici mekanizmalarının ve gen ağları incelemek için gereklidir. Deniz yıldızı Patiria miniata bu çalışmalar için gelişmekte olan bir model sistem. Burada bir embriyo kültürleri, gamet elde üretmek için protokol ve bu türlerden zigot hızlı mikroenjeksiyon sunuyoruz.

Mikroenjeksiyonu Bir Yöntem Patiria Minata Zigotların

Akdeniz meyve sineği (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) dünya çapında bir tarım zararlısıdır. Biyolojisinin daha derin bir şekilde anlaşılması, medfly popülasyonlarını kontrol etmenin ve böylece ekonomik etkiyi azaltmanın anahtarıdır. Embriyo mikroenjeksiyonu, bu türde hem germ hattı transformasyonuna hem de ters genetik çalışmalara olanak sağlayan temel bir araçtır.

Dünya Tarım Pest Böcek Embriyo Mikroenjeksiyon yoluyla Nükleik Asitler teslim edilmesi,<em&gt; Ceratitis capitata</em

Zebra balığı embriyo ve larva mikroenjeksiyon birçok Zebra balığı modellerinde kullanılan çok önemli ama zorlu bir tekniktir. Burada, Zebra balığı mikroenjeksiyon ve görüntüleme için yönünü ve istikrar içinde yardım etmek için microscale araçlar bir dizi mevcut.

Microstructured cihazlar için en iyi duruma getirilmiş mikroenjeksiyon ve Zebra balığı larva görüntüleme

Döllenmiş yumurta fare ve erken sahne embriyolar zona pelusida, gen teslim karşı bir bariyer oluşturur bir glikoprotein matris tarafından korunmaktadır. Bu makalede, zona lentiviral vektörler ile embriyonik hücreler transduce ve transgenik fareler oluşturmak için bir lazer ile perfore için bir iletişim kuralı.

Fare Lentiviral Gene lazer destekli teslim yumurta döllenmiş

Mevcut protokol, gen kaseti knock-in ve flokslu fareleri verimli bir şekilde üretmek için CRISPR-Cas9 ve donör DNA'sının zigot mikroenjeksiyonunu tanımlamaktadır.

Farelerde gen kaseti knock-in ve flox alelleri oluşturmak için zigot mikroenjeksiyonu

Öğrenin, lazer destekli sitoplazmik mikroenjeksiyon yöntemiyle hayvancılık zigotlarına genom düzenleme araçlarının etkili teslimatını. Bu teknik, gen fonksiyonu çalışmaları ve transgenik hayvan üretimi için güvenilir bir yaklaşım sunar.

Lazer destekli Hayvancılık Zigotlann Sitoplazmik Mikroenjeksiyon

Daha fazla video keşfet