"Fagozomun Kapatma Deneyi" kullanma Üç Boyutta fagozomun Formasyonu Visualize'a Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu (TIRFM)

Bu protokolün genel amacı, Toplam İç Yansıma Floresansı veya TIRF Mikroskobu kullanarak canlı makrofajlarda fagozom oluşumunun yanı sıra fagozom şizminin kesin bölgesini 3D olarak görselleştirmektir. Bu yöntem, psödopod ekstansiyonu ve uç füzyonu sırasında iki farklı floresan proteinin adım adım lokalizasyonunu izlemek için TIRF Mikroskobunu epifloresan ile birleştirir. Teknik, kritik açıyı belirlemek ve plazma zarına yakın hakkında sonuçlar çıkarmak için çok önemli olan bir TIRF sinyali elde etmek için sistematik bir yöntem sağlar.

TIRF mikroskop seansından bir gün önce, mikroskop aşamasının homojen bir şekilde ısınmasını sağlamak için ısıtma odasını 37 santigrat dereceye getirin. Ertesi sabah, 100 mikrolitre PBS kullanarak,% 0.1 BSA ile takviye edilmiş, 35 milimetrelik cam tabanlı tabak başına 6. koyun kırmızı kan hücrelerine veya SRBC'lere 7x10 yıkamak için. İkinci santrifüjlemeden sonra, hücreleri 500 mikrolitre tavşan IGG anti-SRBC'lerde, 5 mikrolitre hücre başına% 0.1 BSA ile takviye edilmiş PBS'de alt aglütinasyon konsantrasyonunda yeniden süspanse edin ve hücreleri yavaş bir rotasyonla 30 dakika inkübe edin.

İnkübasyonun sonunda, SRBC'leri PBS artı BSA'da iki kez yıkayın ve hücreleri tabak başına 2 mililitre 37 santigrat derece, serumsuz mikroskopi ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra, 35 milimetre cam tabanlı bulaşıkları oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 2 mililitre% 0.1 poli-L lizin ile muamele edin, ardından 2 mililitre PBS ile iki yıkama yapın. SRBC'lerin kovalent olmayan fiksasyonu için, polilisin kaplı tabakların her birine 2 mililitre IGG opsonize hücre dökün ve numuneleri sallanan bir rotor santrifüjünde santrifüjleyin.

Süpernatanları atın ve parçacıkları 2 mililitre PBS ve% 10 BSA ile bir kez yıkayın. Daha sonra, parçacıkları 2 militer taze PBS artı% 10 BSA ile oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin, ardından 2 mililitre PBS ile üç yıkama yapın. Son yıkamadan sonra, PBS'yi 2 mililitre 37 santigrat derece, serumsuz mikroskopi ortamı ile değiştirin.

Mikroskop tablasına SRBC kaplı bir tabak yerleştirin. Daha sonra, transfekte edilmiş hücreleri kültür kabının altından kazıyın ve tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için hücreleri birkaç kez pipetleyin. Kopyalanan hücreleri SRBC kaplı kaba ekleyin.

Canlı alım yazılımını başlatın. Floresan etiketli proteinleri ifade eden bir hücre bulun ve çanağın konumunu, ilgilenilen bir hücre alanın ortasında olacak şekilde ayarlayın. Tek bir uyarma dalga boyunda, 0,01 derecelik artışlarla sıfırdan %5'e kadar farklı açılarda 500 görüntü elde edin.

Gelen ışığın cam-ortam arayüzünde tamamen yansıtılması için kritik açıyı belirlemek ve geçici bir dalga oluşturmak için görüntü dizisini uygun görüntüleme yazılımında açın. Hücrede tek tip floresan ile ilgili bir bölge seçin. Ardından, Görüntü sekmesi altında Yığınlar'ı seçin ve Z Ekseni Profilini Çiz'i seçin.

Z ekseni profilini çizmek için, x ekseni üzerindeki açıların fonksiyonu ile ilgilenilen bölgede ölçülen ortalama floresan yoğunluğu. X ekseni üzerindeki, kritik açıdan daha üstün olan herhangi bir açı değeri, daha sonra bir TIRF sinyali elde etmek için mikroskopi oturumu sırasında kullanılabilir. Ardından, canlı alım yazılımında, alımın parametrelerini ayarlamak için protokol düzenleyicisini kullanın.

Döngü toplama dizilerinin sayısı, floresan kanalları ve lazer yoğunlukları, TIRF açısı ve maruz kalma süresi dahil. Epifloresan modu düzlemine ulaşmak için hedefin Z hareketini ayarlayın. Ardından, epifloresan modunda, TIRF açısını 1'e ayarlayın ve hedefin Z hareketini TIRF düzlemine geri getirin.

Ardından, parlak ışıklı LED modunda hücrenin bir görüntüsünü elde edin. Şimdi, bir SRBC ile fagositoz yapan, orta düzeyde floresan etiketli protein ekspresyonuna sahip bir ilgi hücresi bulun ve hücreyi alanın ortasına taşıyın. Böyle bir hücrenin, parçacığın etrafındaki genişletilmiş bir plazma zarı ile tanımlanabileceğine dikkat edin.

500 ila 1.000 karelik bir akış alımına başlamak için Döngü Sayısı sekmesine kare sayısını girin. Gerekirse, hücredeki farklı floresan seviyelerine uyum sağlamak için lazer yoğunluğunu ve maruz kalma süresini değiştirin. İki kanala karşılık gelen iki ayrı görüntü dizisi oluşturmak için, dizileri imagine yazılımında açın ve Görüntü sekmesine tıklayın.

Hyperstacks menüsünde Stack to Hyperstack'i seçin. Ardından, açılır pencerede Sipariş için xyctz, Kanallar için kullanılan florokrom sayısı, z eksenindeki Dilim sayısı, Çerçeveler altındaki kanal sayısına bölünen görüntü sayısı ve Görüntü Modu için Gri Tonlama girin. Ardından kanalları bölün.

Burada, bir IGG opsonize SRBC'yi yutan ham 264.7 makrofajlarda bir fagozom kapatma testinin temsili bir canlı hücre TIRF mikroskobu filmi gösterilmektedir. Psödopodların uçları SRBC'nin etrafındaki cam lamele karşıt olarak, TIRF alanında kapanana kadar kademeli olarak daralan bir F-aktin halkası tespit edilir. Paralel olarak, epifluroesans tarafından tespit edilen bulanık F-aktin sinyali, aşamayı TIRF alanının üç mikron üzerine kaydırdıktan sonra, fagositik kabın tabanındaki depolimerizasyona karşılık gelir.

Üç dakika sonra, SRBC, iletilen ışık görüntüleme ile onaylandığı gibi tamamen içselleştirilir. Bu yöntem kullanılarak, fagositik kabın tabanındaki aktinin hücre içi kompartmanlarda fokal ekzositoz meydana geldiği gösterilebilir. Ediniminden sonra, bir hücre bağıntılı elektron mikroskobu için daha fazla işlenebilir veya tüm hücre popülasyonu klasik immünofloresan mikroskobu için sabitlenebilir ve dondurulabilir.

Fagositozun sıcaklığa karşı çok hassas olduğunu ve bu nedenle ısıtma odası ve kültür kabı ortamı içindeki sıcaklığın prosedür boyunca sabit 37 santigrat derece sıcaklıkta tutulması gerektiğini akılda tutmak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, parçacıkları nasıl opsonize edeceğinizi, parçacıklarla örtü kaymalarını nasıl kaplayacağınızı, TIRF mikroskobu için kritik açıları nasıl belirleyeceğinizi ve canlı hücre fagositozu sırasında ilgilenilen proteinlerin lokalizasyonunu nasıl görüntüleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.