Mutlak ve Bağıl Kantitatif PCR Veri birleştirme STAT3 Splice Varyant Dökümünü belirlememize
October 9th, 2016
Tandem birleştirme olayları, birbirinden 12 nükleotidden daha az uzaklıkta meydana gelir. Bu tür ek varyantlarının oranlarının niceliksel olarak belirlenmesi, mutlak bir kantitatif PCR yaklaşımı kullanılarak mümkündür. Bu el yazması, iki birleştirme olayının Serine-701 dahil etme/dışlama ve α/β C-uçları ile sonuçlandığı STAT3 geninin ek varyantlarının nasıl ölçülebileceğini açıklamaktadır.
Bu protokolün genel amacı, eozinofillerdeki STAT3 ek varyantı transkriptlerinin oranlarını ve mutlak seviyelerini ölçmektir. Bu yöntem, distal uçbirleştirme olaylarının birlikteliği ve tandem uçbirleştirme oranlarının farklılaşmasına neden olabilecek koşulların tanımlanması gibi ekleme düzenleme alanındaki temel soruları ele alabilir. Bu tekniğin ana avantajı, mutlak ve bağıl qPCR verilerinin elde edilmesini sağlayan plazmid standartlarıdır, böylece dört STAT3 transkriptinin oranlarını ve genel seviyelerini belirleyebiliriz.
Bizim durumumuzda, dört STAT3 varyantı olan S alfa, S beta, delta S alfa ve delta S beta'nın, eozinofiller sitokinler tarafından uyarıldığında nasıl değiştiğini öğrenmek istiyoruz. Bu yöntem eozinofil STAT3 bileşimi hakkında bilgi sağlayabilse de, cDNA'nın elde edilebileceği diğer hücre tiplerine de uygulanabilir. S ve delta S sadece üç nükleotidde farklılık gösterdiğinden, her varyant için her iki standart standartta da özgüllük elde etmek için verimlilikten ödün vermek zorunda kaldık.
Bu protokolde, insan eozinofillerinden hazırlanan cDNA, STAT3 ek varyantlarını amplifiye etmek için şablon olarak kullanılır. Metin protokolünde açıklandığı gibi plazmitleri oluşturduktan sonra, birkaç koloniden plazmitleri dizilemek için dizileme reaksiyonları hazırlayın. Her 20 mikrolitrelik reaksiyon, üç mikrolitre dizileme reaksiyonu tamponu, iki mikrolitre dizileme reaksiyonu karışımı, 12 mikrolitre ultra saf su, bir mikrolitre plazmid ve iki mikrolitre dizileme astarı içermelidir.
Sıralama sonuçları mevcut olduğunda, her bir varyantı kodlayan plazmitlerin elektroforetogramlarını değerlendirin; S alfa, S beta, delta S alfa ve delta S beta. Saf plazmit DNA konsantrasyonunu mikrolitre başına nanogram cinsinden ölçün ve mikrolitre başına kopya sayısını hesaplayın. Bu prosedüre, ultra saf su kullanarak STAT3 plazmitlerinin 10'da bir seyreltme serisini hazırlayarak başlayın.
Mikrolitre başına yaklaşık 10 ila sekizinci ila 10 ila üçüncü kopya ile. En konsantre numunenin konsantrasyonunu ölçün. Her bir varyant için mikrolitre başına 10 ila altıncı kopyada her bir ekleme varyantı için negatif kontroller olarak dört hedef olmayan karışım hazırlamak için seyreltilmiş plazmitleri kullanın.
Her biri mikrolitre başına 10 ila altıncı kopya olan dört şablonun tümünün eşit konsantrasyonlarına sahip bir hedef karışım hazırlayın. Numunede 560 nanomolar nihai konsantrasyon için, her biri yedi mikromolar konsantrasyonda 60 mikrolitre primer içeren her bir ekleme varyantı için astar çifti çözeltileri hazırlayın. DNA polimerazı, çift sarmallı DNA bağlayıcı boya karışımını, yedi ila beşi saf su ile seyreltin.
Bu şablonu izleyerek testi 96 oyuklu bir PCR plakasında ayarlayın. İlk önce her bir oyuğa 21 mikrolitre seyreltilmiş DNA polimeraz, çift sarmallı DNA bağlayıcı boya karışımı ekleyin. Ardından iki mikrolitre astar karışımı ve iki mikrolitre şablon ekleyin.
Şablonsuz her kontrol kuyusuna şablon yerine iki mikrolitre filtrelenmiş su ekleyin. Tekrarlanabilirliği değerlendirmek için reaksiyonları çift olarak ayarlayın. qPCR plakasını yapışkan bir kapakla kapatın ve 12 santigrat derecede 1.200 g'da beş dakika santrifüjleyin.
qPCR makinesini açın ve kapalı qPCR plakasını yerleştirin. ABI gerçek zamanlı PCR sistemini kullanıyorsanız, deneyi gösterildiği gibi ayarlayın. Dosya, Yeni, İleri'ye tıklayın, yeni Algılayıcı'yı seçin, ardından bir ad girin ve bir Raporlayıcı ve bir Söndürücü seçin.
Her ekleme varyantı için yeni bir dedektör kurun. İleri'yi seçin ve Numune Plakasını Ayarla sayfasında istendiği gibi standartları ayarlayın, miktarların tabloya girildiğinden ve uygun dedektörlerin seçildiğinden emin olun. Son'a tıklayın.
Uygun PCR döngü programını ayarlayın. Eşik döngü değerlerini belirlemek için floresan okumasının her döngünün 72 santigrat derece adımı sırasında gerçekleştiğinden emin olun. Çalıştır'ı seçin.
Çalışma tamamlandığında, Sonuçlar sekmesine, Amplifikasyon Grafiği sekmesine tıklayın. Veri kalitesini değerlendirmek için Çıkış Amplifikasyon grafiğini değerlendirin. Üstel bir çizim, güvenilir amplifikasyonu gösterir.
Sonuçları bir elektronik tablo yazılımına aktarın. Metin protokolünde açıklandığı gibi verilerin analizi, testin tekrarlanabilirlik adına daha fazla optimizasyon gerektirip gerektirmediğini bilmenin anahtarıdır. Bu test için cDNA, transkripsiyonu teşvik etmek için sitokinlerle muamele edilen eozinofillerden hazırlanır.
1, 024'te bir ila bir seyreltme aralığına sahip iki numune cDNA alikotunun seri seyreltmelerini hazırlayın. Testi, primer özgüllüğünü analiz etmek için gösterildiği gibi 25 mikrolitrelik reaksiyonlara sahip 96 oyuklu bir plakada, ancak pan STAT3 ve bir temizlik geni GUSB için birkaç primer konsantrasyonu ile ayarlayın. Bu tabloda bir şablon gösterilmektedir.
Mühürlü PCR plakasını qPCR makinesine yerleştirin. Yazılımı kullanarak, GUSB için yeni bir dedektör ekleyerek ve uygun PCR döngü programını kullanarak deneyi ayarlayın. Daha sonra sonuçlar, metin protokolünde açıklandığı gibi her bir numune için eşik döngü değerini hesaplamak için kullanılır.
Bu prosedüre başlamak için, temizlik geni GUSB için nispi qPCR'de elde edilen eşik döngü değerlerini karşılaştırın ve tüm konsantrasyonların tek bir büyüklük sırası içinde olduğundan emin olmak için cDNA'yı buna göre ultra saf su ile seyreltin. 96 oyuklu plakalarda numunelerin mutlak qPCR testlerini ayarlayın. S alfa ve S beta için bu şablonu ve delta S alfa ve delta S beta için bu şablonu izleyin.
Tahlilleri daha önce gösterildiği gibi gerçekleştirin ve tahlilleri en az bir kez tekrarlayın. Daha sonra, 400 mikromolar'da pan STAT3 primerleri ve bu şablonu izleyerek dört plazmidin tümünün veya tek bir plazmitin bir karışımını kullanarak 25 mikrolitre reaksiyonlu mutlak bir qPCR 96 oyuklu plaka oluşturun. qPCR plakasını yapışkan bir kapakla kapatın ve 12 santigrat derecede 1.200 g'da beş dakika santrifüjleyin.
Mühürlü PCR plakasını qPCR makinesine yerleştirin ve deneyi daha önce gösterildiği gibi pan STAT3 için yeni bir dedektör ekleyerek ayarlayın. Bağıl qPCR ile aynı döngü parametrelerini ayarlayın. Testi en az bir kez tekrarladıktan sonra, sonuçları metin protokolünde açıklandığı gibi analiz edin.
İyi kaliteli qPCR verileri, döngü boyunca transkriptlerde üstel artışı gösteren bir sigmoidal amplikasyon grafiği oluşturacaktır. Bu veriler, STAT3 S alfa içeren iki seri plazmit dilüsyonunun qPCR'sinden elde edildi. Her bir renkli çizgi çifti, 40 döngü boyunca çift seyreltilmiş numunelerin floresan seviyelerini temsil eder.
Şablon kalibratör plazmitleri için oluşturulan standart eğriler, amplifikasyonun verimliliğini gösterecektir. STAT3 S alfa için bu eğride, amplifikasyon verimliliği %83.9 idi. STAT3 seviyelerinin uyumunu değerlendirmek için, dört ekleme varyantının her birinin mutlak değerleri ve toplam STAT3 seviyesi ölçüldü. İdeal olarak, hem doğrusal regresyon hem de eğim bire yakın olmalıdır.
Mutlak qPCR verileri, sitokin tedavisi boyunca dört STAT3 ek varyantının oranlarını göstermek için pasta grafikler olarak sunulur. Mutlak ve bağıl qPCR verilerinin birleştirilmesi, tüm STAT3 ek varyantlarının seviyelerinin, sitokinler IL3 ve TNF alfa ile stimülasyon sonrası arttığını ve seviyelerin altı saatte zirve yaptığını gösterdi. Tüm zaman noktalarından gelen verilerin bir araya getirilmesi, beta ve delta S birleştirme olaylarının birlikteliği için küçük ama önemli bir önyargıyı ortaya çıkardı.
Optimize edildikten sonra, bu tekniğe dayalı tahliller, uygun şekilde yapılırsa dört saat içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü denerken, kontaminasyonu önlemek için steril koşullar altında çalışmayı unutmamak önemlidir. Bir kodonu içeren veya hariç tutan ekleme kararları, çerçeve içi ekleme varyasyonunun %20'sini oluşturur.
Protokolümüz, bu tür varyasyonların nicelleştirilmesine kolayca uyarlanabilir olmalıdır. Geliştirildikten sonra, bu teknik, Mao Zhang'ın, ABC lenfoma hücrelerindeki STAT3 varyantlarının nakavt yeniden ifade deneylerini kontrol etmek için Li-Shan Rue grubundaki grubumla birlikte çalışmasına izin verdi. Bu deneyler, kültürde hücre sağkalımı için S ve delta S varyantlarının bir karışımının gerekli olduğunu gösterdi.
Bu videoyu izledikten sonra, mutlak ve bağıl qPCR'nin nasıl gerçekleştirileceğini ve ince ekleme farklılıklarını ayırt etmek ve ölçmek için uygun koşulları iyi bir şekilde anlamış olmalısınız.
Genel Bakış
Bu çalışma, eozinofillerdeki STAT3 ekleme varyantı transkriptlerinin oranlarını ve mutlak seviyelerini kantitativleştirmek için bir yöntem sunmaktadır. Protokol, tandem ekleme olaylarından kaynaklanan ekleme varyantlarını analiz etmek için mutlak kantitatif PCR kullanmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Moleküler Biyoloji
Arka Plan
- Tandem ekleme olayları, 12 nükleotiden daha az aralıklı bölgelerde meydana gelir.
- Ekleme varyantlarının kantitifiye edilmesi, gen regülasyonunu anlamak için önemlidir.
- STAT3 ekleme varyantları arasında S alfa, S beta, delta S alfa ve delta S beta bulunur.
- Bu varyantları anlamak, eozinofil işlevi ve sitokinlere verilen yanıt hakkında bilgiler sağlayabilir.
Çalışmanın Amacı
- Eozinofillerdeki STAT3 ekleme varyantlarının seviyelerini kantitifiye etmek.
- Sitokin stimülasyonunun bu varyantların ekspresyonunu nasıl etkilediğini araştırmak.
- Ekleme varyantı oranlarını değerlendirmek için güvenilir bir yöntem sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- İnsan eozinofillerinden cDNA hazırlanması.
- Mutlak ve göreceli qPCR veri elde etmek için plazmit standartlarının kullanımı.
- Her ekleme varyantı için plazmit yapılarını değerlendirmek üzere sekanslama reaksiyonları.
- Transkript seviyelerini analiz etmek için 96 kuyu formatında qPCR deneyleri kurmak.
Ana Sonuçlar
- Dört STAT3 ekleme varyantının başarılı bir şekilde kantitifiye edilmesi.
- Sitokin stimülasyonu üzerine ekleme varyantı seviyelerinde meydana gelen değişikliklerin gösterilmesi.
- Ekleme varyantı analizi için çeşitli hücre tiplerine uygulanabilen bir yöntem sağlanması.
- Veriler, deneme tekrarlanabilirliğinde optimizasyon gerekliliğini göstermiştir.
Sonuçlar
- Yöntem, eozinofillerdeki STAT3 ekleme varyantlarını etkili bir şekilde kantitifiye eder.
- Elde edilen bilgiler, ekleme regülasyonu hakkındaki anlayışı geliştirebilir.
- Bu yaklaşım, diğer hücre tipleri ve koşullar için uyarlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of splice variant proportions enables mechanistic de-risking in target validation by resolving transcriptional heterogeneity that can confound functional assays. This approach supports predictive confidence in lead identification by linking isoform-specific expression to phenotypic outcomes in disease-relevant systems. The method’s adaptability to tandem splicing sites offers a scalable strategy for early discovery workflows where subtle transcriptional changes inform go/no-go decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional hypotheses by quantifying isoform-specific expression changes in response to cytokine stimulation.
- Operational Value: Provides absolute quantification via plasmid standards, reducing reliance on comparative methods that may introduce normalization bias.
- Predictive Value: Supports assessment of co-splicing interdependence, aiding in the prioritization of targets with coordinated regulatory mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, reproducibility-ready data for four highly similar splice variants, enabling precise discrimination in multiplexed assays.
- Operational Value: Establishes standardized workflows using calibrated plasmid dilutions, facilitating cross-lab consistency in transcript quantification.
- Scalability: Compatible with 96-well qPCR formats, allowing medium-throughput screening of splice variant dynamics under experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links eosinophil STAT3 isoform shifts to cytokine exposure, providing a disease-relevant system for inflammatory pathway analysis.
- Mechanistic De-risking: Reveals co-splicing patterns between distal tandem sites, informing biomarker strategies that account for coordinated transcriptional regulation.
- Preclinical Model Relevance: Demonstrated adaptability to lymphoma cells, supporting cross-system validation of splice variant functional roles.
Pipeline & Workflow Integration
The method bridges discovery biology and lead identification by delivering absolute and relative transcript data that inform both target validation and assay readiness stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of splicing regulation by quantifying isoform-specific responses to stimuli, clarifying pathway-level effects.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs from absolute qPCR, enabling reliable comparison of splice variant proportions across conditions.
- Analytics: Combines absolute quantification with efficiency-corrected relative qPCR to derive both proportional and total transcript levels, enhancing data interpretability.
- Translational Research: Connects isoform dynamics in primary eosinophils to preclinical models, supporting continuity in target validation.
- Enterprise Reuse: Plasmid-based standardization allows the assay to be reused across projects and cell types as a plug-and-play quantification module.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by resolving isoform-specific expression, improving target confidence in STAT3-related pathways.
- Operational Value: Ensures reproducibility through plasmid standard curves and optimized cycling parameters, minimizing inter-assay variability.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by linking splice variant ratios to functional outcomes in cellular models.
- Portfolio Impact: Enables data-driven triage of targets based on isoform expression stability and co-splicing behavior under pathophysiological conditions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in qPCR optimization, plasmid preparation, and sequence validation to ensure splice variant specificity.
- Dependent on access to qPCR instrumentation with fluorescence detection and thermal cycling precision for accurate threshold cycle determination.
- Necessitates cross-team standardization of plasmid dilution series and primer concentration protocols to maintain assay comparability.
- Involves adaptation considerations when transferring the method to new cell types, including cDNA quality and transcript abundance thresholds.
- Practical limitation: Primer specificity must be balanced with amplification efficiency due to minimal nucleotide differences between variants, as noted in the protocol optimization.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:16
Creating Plasmids as Template Standards
2:20
Analyzing Primer Specificity for Absolute qPCR
5:49
Performing Relative qPCR Assays
6:57
Analyzing Absolute qPCR Data for Unknown Samples
8:27
Results: Measurement of STAT3 Splice Variant Levels in Eosinophils Treated with Cytokines
10:06
Conclusion
