Roman Floresan Probları Plazma Membran Fosfatidilinositol 4,5-bisfosfatın tek molekül Süper çözünürlüklü görüntüleme

Bu çalışmanın genel amacı, tek moleküllü floresan lokalizasyon mikroskobu kullanılarak hücre plazma zarında Fosfatidilinositol 4, 5-bifosfatın nano ölçekli dağılımını yaymaktır. Bu yöntem, fosfoinositid sinyalizasyonu ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olur. Örneğin, hücre zarındaki sinyal kompleksi altındaki fosfoinositidlerin nano ölçekli organizasyonu nedir?

Bu tekniğin temel avantajları, yüksek uzamsal çözünürlük ve fosfolipid morfolojik çalışmalarında önemli bir endişe kaynağı olan deterjan işleminin atlanmasıdır. Bu yaklaşım üç ana adımı içerir. Birinci adım: Canlı hücrelerden plazma zarı tabakasının hazırlanması.

İkinci adım: Fosfoinositid etiketleme ve tek moleküllü floresan görüntüleme. Üçüncü adım: Tek molekül lokalizasyonu ve görüntüleme rekonstrüksiyonu. Deney gününde, ceket örtüsü yarım ila bir mililitre PDL ile kayar.

Bir veya iki saat sonra, fazla PDL'yi kapak fişinin kenarından kağıt mendil ile emdirin. Daha sonra kapak fişlerini dört santigrat derecede metal bir plaka üzerinde saklayın. Daha sonra, bir milimolar EGTA içeren yarım ila bir mililitre buz gibi soğuk PBS ile örtü fişleri üzerinde büyütülmüş önceden transpected INS-1 hücrelerini yıkayın.

Bu yıkamayı üç kez tekrarlayın ve fazla PBS'yi emdirin. Şimdi cımbız kullanarak, kültürlenmiş hücrelerle birlikte kapak fişlerini, hücre tarafı aşağı bakacak şekilde PDL kaplı kapak fişlerinin üzerine yerleştirin. Bunu soğutulmuş metal plaka üzerinde yapın.

Ardından, hücrelere yapışması için zaman tanımak için plakayı yedi ila on dakika boyunca dört santigrat dereceye aktarın. Daha sonra, PDL kaplı lamel üzerinde ince bir hücre zarı tabakası bırakacak olan hücre yüklü lamel nazikçe soymak için cımbız kullanın. Ardından membran tabakalarını yarım ila bir mililitre buz gibi soğuk PBS ile nazikçe yıkayın.

Şimdi her bir membran tabakasını PBS'de yüzde 0,2 glutaraldehit ile yaklaşık 150 mikrolitre buz gibi yüzde dört PFA'ya sabitleyin. Membranların dört santigrat derecede 15 dakika sabitlenmesine izin verin. Fiksasyondan sonra ya hemen görüntülemeye devam edin ya da preparatları buz gibi soğuk PBS ile örtün ve dört santigrat derecede saklayın.

pH probları kullanılıyorsa, acil görüntüleme şiddetle tavsiye edilir. Bu işlem için TIRF mikroskobu tabanlı bir SMLM sistemi kullanılır. Membranları görüntülemeden önce, bir mikrolitre floresan boncuk çözeltisini 10 mililitre PBS'de 50 milimolar magnezyum klorür ile seyreltin.

Daha sonra görüntüleme odasına bir numune yükleyin ve seyreltilmiş çözeltiden 200 mikrolitre ekleyin ve 10 dakika bekleyin. Daha sonra numuneyi PBS ile üç kez yıkayın. Şimdi PALM görüntüleme sistemini başlatın.

İlgili görüntüleme yazılımında iRFP kanal düğmesini seçin. Ardından, iRFP kanalındaki pH problarını ifade eden hücre zarını bulun, sapma düzeltmesi için floresan boncukları kullanın. Normal bir TIRF açısını, TIRF kritik açısından 1,5 daha derin olan ve varsayılan açı olması gereken 2140 olarak ayarlayın.

Ardından, iRFP kanalında referans olarak geleneksel bir TIRF görüntüsü toplamak için yakalama düğmesini kullanın. Ardından, RFP kanal düğmesine tıklayarak PAm-Cherry1 kanalına geçin. Ardından, tam aydınlatma için AOTF pedindeki kaydırma çubuğunu tamamen sağa ayarlayın ve arka plan zarı çiçeklenmesini ağartmak için lazeri yaklaşık 10 ila 20 saniye uygulayın.

Ardından, format sekmesi altındaki en uygun kamera ayarını ikiye iki gruplama olarak ayarlayın. Ardından, ND Dizi Alımı sekmesi altındaki hızlı alma protokolünü 20 hertz'de 30.000 görüntüye ayarlayın. Ardından, görüntü alımı sırasında 405 nanometre lazere yüzde 0,1 ila bir oranında güç uygulayın, böylece her karedeki uzamsal olarak izole edilmiş noktalar kolayca tanımlanabilir.

Şimdi Şimdi Çalıştır düğmesine tıklayarak PAm-Cherry1 görüntülerini edinin. Edinimler sırasında aktive edilebilecek molekül sayısı kademeli olarak azalacaktır. Yanıt olarak, optimum sinyal yoğunluğunu korumak için 405 nanometre lazerin yoğunluğunu kademeli olarak artırın.

PAm-Cherry1 sinyalinin tamamı etkinleştirilene kadar görüntü alın. Daha sonra görüntü işleme ve rekonstrüksiyon yapılırken, her kareden ayrı moleküler olayları tanımlayın ve lokalize edin. Filtreleme yoğunluğu eşiğini, dalgacıktaki eşik sayısı ile ayarlayın.

Daha fazla ayrıntı metin protokolünde verilmiştir. PIP2 uzamsal dağılımı, metinde açıklanan uygun fiksasyon ile farklı fiksasyona duyarlıdır, PIP2 probları, PIP2 antikoru veya spesifik pH alanları ile etiketlendiğinde tutarlı bir dağılım göstermiştir. Karşılaştırıldığında, EGFP etiketli pH alanları ile etiketlenmiş canlı hücreler çok farklı görüntülenmez.

Tüm numuneler eşit bir prob dağılımı gösterdi. Buna karşılık, optimal olmayan fiksasyon, keskin-yoğun PIP2 kümeleri ve sinyal yoğunluğunda bir azalma ile sonuçlandı. Optimal fiksasyon koşulları altında, sabit hücrelerde PIP2'nin süper çözünürlüklü görüntüleri, plazma zarının önemli bir bölümünde sadece sınırlı konsantrasyon gradyanları ile homojen bir prob dağılımı ortaya çıkardı.

Bazı membran yamaları, seyrek dağılmış ve çeşitli boyutlarda PIP2 probları ile zenginleştirilmiştir. Canlı hücre PALM görüntüleri, sabit hücrelerle benzer bir uzamsal dağılım gösterdi. PIP2 sinyallerinin ayrıntılı analizi, dinamiklerinin yerel bölgelerde hızlı olduğunu ortaya koydu, ancak bu, genel bolluklarında önemli değişikliklere neden olmadı.

Bu teknik, fosfolipitler alanındaki araştırmacıların fizyolojik koşullar altında diğer fosfoinositid alt tiplerinin dağılımını ve aktivitesini keşfetmeleri için yeni bir yol sunmaktadır.