Name: Fagozomun Kapatma Deneyi kullanma Üç Boyutta fagozomun Formasyonu Visualizea Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu (TIRFM) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Öğrenin, canlı makrofajlarda TIRFM kullanarak fagozom oluşumunu ve kapanışını üç boyutta görselleştirme yöntemini. Bu teknik, fagositoz sırasında hücre dinamiklerini yüksek çözünürlükle izlemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Deneysel yaklaşım üzerine ilk tartışmalar için Dr. Alexandre Benmerah'a (Institut Imagine Necker, Paris, Fransa) ve makaleyi okuduğu için Dr. Jamil Jubrail'e teşekkür ederiz. Nadège Kambou ve Susanna Borreill, laboratuvarımızda bu yöntemle deneyler yaptıkları için kabul edilmektedir. Bu çalışma, CNRS (ATIP Programı), Ville de Paris ve Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM INE20041102865, FRM DEQ20130326518 için doktora bursu dahil) FN ve Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales" (ANRS) tarafından JM için doktora bursu da dahil olmak üzere hibelerle desteklenmiştir.

Not: LifeAct mCherry kullanılan plazmid 17 sonra üretilen Dr. Guillaume Montagnac, Institut Curie, Paris, bir tür hediyedir. 1. Hücre ve transfeksiyonu Not: RAW264.7 makrofaj komple ortam içinde, alt konfluent (RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 ortamı, 10 mM HEPES, 1 mM sodyum piruvat, 50 uM β-mersaptoetanol, kadar büyütülür, 2 mM L-glutamin ve% 10 FCS ( 100 mm plaka fetal inek serumu)). Bunlar elektroporasyon ile floresan etiketli proteinleri kodlayan plazmid ile transfekte edilir. Rutin olarak, yaklaşık 5-6 Ekim 6 hücreleri, sırasıyla, her transfeksiyon ya da ko-transfeksiyon için plazmid, 20 ug veya 10 ug ile transfekte edilir, x. Elektroporasyon veya lipofeksiyon göre transfeksiyon için diğer araçlar alternatif yaklaşımlar olarak kullanılabilir unutmayın. <ol><li> Hücre kaldırıcı hücreleri kazıyın ve pipetleme ve birkaç kez aşağı kültür ortamında 10 ml bunları tekrar süspansiyon. </li><li> santrifüjHücre süspansiyonu 300 xg, sallanan açılı rotor oda sıcaklığında 5 dakika. </li><li> tam orta Onceden 10 mi, 37 ° C de gentamisin 10 ug / ml ile takviye edilmiştir. </li><li> Santrifüj sonrasında, süpernatant atılır ve elektroporasyon kitinden &quot;yıkama tamponu A&quot; 3 ml pelletini. </li><li> hücre süspansiyonu 300 xg, sallanan açılı rotor oda sıcaklığında 5 dakika santrifüj. </li><li> Bu süre içinde, oda sıcaklığında, DNA karışımı hazırlamak: 120 ul 2x tampon B, ilgilenilen proteinin, QSP 240 ul H2O kodlayan plazmit DNA 20 ug </li><li> santrifüj sonrasında, tüm süpernatant atın. </li><li> DNA karışımı hücre pelletini ve 4 mm elektroporasyon küvetler içine aktarın. </li><li> 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 250 V, 900 iF de electroporate. </li><li> Hemen gentamisin ile tamamlanmış olan önceden ısıtılmış (37 ° C) &#39;de hücreler komple ortam tekrar süspansiyon ve plaka100 mm tabak m. </li><li> Gece boyunca 37 ° C,% 5 CO2 de transfekte edilmiş hücrelerin inkübe edin. </li><li> Ertesi sabah, (fenol kırmızısı olmaksızın RPMI 1640, 10 mM HEPES, 1 mM sodyum piruvat, 50 uM β-mersaptoetanol, 2 mM L-glutamin) serumsuz mikroskopi ortamı 10 ml tam orta yerine. </li></ol> Kırmızı kan hücrelerinin 2. Opsonizasyon Not: makrofajlar parçacık hedef bir model olarak, koyun kırmızı kan hücreleri (SRBC&#39;ler) kullanılır. Genellikle, 35 mm cam alt tabak başına yaklaşık 7 x 10 6 SRBC&#39;ler kullanılır. <ol><li> 1x PBS (fosfat tamponlu tuzlu su) /0.1% BSA (sığır serum albümini) ve santrifüj (600 x g&#39;de, 4 dakika), 100 ul SRBClere yıkayın. </li><li> Santrifüj sonrasında, süpernatant atılır ve 1 x 100 ul PBS /% 0.1 BSA ve santrifüj (600 x g&#39;de, 4 dk) SRBClere tekrar süspansiyon. </li><li> santrifüj sonrasında, süpernatantı atmak ve tavşan IgG anti-SRBClere 1x PBS /% 0.1 BSA SRBClere tekrar süspansiyonkonsantrasyonun alt-aglütinasyon. SRBClere antikor / 5 ul ihtiva eden çözeltinin 500 ul kullanın. Not: antikorların alt aglütinasyon konsantrasyonu ağ oluşumu olduğu tespit aglütinasyon uyarmadı düşük konsantrasyona karşılık gelir. Genel olarak, alt aglütinasyon konsantrasyonu 8.2 ug / ml&#39;dir. <ol><li> Bir hemaglütinasyon testi ile SRBClere opsonize için gerekli IgG anti-SRBClere konsantrasyonunu belirlemek. Bir mikro-1 / 25,600 - seri olarak 1/50 ile (13.1 mg / ml stok) IgG SRBC&#39;ler seyreltin. Her kuyuda 2 x 10 6 SRBClere ekleyin. Birkaç saat oda sıcaklığında karanlıkta plaka inkübe edin. </li></ol></li><li> yavaş dönüşü 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 1x PBS içinde iki yıkama / yukarıda tarif edildiği gibi% 0.1 BSA sonra önceden ısıtılmış serum barındırmayan ortam içinde mikroskopi IgG opsonize SRBClere (IgG SRBC&#39;ler) (2 mi / çanak) yeniden süspanse edin. </li></ol> Lameller 3. Poli-lizin Kaplama <ol><li> Bu aradaOda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 0.01 poli-L-lizin, 2 ml 35 mm cam alt yemekler tedavi. </li><li> 1x 2 ml PBS yemeklerin iki kez yıkayın. </li></ol> Cam alt yemekleri üzerine SRBClere 4. Kovalent olmayan Fixation <ol><li> 35 mm cam alt çanak başına SRBC&#39;ler süspansiyon 2 ml dökün. </li><li> 35 mm cam alt yemekleri üzerine 2 dakika boyunca 500 xg&#39;de bir sallanan rotor santrifüj. </li><li> Süpernatantı ve 1 x PBS /% 10 BSA, 2 ml ile bir kez yıkanır. </li><li> tabak başına 1 x PBS /% 10 BSA, 2 ml 30 dakika boyunca parçacıkları inkübe edin. </li><li> 1x 2 ml PBS yemeklerin üç kez yıkayın. </li><li> Önceden ısıtılmış (37 ° C), serumsuz mikroskopi orta 2 ml 1 x PBS değiştirin. </li></ol> 5. Fagositoz TIRFM tarafından görüntülendi <ol><li> Mikroskop Not: TIRFM bir yağ batırma objektifi (K 100 X, NA1.49), CO2 ile bir ısıtma odası ile donatılmış bir mikroskop kullanılarak gerçekleştirilmiştir ve iki şarkıBir 1.5x lens ile birleştiğinde le foton algılama kameraları EMCCD (Elektron Çarpma Charge Coupled Device). <ol><li> TIRF mikroskop oturumu önceki gün, mikroskop sahne homojen bir ısıtma sağlamak için 37 ° C&#39;de ısıtma odasına açın. </li></ol></li><li> Kritik Açı tayini Not: ImageJ Renk Profiler yazılım TIRF görüntü akışlarını işlemek için kullanılır. <ol><li> mikroskop altında serum içermeyen mikroskobu ortamıyla opsonize SRBC içeren bir 35 mm cam alt çanak yerleştirin. </li><li> Hücreleri Pençe ve eklemeden önce orta onları tekrar süspansiyon - çanak (100 500 ul). </li><li> mikroskop kontrol etmek ve 491 nm ve / veya floresan etiketli proteinleri ifade eden hücreleri belirlemek için bir 561 nm lazer ile uyarma yapmak için &quot;canlı Toplama&quot; yazılımı kullanın. </li><li> floresan etiketli proteinleri ifade eden bir hücreyi tespit. </li><li> alanın ortasına yerleştirin ve 500 im kazanmakFarklı açılarda bir uyarma dalga boyunda yaşları 0.01º (Şekil 2A) bir artış ile, 5º&#39;lik kadar 0º itibaren. açıları otomatik mikroskop sistemi tarafından değiştirilir. </li><li> olay ışık tamamen cam / orta arayüzü yansıyan sağlayan kritik açısını belirlemek ve kaybolan dalga üretir. ImageJ Renk Profiler yazılımı kullanarak, &quot;Dosya&quot; tıklayarak &quot;Aç&quot; görüntü sırası açın ve dosyayı seçin. </li><li> Düzgün bir floresan (Şekil 2B sarı 1) ile hücrede, dikdörtgen aracı ile, faiz (ROI) bir bölge seçin. </li><li> &quot;Z ekseni profili&quot; arsa (menü ve &quot;Plot Z ekseni Profili&quot; açılır &quot;Resim&quot; sekmesinde &quot;Stacks&quot; Şekil 2B tıklayarak x ekseni üzerindeki açıların fonksiyonu ile ROI ölçülen floresan yoğunluğu ortalama kırmızı 2). Not: Kritik açı ma giden açısıdırfloresan keskin bir düşüşe önce ximum floresan. </li><li> Örnek 2.00 (Şekil 2C) gibi bir TIRF sinyali elde etmek mikroskopi oturumu sırasında kritik açıya üstün x ekseni üzerindeki açısının herhangi bir değer kullanın. </li></ol></li><li> Devralmalar <ol><li> Canlı Toplama yazılımı kullanarak, modül &quot;Protokol Editor&quot; (Şekil 3A) ile iktisap parametrelerini ayarlamak. <ol><li> TIRF bölgedeki ilgi proteinlerin floresan sinyal elde etmek &quot;Çok Kanallar&quot; edinimi oluşan bir &quot;döngü&quot; ile bir protokol oluşturun. (Örneğin 2.00) TIRF açısı, (Örnek 50 ms için) kalma süresi ve (örneğin,% 50) lazer yoğunluğu (Şekil 3B 1) girin. </li><li> &quot;Çok Kanallar&quot; aracı ile Epifloresans sinyal edinimi elde etmek için TIRF bölgenin üstüne hedefi 3 mikron &quot;Z hareket&quot; tanıtmak. t altında bir açı girinO kritik açı (örneğin 1.00 gibi), fuar süresi (50 msn) ve lazer yoğunluğu (% 50) (Şekil 3B, 2 ve 3). </li><li> Sonraki TIRF bölge (Şekil 3B 4) dönmek için, aşağıda amaç 3 mikron &quot;z hareket&quot; ekleyin. (Işık Yayan Diyot) (Şekil 3B 5) LED parlak ışıkta hücrenin bir &quot;anlık&quot; ekleyin. </li></ol></li><li> parçacık etrafında plazma zarı uzatarak SRBC fagositoz başlatır floresan takılı protein ifadesi orta seviyede ilgi bir hücreyi bulun. </li><li> alanın ortasına yerleştirin. </li><li> 1000 kare - 500 edinilmesini akışı başlar. &quot;Döngü sayısı&quot; sekmesinde, &quot;750 kare&quot; (Şekil 3B 1) girin. Not: ImageJ Renk Profiler yazılım TIRF görüntü akışlarını işlemek için kullanılır. </li><li> tıklayarak Resim J yazılımında dizi görüntüleri açın&quot;Aç&quot; &quot;Dosya&quot; ve dosyayı seçerek. </li><li> sekme &quot;Image&quot; butonuna tıklayarak kanalları ayırmak, &quot;Hyperstacks&quot; menüsü ve &quot;Yığın hyperstack&quot; fonksiyonu açılır. çıktı penceresini tamamlayın: Sipariş: xyctz; Kanal (C): kanal sayısı (örn: &quot;2&quot;, iki fluorochromes varsa); Dilimler (z): z ekseninde dilim sayısı (örn: &quot;1&quot; z ekseninde hiçbir hareket yoksa); Çerçeveler (t): kanal sayısı başına bölünmüş görüntü sayısı; Ekran modu: Gri Tonlama. Not: İki ayrı görüntü dizileri iki farklı kanallar karşılık, oluşturulur. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of phagocytosis.</a> Ann Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).</li>
<li>Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+cups+into+phagosomes+and+macropinosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Shaping cups into phagosomes and macropinosomes.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).</li>
<li>Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+and+comparative+innate+immunity%3A+learning+on+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis and comparative innate immunity: learning on the fly.</a> Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).</li>
<li>Niedergang, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNiedergang%2C+F+%22Encyclopedia+of+Cell+Biology%22">Encyclopedia of Cell Biology</a>. Bradshaw, R. A., Stahl, P. D. 2, Academic Press. Waltham, MA. 751-757 (2016).</li>
<li>Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell+clearance%3A+basic+biology+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential.</a> Nat Rev Immunol. 14, 166-180 (2014).</li>
<li>Aderem, A., Underhill, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+phagocytosis+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of phagocytosis in macrophages.</a> Annu. Rev. Immunol. 17, 593-623 (1999).</li>
<li>Underhill, D. M., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Information+processing+during+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Information processing during phagocytosis.</a> Nat Rev Immunol. 12, 492-502 (2012).</li>
<li>Underhill, D. M., Ozinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+of+microbes%3A+complexity+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis of microbes: complexity in action.</a> Annu Rev Immunol. 20, 825-852 (2002).</li>
<li>Canton, J., Neculai, D., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scavenger+receptors+in+homeostasis+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Scavenger receptors in homeostasis and immunity.</a> Nat Rev Immunol. 13, 621-634 (2013).</li>
<li>Freeman, S. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+receptors%2C+signal+integration%2C+and+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton.</a> Immunol Rev. 262, 193-215 (2014).</li>
<li>Scott, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol-4%2C5-bisphosphate+hydrolysis+directs+actin+remodeling+during+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis.</a> J Cell Biol. 169, 139-149 (2005).</li>
<li>Schlam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositide+3-kinase+enables+phagocytosis+of+large+particles+by+terminating+actin+assembly+through+Rac%2FCdc42+GTPase-activating+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositide 3-kinase enables phagocytosis of large particles by terminating actin assembly through Rac/Cdc42 GTPase-activating proteins.</a> Nat Commun. 6, 8623(2015).</li>
<li>Marion, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NF-kappaB+Signaling+Protein+Bcl10+Regulates+Actin+Dynamics+by+Controlling+AP1+and+OCRL-Bearing+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The NF-kappaB Signaling Protein Bcl10 Regulates Actin Dynamics by Controlling AP1 and OCRL-Bearing Vesicles.</a> Dev Cell. 23, 954-967 (2012).</li>
<li>Loovers, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+phagocytosis+in+Dictyostelium+by+the+inositol+5-phosphatase+OCRL+homolog+Dd5P4%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Regulation of phagocytosis in Dictyostelium by the inositol 5-phosphatase OCRL homolog Dd5P4.</a> Traffic. 8, 618-628 (2007).</li>
<li>Deschamps, C., Echard, A., Niedergang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+and+cytokinesis%3A+do+cells+use+common+tools+to+cut+and+to+eat%3F+Highlights+on+common+themes+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis and cytokinesis: do cells use common tools to cut and to eat? Highlights on common themes and differences.</a> Traffic. 14, 355-364 (2013).</li>
<li>Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+12%2C+Unit+12.29%3A+Total+internal+reflection+fluorescence+%28TIRF%29+microscopy+illuminator+for+improved+imaging+of+cell+surface+events%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cytom%22%5BJournal%5D)">Chapter 12, Unit 12.29: Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events.</a> Curr Protoc Cytom. , (2012).</li>
<li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact%3A+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5, 605-607 (2008).</li>
<li>Marie-Anais, F., Mazzolini, J., Herit, F., Niedergang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin-actin+cross-talk+contributes+to+phagosome+formation+and+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Dynamin-actin cross-talk contributes to phagosome formation and closure.</a> Traffic. 17 (5), 487-499 (2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada açıklanan deneysel protokol, gerçek zamanlı olarak ve canlı hücrelerde, yüksek çözünürlüklü, bir fagozom oluşumunu ve özellikle kapanmasını takip etmek için benzeri görülmemiş bir yöntem önermektedir. Birkaç teknik hususun tartışılması gerekir. İlk olarak, tahlil sıcaklığa karşı çok hassastır. Fagositozun etkinliğini bozabilecek sıcaklık değişimlerini önlemek için ısıtma odasının 37 °C'de olduğunu ve tüm ortamların, cihazların veya hücrelerin oda içinde tutulduğunu kontrol etmek çok önemlidir. Fagozom oluşumunu ön...

Fagositoz tanıma ve yutulur malzemenin içselleştirme ve bozulmasına yol açar, reseptörleri yüzey malzemesinin bağlanmasını başlar başlıca bir hücre fonksiyonudur. Böyle kalıp Dictyostelium discoideum ve amip gibi tek hücreli ökaryotlar bakteriler üzerinde beslemek için fagositoz kullanırken, yüksek organizmalar profesyonel hücreleri ile gelişmiştir. Makrofajlar ya da dendritik hücreler, çeşitli doku ve organlarda patojenlere karşı ilk savunma hattıdır ve antijen sunumu ve sitokin üretimi 1-4 ile adaptif bağışıklık sistemini aktive etmek için çok önemlidir. Belirli koşullar altında, fagositoz profesyonel olmayan fagositik hücreler, örneğin, endotel ve epitel hücreleri tarafından gerçekleştirilebilir. Bu işlem gelişimi sırasında ve normal doku devirinde ve yeniden modelleme için erişkin homeostazın muhafaza etmek önemlidir. Böyle testiste veya retina Sertoli hücreleri Son olarak, özel fagositlerpigment epitel hücreleri son derece güçlü fagositler 5 vardır. Bir fagozomun oluşumu burada mikroorganizmalar veya hücresel döküntü bozunması fagositik hücrenin yüzeyi üzerinde fagositik reseptörlerinin kümelenme ile başlar oluşur. sistemlerinde, Fc alıcıları (FcR) ya da tamamlayıcı reseptör (CR) ve opsonik reseptörlerin kümeleme, aşağıdaki akıntı yönündeki sinyal olaylarını de karakterize edilmiştir. Ancak, Toll benzeri reseptörler (TLR), lektinler, mannoz reseptörleri ve çöpçü reseptörleri de dahil olmak üzere pek çok sivil opsonik reseptörleri de vardır. Bu reseptörler, mannoz veya fukoz kalıntılarının, fosfatidilserin ve lipopolisakkaritler 1,6-9 parçacık yüzeyi üzerinde determinantlar tanır. Patojen veya hücre enkaz tanıma ve daha sonra yoğun ve geçici aktin yeniden yol fagositik reseptör çeşitli türleri, kümeleme bağlayıcı içerir. hücre içi compartmen paralel fokal ekzositozdats membran geriliminin serbest bırakılmasından katkıda bulunur ve büyük partiküllerin etkin fagositoz önemlidir. aktin polimerizasyonu ve membran deformasyon yol açan sinyal olayları tek bir fagositik reseptör tetikleyen deneysel modellerde disseke edildi. FcR aracılı fagositoz sırasında küçük GTPases (rac, Cdc42) tarafından düzenlenir yoğun bir aktin polimerizasyon bulunmaktadır. Bunların efektörlere arasında, Wiskott-Aldrich sendromu proteini (WASP) aktin filamanlarını 1,2,4,10 çekirdeklerin Aktin-ilişkili protein kompleksi 2/3 (ARP2 / 3) aktivasyonuna yol açar. Fosfatidilinositol-4, 5-bifosfat (PI (4,5) P2) Yerel üretim pseudopod oluşumunu sürücüler ilk aktin polimerizasyonu için çok önemlidir. PI (3,4,5) P3 olan dönüşüm pseudopod uzatma ve fagosom kapak 11 için gereklidir. Çeşitli yollar PI (4,5) P 2 kayboluşu katkıda bulunur. fosfatidilinositol fosfat kina öncelikle dekolmanıfagosom tutukladı PI (4,5) P2 sentezi gelen ses (PIPKIs). İkinci olarak, fosforile edilebilir ve ben kinazlar (PI3K) PI3K sınıf tarafından tüketilen ve PI (3,4,5) P3 12 dönüştürülür. Fosfatazlar ve fosfolipaz için bir rolü, memeli hücrelerinde ve Dictyostelium 13,14 fagositoz sırasında PI (4,5) P2, hidroliz ve F-aktin çıkarılması ima edilmiştir. Fosfolipaz C (PLC) δ diasilgliserol ve inositol-1,4,5- tris fosfat PI (4,5), p, 2 hidrolize olur. PI (4,5) P2 ve PI (3,4,5) P3 fosfataz OCRL (Lowe oculocerebrorenal sendromu), aynı zamanda fagosom oluşumunda rol oynadığı gösterilmiştir. F-aktin ve depolimerizasyon hassas yerel oluşumu sıkıca uzayda ve zamanda düzenlenir ve biz hücre içi bölmelerin o işe göstermiştir böylece fagositik fincan dibinde yerel aktin depolymerization katkıda yerel OCRL fosfataz teslim etmek önemlidir <sup&gt; 13,15. Bunun için, biz burada açıklanan deney seti kadar kullanılır. fagosom kapatılması ve membran açılmasıyla meydana için gerekli mekanizma ve moleküler oyuncular kötü çünkü görselleştirme ve fagosom kapatılması siteyi takip zorluklar tanımlı kalır. Yakın zamana kadar, fagositoz zor fagosom kapatma sitenin zamanında görselleştirme yaparak, onların sırt yüzünde ya da iki tarafta parçacıkları içselleştirmek sabit veya canlı hücreler gözlendi. Buna ek olarak, sabitleme yöntemleri membranların ve önyargı yalancı ayak uzatma ve kapatma sonuçları geri çekilmesini neden olabilir. Buna karşılık, biz kurmak ve burada açıklamak var tahlil bize pseudopod uzantısı ve toplam iç yansıma mikroskobu (TIRFM) 16 dayalı canlı hücrelerde 13 fagositoz kapatılması adımını, görüntülemenizi sağlar. Bu optik bir teknik şeffaf arasındaki ara yüzeyde ince bir bölgede florofor uyandırmak üzere bir çabuk kaybolan dalga harcayacaktırkapak (lamel) ve bir sıvı (hücre kültür ortamı). uyarım derinliği kalınlığı plazma zarına yakın bir moleküler olayların canlandırılmasına olanak tanıyan bir katı yüzey yaklaşık 100 nm&#39;dir. TIRFM yüksek sinyal-zemin oranı sağlar ve bağlı hücrelerin aydınlatma toplanan out-of-focus floresan ve sitotoksisite sınırlar. TIRFM yararlanan biz lamelleri IgG opsonize kırmızı kan hücrelerinin (IgG SRBC&#39;ler) ile kaplanmış sonra poli-lizin ile aktive edildiği &quot;fagosom kapatma tahlil&quot; geliştirdi. ilgi geçici floresan etiketli proteinler ifade makrofajlar daha sonra IgG SRBClere yutmak için izin verilir. Hücreler kovalent olmayan cam yüzeyine bağlanmış olan hedef partikülleri ayırmak birlikte, psödopod uçları görülen ve TIRF modunda kaydedilebilir. TIRF satın almalar vis sağlayan, yukarıdaki aşama 3 mikron değişen sonra, Epifloresans modunda satın almalar ile birleştirilirfagositik fincan baz ualization. Bu işlem sırasında, aktin ya da Dynamin inhibe gibi farmakolojik ilaçların ilavesi, moleküler seviyede işlemini incelemek için de mümkündür. Burada detaylı bir şekilde tarif protokol RAW264.7 mürin makrofaj hücre çizgisinde ve opsonize edilmiş parçacıklar için olduğu ancak, herhangi bir diğer fagositik bir hücre ve boncuk gibi başka hedeflere sahip uyarlanabilir. Bu yöntem zaman ve çeşitli fagositik sürecinde pseudopod uzantısı ve fagosom kapatılması rol oynayan moleküler oyuncuların uzayda düzenlemenin daha iyi karakterizasyonu sağlayacaktır.

<table><tbody><tr><td>Koyun önleyici kırmızı kan hücreleri IgG</td><td>MP Biyomedikaller</td><td>55806</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin ısı şoku fraksiyonu, pH 7, & ge; %98 ve nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kaldırıcı</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Küvetler 4 mm</td><td>Hücre projesi</td><td>EP104</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yok</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>14190-094</td><td>Oda sıcaklığında</td></tr><tr><td>Elektrotampon kiti</td><td>Hücre projesi</td><td>EB110</td><td></td></tr><tr><td>100 mm TC ile İşlem Görmüş Hücre Kültürü Kabı</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Gen X hücreli pulser</td><td>Biorad</td><td>165-2661</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>Cam Alt Tabaklar 35 mm kaplamasız 1.5</td><td>MatTek şirketi</td><td>P35G-1.5-14-C Kasa</td><td></td></tr><tr><td>iMIC</td><td>TILL Fotonik</td><td></td><td>Yağa daldırma objektifi (N 100X, NA1.49), CO2 ile ısıtma odası, kamera tek foton algılama EMCCD (Elektron Çarpma Şarj Bağlantılı Cihaz) ve 1.5X lens</td></tr><tr><td>Poli-L-Lizin Çözeltisi% 0.1</td> <td>Sigma</td><td>P8920-100ml</td><td>Suda% 0.01'de Seyreltme&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI 1640 orta boy GLUTAMAX&nbsp; Takviye</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 orta, fenol kırmızısı yok (10 x 500 ml)</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>11835-105</td><td>37 °C sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>Koyun kırmızı kan hücreleri (SRBC'ler)</td> <td>Eurobio</td><td>DSGMTN00-0Q</td><td>4 ° C'de Alsever tamponunda korunur; Kullanmadan önce C</td></tr></tbody></table>

&quot;fagozomun kapatma deneyi&quot; kullanma Üç boyutta fagozomun formasyonu visualize&#39;a toplam İç yansıma floresan mikroskobu (tirfm)

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy (TIRFM)

Fagositoz, özelleşmiş hücreler tarafından mikroorganizmaları veya hücresel kalıntıları içselleştirmek ve ortadan kaldırmak için kullanılan bir mekanizmadır. Parçacık etrafındaki plazma zarı uzantısı için itici güç olan aktin hücre iskeletinin derin yeniden düzenlemelerine dayanır. Ek olarak, büyük materyalin verimli bir şekilde yutulması, hücre içi bölmelerin fokal ekzositozuna dayanır. Bu süreç oldukça dinamiktir ve fagositik kap oluşumu sırasında çok sayıda moleküler oyuncunun rol oynadığı tanımlanmıştır. Bununla birlikte, tüm bu moleküllerin zaman ve uzaydaki kesin düzenlemesi belirsizliğini korumaktadır. Ek olarak, fagozom kapanmasının son adımını gözlemlemek çok zor olmuştur, çünkü RNA interferansı veya baskın negatif mutantlar tarafından inhibisyon genellikle fagositik kap oluşumunun durmasına neden olur. 
Epifloresan ile birlikte toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) kullanarak, bir lamel ile gevşek bir şekilde bağlanmış bir parçacığın etrafında büyüyen bir fagozomdaki psödopodların ve uçlarının uzantısını adım adım izlemek için özel bir deneysel yaklaşım oluşturduk. Bu yöntem, aynı anda iki farklı floresan etiketli protein için canlı hücrelerde fagozomun kapanması sırasında psödopodların uçlarını ve füzyonlarını yüksek çözünürlükte gözlemlememizi sağlar.

Bu yazıda tarif edilen deneysel sistem şematik olarak Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Bir floresan etiketi kaynaşık yararlı proteinleri eksprese eden transfekte RAW264.7 makrofaj kovalent olmayan bir şekilde tespit edildi IgG opsonize koyun kırmızı kan hücreleri (SRBC&#39;ler) ile temas içine yerleştirilmektedir lamel. makrofajlar onu yutmak için lamel SRBC ayırabilirsiniz. kullanılan TIRF mikroskop 3 mikron yukarıda Z vardiyadan sonra Epifloresans modunda psödopod ve si...

Toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanarak, canlı makrofajlarda eşi benzeri görülmemiş yüksek çözünürlüklü fagozom oluşumunu ve kapanışını üç boyutta görselleştirmek için bir deney düzeneği tanımlıyoruz. Fagositik kabın tabanının, uzayan psödopodların ve ayrıca fagozom kesilmesinin kesin yerinin izlenmesine izin verir.

&quot;Fagozomun Kapatma Deneyi&quot; kullanma Üç Boyutta fagozomun Formasyonu Visualize&#39;a Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements ...

Bu protokolün genel amacı, Total Internal Reflection Florescence (Toplam İç Yansıma Floresansı) veya TIRF Mikroskopi kullanarak, canlı makrofajlarda fagozom oluşumunu ve fagozom bölünmesinin kesin konumunu 3 boyutlu olarak görselleştirmektir. Bu yöntem, psödopod uzaması ve uç füzyonu sırasında iki farklı floresan proteinin adım adım lokalizasyonunu izlemek için TIRF Mikroskopi ile epifloresansı birleştirir. Teknik, kritik açıyı belirlemek ve plazma membranına yakın bölgeler hakkında sonuçlar çıkarmak için hayati öneme sahip olan bir TIRF sinyali elde etmek için sistematik bir yöntem sunar.TIRF mikroskobu oturumundan bir gün önce, mikroskop tablasının homojen bir şekilde ısınmasını sağlamak için ısıtma haznesini 37 °C'ye getirin. Ertesi sabah, 35 mm'lik cam tabanlı kap başına 7x10⁶ koyun eritrositlerini (SRBC) yıkamak için %0,1 BSA ile desteklenmiş 100 µL PBS kullanarak iki kez yıkama yapın. İkinci santrifüjden sonra, hücreleri 5 mL hücre başına %0,1 BSA ile desteklenmiş PBS içinde, sub-aglütinasyon konsantrasyonundaki tavşan IgG anti-SRBC'lerin 500 µL'sinde yeniden süspanse edin ve hücreleri düşük hızda rotasyonla 30 dakika boyunca inkübe edin.İnkübasyon sonunda, SRBC'leri PBS artı

phagosome-closure-assay-to-visualize-phagosome-formation-three

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, aktin ve mikrotübül polimerizasyon dinamiklerini görselleştirmek için toplam iç yansıma mikroskobu tabanlı bir teknik olan TIRF açıklanmaktadır. Yöntem, hücresel karışmaları anlamak için gerekli olan aktin ve mikrotübül eşleşme dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak yüksek çözünürlüklü görüntülenmesine izin verir.

Aktin ve Mikrotübül Eşleşme Dinamiğini Görselleştirmek için TIRF Mikroskobu

Bu video, bir cam tabanlı çanağın yüzeyine tutturulmuş IgG-opsonize kırmızı kan hücrelerinin (RBC'ler) makrofaj aracılı fagositozu sırasında fagozom oluşumunun ve kapanmasının gerçek zamanlı görselleştirilmesi için yüksek çözünürlüklü bir toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu tekniğini göstermektedir. Makrofajlar, RBC'lerin etrafına psödopodia uzatır ve onları fagozomların içine sokar ve onları cam yüzeyden ayırır.

Fagozom Oluşumu ve Kapanışının TIRF Mikroskobu Tabanlı Görselleştirilmesi

Kaynak: Daniele, F., et. al SH-SY5Y Nöroblastom Hücrelerinde Nörotransmitter Vezikül Dinamiklerini Değerlendirmek için TIRFM ve pH'a duyarlı GFP probları: Hücre Görüntüleme ve Veri Analizi. J. Vis. Uzm. (2015). Bu video, florofor etiketli sinaptik vezikülleri görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu kullanılarak insan nöroblastom hücrelerinin görüntülenmesini göstermektedir. Hücreler ilk olarak epifloresan modunda odaklanır. Daha sonra, zarın yakınındaki floroforları...

Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu Kullanılarak Hücre Görüntüleme

Kaynak: Winkle, C. C., et al. Akson dallanması ve nöronal morfogenez sırasında plazma zarı iletiminin rolünü tanımlamak için birleşik metodolojilerin kullanılması. J. Vis. Uzm. (2016)Bu video, kortikal nöronlardaki ekzositik olayları görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobunu göstermektedir. pH'a duyarlı bir yeşil floresan protein (GFP) markörü, vezikül füzyonu üzerine floresan yapar ve zaman atlamalı görüntülemede membran-proksimal ekzositozu yakalayan seçici TIRF...

Ekzositik olayların görselleştirilmesi için toplam iç yansıma floresan mikroskobu 

Polarizasyon tabanlı Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu (pTIRFM) hücre zarı dinamiklerinin gerçek zamanlı algılama sağlar. Bu makalede, düzenlenmiş Ekzositoz sırasında zar yeniden çalışma için pTIRFM uygulanmasını tarif etmektedir. Teknik doğrudan veya dolaylı membran şekil değişiklikleri içeren hücre biyolojisi diğer işlemler için genellenebilir.

PTIRFM ile görüntüleme Plazma Membran deformasyonlar

Klatrin aracılı endositoz, hızlı ve oldukça dinamik bir süreç, sinyal reseptörleri de dahil olmak üzere birçok proteini içselleştirir. Burada açıklanan protokol, bireysel endositik olayların kinetiğini doğrudan görselleştirir. Bu, endositik makinenin çekirdek üyelerinin birbirleriyle nasıl koordine olduğunu ve protein yükünün bu süreci nasıl etkilediğini anlamak için gereklidir.

TIRF Mikroskopi ile Tek olay ebatları da G protein-bağlanmış alıcılar üzerinden Klatrin dolayımlı endositoz görselleştirme

Bu makale, bir sinaptobrevin2-pHluorin yapısı ve Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu kullanarak nöroblastom hücrelerinde nörotransmitter vezikül dinamiklerini araştırmak için bir yöntem sağlar. Görüntü işleme ve veri analizi için geliştirilen strateji de raporlanmaktadır.

TIRFM ve pH-duyarlı GFP-sondalar SH-SY5Y Nöroblastom Hücrelerinde nörotransmitter Vesikül Dynamics değerlendirin: Hücre Görüntüleme ve Veri Analizi

Burada dönen disk confocal mikroskobu görüntüsü tek fagositik olayları için fare ikamet periton makrofajlar tarafından kullanma yöntemleri açıklanmaktadır. İletişim kuralları diğer fagositik hücreler için genişletilebilir.

Fagositoz fare makrofajlar tarafından hızlandırılmış 3D görüntüleme

Hızlı ve yüksek çözünürlüklü izin gelişmiş bir mikroskop düşsel hem, izole plazma zarı ve çevredeki hücre içi hacim sunulacak. Yüksek edinme hesaplı en fazla 3,5 canlı görüntüleme deneyler bir kurulum disk ve toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik entegrasyon sağlar görüntü yığını başına s.

Hücreleri tarafından seçilmiş adezyon oluşumunda görselleştirme gelişmiş Disk-toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik

Dinamik mikrotübüllerin ve floresan olarak etiketlenmiş mikrotübülle ilişkili proteinlerin eşzamanlı görüntülenmesi için girişim-yansıma mikroskobu ve toplam-iç-yansıma-floresan mikroskobu uygulamak için bir protokol sunuyoruz.

Dinamik Mikrotübülleri ve İlişkili Proteinleri Görüntülemek için Eşzamanlı Girişim Yansıması ve Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu

Öğrenin, canlı makrofajlarda TIRFM kullanarak fagozom oluşumunu ve kapanışını üç boyutta görselleştirme yöntemini. Bu teknik, fagositoz sırasında hücre dinamiklerini yüksek çözünürlükle izlemeyi sağlar.

"Fagozomun Kapatma Deneyi" kullanma Üç Boyutta fagozomun Formasyonu Visualize'a Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu (TIRFM)

Daha fazla video keşfet