Name: Mutlak ve Bağıl Kantitatif PCR Veri birleştirme STAT3 Splice Varyant Dökümünü belirlememize (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Öğrenin, mutlak ve bağıl kantitatif PCR kullanarak eosinofillerde STAT3 splice varyantlarının oranlarını ve düzeylerini nasıl belirleyeceğinizi. Bu yöntem, gen düzenlemesi ve sitokin yanıtlarını anlamak için kritik bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

P01HL088584: Yazarlar Havayolu Enflamasyon ve Remodeling içinde Eosinophillerdeki Rolü Program Projesi Hibe Sağlık-NHLBI Ulusal Enstitüleri kabul etmek istiyorum (PI: N. Jarjour) ve Wisconsin Carbone Kanser Merkezi ve Tıp Anabilim Üniversitesi intramural finansman için. Biz dört STAT3 varyantları klonlama Douglas Annis teşekkür ederiz.

NOT: Periferik kan eozinofil Sağlık Bilimleri Kurumsal Değerlendirme Kurulu Wisconsin-Madison Merkezi&#39;nin Üniversitesi tarafından bir protokol onaylandı (# 2013-1570) ile uyum içinde tanımlayıcı bilgiler olmadan alındı. donörden imzalı bilgilendirilmiş olur araştırma her numune kullanılarak elde edilmiştir. 1. Şablon Standartları olarak plazmidler oluşturma <ol><li> Tablo 1a başına 5&#39;Kpnl ve Nhel kısıtlama siteleri (ve 5&#39;-uzantıları) ile, hem STAT3 ekleme siteleri kapsayan bir amplikon için primerler oluşturun. Not: Kpnl ve Nhel siteleri uçlar sağlamak üzere seçilmiştir kanamisin direnci 25,26 olan bir tadil edilmiş, pET-28a vektörüne lige edilmesi Kpnl sitesi çok sayıda klonlama yerine ilave edilmiştir.. </li><li> Hücre kültür ortamı içinde 2.5 x 10 6 hücre / ml&#39;lik iki kopya halindeki numunelerin hazırlanması Taze bağışlanan eozinofil kullanılarak (Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) 1640 ortamı). % 5 CO2 ve% 10 nem altında 37 ° C de 1 saat süreyle inkübe edin. <ol><li> RNA ekstraksiyonu ve cDNA sentezi kitleri kullanılarak üreticinin talimatlarına göre (Hazırlık başına en az 1 x 10 6 hücre) örnekleri, tamamlayıcı (c) DNA hazırlamak. </li></ol></li><li> Şablon cDNA aşama 1.2.1 hazırlanan itibaren, STAT3 ekleme Tablo 2a başına amplifikasyon PCR kullanılarak varyantları yükseltmek. </li><li> % 2&#39;lik agaroz Tris-asetat-etilendiamintetraasetat (TAE) jel 27 amplikonları giderin. jelden tüketim bantları ve gel eksizyonu kiti talimatlarına göre saflaştırılması. </li><li> Miktarlar, inkübasyon süreleri ve sıcaklıklar kullanılarak, uygun sınırlandırma enzimleri (referans 27 sınırlama genel bakış) ile kesilmiştir amplikonlar ve plazmid enzimi sağlayıcı tarafından; ve adım 1.4 olarak arındırmak. sağlayıcı tarafından önerilen koşullar altında plazmide sınırlı amplikonları Arter. </li><li> Negatif cont hazırlayınROL (ligazı parçasız fakat sınırlı plazma DNA) ve bir pozitif kontrol (kanamisine dirençli sınırsız plazmid). Yetkili E. standart plazmid dönüşümleri gerçekleştirmek E. coli DH5α 28 kullanılarak ligasyon karışımları 27. </li><li> Dönüştürülmüş E. inkübe 1 ml Luria-Broth (LB) ortamı içinde E. coli, 37 ° C&#39;de 1 saat çalkalanarak (talimat 27 gibi hazırlandı). 50 ug / ml kanamisin ug ve gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe ihtiva eden LB plakaları üzerine yayıldı dönüştürücüler. </li><li> Steril kürdan 27 kullanılarak STAT3 a ve STAT3 β plakaları birkaç koloniler seçin. 2 ml LB her transfer bir çalkalama inkübatöründe 37 ° C&#39;de gece boyunca kültür büyütün. </li><li> DNA saflaştırma kiti sağlanan yönergeleri takip ederek bakteri kültürlerinden plazmidler arındırın. -20 Veya -80 ° C&#39;de saklayın plazmidler. </li><li> 20 ul sekanslama hazırlayarak Pek çok koloniden, sekans plazmid. pipet 3ul sıralaması reaksiyon tamponu, 2 ul sıralaması Reaksiyon karışımı, 12 ul ultra saf su, şablonu ve 2 ul sekanslanma primeri olarak 1 ul plazmit kullanmak avantajlıdır. NOT: pET-28a vektör kullanıyorsanız, &#39;sıralama primer 5&#39;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGG-3 kullanın. <ol><li> Sα, Sβ, ΔSα ve ΔSβ 25: Her varyantını kodlayan plasmidlerin Elektroforetogramların değerlendirin. </li></ol></li><li> ng / ul saf plazmid DNA Tedbir konsantrasyonu. Bir spektrofotometre kullanılarak 260 nm&#39;de absorbans okuma durumunda, Beer-Lambert kuralına 29 kullanılarak DNA konsantrasyonunun hesaplanması: <img alt="denklem 1" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq1.jpg" /> C = konsantrasyon A = absorbans, ε (yok olma katsayısı) = 0.02 (ug / ml) 1 cm -1 ışık çift şeritli bir DNA ve L = yol uzunluğu (genellikle 1 cm) dir. </li><li> STAT3 uç uca ekleme varyantı cDNA am moleküler ağırlığıplicons ve vektör ul başına kopya sayısını hesaplamak. NOT: Baz çifti başına molekül ağırlığı (bp) 650 Da olarak tahmin edilmektedir. <img alt="denklem 2" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq2.jpg" /></li></ol> 2. Mutlak qPCR için primer Özgüllük Analiz <ol><li> Ultra saf su ile ul başına ~ 10 Ağustos-10 Mart kopya (20 ul) ile, STAT3 plazmidlerin 10 dilüsyon serisinde 1 hazırlayın. En konsantre Tedbir konsantrasyonu (ul başına ~ 10 8 kopya, adım 1.11 bakınız). </li><li> Dört &quot;hedef dışı&quot; karışımları hazırlamak için seyreltilmiş plazmidler kullanın (yani., STAT3 Sα, ΔSα, Sβ ama hiçbir ΔSβ eşit konsantrasyonlarını içeren STAT3 ΔSβ negatif kontrol) her ul başına 10 6 kopya olarak. Ul başına 10 6 kopya olarak dört şablonları her eşit konsantrasyonları ile bir &quot;hedef&quot; karışımı hazırlayın. </li><li> primer çifti çözüm hazırlayınHer bir bağlantı varyant için S (560 nM olacak örnek nihai konsantrasyon), 7 uM konsantrasyonu ~ yaparak primerlerin her biri 60 ul (Tablo 1b ve Şekil 1 &#39;e bakınız). </li><li> Saf H2O ile 5: DNA polimeraz / dsDNA bağlayıcı boya karışımı 7 seyreltin </li><li> Şablon (Tablo 3) &#39;de gösterildiği gibi, bir 96-yuvalı PCR plaka tahlil 1. ayarlayın. <ol><li> DNA polimeraz / boya karışımı dsDNA bağlayıcı seyreltilmiş 21 ul ekleyin, sonra primer karışımının 2 ul ve şablon 2 ul (Tablo başına 2b). Bunun yerine şablon, iyi hiçbir şablon kontrolü (NTC) H 2 O süzülmüş 2 ul ekleyin. Iki nüsha halinde kurmak reaksiyonlar tekrarlanabilirliği 30 değerlendirmek için. </li></ol></li><li> Yapışkan kapağı ve 12 ° C&#39;de 1.200 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj ile mühür qPCR plaka. </li><li> Açıklandığı gibi Materyalleri listelenen yazılımları kullanıyorsanız, deney kurdu. <ol><li> qPCR makine ve insert açın qPCR plaka mühürlü. Dosya Click &amp;# 62; Yeni&gt; İleri&gt; &quot;Yeni dedektörü&quot; seçeneğini seçin muhabir seçin, içki ve adını sağlar. Her ekleme varyantı için &quot;yeni bir dedektör&quot; kurmak. </li><li> miktarlarda sağlanması, İleri&#39;yi seçin ve Set Up Numune Plaka sayfasında istendiğinde standartları kurmak tabloya girilir ve uygun dedektörler seçilir. bitirmek tıklayın. </li><li> Tablo 2b göre bisiklet ayarlayın. (Ct belirlemek için) okuyan floresan sağlamak her döngünün 72 ° C adımı sırasında oluşur. Çalıştır seçin. </li><li> çalışma tamamlandığında, sonuçlar sekmesi&gt; Büyütme arsa sekmesini tıklayın. (Şekil 2 deki gibi bir üstel arsa arayın) veri kalitesini değerlendirmek için çıkış amplifikasyon arsa değerlendirin. NOT: emin olun amplifikasyon araziler çoğunlukla üstel ve çevrim eşik arsa üstel kısmında ayarlanabilir vardır. Sağlamak NTSC amplifiye değildir ve diğer standart noktaları yüksek ΔRn ile düşük bir Cr değeri elde göstermektedir. </li><li> export Dosya&gt; Dışa Aktar&gt; Sonuçları tıklayın tablo yazılımı sonuçlanır. </li></ol></li></ol> 3. Mutlak qPCR Testi Özgüllük ve Tekrarlayabilme değerlendirilmesi <ol><li> Tekrarlanabilirlik <ol><li> Ct standart sapması değerleri (floresan için eşik döngüsü) hesaplamak için Adım 2.7.5 verileri kullanır. <img alt="denklem 3" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq3.jpg" /> Burada n = numune sayısı (2 kopya halinde yapıldığı takdirde), <img alt="denklem 4" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq4.jpg" /> = Numunenin Ct ve <img alt="Denklem 5" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq5.jpg" /> = Ct ortalama numune. Çiftleri Ct değerlerinin standart sapması ≤0.2 olup olmadığını kontrol edin. NTC kuyularda ama tüm Ct değerleri 38 daha küçük olup olmadığını kontrol edin. </li><li> tekrarlanabilirlik ya artan ya da azalan tavlama zaman kötü optimize bisiklet parametreleri ise. </li></ol></li><li> Arsa günlüğü kopya uyuşmuşer (as Adım 1.12 belirlenen ve Adım 2.1 hazırlanan) Ct değeri vs bir standart eğri oluşturmak için; aşağıdaki denklem elde edilmiştir: <img alt="Denklem 6" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq6.jpg" /> Y Ct Nerede, m degrade olduğunu x log (kopya sayısı) ve b kesmek değeridir. NOT: lineer regresyon R 2 değeri iyi veri ≥0.95 olacaktır. </li><li> Standart eğri ve denklem kullanılarak amplifikasyon verimi olarak hesaplanır <img alt="Denklem 7" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq7.jpg" /> NOT: verimlilik ≥75% hedefleyin. </li><li> Çok formülü kullanılarak qPCR tahlil 1 özgüllüğü hesaplayın: <img alt="Denklem 8" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq8.jpg" /> Burada Δ Ct çok = Ct hedefi - spesifik ve spesifik olmayan amplifikatör için eşik döngüsü sayısının farkı tarif Ct hedef olmayan,lification NOT: Özgünlük büyüklük dört siparişleri aşmalıdır (yani, özgüllük faktörü ≥4.). <ol><li> özgüllüğü kötüyse, astar konsantrasyonunu düşürerek optimize. 100 nM ila 500 nM arasında değişen nihai primer konsantrasyonları ile (adımları 2.5-2.7 tarif edildiği gibi) deneyleri ayarlayın. </li></ol></li></ol> 4. Bağıl qPCR Tahliller Sahne <ol><li> Transkripsiyon Destekleme Sitokinlerle Hücreler davranın. <ol><li> Taze bağışlanan eozinofiller için, hücre kültür ortamı içinde 2.5 x 10 6 hücre / ml (RPMI 1640 ortamı) ve iki kopya halindeki numunelerin hazırlanması ve (50 ng / ml, interlökin-3 (IL3) ve / veya 50 ng / ml, tümör nekroz faktörü α ile muamele % 5 CO2 ve% 10 nem altında 37 ° C&#39;de 3, 6, 9 ve 20 saat arasında süre için TNFa). </li></ol></li><li> RNA ekstraksiyonu, ve cDNA sentezi kitleri kullanılarak üreticinin talimatlarına göre eozinofil örnekleri (Hazırlık başına en az 1 x 10 6 hücre) için cDNA hazırlanır. </li&gt; <li> &quot;1 1024&quot; seyreltme &quot;1&quot; den bir seyreltme aralığı, iki örnek cDNA alikotları (kontrol veya dinlenme örnekleri) seri dilüsyonları hazırlayın. <ol><li> 1 seyreltme 4, pipet 1 ul cDNA ve 3 ul ultra saf su için. </li><li> 1 16 seyreltme için, 1 pipet 1 ul 4 seyreltme ve 3 ul ultra-saf su, vs </li></ol></li><li> Açıklanan adımlar 2.3-2.5 olarak ama pan STAT3 ve GUSB (Tablo 4&#39;te şablonu bakınız) için çeşitli astar konsantrasyonları ile 25 ul reaksiyonlar ile 96-plaka PCR ayarlayın. </li><li> GUSB için &quot;yeni dedektör&quot; ekleyin ve Tablo 2c açıklanan bisiklet parametreleri kullanılarak, adımları 2,6-2,7 uygulayın. </li><li> standart eğrileri astar konsantrasyonu% 95-100 amplifikasyon verimliliği neden olduğunu belirlemek için (adımları 3.2 ve 3.3) oluşturun. </li><li> (Kademe 4,2) hazırlanan cDNA örnekleri ve optimize edilmiş astar konsantrasyonları ile kurmak plaka(bisiklet parametreleri, reaktifler ve Tablo 5 ile 96 oyuklu plaka şablon Tablo 2c bakınız). </li><li> adımlar 2.6-2.7 gerçekleştirin. Tekrarlayın tahlil en az bir kez ve veri kalitesini kontrol edin. </li><li> STAT3 ve temizlik gen GUSB hem yinelenen örnek CTS ortalama Ct değerini hesaplayın. </li><li> Her bir numune için Δ Ct değerleri elde edilir. <img alt="Denklem 9" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq9.jpg" /></li><li> Örnek olarak (genellikle ilgi transkriptinin düşük konsantrasyonuna sahiptir) dinlenme örnek belirleyin 0 hesaplama ΔΔ (on Örnek X olarak gösterilen), her bir numune için Ct 31: <img alt="Denklem 10" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq10.jpg" /></li><li> Her numune için kat-artış hesaplayın: <img alt="denklem 11" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq11.jpg" /></li><li> Tekrarlanabilirlik <ol><li> Pan ST için kopya sayısının varyasyon (CV) katsayısı hesaplamakAT3 ve GUSB. <img alt="denklem 12" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq12.jpg" /> N = numune sayısı, = numunenin hesaplanan kopya sayısı ve = örnek Nerede anlamına gelir. Her numune (çoklu analizler) bu CV kontrol ≤10% &#39;dir. </li></ol></li></ol> 5. Bilinmeyen Örnekleri için mutlak qPCR Veri Analizi <ol><li> Numunelerin cDNA konsantrasyonları bir mertebe dahilinde sağlamak için ev bakıcısı geni GUSB için (adım 4.9 de tarif edildiği gibi) göreceli qPCR olarak elde edilen Ct değerleri karşılaştırın. <ol><li> Buna göre (cDNA seyreltilir örneğin örnek 1 Ct değeri ~ 17.5 ve diğer numunelerin Ct değerleri varsa, örnek 1 kabaca 2 (21-17,5) = 11 kat daha fazla konsantre olup, ~ 21 olduğu bir 1 yapın. 1 seyreltme gereğinden fazla inceltilmeden aynı aralıkta saf su). NOT: Büyük ölçüde farklı başlangıç ​​konsantrasyonları önyargı lineer regresyon analizi (4.1 adım olacaktır2). </li></ol></li><li> Örneklerin mutlak qPCR tahlil ayarlayın. Tablo 6 uyarınca Sα ve Sβ için tahlil 2a şablon levha hazırlanması; ve. Tablo 7&#39;deki gibi ΔSα ve ΔSβ için tahlil 2b hazırlanması adımlarda açıklandığı gibi deneyleri yürütmek 2.6-2.7.3 (Tablo 2b). en az bir kez tahlilleri tekrarlayın. </li><li> adımlarda 2.7.4-2.7.5 açıklandığı gibi veri kalitesi ve ihracat kontrol edin. </li><li> Pan-STAT3 primerleri (Tablo 1c primerler, Tablo 8&#39;de şablonu) 400 uM ve tüm dört plazmid bir karışımını ya belirtilen toplam konsantrasyonlarda tek plasmidi kullanılarak 25 ul reaksiyonlar mutlak qPCR 96 plaka ayarlayın. Not: Verim mutlak qPCR madde, ancak bu primerlerin verimliliğini optimize görece qPCR (Adım 4) için önemlidir etmez. </li><li> Yapışkan kapağı ve 12 ° C&#39;de 1.200 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj ile mühür qPCR plaka. </li><li> pan &quot;yeni dedektör&quot; kurmak- Adım 2.7.1-2.7.3 gibi STAT3. </li><li> Tablo 2c başına (göreceli qPCR aynı koşullara) STAT3 pan için bisiklet ayarlayın. (Ct belirlemek için) okuyan floresan sağlamak her döngünün 72 ° C adımı sırasında oluşur. Tekrarlayın tahlil en az bir kez tekrarlanabilir sağlamak. </li><li> (2.7.4-2.7.5 adımlara bakın) veri kalitesi ve ihracat kontrol edin. <ol><li> Amplifikasyon çizimini (bakınız Şekil 2) üstel değilseniz numune cDNA (1:10) seyreltin ve (adım 5.7) de tarif edilen deney tekrar edin. </li></ol></li><li> Standart eğri denklemi kullanarak, her ekleme varyantının ve her bir numune içindeki pan STAT3 kopya sayısını hesaplamak ve örneklerin Ct değerleri (Şekil 3 3.2). <img alt="Denklem 13" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq13.jpg" /></li><li> Arsa günlüğü STA için günlük (kümülatif mutlak qPCR kopya sayısı değerleri vs (pan-STAT3 için elde edilen mutlak qPCR kopya sayısı değerleri)T3 ekleme) varyantları. NOT: İdeal lineer regresyon ve eğim değerleri hem ~ 1 olur. </li><li> tekrarlanabilirlik (Adım 3.1) ve tekrarlanabilirlik (Adım 4.13) hesaplayın. </li></ol> 6. birleştirme Mutlak ve Bağıl qPCR Veri <ol><li> Her ekleme varyantının kat artış hesaplamak için toplam STAT3 kat artış ile varyant oranını çarpın. </li><li> standart sapmalar hesaplayın hata yayılması için hesap mutlak ve bağıl değerleri (Adım 3.1.1 bakınız). gösterildiği gibi standart ölçme hatası (SEM) belirleyin: <img alt="Denklem 14" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq14.jpg" /></li></ol>

<ol><li>Hiller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetically+widespread+alternative+splicing+at+unusual+GYNGYN+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Phylogenetically widespread alternative splicing at unusual GYNGYN donors.</a> Genome Biol. 7 (7), R65(2006).</li>
<li>Treacy, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twin+of+I-POU%3A+a+two+amino+acid+difference+in+the+I-POU+homeodomain+distinguishes+an+activator+from+an+inhibitor+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Twin of I-POU: a two amino acid difference in the I-POU homeodomain distinguishes an activator from an inhibitor of transcription.</a> Cell. 68 (3), 491-505 (1992).</li>
<li>Schindler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+at+NAGNAG+acceptors+in+Arabidopsis+thaliana+SR+and+SR-related+protein-coding+genes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing at NAGNAG acceptors in Arabidopsis thaliana SR and SR-related protein-coding genes.</a> BMC Genomics. 9, 159(2008).</li>
<li>Szafranski, K., Kramer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((It%27s+a+bit+over%2C+is+that+ok%3F+The+subtle+surplus+from+tandem+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">It's a bit over, is that ok? The subtle surplus from tandem alternative splicing.</a> RNA Biol. 12 (2), 115-122 (2015).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+at+GYNNGY+5%27+splice+sites%3A+more+noise%2C+less+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing at GYNNGY 5' splice sites: more noise, less regulation.</a> Nucleic Acids Res. 42 (22), 13969-13980 (2014).</li>
<li>Hiller, M., Platzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+and+subtle%3A+alternative+splicing+at+short-distance+tandem+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Widespread and subtle: alternative splicing at short-distance tandem sites.</a> Trends Genet. 24 (5), 246-255 (2008).</li>
<li>Tsai, K. W., Lin, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+wobble+splicing+indicates+that+it+is+not+tissue+specific%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of wobble splicing indicates that it is not tissue specific.</a> Genomics. 88 (6), 855-864 (2006).</li>
<li>Tadokoro, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+occurrence+of+protein+isoforms+with+or+without+a+single+amino+acid+residue+by+subtle+alternative+splicing%3A+the+case+of+Gln+in+DRPLA+affects+subcellular+localization+of+the+products%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Frequent occurrence of protein isoforms with or without a single amino acid residue by subtle alternative splicing: the case of Gln in DRPLA affects subcellular localization of the products.</a> J Hum Genet. 50 (8), 382-394 (2005).</li>
<li>Bradley, R. K., Merkin, J., Lambert, N. J., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+RNA+triplets+is+often+regulated+and+accelerates+proteome+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of RNA triplets is often regulated and accelerates proteome evolution.</a> PLoS Biol. 10 (1), e1001229(2012).</li>
<li>Zheng, C. L., Fu, X. D., Gribskov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+regulatory+elements+defining+constitutive+splicing+and+different+modes+of+alternative+splicing+in+human+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Characteristics and regulatory elements defining constitutive splicing and different modes of alternative splicing in human and mouse.</a> RNA. 11 (12), 1777-1787 (2005).</li>
<li>Schaefer, T. S., Sanders, L. K., Nathans, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+transcriptional+activity+of+Jun+and+Stat3+beta%2C+a+short+form+of+Stat3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cooperative transcriptional activity of Jun and Stat3 beta, a short form of Stat3.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9097-9101 (1995).</li>
<li>Waitkus, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+integration+and+gene+induction+by+a+functionally+distinct+STAT3+phosphoform%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Signal integration and gene induction by a functionally distinct STAT3 phosphoform.</a> Mol Cell Biol. 34 (10), 1800-1811 (2014).</li>
<li>Srivastava, J., DiGiovanni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-canonical+Stat3+signaling+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Non-canonical Stat3 signaling in cancer.</a> Mol Carcinog. , (2015).</li>
<li>Holland, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+mutations+in+the+hyper-IgE+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">STAT3 mutations in the hyper-IgE syndrome.</a> N Engl J Med. 357 (16), 1608-1619 (2007).</li>
<li>Maritano, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+STAT3+isoforms+alpha+and+beta+have+unique+and+specific+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The STAT3 isoforms alpha and beta have unique and specific functions.</a> Nat Immunol. 5 (4), 401-409 (2004).</li>
<li>Hevehan, D. L., Miller, W. M., Papoutsakis, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+and+phosphorylation+of+distinct+STAT3+proteins+during+granulocytic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential expression and phosphorylation of distinct STAT3 proteins during granulocytic differentiation.</a> Blood. 99 (5), 1627-1637 (2002).</li>
<li>Yoo, J. Y., Huso, D. L., Nathans, D., Desiderio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+ablation+of+Stat3beta+distorts+the+pattern+of+Stat3-responsive+gene+expression+and+impairs+recovery+from+endotoxic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Specific ablation of Stat3beta distorts the pattern of Stat3-responsive gene expression and impairs recovery from endotoxic shock.</a> Cell. 108 (3), 331-344 (2002).</li>
<li>Stahl, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+STATs+and+other+substrates+specified+by+modular+tyrosine-based+motifs+in+cytokine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Choice of STATs and other substrates specified by modular tyrosine-based motifs in cytokine receptors.</a> Science. 267 (5202), 1349-1353 (1995).</li>
<li>Zheng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mix+of+S+and+DeltaS+variants+of+STAT3+enable+survival+of+activated+B-cell-like+diffuse+large+B-cell+lymphoma+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogenesis%22%5BJournal%5D)">A mix of S and DeltaS variants of STAT3 enable survival of activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells in culture.</a> Oncogenesis. 4, 184(2016).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., Vitzthum, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigations+on+DNA+intercalation+and+surface+binding+by+SYBR+Green+I%2C+its+structure+determination+and+methodological+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications.</a> Nucleic Acids Res. 32 (12), e103(2004).</li>
<li>Kelly, E. A., Liu, L. Y., Esnault, S., Quinchia Johnson, B. H., Jarjour, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+synergistic+effect+of+IL-3+and+TNF+on+matrix+metalloproteinase+9+generation+by+human+eosinophils%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Potent synergistic effect of IL-3 and TNF on matrix metalloproteinase 9 generation by human eosinophils.</a> Cytokine. 58 (2), 199-206 (2012).</li>
<li>Whelan, J. A., Russell, N. B., Whelan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+absolute+quantification+of+cDNA+using+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for the absolute quantification of cDNA using real-time PCR.</a> J Immunol Methods. 278 (1-2), 261-269 (2003).</li>
<li>Too, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+PCR+quantification+of+GFRalpha-2+alternatively+spliced+isoforms+in+murine+brain+and+peripheral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Mol+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Real time PCR quantification of GFRalpha-2 alternatively spliced isoforms in murine brain and peripheral tissues.</a> Brain Res Mol Brain Res. 114 (2), 146-153 (2003).</li>
<li>Turton, K. B., Annis, D. S., Rui, L., Esnault, S., Mosher, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratios+of+Four+STAT3+Splice+Variants+in+Human+Eosinophils+and+Diffuse+Large+B+Cell+Lymphoma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Ratios of Four STAT3 Splice Variants in Human Eosinophils and Diffuse Large B Cell Lymphoma Cells.</a> PloS One. 10 (5), e0127243(2015).</li>
<li>Maurer, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+binding+site+on+fibronectin+for+the+functional+upstream+domain+of+protein+F1+of+Streptococcus+pyogenes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Extended binding site on fibronectin for the functional upstream domain of protein F1 of Streptococcus pyogenes.</a> J Biol Chem. 285 (52), 41087-41099 (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Current+protocols+in+molecular+biology%22">Current protocols in molecular biology</a>. Ausubel, F. M., et al. , Greene Pub. Associates; J. Wiley. (1987).</li>
<li>Grant, S. G., Jessee, J., Bloom, F. R., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+plasmid+rescue+from+transgenic+mouse+DNAs+into+Escherichia+coli+methylation-restriction+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Differential plasmid rescue from transgenic mouse DNAs into Escherichia coli methylation-restriction mutants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (12), 4645-4649 (1990).</li>
<li>Kocsis, L., Herman, P., Eke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+modified+Beer-Lambert+law+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">The modified Beer-Lambert law revisited.</a> Phys Med Biol. 51 (5), N91-N98 (2006).</li>
<li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIQE+guidelines%3A+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
<li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29 (9), e45(2001).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22A-Z+of+quantitative+PCR%22">A-Z of quantitative PCR</a>. Bustin, S. A. , International University Line. (2004).</li>
<li>Zhang, H. F., Lai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+in+cancer-friend+or+foe%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">STAT3 in cancer-friend or foe.</a> Cancers (Basel). 6 (3), 1408-1440 (2014).</li>
<li>Caldenhoven, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3beta%2C+a+splice+variant+of+transcription+factor+STAT3%2C+is+a+dominant+negative+regulator+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">STAT3beta, a splice variant of transcription factor STAT3, is a dominant negative regulator of transcription.</a> J Biol Chem. 271 (22), 13221-13227 (1996).</li>
<li>Zammarchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumorigenic+potential+of+STAT3+alternative+splicing+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Antitumorigenic potential of STAT3 alternative splicing modulation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (43), 17779-17784 (2011).</li>
<li>Liu, Y., Beyer, A., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Dependency+of+Cellular+Protein+Levels+on+mRNA+Abundance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">On the Dependency of Cellular Protein Levels on mRNA Abundance.</a> Cell. 165 (3), 535-550 (2016).</li>
<li>Narimatsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+autoregulation+of+the+stat3+gene+and+its+role+in+interleukin-6-induced+survival+signals+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific autoregulation of the stat3 gene and its role in interleukin-6-induced survival signals in T cells.</a> Mol Cell Biol. 21 (19), 6615-6625 (2001).</li>
<li>Szafranski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+state+co-regulates+thousands+of+mammalian+mRNA+splicing+events+at+tandem+splice+sites+and+alternative+exons%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Physiological state co-regulates thousands of mammalian mRNA splicing events at tandem splice sites and alternative exons.</a> Nucleic Acids Res. 42 (14), 8895-8904 (2014).</li>
<li>Sundin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+STAT3+mutation+causing+hyper-IgE+syndrome%3A+studies+of+the+clinical+course+and+immunopathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Novel STAT3 mutation causing hyper-IgE syndrome: studies of the clinical course and immunopathology.</a> J Clin Immunol. 34 (4), 469-477 (2014).</li>
<li>Oltean, S., Bates, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+alternative+splicing+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of alternative splicing in cancer.</a> Oncogene. 33 (46), 5311-5318 (2014).</li>
<li>Boultwood, J., Dolatshad, H., Varanasi, S. S., Yip, B. H., Pellagatti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+splicing+factor+mutations+in+the+pathogenesis+of+the+myelodysplastic+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Biol+Regul%22%5BJournal%5D)">The role of splicing factor mutations in the pathogenesis of the myelodysplastic syndromes.</a> Adv Biol Regul. 54, 153-161 (2014).</li>
<li>Tilgner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+transcriptome+analysis+using+synthetic+long-read+sequencing+reveals+molecular+co-association+of+distant+splicing+events%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Comprehensive transcriptome analysis using synthetic long-read sequencing reveals molecular co-association of distant splicing events.</a> Nat Biotechnol. 33 (7), 736-742 (2015).</li>
<li>Hiller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+occurrence+of+alternative+splicing+at+NAGNAG+acceptors+contributes+to+proteome+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Widespread occurrence of alternative splicing at NAGNAG acceptors contributes to proteome plasticity.</a> Nat Genet. 36 (12), 1255-1257 (2004).</li>
<li>Rosenfeld, J. A., Malhotra, A. K., Lencz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+multi-nucleotide+polymorphisms+in+the+human+genome+characterized+by+whole+genome+and+exome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Novel multi-nucleotide polymorphisms in the human genome characterized by whole genome and exome sequencing.</a> Nucleic Acids Res. 38 (18), 6102-6111 (2010).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Biz eozinofiller ve lenfoma hücrelerinde düzeyleri ve STAT3 bağlantı varyantı transkript oranlarını değerlendirmek ve sitokin uyarı seviyeleri ve oranlarını etkileyip etkilemediğini öğrenmek için bu protokolü geliştirdi. STAT3 kanser bir onkoproteinin veya tümör baskılayıcı gibi davranan konusunda çelişkili raporlar ile, nedeniyle pleiotropik ve belirsiz işlevsellik özel ilgi (referans 33 gözden). STAT3 α ve β bağlantı varyantı fonksiyonu farklılıklar daha önce 34,35 karakterize olmuştu, ve bizim protokol S optimal oranı için bir ihtiyaç olduğunu açıkça göstermektedir bir knock-down / yeniden ifade analizini kolaylaştırdı ve ΔS 19 transkript. farklı ekleme varyantları doğru ölçümü varyant kompozisyon splice heterojen STAT3 fonksiyonu ile ilgili daha fazla soruşturma kolaylaştıracaktır. protokol ab yeteneğini birleştirerek, mutlak ve bağıl qPCR verileri entegreÇözünen qPCR bağlantı varyantı oranlarını hesaplamak için, ve göreli qPCR genel STAT3 ifade değişikliklerini ölçmek için. Bu yaklaşım bir 50&#39;den fazla nükleotid arayla iki alternatif bağlantı yerlerinde yapıştırma oranları sırayla ince farkları ayırt eder ve aynı anda ölçmek için sağlar. Bireysel ekleme olayların oranlarını belirleme ko-yapıştırma önyargı ΔSβ seviyeleri iki site kullanımları rastgele 25 spliced eğer beklenenden daha yüksek olacak şekilde varlığını dikkate değer bulgu elde olmazdı. Kritik olarak, plazmid kalibrasyon eğrileri kullanılarak Mutlak qPCR çok benzer dizileri neden bağlantı varyasyonları (optimal verimde) ölçümü sağlar. Biz yeni bir ince ekleme qPCR tahlil optimize etmek için yaklaşık iki ay sürer tahmin ediyoruz. Tahlil gelişiminde önemli adımlar mutlak qPCR için standart eğrileri üreten kullanılan STAT3 plazmid yaratılması; deneyselözgüllük ve tekrarlanabilirliği sağlamak için en uygun astar dizileri ve bisiklet parametrelerini belirlemek; ve bağıl qPCR veri entegrasyonu GAPDH ifade pan-STAT3 ifade göreli miktarının elde. Kümülatif ölçümü karşı STAT3 pan ile ölçülebilir kopya sayısının korelasyon (Sα + ΔSα + Sβ + ΔSβ) protokolü güvenilir sonuçlar ürettiğini göstermektedir. tekniğin uyarı geniş doğrulama işlemidir. Test içi değişkenlik (tekrarlanabilirlik), interassay değişkenliği (tekrarlanabilirlik) ve özgüllüğü değerlendirmek için gereklidir. protokol bu parametreler için sayısal çıkışları almak için yollar özetliyor. Biz, verimlilik özgünlüğü faktörü ≥4, varyasyon (tekrarlanabilirlik) katsayısı ≤10% ve Ct standart sapma (tekrarlanabilirlik) ≤0.2 olarak uygun eşik 30 ≥75% sayılır. STAT3 sekansı amino asitler 1-690 mutasyonlar veya silme discove olmayacakonlar ekleme oranlarını etkileyebilir, ancak bu protokol ile kırmızı. Transkript oranları oranları 36 proteoform orantılı olmayabilir. örnekler, toplam cDNA başlangıç ​​farklı miktarlarda beri mutlak qPCR kurulu bir ev bakıcısı geni kullanarak görece qPCR ile birlikte sürece arası Örnek karşılaştırma için bir örnek içinde, ek yeri varyantlarının kopya sayısını karşılaştırarak ancak için uygundur. Yöntem tekrarlanabilirliği 30 MIQE qPCR kurallarına uyan, tarif. PCR çevrim parametreleri ve primer konsantrasyonları diğer ekipman kullanıldığında tekrarlanabilir verileri elde etmek için modifiye edilmesi gerekebilir. Mükemmel özgüllük ölçüde ödün verim olmadan mümkün değildir, ancak hedef büyüklüğe arasında daha büyük dört ile daha etkili bir şekilde büyütülmüştür. Lineer DNA, daha kolay bir şekilde dairesel daha yükseltilir. Alternatif bir plazmid tatmin edici standart eğrileri vermezse (R2 &lt;; ) 0.95, miktarının öncesinde tek bir site kısıtlaması ile plazmid linnerleştirilmesi düşünün. QPCR Optimize kaliteli verileri (Şekil 1) elde etmek için çok önemlidir. En qPCR protokolleri iki aşamalı bisiklet güveniyor ve makineler buna göre optimize edilmiştir. Isıtma bloğunun düzgün olmayan ısıtma zayıf tekrarlanabilirlik katkıda üç adımlı bir bisiklet şiddetlenebilir. Tahliller ideal özel bir laminer akış kaputu, filtre pipet uçları ve ultra saf su ile steril şartlar altında kurulmalıdır. kirleticiler tutarsız sonuçlara yol açabilir, çünkü tahliller ideal özel bir laminer akış kaputu, filtre pipet uçları ve ultra saf su ile steril şartlar altında kurulmalıdır. QPCR optimizasyonu hakkında daha fazla bilgi için, Bustin ark bakın. 32 STAT3 nicel bağlamda bir dizi daha fazla fikir neden olabilir. STAT3 kendi ifadesini 37 otomatik düzenler ve yukarıda açıklanan protokol yardımcı olabilirSTAT3 ekleme varyantları oranları bu pozitif geri besleme döngüsü düzenleyen katkısı olup olmadığını aydınlatmak için. Protokol farklı yoğunluklarda 38 ya da gelişimi boyunca hücrelerinde görüldüğü gibi uç uca ekleme varyantı oranlarında vardiya çalışma için kullanılabilir: Bu bilinmektedir hematopoez 16 sırasında protein düzeyinde STAT3 α / β oranı değişir. Sundin ve ark. bulundu Eyüp&#39;ün sendromlu 39 hastanın STAT3 içinde ekson 12 bir intronik tek nükleotid polimorfizm önyargılı ekleme. Ekson 21 ve 22 ya da ekson 22 ve 23 arasında intronlar mevcut birçok SNP biri, sırasıyla ΔS / S ekleme oranları ve α / p katkıda bulunabilir düşünülebilir. Tahlil yapıştırma düzenlenmesinde mutasyonlar ya da değişiklikler yapıştırma işlemi 40 yanlılık olabilir kanserli hücrelerin içinde STAT3 transkript ölçmek için kullanılabilir. Ekleme faktörlerindeki mutasyonlarla (SF3B1 gibi) Gözlem olarakmiyelodisplastik sendromlarda 41 ed da bu protokol ile ölçülebilir değişikliklere yol açabilir. Daha geniş anlamda, bu yaklaşım özellikle klasik RNA Sek, ne de standart qPCR ile mümkün değildir yapıştırma co-dernek, algılar. dışlayan ekson yapıştırma fenomen yapıştırma kararlarının koordinasyonu gösterirken, diğer birleştirme olayların ortak dernek iyi araştırılmış değil. Tam boy cDNA sorguya şekilde RNA Seq değiştirildiği bir en son tarif edilen alternatif bir yöntem, uzak bağlama olaylan daha fazla ko-bağımlı önce 42 düşünülenden daha olduğunu düşündürmektedir. STAT3 bir donör tandem ekleme sitesi içerir. Alıcı tandem ekleme siteleri 43 daha sıktır ve özetlenen protokol esasları NAGNAG yapıştırma ve 200 nükleotid içindeki diğer yapıştırma olayların tesadüf tespiti için deneyler geliştirmek için bir başlangıç noktası olarak hizmet verebilir. diğer Potentansiyel uygulamaları indellerin veya çift / üçlü nükleotid polimorfizmlerinin 44 gibi diğer ince dizi farklılıkları, tesadüf ölçümü içerir.

Kısa menzilli alternatif alıcı veya donör siteleri birbirine yakın olan (tandem) alternatif ekleme, memeliler 1, omurgasızlar 2 ve bitkilerde 3 yaygındır. Memeli genlerinin% 20, alternatif ekleme bölgeleri birbirinden 2-12 nükleotidleri 4 içeren olduğu tahmin edilmektedir. Bu sitelerin çoğu 3 nükleotid arayla ve tek bir kodon dahil veya hariç sonuçlanabilir. Diğerleri doku özgüllüğü 8 dayalı düzenleme sonucuna ise yapıştırma motifi farklılıkları, seçim stokastik 7 böylece ince olan savundular bu sitelerde 5,6 de yapıştırma düzenlemenin doğası hakkında tartışmalar vardır. Tandem bağlantı yeri seçimi modifiye kılcal elektroforez 7 ve yüksek çözünürlüklü jel elektroforez 8 kullanarak yarı kantitatif analiz edilmiştir. RNA devamı (RNA dizi), her bir ek yeri de ekleme oranları ölçmek için kullanılabilir okurbir site. Bu şekilde, RNA-Seq verileri ikili bağlantı bölgeleri 9 düzenlenmesi hakkında fikir sağlamıştır. Ayrıca nükleotid motifi 10 dayanarak beklenen bağlantı varyantı oranlarının tahmin sağladı. içeren ya da tek bir kodon (N herhangi nükleotid =) NAGNAGs olarak bilinen daha sık görülen tandem alıcı ekleme bölgeleri, üzerinde olmuştur dışlayan yapıştırma vurgu çoğu. (E pirimidin = GYNGYN tanıma motifi, dahil) veya tek bir kodon hariç Tandem donör alternatif ekleme siteleri tandem alıcıları daha az yaygındır. Sinyal ileticisi ve 3 (STAT3) aktivatörü ikili verici alternatif bağlantı 1,11 geçiren temel genidir. Tandem donör ekleme siteleri ekzon 21 ve 22 katılmak ve serin-701 (S veya ΔS sırasıyla) 1,11 için kodonu dahil veya hariç sonuçlanabilir. (40 nükleotid birbirinden) aşağı akış alternatif alıcı siteleri katılmadan ekzon 22 veTransaktivasyon domenini (α) ya da 7 eşsiz C-terminal kalıntılarla (β) 11 olan bir tepe bölümü kesik transaktivasyon alanına 55 terminal kalıntılarını da dahil edilmesi de 23a / b sonucu. Bu nedenle, dört ekleme varyantları mümkündür. STAT3 protein sayıda hücre tipleri 12 bir transkripsiyon faktörü ve büyük sinyal entegratörü ve mutasyona zaman onun kurucu aktivasyon (referans 13 gözden) birçok kanser fenotipleri katkıda bulunur. Eyüp Sendromu, IgE yüksek düzeyde ile karakterize bir immün yetmezlik bozukluğu, ayrıca STAT3 mutasyonlar neden olur (referans 14 gözden). STAT3 a ve β bağlantı varyantı proteinler için ayrı roller önce yapılmış 15 tarif var. Başlangıçta, STAT3 β STAT3 a en transkripsiyonel aktivitesini antagonize, dominant-negatif bir şekilde 16 hareket düşünülen, ancak sonraki iş bağımsız hedef genleri 17 sahiptir öne sürüldü </s&gt; Yukarı. tandem yapıştırma incelik rağmen, yokluğunu ya da serin-701 (Ser701) etkiler fonksiyonun varlığını inanmak için bir neden yoktur. Sadece Ser701 tirozin 705 için (STAT3 aktivasyon 18 fosforile kalıntı) yakın olmakla birlikte, yeni bir çalışma STAT3 S ve ΔS ekleme varyantları STAT3 bağımlısı Diffüz Büyük B Hücreli Lenfoma (DLBLCL) canlılığı hem gerekli olduğunu göstermektedir hücreler 19. Biyolojik önemi keşfedilmeyi beklemektedir. bağlantı varyantı kompozisyon fonksiyonunu etkileyebilir göz önüne alındığında, biz oranın eozinofil sitokin uyarımı ile tedirgin olup olmadığını keşfetmek için çaba gösterdi. Başlangıçta S ek yeri varyantları, Afel spesifik enzim kısıtlama ürünlerin ayrılması ve ardından STAT3 a ve β varyantlar için PCR spesifik kullanarak, iki bağlayıcı olayları arasındaki bağlantıyı keşfetmek için çalışmıştır. Ser701 R olduğu ürünleri dansitometrisi dahil belirtilmedikçeğı ile on kat daha sık STAT3 a ve p hem de onun ihmal (ΔS) daha (veriler gösterilmemiştir). Bununla birlikte, bu yarı-kantitatif bir yaklaşım yeterli tekrarlanabilir olmadığını ve dört bağlantı aynı zamanda varyantları ölçmek için etkili bir şekilde kullanılabilir olabilir. dört adet ek varyantı, her oranlarını analiz etmek için, sıkı teknik (belirli bir numunenin, pek çok tayinde) vermiştir kantitatif PCR (qPCR) protokolünü kurmak için gerekli çoğaltır. Bağıl qPCR belli bir seviyede 20 eksprese olduğu bilinen standart bir ya da ev bakıcısı geni için ilgi konusu bir genin karşılaştırılmasına dayanır ve ilgi ve temizlik genin gen benzer bir verim ile amplifiye edilir, uygun bir. Bir çift sarmallı (ds) DNA bağlayıcı flüoresan (siyanin) boyası PCR amplikonlarının 21 bağlanır ve belirli bir döngü sayısı sonra yeterli bir amplifikasyon tespit için flüoresan için oluştu. yüksek başlangıç ​​seviyesitranskript, alt eşik döngüsü (Ct) değeri. CDNA preparatlar konsantrasyonu farklı olduğundan, bir eozinofil 22 glukuronidaz-β (GUSB) gibi tüm örneklerde tutarlı düzeyde ifade edildiği bilinen bir transkript, konsantrasyonuyla Konuşma metninin konsantrasyon karşılaştırma gerekmektedir. Bağıl qPCR ikili uc uca eklendiği birleşme yeri varyantları görüldüğü gibi, yüksek oranda benzer diziler için uygun değildir. özellikle ekleme varyantları yükseltmek için gerekli olan katı koşullar düşük verimlilik ile sonuçlanmaktadır. Bunun yerine, mutlak miktar 23 kullanılmalıdır. Bu ilgi eklenmiş transkriptin bilinen konsantrasyonları ile bir standart eğri hazırlamak gerektirir ve sağlanması PCR koşulları özgüllük 24 optimize eder. tarif edildiği gibi, özel bir gen için mutlak ve göreli qPCR veriler, belirli bir hücre türü genin ekspresyonunun ortaya koyması birleştirilebilirdeğişik uyarılan eozinofil 25 bu durumda STAT3. Burada STAT3 ekleme varyantı ölçümü yöntemi diğer tandem yapıştırma etkinlikleri hedeflenen çalışmalara adapte edilebilir beklentisi ile tarif edilir. Optimizasyon çeşitli konsantrasyonlarda ve bisiklet parametreleri çok sayıda tekrarlamalar birkaç primer çiftleri birkaç ay boyunca test edilmiştir uzun bir süreçtir, oldu. protokolün temel özellikleri ekleme varyantları bilinen konsantrasyonları ile standart eğrileri dayalı astar özgüllük doğrulama ve miktar vardır. birlikte göreli qPCR bizim uygulama için yararlı oldu ama gerekli değildir.

<table><tbody><tr><td>MJ Research PTC-200 Termal Döngüleyici</td><td>GMI</td><td>N/A</td><td>Standart PCR</td></tr><tr><td>7500 Gerçek Zamanlı PCR Sistemi</td> için kullanılır <td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>N/A</td><td>qPCR makinesi</td></tr><tr><td>GS-6R</td><td>Beckman Coulter</td><td>96 kuyulu plakalar için</td>N<td>/A</td> santrifüj</tr><tr><td>Nanodrop 2000 sprectrofotometre</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 orta</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8758</td><td>hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>PfuTurbo DNA Polimeraz</td><td>Agilent Technologies</td><td>600410</td><td>standart PCR için DNA polimeraz</td></tr><tr><td>KpnI</td><td>New England Biosciences</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>NheI</td><td>New England Biosciences</td><td>R0131S</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Yeşil PCR Master Karışımı</td><td>Qiagen</td><td>330523</td><td>qPCR, DNA polimeraz/dsDNA bağlayıcı boya karışımı</td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>RNA ekstraksiyon kiti</td></tr><tr><td>SuperScript III Birinci İplikli Sentez Sistemi</td><td>Invitrogen (ThermoFisher Scientific)</td><td>18080-044</td><td>cDNA sentez kiti</td></tr><tr><td>Primerler</td><td>Entegre DNA Teknolojisi</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 1.1</td><td>New England Biosciences</td><td>B7201S</td><td></td></tr><tr><td>GenePure LE Agaroz</td><td>ISC BioExpress</td><td>E-3120-500</td><td>TAE jelinin bileşeni</td></tr><tr><td>Pipetleyiciler</td><td>Başlıca laboratuvar tedarikçileri (MLS)</td><td>N/A Filtre</td><td></td></tr><tr><td>pipet uçları</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT10XL, BT20, BT200</td><td></td></tr><tr><td>EU Tek Parça İnce Duvar Plakası</td><td>MidSci</td><td>ABI7501</td><td></td></tr><tr><td>ThermalSeal A Sızdırmazlık Filmi</td><td>MidSci</td><td>TSA-100</td><td>96 kuyulu plaka contası</td></tr><tr><td>pET-Elmer (pET-28a varyantı)</td> <td>Novagen; Mosher laboratuvarında modifiye</td><td>edildi N/A</td><td>PMID'deki ayrıntılar: 20947497</td></tr><tr><td>Wizard Plus SV Minipreps DNA saflaştırma sistemi</td><td>Promega</td><td>A1460</td><td>Plazmid saflaştırma</td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 Döngü Sıralama Kiti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4337455</td><td>Sıralama kiti</td></tr><tr><td>QIAEX II Jel Ekstraksiyon kiti</td><td>Qiagen</td><td>20021</td><td>Amplikon saflaştırma</td></tr><tr><td>DH5 ve alfa; yetkili hücreler</td><td>ThermoFisher Bilimsel</td><td>18265-017</td><td>çeşitli sağlayıcılardan temin edilebilir, bakınız PMID: 2162051</td></tr><tr><td>kanamisin</td><td>Research Products International Corp.</td><td>K22000-5.0</td><td></td></tr><tr><td>Tris bazlı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td>TAE tamponunun</td></tr><tr><td>bileşeni Asetik asit, buzul</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A38C-212</td><td>TAE tamponunun bileşeni</td></tr><tr><td>EDTA (Etilendiamintetraasetik asit)</td> <td>Sigma Chemical Company (Sigma Aldrich)</td> <td>TAE tamponunun</td> <td>E-5134</td> bileşeni</tr><tr><td>Bacto Tripton</td><td>BD Biosciences</td><td>211705</td><td>Luria Et Suyu</td></tr><tr><td>Bacto Maya ekstraktının bileşeni, teknik</td><td>BD Biosciences</td><td>288620</td><td>Luria Et Suyu</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>bileşeni ThermoFisher</td><td>Scientific S271-10</td><td>Luria Et Suyu</td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>bileşeni ThermoFisher Scientific</td><td>SS255-1</td><td>Luria Et Suyu</td></tr><tr><td>bileşeni Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td>Luria bileşeni Et suyu plakası</td></tr><tr><td>Lasergene SeqBuilder</td><td>DNASTAR</td><td></td><td>Şekil 1, Lasergene SeqBuilder yazılım sürümü 12.2.0 (DNASTAR) kullanılarak oluşturulmuştur</td></tr></tbody></table>

mutlak ve bağıl kantitatif pcr veri birleştirme stat3 splice varyant dökümünü belirlememize

Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

İnsan sinyal dönüştürücüsü ve transkripsiyon 3 aktivatörü (STAT3), tandem ekleme bölgesi içeren birçok genden biridir. 3 nükleotid aralıklı alternatif donör ekleme bölgeleri, tek bir kalıntı olan Serine-701'in dahil edilmesine (S) veya dışlanmasına (ΔS) neden olur. Daha aşağı akışta, bir çift alternatif alıcı ekleme bölgesinde ekleme, transaktivasyon alanının (α) 55 terminal kalıntısını veya 7 benzersiz kalıntıya (β) sahip kesilmiş bir transaktivasyon alanını kodlayan transkriptlerle sonuçlanır. Bu yazıda ana hatlarıyla belirtildiği gibi, STAT3'ün dört eklenmiş transkriptinin (Sα, Sβ, ΔSα ve ΔSβ) oranlarının ölçülmesi, mutlak qPCR (kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu) kullanılarak mümkün olmuştur. Bu nedenle protokol, son derece benzer ek varyantlarını ayırt eder ve ölçer. Mutlak qPCR, kalibratör plazmitlerini kullanır ve bu nedenle verimlilik uğruna tespitin özgüllüğünden ödün verilmez. Protokol, primer doğrulamasını ve döngü parametrelerinin optimizasyonunu gerektirir. Mutlak qPCR ve toplam STAT3 transkriptlerinin etkinliğe bağlı bağıl qPCR'sinin bir kombinasyonu, sitokinlerle tedavi edilen eozinofillerdeki STAT3 ek varyantlarının seviyelerinin dalgalanmalarının bir tanımına izin verdi. Protokol ayrıca, iki STAT3 birleştirme olayı arasında bir ortak birleştirme karşılıklı bağımlılığına dair kanıt sağladı. İki qPCR tekniğinin bir kombinasyonuna dayanan strateji, diğer tandem birleştirme bölgelerinde birlikte uçbirleştirmenin araştırılmasına kolayca uyarlanabilir olmalıdır.

Kaliteli qPCR veri bisiklet boyunca transkript üstel artış gösteren, bir sigmoidal amplifikasyon arsa (Şekil 2a) üretecektir. Çok fazla şablonun bulunması uygun olmayan bir başlangıç ​​ilk birkaç döngü kurulmuştur, yani yüksek bir floresan arka plan neden olabilir. Veri üstel eğri (Şekil 2b) vermezseniz, başka optimizasyonu (adımlarda 3.1 ve 3.4 özetlenen) gereklidir. Giderme qPCR sonuçları hakkında daha fazla bilgi için, 32 başvuru bakın. Şablon kalibratör plasmidler için oluşturulan standart eğrilerle amplifikasyonu (STAT3 Sα için eğrinin Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi) etkinliğini gösterir. 83 ve% 95 arasında verimler tarif edilen koşullar altında gözlendi. Özgüllük (3.4 Adım) denklemi eşit olası 25&#39;tir verimliliği, yani özgüllüğü varsayarözgüllük faktörü göstermektedir daha büyük olması muhtemeldir. STAT3 seviyelerinin congruency değerlendirmek için, dört adet ek varyantı, her mutlak değerleri, toplam STAT3 tüm dört adet ek varyantı ortak bir bölge amplifiye ikinci primerler kullanılarak (Şekil 4) seviyesinde hem de ölçüldü. İdeal lineer regresyon (korelasyon göstergesi) ve eğim (özetlenebilir ekleme varyantları pan STAT3 oranı) her ikisi de 1&#39;e yakın olmalıdır. Mutlak qPCR veri pasta grafikler zamanla sitokinler (Şekil 5a) post-stimülasyon dört ekleme varyantları oranlarını göstermek için sunulmuştur. Bu varyant her zaman en bol olmasına rağmen istirahat eozinofiller (0 saat), STAT3 Sα küçük oranda vardı. STAT3 β ekleme varyantları fraksiyonu (çarparak S ^6; STAT3 ΔS ek varyantlarının fraksiyonu tarafından + ΔSβ) (ΔSα + ΔSβ) sürekli ΔSβ deneysel kaydedilmiş değerinden daha düşük bir değer vermiştir. yapıştırma olayları bağımsız olsaydı, bir ΔS kısmını çarparak deneysel belirlenmiş değer ile kabul bir değer verecek β türevleri fraksiyonu tarafından varyantları beklenebilir. Bağımsız ekleme olaylardan beklenenden daha ΔSβ yüksek seviyeleri eş-yapıştırma önyargı var göstermektedir. Mutlak ve göreli qPCR veri birleştirme Tüm STAT3 ekleme varyantları Seviyeleri 6 saat sonrası uyarımı zirve ile sitokinler IL3 ve TNFa ile sonrası stimülasyon da artırılabilir (Şekil 5b - e). Dört ekleme varyantları için üç, transkript seviyeleri medyada eozinofil kıyasla IL3 + TNFa tedavi eozinofiller (6 saat) kabaca 3 kat daha yüksektirAynı zaman noktasında. STAT3 Sα seviyeleri bu zaman noktasında medyaya eozinofil kıyasla IL3 + TNFa tedavi eozinofil 3.5 kat daha yüksektir. Büyük belirsizlikler (ölçüm en büyük standart hatası), tüm örneklerde toplam STAT3 en küçük kısmını ihtiva ΔSβ (Şekil 5e) görülmüştür. Düşük düzeyde daha yüksek Ct değerleri ile bağlantılı olarak bu durum şaşırtıcı değildir. Daha fazla çevrimleri Gerektiren eşik döngüsü nedeniyle amplifikasyon verimliliğine çevrim-to-döngüsü varyasyona belirsizliği bileşik olacaktır ulaşmak için. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54473/54473fig1.jpg" /> Şekil 1:. STAT3 ek yeri varyantları ve pan-STAT3 özellikle STAT3 ek yeri varyantları (sırasıyla Sα, Sβ, ΔSα ve ΔSβ) her yükseltmek için kullanılan primerler şunlardır s qPCR gerçekleştirmek için kullanılan primer çiftleri şematikhown. İleri primerler (STAT3 &quot;S&quot; ve &quot;ΔS&quot;) ekson 21 ve 22 arasındaki kavşak yayılan <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54473/54473fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54473/54473fig2.jpg" /> Şekil 2:. QPCR veri amplifikasyon çizimini, (a) Sigmoidal amplifikasyon çizimini güvenilir bir amplifikasyon anlamına gelir. Bu veriler, 40 döngü (x-ekseni) boyunca yinelenen seyreltilmiş numunelerin floresan seviyeleri temsil renkli çizgiler, her çift, STAT3 Sα içeren plazmidin iki seri dilüsyonları qPCR elde edilmiştir. (Yeşil-gri) en konsantre numune yeterince (eşik floresan değerini aşan baseli için (y-ekseni üzerinde gösterilen floresan orantılı boya, dsDNA bağlayıcı ile) döngüsü 17 ile büyütüldüYeşil) okla gösterildiği gibi KD. Onun Ct değeri 17 (b) Non-üstel araziler background-floresan eşik doğru ilk birkaç döngüleri kurulmuş değildi öneririz olacaktır. Bu durum bir inhibitör ya da yüksek konsantre şablon veya primerlerin varlığı olabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54473/54473fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54473/54473fig3.jpg" /> Şekil 3: günlüğü Standart eğri Ct vs (STAT3 Sα kopya sayısı) her STAT3 ekleme değişkenin kopya sayısı ve eşik döngüsü (Ct) log arasında doğrusal bir ilişki vardır.. Örneklerin cDNA ve böylece plazmid DNA standart bir eğri taklit oluşturmaseyreltilmiş PCR amplikonlarının oluşturulan bir eğrinin daha iyi bir ölçüm sağlar. Sunulan veriler STAT3 Sα içeren plazmidin iki seri dilüsyonları qPCR elde edilen Ct değerleri vardır. Bu eğriden, her numunede kopya sayısı mevcut interpolasyon edilebilir ve amplifikasyon verimliliği (83.9%) hesaplandı. Y yakaladığını yamaç daha az tekrarlanabilir olmasına rağmen, önünü 42.2 devir hiçbir hedef DNA mevcut emin olmak için gerekli olacaktır göstermektedir. Hata çubukları SEM gösterir, n = 3 Karşılaştırılabilir eğrileri STAT3 Sβ, ΔSα ve ΔSβ (gösterilmemiştir) için inşa edildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54473/54473fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54473/54473fig4.jpg" /> Şekil 4: sayısallaştırılmış panolarında Karşılaştırılması <strong&gt; kümülatif STAT3 ekleme varyantları vs STAT3. eklenen STAT3 eklemenin regresyon eğimi (kümülatif için pan oranı) ve R 2 değeri 17 numuneler (eozinofiller ve DBBHL) 1. Değerler yakın (korelasyon) olmalıdır toplam STAT3 vs varyantları dahil. Hata çubukları, X-To-Y belirlemelerinin ortalama ± SEM&#39;i göstermektedir, n için ≥ 2. Referans 20 uyarlanmıştır Şekil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54473/54473fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54473/54473fig5.jpg" /> Şekil 5:. STAT3 uç uca ekleme varyantı seviyeleri sitokin tedavisi boyunca dalgalanma (a) her bir STAT3 ekleme varyantı yüzdelerini gösteren Pasta grafiklerIL3 ve TNFa ile tedavi sırasında eozinofillerinde. (B - E) göre ve mutlak qPCR değerlerin birleştirilmesiyle ölçülen sitokinler çeşitli kombinasyonları ile muamele eozinofillerde STAT3 ek yeri varyantları değişiklikler STAT3 Sα (b) Sβ (c) ΔSα (d) ve ΔSβ (e) seviyeleri. zaman sonrası uyarılması üzerine dalgalanma. Seviyeleri başlangıçta 6 saat sonrası stimülasyon zirve arttı. IL3 + TNFa kombinasyonu, tek başına IL3 daha dört STAT3 ekleme varyantları yüksek ifadesini ortaya çıkardı. SEM hata yayılması için muhasebe her veri noktası için hesaplanan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54473/54473fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="tablo 1" src="/files/ftp_upload/54473/54473tbl1.jpg" /> Tablo 1:<html> Amplifikasyonu (a), mutlak (b) ve görece (c), niceliksel PCR için kullanılan primerler. Klonlama primerleri kısıtlama dizileri ve verimli kesim için 5&#39;-uzantıları vardır. Kpnl ve Nhel kısıtlama siteleri kalın olarak gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54473/54473tbl1large.jpg" target="_blank">Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Tablo 2" src="/files/ftp_upload/54473/54473tbl2.jpg" /> Tablo 2. PCR bisiklet parametreleri (solda) ve büyütme için reaktif hacimleri (sağ) (a), bağıl (b), mutlak (c) kantitatif PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54473/54473tbl2large.jpg" target="_blank">Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <html> 3 / 54473tbl3.jpg &quot;/&gt; Tablo 3:. Mutlak qPCR plazmid kalibrasyon deneyi için şablon Bu deney, tekrarlanabilirlik ve verimlilik, hem de veri sokmak için standart eğrileri oluşturmak değerlendirilmesi gereklidir. &quot;Hedef dışı&quot; karışımlar özgüllük bir tahmin verecektir. Optimizasyon tutarlılığı sağlamak için gerekli olabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54473/54473tbl3large.jpg" target="_blank">Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Tablo 4" src="/files/ftp_upload/54473/54473tbl4.jpg" /> Tablo 4:. Göreli qPCR (pan-STAT3 ve temizlik gen GUSB) Kalibrasyon deneyi için Şablon mutlak qPCR aksine, bu testin noktası büyütme verimi ~% 100 olduğundaki koşullarını belirlemektir.tp_upload / 54473 / 54473tbl4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Tablo 5" src="/files/ftp_upload/54473/54473tbl5.jpg" /> Tablo 5:.. Pan STAT3 ve temizlik gen GUSB ölçmek için göreceli qPCR örnek testi için Şablon standart eğriler testlerin karşılaştırılabilir verimliliği sağlamak için örnekleri ile birlikte tekrarlanan <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54473/54473tbl5large.jpg" target="_blank">bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Tablo 6" src="/files/ftp_upload/54473/54473tbl6.jpg" /> Tablo 6: varyantları ölçmek için mutlak qPCR Örnek deneyi için şablon standart eğriler benzer eff sağlamak için numune ile birlikte tekrar edilir.<html> tahlillerin nasıl etkin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54473/54473tbl6large.jpg" target="_blank">Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Tablo 7" src="/files/ftp_upload/54473/54473tbl7.jpg" /> Tablo 7:.. ΔS varyantları ölçmek için mutlak qPCR örnek testi için Şablon standart eğriler testlerin karşılaştırılabilir verimliliği sağlamak için örnekleri ile birlikte tekrarlanan <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54473/54473tbl7large.jpg" target="_blank">bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Tablo 8" src="/files/ftp_upload/54473/54473tbl8.jpg" /> Tablo 8: pan-STAT3 ölçmek için mutlak qPCR örnek testi için Şablon.large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tandem birleştirme olayları, birbirinden 12 nükleotidden daha az uzaklıkta meydana gelir. Bu tür ek varyantlarının oranlarının niceliksel olarak belirlenmesi, mutlak bir kantitatif PCR yaklaşımı kullanılarak mümkündür. Bu el yazması, iki birleştirme olayının Serine-701 dahil etme/dışlama ve α/β C-uçları ile sonuçlandığı STAT3 geninin ek varyantlarının nasıl ölçülebileceğini açıklamaktadır.

Mutlak ve Bağıl Kantitatif PCR Veri birleştirme STAT3 Splice Varyant Dökümünü belirlememize

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

Bu protokolün genel amacı, eozinofillerdeki STAT3 splice varyant transkriptlerinin oranlarını ve mutlak seviyelerini belirlemektir. Bu yöntem, distal splicing olaylarının eş-ilişkilenmesi ve tandem splicing oranlarının farklılaşmasına neden olabilen koşulların tanımlanması gibi splicing regülasyonu alanındaki temel sorulara yanıt verebilir. Bu tekniğin temel avantajı, mutlak ve göreceli qPCR verilerinin elde edilmesini sağlayan plazmid standartları sayesinde dört STAT3 transkriptinin oranlarını ve genel seviyelerini belirleyebilmemizdir.Bizim durumumuzda, eozinofiller sitokinlerle stimüle edildiğinde dört STAT3 varyantı olan S alfa, S beta, delta S alfa ve delta S beta'nın nasıl değiştiğini öğrenmek istiyoruz. Bu yöntem, eozinofil STAT3 kompozisyonu hakkında bilgi sağlayabilse de, cDNA'sı elde edilebilen diğer hücre tiplerine de uygulanabilir. S ve delta S yalnızca üç nükleotid ile farklılık gösterdiğinden, her bir varyant için standartlarda özgünlük sağlamak amacıyla verimlilikten ödün vermek zorunda kaldık.Bu protokolde, insan eozinofillerinden hazırlanan cDNA, STAT3 splice varyantlarının amplifikasyonu için kalıp olarak kullanılır. Metin protokolünde açıklandığı şekilde plazmidler oluşturulduktan sonra, birkaç koloniden alınan plazmidlerin dizilemesi için dizileme reaksiyonlarını hazırlayın. Her 20 µL'lik reaksiyon; üç µL dizileme reaksiyon tamponu, iki µL dizileme reaksiyon karışımı, 12 µL ultrapure su, bir µL plazmid ve iki µL dizileme primeri içermelidir.Sekanslama sonuçları elde edildiğinde, her bir varyantı kodlayan plazmidlerin (S alfa, S beta, delta S alfa ve delta S beta) elektroforetogramlarını değerlendirin. Saf plazmid DNA konsantrasyonunu nanogram/mikrolitre cinsinden ölçün ve mikrolitre başına kopya sayısını hesaplayın. Bu prosedüre, ultrapure su kullanarak STAT3 plazmidlerinin 1/10'luk bir dilüsyon serisini hazırlayarak başlayın.Mikrolitre başına yaklaşık 10⁸ ile 10³ kopya arasında. En konsantre örneğin konsantrasyonunu ölçün. Her bir splicing varyantı için mikrolitre başına 10⁶ kopya olacak şekilde dört adet hedef dışı karışımı negatif kontrol olarak hazırlamak için seyreltilmiş plazmitleri kullanın.Dördü de mikrolitre başına 10⁶ kopya konsantrasyonda olan tüm kalıpların eşit konsantrasyonlarda bulunduğu bir hedef karışımı hazırlayın. Her bir ekleme varyantı için, örnekteki son konsantrasyon 560 nM olacak şekilde, her biri 7 µM konsantrasyonda 60 µL primerlerden oluşan primer çifti çözeltileri hazırlayın. DNA polimerazı ve çift zincirli DNA bağlayıcı boya karışımını saf su ile 7:5 oranında seyreltin.Analizi, bu şablona uygun olarak 96 kuyucuklu bir PCR plakasına kurun. İlk olarak her kuyucuğa 21 µL seyreltilmiş DNA polimeraz, çift zincirli DNA bağlayıcı boya karışımı ekleyin. Ardından iki µL primer karışımı ve iki µL kalıp ekleyin.Her bir kalıp içermeyen kontrol kuyucuğuna, kalıp yerine iki µL filtrelenmiş su ekleyin. Tekrarlanabilirliği değerlendirmek için reaksiyonları çift örnekler halinde hazırlayın. qPCR plakasını yapışkan bir kapakla kapatın ve 12 °C'de, 1.200 g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.qPCR cihazını açın ve kapatılmış qPCR plağını yerleştirin. ABI gerçek zamanlı PCR sistemi kullanılıyorsa, deneyi gösterildiği şekilde kurun. Dosya (File), Yeni (New), İleri (Next) seçeneklerine tıklayın, yeni Detektör (Detector) seçeneğini belirleyin, ardından bir isim vererek bir Raporlayıcı (Reporter) ve bir Söndürücü (Quencher) seçin.Her bir ekleme varyantı için yeni bir dedektör kurun. İleri seçeneğini belirleyin ve Örnek Plakası Kurulumu sayfasında yönlendirildiği şekilde, miktarların tabloya girildiğinden ve uygun dedektörlerin seçildiğinden emin olarak standartları ayarlayın. Bitir'e tıklayın.Uygun PCR döngü programını ayarlayın. Eşik döngü değerlerini belirlemek için yapılan floresan okumasının, her döngünün 72 °C basamağı sırasında gerçekleştiğinden emin olun. Run seçeneğini belirleyin.Çalışma tamamlandığında Sonuçlar sekmesine ve ardından Amplifikasyon Grafiği sekmesine tıklayın. Veri kalitesini değerlendirmek için Çıktı Amplifikasyon grafiğini inceleyin. Eksponansiyel bir grafik, güvenilir amplifikasyona işaret eder.Sonuçları bir hesap tablosu yazılımına aktarın. Tekrarlanabilirlik adına assay'in daha fazla optimizasyona ihtiyaç duyup duymadığını anlamak için, verilerin metin protokolünde açıklandığı şekilde analiz edilmesi kritiktir. Bu assay için cDNA, transkripsiyonu teşvik etmek amacıyla sitokinlerle işleme tabi tutulmuş eozinofillerden hazırlanır.İki örnek cDNA alikotunun 1'den 1/1.024'e kadar bir dilüsyon aralığında seri dilüsyonlarını hazırlayın. Analizi, primer spesifikliğini analiz etmek için gösterildiği gibi, pan STAT3 ve bir housekeeping geni olan GUSB için çeşitli primer konsantrasyonları kullanarak 25 µL reaksiyonlar içeren 96 kuyucuklu bir plakada kurun. Bir şablon bu tabloda gösterilmiştir.Mühürlenmiş PCR plakasını qPCR cihazına yerleştirin. Yazılımı kullanarak deneyi kurun, GUSB için yeni bir dedektör ekleyin ve uygun PCR döngü programını seçin. Ardından, sonuçlar metin protokolünde açıklandığı şekilde her örnek için eşik döngü değerini hesaplamak amacıyla kullanılır.Bu prosedüre başlamak için, housekeeping gen GUSB için relatif qPCR'da elde edilen eşik döngü (threshold cycle) değerlerini karşılaştırın ve tüm konsantrasyonların aynı büyüklük mertebesinde olduğundan emin olmak için cDNA'yı ultrapure su ile uygun şekilde seyreltin. Örneklerin absolut qPCR analizlerini 96 kuyucuklu plakalara hazırlayın. S alfa ve S beta için bu şablonu, delta S alfa ve delta S beta için ise bu şablonu takip edin.Analizleri daha önce gösterildiği şekilde gerçekleştirin ve analizleri en az bir kez tekrarlayın. Ardından, 400 µM konsantrasyonda pan STAT3 primerleri ve bu şablona uygun olarak dört plazmidin tamamından oluşan bir karışım veya tek bir plazmid kullanarak, 25 µL'lik reaksiyonlar içeren mutlak bir qPCR 96 kuyucuklu plaka hazırlayın. qPCR plakasını yapışkanlı bir kapakla kapatın ve 12 °C'de 1.200 g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.Mühürlenmiş PCR plakasını qPCR cihazına yerleştirin ve pan STAT3 için yeni bir dedektör ekleyerek deneyi daha önce gösterildiği gibi kurun. Relatif qPCR için kullanılan döngü parametrelerinin aynısını ayarlayın. Deneyi en az bir kez tekrarladıktan sonra sonuçları metin protokolünde açıklandığı şekilde analiz edin.Kaliteli qPCR verileri, döngüler boyunca transkriptlerdeki eksponansiyel artışı belirten sigmoidal bir amplifikasyon grafiği oluşturacaktır. Bu veriler, STAT3 S alpha içeren plazmidin iki seri dilüsyonunun qPCR'ından elde edilmiştir. Her renkli çizgi çifti, 40 döngü boyunca tekrarlanan dilüye edilmiş örneklerin floresans seviyelerini temsil etmektedir.Şablon kalibratör plazmidler için oluşturulan standart eğriler, amplifikasyon verimliliğini gösterecektir. STAT3 S alfa için hazırlanan bu eğride amplifikasyon verimliliği %83,9 olarak bulunmuştur. STAT3 seviyelerinin tutarlılığını değerlendirmek amacıyla, toplam STAT3 seviyesinin yanı sıra dört splicing varyantının her birinin mutlak değerleri ölçülmüştür. İdeal olarak, hem doğrusal regresyon hem de eğim bire yakın olmalıdır.Mutlak qPCR verileri, sitokin tedavisi boyunca dört STAT3 splice varyantının oranlarını göstermek amacıyla pasta grafikleri şeklinde sunulmuştur. Mutlak ve göreceli qPCR verilerinin birleştirilmesi, tüm STAT3 splice varyant seviyelerinin IL3 ve TNF alfa sitokinleri ile stimülasyon sonrası arttığını ve seviyelerin altı saatte zirveye ulaştığını göstermiştir. Tüm zaman noktalarından elde edilen verilerin havuzlanması, beta ve delta S splicing olaylarının ko-asosyasyonuna yönelik küçük ancak anlamlı bir eğilim olduğunu ortaya koymuştur.Optimize edildikten sonra, bu tekniğe dayalı analizler, uygun şekilde gerçekleştirildiğinde dört saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, kontaminasyonu önlemek için steril koşullar altında çalışmaya özen göstermek önemlidir. Bir kodonu dahil eden veya hariç tutan ekleme (splicing) kararları, çerçeve içi (in-frame) ekleme varyasyonlarının %20'sini oluşturur.Protokolümüz, bu tür varyasyonların kantifikasyonuna kolayca uyarlanabilir olmalıdır. Geliştirilmesinin ardından bu teknik; Mao Zhang'in, ABC lenfoma hücrelerinde STAT3 varyantlarının knockdown re-ekspresyon deneylerini kontrol etmek amacıyla benim grubumla birlikte Li-Shan Rue'nin grubunda çalışmasına olanak sağlamıştır. Bu deneyler, kültürde hücre sağkalımı için S ve delta S varyantlarının bir karışımının gerekli olduğunu göstermiştir.Bu videoyu izledikten sonra, mutlak ve göreceli qPCR'ın nasıl gerçekleştirileceği ve hafif ekleme (splicing) farklılıklarını ayırt etmek ve nicelleştirmek için uygun koşullar hakkında iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

merging-absolute-relative-quantitative-pcr-data-to-quantify-stat3

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Alternatif ekleme düzenlemesinin, çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçlerde önemli bir hücresel program olan epitelyal-mezenkimal geçişe (EMT) katkıda bulunduğu gösterilmiştir. Burada, EMT sırasında alternatif eklemenin tespiti için indüklenebilir bir EMT modeli kullanan bir yöntemi açıklıyoruz.

Epitel-Mezenkimal Geçiş sırasında alternatif birleştirme Algılama

Burada katı tümörler ve hematolojik malignitelerde ilaç direnci üzerinde anormal yapıştırma etkisini araştıran amaçlayan bir protokol açıklar. Bu hedefe, biz RNA seq ile ebeveyn ve in vitro dirençli modellerin transkriptomik profillerini analiz ve aday genler doğrulamak için bir QRT-PCR tabanlı bir yöntem kurdu.

İlaç Direnci İlgili Roman Splice türevlerini algılamak için RNA sıralamayı kullanarak<em&gt; İn Vitro</em&gt; Kanser Modelleri

Tek memeli hücrelerini sıralamak ve her hücrede ilgilenilen 96'ya kadar hedef genin ekspresyonunu ölçmek için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, mutlak transkript sayılarının tahminini sağlamak için dahili qPCR standartlarının kullanılmasını içerir.

İç Standartları FACS ve qPCR kullanma Tek hücreli Gen İfadesi Profil

Kısa antianlamlı oligonucleotides fare beyin bölümlerde alternatif pre-mRNA yapıştırma desenleri algılamak için kullandığı bir in situ hibridizasyon (ISH) protokolü tanımlanır.

Kantitatif analiz alternatif Pre-mRNA RNA In Situ hibridizasyon tahlil kullanarak fare beyin bölümlerde Uçbirleştirme

Bu makalede, tek veya toplu C. elegans örneklerinde gen ekspresyon seviyelerinin hızlı ve güvenilir bir şekilde belirlenmesi için yüksek aktarım hızı protokolü açıklanmıştır. Bu protokol RNA yalıtımı gerektirmez ve doğrudan örneklerden cDNA üretir. Yüksek verimli çok katlı nanoakışkan gerçek zamanlı qPCR platformları ile birlikte kullanılabilir.

Nanoakışkan Teknoloji Kullanarak Tek ve Toplu C. elegans Örneklerinde Yüksek Verimli Nicel RT-PCR

Bu protokol, kemoterapötik tedaviden sonra alternatif birleştirme regülasyonunda karakteristik olmayan işleve sahip bir proteinin rolünü değerlendirmek için hızlı ve kullanışlı bir araç sunar.

mRNA Birleştirme Değişikliklerini incelemek için E1A Minigene Aracını Kullanma

Alternatif ekleme (AS) ve alternatif poliadenilasyon (APA), transkript izoformlarının ve ürünlerinin çeşitliliğini genişletir. Burada, deneysel koşullar arasında değişen AS ve APA'yı tespit etmek ve görselleştirmek için toplu RNA-seq ve 3' uç dizileme testlerini analiz etmek için biyoinformatik protokolleri açıklıyoruz.

RNA-seq Verilerinde Alternatif Ekleme ve Poliadenilasyonun Tanımlanması

Bu protokol, 5'-splice bölgesi mutasyonlarının birleştirme üzerindeki etkisini izlemek için bir minigene muhabiri testini açıklar ve mutasyona bağlı birleştirme inhibisyonunun kurtarılması için bastırıcı U1 snRNA geliştirir. Muhabir ve bastırıcı U1 snRNA yapıları HeLa hücrelerinde ifade edilir ve birleştirme astar uzantısı veya RT-PCR ile analiz edilir.

Birleştirme Verimliliğini İzlemek için Muhabir Tabanlı Hücresel Test

Bu protokol, fare embriyonik kök hücrelerinde intergenik ve intragenik güçlendirici RNA'ların kararlılığını ve yarı ömrünü Aktinomisin D tedavisi, RT-qPCR ve doğrusal olmayan regresyon analiziyle nicel olarak ölçer. Konuma özgü normalleştirme stratejileri, eRNA bozunma dinamiklerini bağlama bağlı olarak doğru şekilde modellemek için dahil edilir.

Fare embriyonik kök hücrelerinde Enhancer RNA Stabilitesinin Optimize Edilebilir Nicel Değerlendirmesi

Bu protokol, yeni ortaya çıkan geliştirici transkriptleri ölçmek için kolaylaştırılmış bir hesaplama hattı sağlar. Kromatin erişilebilirliğini, kromatin özelliğini ve transkripsiyonel verileri entegre ederek, karmaşık intragenik bölgelerdeki güçlendirici aktivitenin doğru tespitine ve ipliğe özgü analizine olanak tanırken, kapsamlı biyoinformatik eğitimi olmayan araştırmacılar için de erişilebilir olmaya devam eder.

Fare Embriyonik Kök Hücrelerinde İntergenik/İntojenik Güçlendirici RNA Miktar Tayini için Hesaplamalı Bir Boru Hattı

Öğrenin, mutlak ve bağıl kantitatif PCR kullanarak eosinofillerde STAT3 splice varyantlarının oranlarını ve düzeylerini nasıl belirleyeceğinizi. Bu yöntem, gen düzenlemesi ve sitokin yanıtlarını anlamak için kritik bilgiler sunar.

Mutlak ve Bağıl Kantitatif PCR Veri birleştirme STAT3 Splice Varyant Dökümünü belirlememize

Daha fazla video keşfet