"Fagozomun Kapatma Deneyi" kullanma Üç Boyutta fagozomun Formasyonu Visualize'a Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu (TIRFM)

Bu protokolün genel amacı, Total Internal Reflection Florescence (Toplam İç Yansıma Floresansı) veya TIRF Mikroskopi kullanarak, canlı makrofajlarda fagozom oluşumunu ve fagozom bölünmesinin kesin konumunu 3 boyutlu olarak görselleştirmektir. Bu yöntem, psödopod uzaması ve uç füzyonu sırasında iki farklı floresan proteinin adım adım lokalizasyonunu izlemek için TIRF Mikroskopi ile epifloresansı birleştirir. Teknik, kritik açıyı belirlemek ve plazma membranına yakın bölgeler hakkında sonuçlar çıkarmak için hayati öneme sahip olan bir TIRF sinyali elde etmek için sistematik bir yöntem sunar.

TIRF mikroskobu oturumundan bir gün önce, mikroskop tablasının homojen bir şekilde ısınmasını sağlamak için ısıtma haznesini 37 °C'ye getirin. Ertesi sabah, 35 mm'lik cam tabanlı kap başına 7x10⁶ koyun eritrositlerini (SRBC) yıkamak için %0,1 BSA ile desteklenmiş 100 µL PBS kullanarak iki kez yıkama yapın. İkinci santrifüjden sonra, hücreleri 5 mL hücre başına %0,1 BSA ile desteklenmiş PBS içinde, sub-aglütinasyon konsantrasyonundaki tavşan IgG anti-SRBC'lerin 500 µL'sinde yeniden süspanse edin ve hücreleri düşük hızda rotasyonla 30 dakika boyunca inkübe edin.

İnkübasyon sonunda, SRBC'leri PBS artı BSA ile iki kez yıkayın ve hücreleri her kap için 2 mililitre 37 °C'ye ısıtılmış, serumsuz mikroskopi ortamında yeniden süspande edin. Ardından, 35 mm'lik cam tabanlı kapları 0,1% poly-L lysine ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca işlemden geçirin ve ardından 2 mililitre PBS ile iki kez yıkayın. SRBC'lerin kovalent olmayan fiksasyonu için, polylysine kaplı kapların her birine 2 mililitre IGG opsonize hücre dökün ve numuneleri sallanan rotorlu bir santrifüjde santrifüjleyin.

Süpernatanları atın ve partikülleri 2 mililitre PBS artı %10 BSA ile bir kez yıkayın. Ardından, partikülleri 2 mililitre taze PBS artı %10 BSA ile oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin ve ardından 2 mililitre PBS ile üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, PBS'yi 2 mililitre 37 °C'lik, serumsuz mikroskopi medyumu ile değiştirin.

SRBC kaplı bir tabağı mikroskop tablasına yerleştirin. Ardından, kültür tabağının tabanındaki ilgili transfekte hücreleri sıyırın ve tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için hücreleri birkaç kez pipetleyin. Transfekte hücreleri SRBC kaplı tabağa ekleyin.

Canlı görüntüleme yazılımını başlatın. Floresan işaretli proteinler eksprese eden bir hücre bulun ve ilgi duyulan hücrenin alanın merkezinde olması için tabağın konumunu ayarlayın. Tek bir eksitasyon dalga boyunda, sıfırdan %5'e kadar 0,01 derecelik artışlarla farklı açılardan 500 görüntü alın.

Gires ışığın cam-ortam arayüzünde tamamen yansıması ve bir evanescent dalga oluşturması için gereken kritik açıyı belirlemek üzere, görüntü dizisini uygun görüntüleme yazılımında açın. Hücre içinde homojen floresans gösteren bir ilgi alanı seçin. Ardından, Image sekmesi altında Stacks seçeneğini ve ardından Plot Z Axis Profile seçeneğini belirleyin.

İlgi bölgesinde ölçülen z ekseni profili ortalama floresan yoğunluğunu, x eksenindeki açıların bir fonksiyonu olarak grafiğe dökmek içindir. X eksenindeki, kritik açıdan daha büyük olan herhangi bir açı değeri, daha sonra mikroskopi oturumu sırasında bir TIRF sinyali elde etmek için kullanılabilir. Ardından, canlı görüntüleme yazılımında, görüntüleme parametrelerini ayarlamak için protokol düzenleyiciyi kullanın.

Döngü kazanım sekanslarının sayısı, floresan kanallar ve bunların lazer yoğunluğu, TIRF açısı ve pozlama süresi dahil olmak üzere ayarları yapın. Objektifin Z hareketini epifloresans modu düzlemine ulaşacak şekilde ayarlayın. Ardından, epifloresans modundayken TIRF açısını 1'e ve objektifin Z hareketini tekrar TIRF düzlemine ayarlayın.

Ardından, hücrenin parlak ışık LED modunda bir görüntüsünü elde edin. Şimdi, SRBC ile fagositoz yapan ve orta düzeyde floresan işaretli protein ekspresyonuna sahip, ilgilenilen bir hücre bulun ve bu hücreyi alanın ortasına taşıyın. Bu tür bir hücrenin, partikül etrafındaki genişlemiş plazma membranından tanımlanabileceğini unutmayın.

500 ile 1.000 kare arasında bir akışlı kazanım başlatmak için Döngü Sayısı (Loop Count) sekmesine kare sayısını girin. Gerektiğinde, hücredeki farklı floresan seviyelerine uyum sağlamak için lazer yoğunluğunu ve pozlama süresini değiştirin. İki kanala karşılık gelen iki ayrı görüntü dizisi oluşturmak için dizileri görüntüleme yazılımında açın ve Görüntü (Image) sekmesine tıklayın.

Hyperstacks menüsünden Stack to Hyperstack seçeneğini seçin. Ardından, açılan pencerede, Order kısmına xyctz, Channels kısmına kullanılan florokrom sayısını, z eksenindeki Slices kısmına dilim sayısını, Frames kısmına toplam görüntü sayısının kanal sayısına bölünmüş halini ve Display Mode kısmına Grayscale girin. Son olarak, kanalları ayırın.

Burada, IGG opsonize edilmiş SRBC yutan raw 264.7 makrofajlarında bir fagozom kapanma deneyinin temsilci bir canlı hücre TIRF mikroskopi videosu gösterilmektedir. SRBC etrafındaki, cam lamelle karşıt konumdaki pseudopod uçları boyunca, TIRF bölgesinde kapanana kadar kademeli olarak daralan bir F-aktin halkası tespit edilir. Paralel olarak, sahnenin TIRF bölgesinin üç mikron üzerine kaydırılmasının ardından epifloresans ile tespit edilen bulanık F-aktin sinyali, fagositik çukurun tabanındaki depolimerizasyona karşılık gelir.

Üç dakika sonra, transmisyon ışık görüntüleme ile doğrulandığı üzere, SRBC tamamen hücre içine alınmıştır. Bu yöntem kullanılarak, hücre içi kompartmanların fokal ekzositozunun gerçekleştiği fagozitik kabın tabanındaki aktin yapısı gösterilebilir. Alım işleminden sonra, bir hücre korelatif elektron mikroskopisi için ileri işleme tabi tutulabilir veya tüm hücre popülasyonu klasik immünofloresan mikroskopi için fikse edilip dondurularak işlenebilir.

Fagositozun sıcaklığa karşı çok hassas olduğu unutulmamalıdır; bu nedenle, prosedür boyunca ısıtma odasındaki ve kültür kabı ortamındaki sıcaklığın sabit 37 degrees Celsius seviyesinde tutulması gerekir. Bu videoyu izledikten sonra, partiküllerin nasıl opsonize edileceği, lamellerin partiküllerle nasıl kaplanacağı, TIRF mikroskopisi için kritik açıların nasıl belirleneceği ve canlı hücre fagositozu sırasında ilgilenilen proteinlerin lokalizasyonunun nasıl görüntüleneceği konusunda kapsamlı bir bilgi edinmiş olmalısınız.