Rapid Metodoloji tarafından Roman RNA Bağlayıcı Proteinler İzolasyon
September 30th, 2016
RNA-protein etkileşimleri birçok hücresel sürecin merkezinde yer alır. Burada, spesifik RNA'yı izole etmek ve onunla ilişkili yeni proteinleri tanımlamak için in vivo bir yöntemi açıklıyoruz. Bu, RNA'ların hücrede nasıl düzenlendiğine yeni bir ışık tutabilir.
Bu prosedürün genel amacı, spesifik RNA'yı in vivo olarak RNA ile ilişkili proteinlerle verimli bir şekilde izole etmektir. Bu yöntem, belirli bir transkripte bağlı farklı bir fau-arı-çiş kümesinin ne olduğu gibi RNA metabolizması ve regülasyonundaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, asil mRNA ile ilişkili proteinlerin takip yoluyla tanımlanmasına izin veren yüksek izolasyon verimliliğidir.
Hızlı metodoloji, MS2 etiketli MRNA'yı ve bir MS2 bağlayıcı proteinin ve bir streptavadin bağlayıcı proteinin bir füzyon proteinini birlikte eksprese eden bir maya suşu kullanır. Sentetik dekstroz veya SD seçici ortamda 30 santigrat derecede 500 mililitre maya hücresini 0.8 ila 1.0 arasında bir OD600'e büyütün. Hücreler hazır olduğunda, oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 3000 kez G'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
Hücreleri PBS'de yıkayın ve tekrar santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücreleri metiyonin olmadan eşit miktarda SD'de yeniden süspanse edin. Füzyon proteininin ekspresyonunu indüklemek için 30 santigrat derecede 45 ila 60 dakika inkübe edin.
45 ila 60 dakika sonra, RNA ekstraksiyonu için 10 mililitre hücreyi bir kenara koyun ve kalan hücreleri hızlı saflaştırma için kullanın. Bu prosedüre başlamak için, hücrelere 1.35 mililitre% 37 formaldehit, RNA-protein komplekslerini çapraz bağlamak için% 0.1'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin. 30 santigrat derecede 10 dakika inkübe etmeye devam edin.
Çapraz bağlanmayı durdurmak için, 0.125 molar dişin nihai konsantrasyonuna 26.5 mililitre 2.5 molar glisin ekleyin ve 30 santigrat derecede 3 dakika inkübe edin. Bundan sonra, her şeyi buzda tutun ve RNA bozulmasını en aza indirmek için hızlı bir şekilde çalışın. Hücreleri 4 santigrat derecede 4 dakika boyunca 3000 kez G'de santrifüjleyin.
Süpernatanı atın, 45 mililitre soğuk PBS ekleyin ve tekrar santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri, yüksek konsantrasyonda Rnaz inhibitörleri içeren 5 mililitre hızlı lizis tamponunda yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu vidalı kapaklı mikrofüj tüplerinde 500 mikrolitrelik alikotlara bölün ve her alikotlara yaklaşık 400 miligram soğutulmuş cam boncuk ekleyin.
Hücreleri bir boncuk çırpıcıda üç dakika boyunca parçalayın. Lizatı hemen buzun üzerine koyun. Lizatı yeni mikrofüj tüplerine aktarın.
5 mililitrelik bir şırınganın üst kısmını kesin ve vidalı kapaklı tüpler için bir adaptör görevi görmesi için 15 mililitrelik boş bir tüpe koyun. Her tüpün dibinde küçük bir delik açmak için sıcak bir iğne kullanın ve bunları uyarlanmış 15 mililitrelik tüplerin üzerine yerleştirin. Lizatı 15 mililitrelik tüplere aktarmak için küvet tertibatlarını 3000 kez G'de 4 santigrat derecede bir dakika boyunca santrifüjleyin.
Her 15 mililitrelik tüpten akışı yeni bir 1.5 mililitrelik tüpe aktarın ve hücre kalıntılarını temizlemek için 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca 10.000 kez G'de santrifüjleyin. Tüm 1,5 mililitrelik tüplerdeki süpernatanı tek bir 15 mililitrelik tüpte toplayın. RNA ve protein izolasyonu için sırasıyla lizatın 1/50 ve 1/100 hacmini bir kenara koyun.
Hücre lizatına 300 mikrogram Avidin ekleyerek RNA protein komplekslerini izole etmek için hızlı prosedüre başlayın. Sürekli haddeleme altında 4 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Hücre lizatı Avidin ile inkübe edilirken, streptavidin boncuklarını önceden yıkayın, yaklaşık 300 mikrolitre streptavadin boncuk bulamacını 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüpü ağırlığına aktarın, preparatı santrifüjleyin ve ardından 250 mikrolitre boncuk ile sonuçlanacak olan üst süpernatanı çıkarın.
Boncuklara 1 mililitre hızlı lizis tamponu ekleyin ve 4 santigrat derecede 2 dakika boyunca 660 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hızlı lizis tamponu ile tekrar yıkayın. Boncukları bloke etmek için 0,5 mililitre hızlı lizis tamponu, 0,5 mililitre BSA ve 10 mikrolitre maya TRNA ekleyin ve sabit dönüşle 4 santigrat derecede 1 saat inkübe edin.
Boncukları 1 mililitre hızlı lizis tamponu ile iki kez yıkayın. Avidin içeren lizata 250 mikrolitre önceden yıkanmış streptavidin boncuk ekleyin ve sabit rotasyonla 4 santigrat derecede 1 saat inkübe edin. Bu inkübasyon süresi, yeterli bağlanma süresi sağlamak ile RNA bozunması olasılığını en aza indirmek arasında bir uzlaşmadır.
Bir saat sonra, streptavidin boncuklarını temizlemek için 4 santigrat derecede 2 dakika boyunca 660 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanı 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. RNA ve protein izolasyonu için sırasıyla lizatın 1/50 ve 1/100 hacmini bir kenara koyun.
Boncuklara 1 mililitre hızlı lizis tamponu ekleyin. Pipetleme ile karıştırın, yeni bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 4 santigrat derecede 2 dakika boyunca 660 kez G'de santrifüjleyin. Hızlı lizis tamponu ile üç kez daha yıkayın.
Hızlı lizis tamponu ile son yıkamadan sonra, süpernatanı çıkarın, 1 mililitre hızlı yıkama tamponu ekleyin ve 4 santigrat derecede 5 dakika döndürün. Santrifüjleyin ve hızlı yıkama tamponu ile 2 kez daha yıkayın. Boncukları 1 mililitre PBS ile yıkayın ve daha önce olduğu gibi santrifüjleyin.
Süpernatanı çıkarın, boncuklara 120 mikrolitre PBS ekleyin ve bir silindirde 5 dakika döndürün. Daha önce olduğu gibi santrifüjleyin ve yıkama numunesi olarak RNA ve protein ekstraksiyonu için tüm süpernatanı toplayın. RNA ve RNA ile ilişkili proteinleri elüte etmek için, PBS'de 120 mikrolitre 6 milimolar biyotini boncuklara ekleyin ve sabit rotasyonla 4 santigrat derecede 45 dakika inkübe edin.
Boncukları santrifüjleyin ve sızan malzemeyi yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın. Ayrıştırılan numuneyi tekrar döndürün ve boncukların taşınmamasını sağlamak için üst fazı yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın. RNA veya protein ekstraksiyonu için örnekler alın.
RNA'nın izolasyon verimliliğini ve kalitesini belirlemek için, etiketli iki RNA için Northern Analizi yapıldı. PMP1 ve FPR1, döküm hücre lizizinden, hızlı hücre lizizinden ve biotin ile elüsyondan sonra. Ribozomal RNA'lar, etidyum bromür boyaması ile tespit edildi ve elüsyon örneğinde ribozomal RNA'ların olmaması, saflaştırmanın sıkılığını gösterir.
Saflaştırmanın sıkılığı ve özgüllüğü, elüsyon örneklerinde etiketlenmemiş bir MRNA sinyalinin olmaması ile daha da gösterilir. ACT1 boyutunda olmayan FPR1 şeridindeki görünen sinyal, MS2L probu ile önceki hibridizasyondan kalan bir kalıntıdır. Giriş RNA'sı, Sıcak Fenol protokolü tarafından saflaştırılan RNA'ya kıyasla biraz daha fazla bozulmuş olsa da, elüsyon fraksiyonlarındaki güçlü sinyalin ortaya çıkardığı gibi, önemli miktarda tam uzunlukta etiketli RNA spesifik olarak izole edilir.
Protein örnekleri, proteomik analizden önce SDS-PAGE ve silverstaining ile analiz edilebilir. Okla gösterilen MS2-CP-GFP-SBP füzyon proteini, eşit protein yüklemesi gösterir. Yıldız işaretleri, daha sonra kütle spektrometresi analizi için jelden kesilen diferansiyel yoğunluklara sahip bantları gösterir.
Bu prosedürü denerken, eldiven giymek, temiz bir çalışma alanı sağlamak, RNA içermeyen su ile çözelti hazırlamak ve protokol süresini azaltmak için hızlı ve verimli bir şekilde çalışmak önemlidir. Fenol ve formaldehit gibi reaktiflerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman kimyasal bir başlıkta çalışmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın. Bu videoyu izledikten sonra, fayn-tress ve ilişkili gövdesinin RNA'sını nasıl verimli ve etkili bir şekilde saflaştıracağınızı iyi anlamış olmalısınız.
Bu prosedürü takiben, ilgilenilen transkripti bağlayan RNA'ları tespit etmek için RNA-Seq gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, ilişkili proteinleriyle birlikte spesifik RNA'yı izole etmek için bir in vivo yöntemi sunar. Bu teknik, hücreler içinde RNA düzenlemesini anlamamızı artırmayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Ana Bileşenleri
Bilim Alanı
- RNA-protein etkileşimleri
- Hücresel süreçler
- RNA metabolizması
Arka Plan
- RNA-protein etkileşimleri çeşitli hücresel fonksiyonlar için kritik öneme sahiptir.
- Bu etkileşimleri anlamak, RNA düzenlemesi hakkında içgörüler sağlayabilir.
- Mevcut yöntemler, spesifik RNA-protein komplekslerini izole etmede verimlilikten yoksun olabilir.
- Bu çalışma, maya suşları kullanan yeni bir yaklaşım sunar.
Çalışmanın Amacı
- Spesifik RNA'yı izole etmek ve ilişkili proteinleri in vivo olarak tanımlamak.
- RNA metabolizması ve düzenlemesi ile ilgili soruları ele almak.
- RNA-protein izole etme tekniklerinin verimliliğini artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- MS2 etiketli mRNA eksprese eden bir maya suşunun kullanılması.
- MS2 bağlanma proteini ve streptavidin bağlanma proteininin füzyon proteini.
- Maya hücrelerinin sentetik dekstroz ortamında büyütülmesi.
- RNA-protein komplekslerini izole etmek için santrifüjleme.
Ana Sonuçlar
- RNA-protein komplekslerini izole etmede yüksek verim elde edilmiştir.
- Yeni mRNA'ya ilişkin proteinlerin tanımlanması kolaylaştırılmıştır.
- Bu yöntem, örneklerin hızlı işlenmesini sağlar.
- Bu yaklaşımla RNA düzenlemesi hakkında içgörüler elde edilmiştir.
Sonuçlar
- Bu yöntem, RNA-protein etkileşimlerini incelemek için değerli bir araç sağlar.
- RNA metabolizması ve düzenlemesi hakkındaki anlayışımızı artırır.
- Gelecekteki uygulamalar, hücresel süreçlerde keşifler yapmaya yol açabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Identifying RNA-binding proteins (RBPs) associated with specific transcripts is critical for target validation in RNA therapeutics and biomarker discovery. The RaPID methodology enables efficient in vivo isolation of RNA-protein complexes, supporting mechanistic de-risking by clarifying functional interactions in a disease-relevant system. This approach enhances predictive confidence in early discovery by providing quantitative, reproducible data on RBP-mRNA associations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying RBPs bound to disease-relevant mRNAs like ER-associated PMP1.
- Operational Value: Provides a reproducible workflow for isolating native RNA-protein complexes from yeast, reducing false positives from in vitro methods.
- Predictive Value: Supports target confidence through specific, high-efficiency capture of in vivo interactions, aiding portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated biological systems (yeast strains expressing MS2-tagged RNA and fusion protein) for downstream screening applications.
- Operational Value: Standardizes complex isolation via streptavidin bead pulldown, improving reproducibility across experiments.
- Assay Readiness: Produces purified RNA and protein fractions suitable for quantitative analysis by mass spectrometry or Northern blot.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase RBP identification to preclinical validation by enabling follow-up analyses like RNA-Seq and SDS-PAGE.
- Mechanistic De-risking: Demonstrates stringency and specificity through lack of ribosomal RNA and untagged mRNA signals in elution samples.
- Disease-Relevant System: Applicable to yeast models of RNA metabolism, with potential adaptation to mammalian systems for target validation.
Pipeline & Workflow Integration
The RaPID method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing and biological de-risking before lead identification and preclinical validation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by isolating specific RNA-protein complexes from vivo conditions, clarifying functional associations.
- Screening: Enables assay development through standardized isolation of RNA-protein complexes, supporting reproducible compound or genetic screening.
- Analytics: Generates quantitative outputs via mass spectrometry and Northern blot analysis, allowing comparison of RBP abundance across conditions.
- Translational Research: Supports preclinical continuity by providing purified complexes for downstream validation in disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for RBP discovery across multiple transcripts, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in RNA regulation.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability through defined crosslinking, lysis, and bead-based purification steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reliable data on RBP-mRNA interactions, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated RBP associations in disease-relevant contexts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, yeast culture, and RNA-protein interaction techniques.
- Needs instrumentation for crosslinking (formaldehyde), bead-based separation, and centrifugation at multiple speeds.
- Demands cross-team standardization of lysis buffer composition and RNase inhibitor use to ensure reproducibility.
- Involves adaptation considerations when transferring from yeast to other model systems, particularly regarding tagging and fusion protein expression.
- Includes practical limitations such as RNA degradation risk during processing and the need for rapid, cold handling to maintain complex integrity.
