Rapid Metodoloji tarafından Roman RNA Bağlayıcı Proteinler İzolasyon

Bu prosedürün genel amacı, belirli RNA'ları, in vivo ortamda bu RNA'larla ilişkili olan proteinlerle birlikte verimli bir şekilde izole etmektir. Bu yöntem, belirli bir transkriptle bağlanan belirgin RBP kümesinin ne olduğu gibi, RNA metabolizması ve düzenlemesindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, yeni mRNA ilişkili proteinlerinle sonraki tanımlama süreçlerine olanak sağlayan yüksek izolasyon verimliliğidir.

Hızlı metodoloji, MS2 etiketli MRNA ile bir MS2 bağlayıcı protein ve bir streptavadin bağlayıcı proteinin füzyon proteinini birlikte eksprese eden bir maya suşu kullanır. 500 mililitre maya hücresini, sentetik dekstroz veya SD seçici besiyerinde 30 °C'de 0,8 ile 1,0 arası bir OD600 değerine ulaşana kadar büyütün. Hücreler hazır olduğunda, oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 3000 ×g'de santrifüjleyin ve süpernatantı atın.

Hücreleri PBS ile yıkayın ve tekrar santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve hücreleri metiyonin içermeyen eşit hacimde SD içinde yeniden süspanse edin. Füzyon proteininin ekspresyonunu indüklemek için 30 °C'de 45 ila 60 dakika inkübe edin.

45 ila 60 dakika sonra, RNA ekstraksiyonu için hücrelerden 10 mililitre ayırın ve kalan hücreleri hızlı saflaştırma için kullanın. Bu prosedüre başlamak için, RNA-protein komplekslerini çapraz bağlamak amacıyla hücrelere, nihai konsantrasyonu 0,1% olacak şekilde 1,35 mililitre %37'lik formaldehyde ekleyin. 30 degrees Celsius'de 10 dakika boyunca inkübasyona devam edin.

Çapraz bağlanmayı durdurmak için, 0,125 molar nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde 26,5 mililitre 2,5 molar glisin ekleyin ve 30 °C'de 3 dakika inkübe edin. Bundan sonra, RNA degradasyonunu minimize etmek için her şeyi buz üzerinde tutun ve hızlı çalışın. Hücreleri 4 °C'de 4 dakika boyunca 3000 ×g'de santrifüjleyin.

Süpernatanı dökün, 45 mililitre soğuk PBS ekleyin ve tekrar santrifüjleyin. Süpernatanı uzaklaştırın ve hücreleri, yüksek konsantrasyonda Rnase inhibitörleri içeren 5 mililitre hızlı liziz tamponunda yeniden süspande edin. Hücre süspansiyonunu vidalı kapaklı mikrofüj tüplerine 500 mikrolitrelik alikotlar halinde bölün ve her alikota yaklaşık 400 miligram soğutulmuş cam boncuk ekleyin.

Hücreleri bir boncuklu homojenizatörde (bead-beater) üç dakika boyunca lizleyin. Lizatı derhal buz üzerine koyun. Lizatı yeni mikrosantrifüj tüplerine aktarın.

Vida kapaklı tüpler için bir adaptör görevi görmesi amacıyla, 5 mililitrelik bir şırınganın üst kısmını kesin ve boş bir 15 mililitrelik tüpün üzerine yerleştirin. Her bir tüpün alt kısmına ısıtılmış bir iğne ile küçük bir delik açın ve bunları adaptörlü 15 mililitrelik tüplerin üzerine yerleştirin. Lizatı 15 mililitrelik tüplere elüe etmek için tüp düzeneklerini 4 °C'de, bir dakika boyunca 3000 ×g'de santrifüjleyin.

Her bir 15 mililitrelik tüpteki akış sıvısını yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın ve hücre kalıntılarını temizlemek için 4 degrees Celsius'de 10.000 times G hızında 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Tüm 1,5 mililitrelik tüplerdeki süpernatantı tek bir 15 mililitrelik tüpte toplayın. Lizat hacminin sırasıyla 1/50'lik ve 1/100'lük kısmını RNA ve protein izolasyonu için ayırın.

Hücre lizatına 300 mikrogram Avidin ekleyerek RNA protein komplekslerinin izolasyonu için hızlı prosedüre başlayın. Sabit yuvarlama altında, 4 santigrat derecede 30 minutes boyunca inkübe edin. Hücre lizatı Avidin ile inkübe edilirken, streptavidin boncuklarını ön yıkamadan geçirin, streptavidin boncuk süspansiyonundan yaklaşık 300 mikrolitreyle 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın, preparatı santrifüjleyin ve ardından 250 mikrolitre boncuk kalana kadar üstteki süpernatantı uzaklaştırın.

Boncuklara 1 mililitre hızlı lizis tamponu ekleyin ve 4 santigrat derecede 2 dakika boyunca 660 xg hızda santrifüj edin. Süpernatantı uzaklaştırın ve hızlı lizis tamponu ile tekrar yıkayın. Boncukları bloklamak için 0,5 mililitre hızlı lizis tamponu, 0,5 mililitre BSA ve 10 mikrolitre maya TRNA ekleyin ve sabit rotasyonla 4 santigrat derecede 1 saat boyunca inkübe edin.

Boncukları 1 mililitre hızlı lizis tamponu ile iki kez yıkayın. Önceden yıkanmış 250 mikrolitre streptavidin boncuğunu avidin içeren lizata ekleyin ve 4 derece Celsius'ta sabit rotasyonla 1 saat boyunca inkübe edin. Bu inkübasyon süresi, yeterli bağlanma süresi sağlamak ile RNA degradasyonu olasılığını minimize etmek arasındaki bir dengedir.

Bir saat sonra, streptavidin boncuklarını temizlemek için 4 °C'de 2 dakika boyunca 660 ×g'de santrifüj edin. Süpernatantı 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Lizat hacminin sırasıyla 1/50'sini RNA izolasyonu ve 1/100'ünü protein izolasyonu için ayırın.

Boncukların üzerine 1 mililitre hızlı liziz tamponu ekleyin. Pipetleme yoluyla karıştırın, yeni bir 1,5 mililitre mikro santrifüj tüpüne aktarın ve 4 °C'de 2 dakika boyunca 660 ×g'de santrifüjleyin. Hızlı liziz tamponu ile üç kez daha yıkayın.

Hızlı lizis tamponu ile yapılan son yıkamadan sonra, süpernatantı uzaklaştırın, 1 mililitre hızlı yıkama tamponu ekleyin ve 4 santigrat derecede 5 dakika boyunca döndürün. Santrifüjleyin ve hızlı yıkama tamponu ile 2 kez daha yıkayın. Boncukları 1 mililitre PBS ile yıkayın ve daha önce yaptığınız gibi santrifüjleyin.

Süpernatantı uzaklaştırın, boncuklara 120 µL PBS ekleyin ve bir roller içinde 5 dakika döndürün. Daha önce olduğu gibi santrifüjleyin ve RNA ile protein ekstraksiyonu için tüm süpernatantı yıkama örneği olarak toplayın. RNA'yı ve RNA ile ilişkili proteinleri elüye etmek için boncuklara PBS içinde 6 mM biotin içeren 120 µL ekleyin ve 4 °C'de sabit rotasyonla 45 dakika inkübe edin.

Boncukları santrifüjleyin ve elüye edilen materyali yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın. Boncukların taşınmadığından emin olmak için elüye edilen örneği tekrar döndürün ve üst fazı yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın. RNA veya protein ekstraksiyonu için örnekler alın.

RNA izolasyon verimliliğini ve kalitesini belirlemek için, döküm hücre lizizi, hızlı hücre lizizi ve biotin ile elüsyondan sonra elde edilen PMP1 ve FPR1 şeklinde etiketlenmiş iki RNA için Northern Analizi gerçekleştirilmiştir. Ribozomal RNA'lar etidyum bromür boyaması ile tespit edilmiş olup, elüsyon örneğinde ribozomal RNA'ların bulunmaması saflaştırmanın kesinliğini göstermektedir.

Saflaştırmanın kesinliği ve özgüllüğü, elüsyon örneklerinde etiketsiz MRNA sinyalinin bulunmamasıyla daha da kanıtlanmıştır. FPR1 şeridindeki ve ACT1 boyutunda olmayan belirgin sinyal, MS2L probu ile yapılan önceki hibridizasyondan kalmıştır. Girdi RNA'sı, Hot Phenol protokolü ile saflaştırılan RNA'ya kıyasla bir miktar daha degrade olmuş olsa da elüsyon fraksiyonlarındaki güçlü sinyalin gösterdiği üzere, önemli miktarda tam uzunluktaki etiketli RNA özgül olarak izole edilmiştir.

Protein örnekleri, proteomik analiz öncesinde SDS-PAGE ve gümüş boyama ile analiz edilebilir. Okla gösterilen MS2-CP-GFP-SBP füzyon proteini, eşit protein yüklemesini kanıtlamaktadır. Yıldızlar, kütle spektrometrisi analizi için daha sonra jelden kesilen farklı yoğunluktaki bantları belirtmektedir.

Bu prosedürü uygularken eldiven giymek, çalışma alanının temiz olduğundan emin olmak, çözeltiyi RNA'sız su ile hazırlamak ve protokol süresini kısaltmak için hızlı ve verimli çalışmak önemlidir. Fenol ve formaldehit gibi reaktiflerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman kimyasal çekmecede çalışmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın. Bu videoyu izledikten sonra, fayn-tress RNA'sının ve onunla ilişkili gövdenin nasıl verimli ve etkili bir şekilde saflaştırılacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

Bu prosedürün ardından, ilgilenilen transkripte bağlanan RNA'ları tespit etmek amacıyla RNA-Seq gibi diğer yöntemler uygulanabilir.