Mutlak ve Bağıl Kantitatif PCR Veri birleştirme STAT3 Splice Varyant Dökümünü belirlememize

Bu protokolün genel amacı, eozinofillerdeki STAT3 ek varyantı transkriptlerinin oranlarını ve mutlak seviyelerini ölçmektir. Bu yöntem, distal uçbirleştirme olaylarının birlikteliği ve tandem uçbirleştirme oranlarının farklılaşmasına neden olabilecek koşulların tanımlanması gibi ekleme düzenleme alanındaki temel soruları ele alabilir. Bu tekniğin ana avantajı, mutlak ve bağıl qPCR verilerinin elde edilmesini sağlayan plazmid standartlarıdır, böylece dört STAT3 transkriptinin oranlarını ve genel seviyelerini belirleyebiliriz.

Bizim durumumuzda, dört STAT3 varyantı olan S alfa, S beta, delta S alfa ve delta S beta'nın, eozinofiller sitokinler tarafından uyarıldığında nasıl değiştiğini öğrenmek istiyoruz. Bu yöntem eozinofil STAT3 bileşimi hakkında bilgi sağlayabilse de, cDNA'nın elde edilebileceği diğer hücre tiplerine de uygulanabilir. S ve delta S sadece üç nükleotidde farklılık gösterdiğinden, her varyant için her iki standart standartta da özgüllük elde etmek için verimlilikten ödün vermek zorunda kaldık.

Bu protokolde, insan eozinofillerinden hazırlanan cDNA, STAT3 ek varyantlarını amplifiye etmek için şablon olarak kullanılır. Metin protokolünde açıklandığı gibi plazmitleri oluşturduktan sonra, birkaç koloniden plazmitleri dizilemek için dizileme reaksiyonları hazırlayın. Her 20 mikrolitrelik reaksiyon, üç mikrolitre dizileme reaksiyonu tamponu, iki mikrolitre dizileme reaksiyonu karışımı, 12 mikrolitre ultra saf su, bir mikrolitre plazmid ve iki mikrolitre dizileme astarı içermelidir.

Sıralama sonuçları mevcut olduğunda, her bir varyantı kodlayan plazmitlerin elektroforetogramlarını değerlendirin; S alfa, S beta, delta S alfa ve delta S beta. Saf plazmit DNA konsantrasyonunu mikrolitre başına nanogram cinsinden ölçün ve mikrolitre başına kopya sayısını hesaplayın. Bu prosedüre, ultra saf su kullanarak STAT3 plazmitlerinin 10'da bir seyreltme serisini hazırlayarak başlayın.

Mikrolitre başına yaklaşık 10 ila sekizinci ila 10 ila üçüncü kopya ile. En konsantre numunenin konsantrasyonunu ölçün. Her bir varyant için mikrolitre başına 10 ila altıncı kopyada her bir ekleme varyantı için negatif kontroller olarak dört hedef olmayan karışım hazırlamak için seyreltilmiş plazmitleri kullanın.

Her biri mikrolitre başına 10 ila altıncı kopya olan dört şablonun tümünün eşit konsantrasyonlarına sahip bir hedef karışım hazırlayın. Numunede 560 nanomolar nihai konsantrasyon için, her biri yedi mikromolar konsantrasyonda 60 mikrolitre primer içeren her bir ekleme varyantı için astar çifti çözeltileri hazırlayın. DNA polimerazı, çift sarmallı DNA bağlayıcı boya karışımını, yedi ila beşi saf su ile seyreltin.

Bu şablonu izleyerek testi 96 oyuklu bir PCR plakasında ayarlayın. İlk önce her bir oyuğa 21 mikrolitre seyreltilmiş DNA polimeraz, çift sarmallı DNA bağlayıcı boya karışımı ekleyin. Ardından iki mikrolitre astar karışımı ve iki mikrolitre şablon ekleyin.

Şablonsuz her kontrol kuyusuna şablon yerine iki mikrolitre filtrelenmiş su ekleyin. Tekrarlanabilirliği değerlendirmek için reaksiyonları çift olarak ayarlayın. qPCR plakasını yapışkan bir kapakla kapatın ve 12 santigrat derecede 1.200 g'da beş dakika santrifüjleyin.

qPCR makinesini açın ve kapalı qPCR plakasını yerleştirin. ABI gerçek zamanlı PCR sistemini kullanıyorsanız, deneyi gösterildiği gibi ayarlayın. Dosya, Yeni, İleri'ye tıklayın, yeni Algılayıcı'yı seçin, ardından bir ad girin ve bir Raporlayıcı ve bir Söndürücü seçin.

Her ekleme varyantı için yeni bir dedektör kurun. İleri'yi seçin ve Numune Plakasını Ayarla sayfasında istendiği gibi standartları ayarlayın, miktarların tabloya girildiğinden ve uygun dedektörlerin seçildiğinden emin olun. Son'a tıklayın.

Uygun PCR döngü programını ayarlayın. Eşik döngü değerlerini belirlemek için floresan okumasının her döngünün 72 santigrat derece adımı sırasında gerçekleştiğinden emin olun. Çalıştır'ı seçin.

Çalışma tamamlandığında, Sonuçlar sekmesine, Amplifikasyon Grafiği sekmesine tıklayın. Veri kalitesini değerlendirmek için Çıkış Amplifikasyon grafiğini değerlendirin. Üstel bir çizim, güvenilir amplifikasyonu gösterir.

Sonuçları bir elektronik tablo yazılımına aktarın. Metin protokolünde açıklandığı gibi verilerin analizi, testin tekrarlanabilirlik adına daha fazla optimizasyon gerektirip gerektirmediğini bilmenin anahtarıdır. Bu test için cDNA, transkripsiyonu teşvik etmek için sitokinlerle muamele edilen eozinofillerden hazırlanır.

1, 024'te bir ila bir seyreltme aralığına sahip iki numune cDNA alikotunun seri seyreltmelerini hazırlayın. Testi, primer özgüllüğünü analiz etmek için gösterildiği gibi 25 mikrolitrelik reaksiyonlara sahip 96 oyuklu bir plakada, ancak pan STAT3 ve bir temizlik geni GUSB için birkaç primer konsantrasyonu ile ayarlayın. Bu tabloda bir şablon gösterilmektedir.

Mühürlü PCR plakasını qPCR makinesine yerleştirin. Yazılımı kullanarak, GUSB için yeni bir dedektör ekleyerek ve uygun PCR döngü programını kullanarak deneyi ayarlayın. Daha sonra sonuçlar, metin protokolünde açıklandığı gibi her bir numune için eşik döngü değerini hesaplamak için kullanılır.

Bu prosedüre başlamak için, temizlik geni GUSB için nispi qPCR'de elde edilen eşik döngü değerlerini karşılaştırın ve tüm konsantrasyonların tek bir büyüklük sırası içinde olduğundan emin olmak için cDNA'yı buna göre ultra saf su ile seyreltin. 96 oyuklu plakalarda numunelerin mutlak qPCR testlerini ayarlayın. S alfa ve S beta için bu şablonu ve delta S alfa ve delta S beta için bu şablonu izleyin.

Tahlilleri daha önce gösterildiği gibi gerçekleştirin ve tahlilleri en az bir kez tekrarlayın. Daha sonra, 400 mikromolar'da pan STAT3 primerleri ve bu şablonu izleyerek dört plazmidin tümünün veya tek bir plazmitin bir karışımını kullanarak 25 mikrolitre reaksiyonlu mutlak bir qPCR 96 oyuklu plaka oluşturun. qPCR plakasını yapışkan bir kapakla kapatın ve 12 santigrat derecede 1.200 g'da beş dakika santrifüjleyin.

Mühürlü PCR plakasını qPCR makinesine yerleştirin ve deneyi daha önce gösterildiği gibi pan STAT3 için yeni bir dedektör ekleyerek ayarlayın. Bağıl qPCR ile aynı döngü parametrelerini ayarlayın. Testi en az bir kez tekrarladıktan sonra, sonuçları metin protokolünde açıklandığı gibi analiz edin.

İyi kaliteli qPCR verileri, döngü boyunca transkriptlerde üstel artışı gösteren bir sigmoidal amplikasyon grafiği oluşturacaktır. Bu veriler, STAT3 S alfa içeren iki seri plazmit dilüsyonunun qPCR'sinden elde edildi. Her bir renkli çizgi çifti, 40 döngü boyunca çift seyreltilmiş numunelerin floresan seviyelerini temsil eder.

Şablon kalibratör plazmitleri için oluşturulan standart eğriler, amplifikasyonun verimliliğini gösterecektir. STAT3 S alfa için bu eğride, amplifikasyon verimliliği %83.9 idi. STAT3 seviyelerinin uyumunu değerlendirmek için, dört ekleme varyantının her birinin mutlak değerleri ve toplam STAT3 seviyesi ölçüldü. İdeal olarak, hem doğrusal regresyon hem de eğim bire yakın olmalıdır.

Mutlak qPCR verileri, sitokin tedavisi boyunca dört STAT3 ek varyantının oranlarını göstermek için pasta grafikler olarak sunulur. Mutlak ve bağıl qPCR verilerinin birleştirilmesi, tüm STAT3 ek varyantlarının seviyelerinin, sitokinler IL3 ve TNF alfa ile stimülasyon sonrası arttığını ve seviyelerin altı saatte zirve yaptığını gösterdi. Tüm zaman noktalarından gelen verilerin bir araya getirilmesi, beta ve delta S birleştirme olaylarının birlikteliği için küçük ama önemli bir önyargıyı ortaya çıkardı.

Optimize edildikten sonra, bu tekniğe dayalı tahliller, uygun şekilde yapılırsa dört saat içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü denerken, kontaminasyonu önlemek için steril koşullar altında çalışmayı unutmamak önemlidir. Bir kodonu içeren veya hariç tutan ekleme kararları, çerçeve içi ekleme varyasyonunun %20'sini oluşturur.

Protokolümüz, bu tür varyasyonların nicelleştirilmesine kolayca uyarlanabilir olmalıdır. Geliştirildikten sonra, bu teknik, Mao Zhang'ın, ABC lenfoma hücrelerindeki STAT3 varyantlarının nakavt yeniden ifade deneylerini kontrol etmek için Li-Shan Rue grubundaki grubumla birlikte çalışmasına izin verdi. Bu deneyler, kültürde hücre sağkalımı için S ve delta S varyantlarının bir karışımının gerekli olduğunu gösterdi.

Bu videoyu izledikten sonra, mutlak ve bağıl qPCR'nin nasıl gerçekleştirileceğini ve ince ekleme farklılıklarını ayırt etmek ve ölçmek için uygun koşulları iyi bir şekilde anlamış olmalısınız.