Name: Lökosit zenginleştirilmiş Kan Örneklerinde Halojenleyici Peroksidaz Faaliyet Hızlı ve Özgül Değerlendirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: Öğrenin küçük kan örneklerinden lökosit zenginleştirme ve halojenleyici peroksidaz aktivitesi değerlendirme yöntemini. Bu hızlı, ekonomik ve güvenilir teknik insan ve hayvan örneklerinde yeni inflamatuar belirteçlerin incelenmesine olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Alman Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı'nın (BMBF, 1315883) yanı sıra Sächsische Aufbaubank (SAB) projesi tarafından finanse edilen 100116526 Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu'nun (ERDF) bir fonundan sağlanan finansmanla mümkün olmuştur.

Bütün insan kan örnekleri sağlıklı gönüllülerden elde edildi ve uygulanan lökosit zenginleştirme protokolü Leipzig Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik komisyonu yönergeleri takip eder. sıçan kan deneyler, hayvan bakımı ve kullanımı ile ilgili Alman kurallarına göre, sorumlu yerel etik kurulu (Landesdirektion Sachsen, Referat 24) tarafından onaylanmıştır. 1. Deney Düzeneği NOT: kan örneklerinden eritrositlerin tükenmesi için hipotonik parçalama prosedürü zaman kritik bir işlem olduğundan, önceden protokolün bu kısmı için gerekli tüm donanım (örneğin, tamponlar) hazırlar. <ol><li> hipotonik liziz için bir 15 ml santrifüj tüpüne ve kan numune başına takip eden aminofenil floresein (APF) boyama için bir 1.5 ml örnek tüp etiketleyin. <ol><li> Lökosit zenginleştirme, steril koşullar altında yapılacak ise, akışı altında Bu etiketlenmesikutu. </li></ol></li><li> örnek başına 12 ml fosfat tamponlu salin (PBS, 10 mM) hazırlanır. lökositler, steril koşullar altında izole ya da edilip edilmeyeceğine bağlı olarak, ilgili steril hazır çözelti ile ya da damıtılmış su içinde PBS çözünen tabletler yoluyla PBS hazırlar. pH değeri kontrol ve gerekirse, 0.1 M HCI ve NaOH çözümler küçük miktarlarda kullanılarak pH 7.4&#39;e ayarlanır. <ol><li> yaklaşık 16 numune için yeterli steril olmayan bir tampon çözeltisi elde etmek üzere distile su, 200 ml (Malzeme Tablo) PBS tablet içinde çözülür. Eğer arzu edilirse, steril süzme ile bu çözüm sterilize edin. </li></ol></li><li> Ca ile desteklenmiş 1 ml Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS) 2+ numune başına hazırlayın. <ol><li> 100 ml HBSS tuzu (nihai hacim), iki kez damıtılmış su ile 970 mg eritin. Nihai hacme kadar doldurmadan önce, pH değerini kontrol ve pH 7.4 ayarlayın. Düşük tampon kapasitesi nedeniyle, bir her gün taze olarak bu tampon hazırlamak0.1 M HCI ve NaOH çözümler küçük miktarlarda kullanarak özel itina ile pH ayarlamasını yapmak d. Not: steril bir çözelti deneye bağlı olarak, kullanılabilir. Çözelti, steril filtrasyon ile sterilize edilir. </li></ol></li><li> İki tampon, etiket dışında ve bir tüp hazırlanması (örneğin, 50 mi santrifüj borusu) ya da bir şişe (örneğin, ölçüm kabı 250 mi) önceden hipotonik lizis prosedürü için iki kez damıtılmış su ile yıkanır. örnek başına 10 ml su hazırlayın. </li><li> Buz üzerinde gerçekleştirilir APF boyama (bölüm 3) için, ezilmiş buz ile bir kap hazırlanır. </li><li> boyama esnasında kullanılan çalışma çözümleri hızlı hazırlanmasını sağlamak için önceden APF hacimde hazırlayın (3.2 adım) ve donma ve APF çözümünün çözülme defalarca önlemek için. Not: AFP genellikle 5 mg / ml metil asetat (11.81 mM) stok çözeltisi olarak elde edilir. <ol><li> 0.5 ml tüpler içinde 10-100 ul alikotları dondurun. APF nihai boyama için10 uM boya konsantrasyonu (adım 3.8) kullanılmıştır. </li></ol></li></ol> Eritrositler 2. Hipotonik Lizis NOT: kirlenmesini önlemek için bir laminer akış tezgah altında (santrifüj adımları hariç) hipotonik lizis adımları uygulayın. Oda sıcaklığında tüm prosedürü uygulayın. hipotonik lizis zaman kritik bir süreç olduğu için, önceden su (2 mi) ve PBS (5 mi) eklenmesi için pipetler ayarlayın ve işleme başlamadan önce su ve PBS şişeler açın. Kullanımdan önce, oda sıcaklığında PBS çözeltisi ve saf su saklayın. <ol><li> Her kan örneği transferi uygun 15 ml santrifüj tüpüne 100 ul. Not: Deneylerde kan örnekleri, genellikle pıhtılaşmayı önlemek için, heparinin 10 U / ml ihtiva etmektedir. Ancak, numune malzemenin farklı kaynaklardan anti-koagülan doğası ve konsantrasyonu farklı olabilir. APF boyaması üzerindeki etkisi karş tarafından test edilmelidirdiğer türleri veya anti-koagülan konsantrasyonları ile takviye edilmiş, kan numuneleri elde edilen sonuçlara sonuçları ing. </li><li> 2 mL distile su ekleyin ve bir orta düzeyde ayarlanmış bir vorteks mikser kullanarak örnekleri karıştırın. daha sonra numune başına 5 ml PBS ilave ve vorteks karıştırıcı ile karıştırın, 60 saniye boyunca inkübe edin. Not: yaklaşık 5 numuneye kadar paralel hazırlanabilir. numune sipariş karşılaştırılabilir inkübasyon süreleri elde etmek için su ve PBS eklenmesi için aynı tutmak. </li><li> PBS ilave (aşama 2.2), oda sıcaklığında 6 dakika 450 x g santrifüj ile tüm örneklerde kalan sağlam hücreler pelet izotonik koşulların yenilenme sonra. </li><li> Bir tablo çöp kutusuna dökerek süpernatantı. santrifüj tersini tüp ve bir kağıt havlu üzerine açılış dokunarak kadar sıvı mümkün olduğunca kaldırın. Hücre topağı mümkün olduğunca kuru olduğundan emin olun. </li><li> (Adım 2.2) daha önce açıklandığı gibi hipotonik lizis işlemi tekrarlayın. NOT: Prensip olarak, bu hipotonik lizis prosedürü elde edilecek karışık bir lökosit fraksiyonunun saflığı bağlı olarak, birden fazla kez tekrar edilebilir (2.5 2.3 adım). İki parçalama elde karışık hücre fraksiyonu içinde eritrosit kalan payı adımlar sonra yaklaşık% 25&#39;tir. </li><li> Oda sıcaklığında 6 dakika 450 x g santrifüj ile geri kalan sağlam hücreler pelet. süpernatant (adım 2.4) sökün. pelet 500 ul HBSS ekleyin ve homojen bir çözelti elde edilene kadar yavaşça çözülür. buna göre etiketlenmiş 1.5 ml numune tüpüne her örnek aktarın. </li><li> Deneye bağlı olarak, doğrudan, (akış sitometrisi ile, örneğin,) elde edilen numunelerin, 25, 32 (tek hücre tiplerinin tanımlanması için) floresans etiketli antikorlar ile leke analizi (hücre aktivasyon deneyleri için) hücre uyaranlara 33 inkübe ya da buz ve Kullanım depolanan sonra. Çalışmanın amacı bağlı olarak, hemen üzerinde sonraki deneylerigranülosit yana karışık bir lökosit fraksiyonu yaklaşık 20 saat arasında oldukça kısa bir yarı ömre sahiptir. Not: Bu, aynı zamanda, aşağıda tarif edilen peroksidaz aktivitesi boyama için de geçerlidir. </li></ol> 3. Halojenleyici Peroksidaz Aktivitesi Boyama Not: kandan alınan hema peroksidazlar MPO ve EPO tarafından HOCl- ve HOBr&#39;nin üretim adlandırılan arasında hipohalus asitlerinin ile floresan oksidize edilir APF kullanılarak ölçülür. floresan işaretli antikorlar ile hücre etiketleme APF boyama ile bir arada gerçekleştirilen bu yüzden eğer floresan emisyon sinyali engelleyebilir florofor kaçının. <ol><li> buz üzerinde 4 ° C de APF boyama gerçekleştirin. </li><li> APF bir çalışma çözeltisi hazırlamak için boya uygun bir kısım Çözülme (örneğin, 10 ul, 11.81 mM) ve tam 1 ​​mM (örneğin, 10 ul 108.1 ul tampon ekleyin) için HBSS ile seyreltin. <ol><li> Her numune (500 ul hücre çözeltisi) için 5 u hazırlamaktarif APF hazır çözeltinin l. Bu duruma göre, 118.1 ul AFP çalışma çözeltisi (1 mM) 20 numune hazırlamak için verir APF (11,81 mm), bir adet 10 ul tablet kullanımı. Nedeniyle pipetleme sırasında kaybı hesaplanmış yaklaşık% 10 daha fazla APF çalışma çözeltisi hazırlayın. </li></ol></li><li> , APF boyama peroksidaz özgüllük kontrol hema peroksidaz inhibitörü, 4-aminobenzoik asit hidrazid (4-ABAH) 35 ile kontrol örneklerini hazırlamak için. <ol><li> Çözücü, 500 ul, 75.6 mg 4-ABAH seyreltilerek, dimetil sülfoksit içinde 4-ABAH (151.17 g / mol), (DMSO) içindeki bir 1 M stok çözelti hazırlayın. Dahası HBSS 4-Abah 1/10 sulandırmak. </li></ol></li><li> Sırasıyla, &quot;70 mM H2O 2&quot; ve &quot;7 mM H2O 2&quot;, bir H2O 2 çalışma çözeltisi etiketi iki 1.5 mi santrifüj tüpleri hazırlanması için. <ol><li> &quot;70 mM H 2 O 2&quot; etiketli tüp içinde, taze 10 ul sulandırmakyaklaşık 88 mM&#39;lik bir konsantrasyon elde etmek için distile su 990 ul kullanılarak H2O 2,% 30&#39;luk bir stok çözeltisi (8.8 mM). Buz üzerinde saklayın ve 4 saat içinde kullanın. NOT: H 2 O 2, tipik tedarikçiler tarafından% 30 stok çözelti olarak teslim edilir. 4 ° C&#39;de depolandığında, yaklaşık 3 yıl stabildir. Bozunmadan kaçınmak için damıtılmış su içinde H2O 2 dilüsyonları gerçekleştirin. H2O 2 seyreltmeler, 0.1 M NaOH çözeltisi içinde hazırlanabilir. </li><li> Tam H belirlenmesi için 2 O 2 konsantrasyonunun etiketlenmiş 1.5 ml&#39;lik bir tüp içinde damıtılmış su 900 ul bu solüsyondan 100 ul eklenmesiyle ilk H 2 O 2 stok solüsyonu (yaklaşık 88 mm), daha da 1-10 seyreltme hazırlanması &quot;7 mM H 2 O 2&quot;. </li><li> (UV-Vis fotospektrometre kullanarak yakın UV aralığında (örneğin, 200-300 nm) spektrumunu kaydetme ve 240 nm&#39;de absorbansı kullanın49; 240 = 34 M -1 cm -1) ikinci H 2 O 2 stok solüsyonu 34 gerçek H 2 O 2 konsantrasyonunu belirlemek için. Referans küvet sadece distile su içerdiğinden emin olun. Ölçüm kullanım kuvars küvetler UV aralığında bir spektrum kaydedilir olarak. </li><li> Bu sonuçtan, hem H 2 O 2 stok çözümleri tam konsantrasyonları hesaplayın. Damıtılmış su, uygun bir miktarının ilave edilmesi ile &quot;70 mM H2O 2&quot; örnek tüp tam olarak 70 mM ilk ihtiyat çözeltisinin yoğunluğu ayarlayın. buz üzerinde elde edilen çalışma çözüm saklayın ve bir saat içinde kullanın. </li></ol></li><li> 1 mM&#39;lik bir son konsantrasyon için, uygun örnekler 4-ABAH çalışma çözeltisi (100 mM) 5 ul ekle. APF ilave edilmeden önce bir inkübatör içerisinde 37 ° C&#39;de 15 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Her bir 5 ul APF çalışma çözeltisi (1 mM) ilave500 ul numune 10 uM bir nihai boya konsantrasyonu elde edildi. (Orta ayara vorteks karıştırıcı kullanılarak, örneğin) yavaşça örnekleri karıştırın ve 37 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edilir. </li><li> 700 uM&#39;lik bir son konsantrasyon için her 500 ul numune 5 ul H2O 2 çalışma çözeltisi (70 mM) eklenir. Yavaşça örnekleri karıştırın ve 37 ° C&#39;de 60 dakika boyunca inkübe. paralel olarak uygun kontrol ölçümleri gerçekleştirmek. NOT: Kontrol ölçümleri 700 uM H 2 O 2 hücreleri için toksik olmadığını gösterdi. Ayrıca önemli bir hücresel tepkiler gözlenmiştir. NOT: APF boyama, H2O 2 ilavesi olmaksızın, bilimsel soruya bağlı olarak ile gerçekleştirilebilir. H2O 2 eklenmesi hücreleri tarafından maksimum HOCl ve HOBr&#39;nin üretim saptanmasına izin verir ise, hidrojen peroksit yokluğunda sadece bazal klorlama MPO ve EPO aktivitesi belirlenir. TO ikinci bir anlamlı olarak daha yüksek floresan sinyal anlamına gelir. </li><li> hücreler pelet için, oda sıcaklığında 10 dakika karıştırıldı ve 400 x g&#39;de için örnekler santrifüj. İyice pelet bozmadan süpernatant kaldırmak ve hücreleri tekrar süspansiyon 250 ul HBSS ekleyin. NOT: Numuneler şimdi 25 flow sitometri aracılığı ile analiz için hazır. </li><li> ağartma önlemek için analize kadar karanlıkta örnekleri saklayın. 480-490 nm&#39;de eksitasyonla sonra yaklaşık 525 nm 37 ° floresan emisyonu tespit eder. </li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Nötrofiller, insan kanından en bol lökositlerdir olarak peroksidaz-pozitif hücrelerinin elde edilmesi çoğu zaman sadece bu hücreler üzerinde odaklanır ve yoğunluk dereceli santrifüj 38 diğer lökositlerin nötrofillerin bir şekilde ayrılmasını da içerir. Nötrofiller daha az bol sıçangil kan örneklerinde henüz olarak ikinci daha karmaşık yöntemleri için 39 40 kullanılmalıdır. Ayrıca her iki yöntemde de bağlı daha büyük kan hacim ihtiyacı için, numunelerden peroksidaz pozitif monositler kald...

Polimorfonükleer lökositler (PMN olarak da adlandırılır granülositler) ve monositler kan 1,2 olarak doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli hücresel bileşenleri temsil eder. Patojenlere karşı ve kazanılmış bağışıklık sistemi aktivasyonu ve sistemik enflamatuar tepki 2-4 başlatılmasından birincil savunma katkıda bulunur. Oysa özellikle nötrofiller, granülosit en bol türü ve monositler de önemli ölçüde akut inflamatuar olayların 5 düzenlenmesi ve fesih katkıda bulunur. Bu nedenle, bu hücreler aynı zamanda römatoid artrit, 6,7 gibi kronik iltihaplı hastalıklarda önemli bir rol oynayabilir. Aslında, astım, kronik enflamasyonlu hava geçiş yolu hastalığı olarak, eozinofil bozulmuş apoptoz, kan 8&#39;de ikinci granülosit Çeşidi ile karakterize edilir. Oysa granülosit apoptoz ve makrofajlar tarafından onların hızlı çıkarma hücresel sonlandırma sırasında iki temel adımlardırinflamasyon 9-11. Adı bağışıklık hücreleri, iki yakın ilişkili enzimler, yani miyeloperoksidaz (MPO, nötrofiller ve monositler) ve eozinofil peroksidaz (EPO, eozinofiller) &#39;de 12,13 bulunabilir. Bu hem peroksidazlar klasik iki-elektronik ilgili hipo (sözde) ila (sözde) halidler bakterisid özellikleri 14-16 için bilinen halojen asitleri okside olarak humoral bağışıklık tepkisi ile ilişkilidir. Fizyolojik koşullar altında MPO esas olarak form hipokloröz asit (HOCI) ve hypothiocyanite (- OSCN) ikinci ve hipobromus asit (HOBr&#39;nin) EPO 17-19 oluşturduğu getirilmektedir. Yeni sonuçlar, bu (sözde) halojenasyon enzim aktivitesi aynı zamanda inflamatuar yanıtların düzenlenmesinde ve bağışıklık reaksiyonları 20,21 feshi katkıda bulunabileceğini düşündürmektedir. Aslında, MPO ve elde edilen ürünlerin tarafından HOCl üretimi T hücre tabanlı adaptif immün yanıtları 22-2 bastırmak gösterilmiştir4. Bu fizyolojik fonksiyonu MPO ve EPO katkısı kronik inflamatuar hastalıklarda doğuştan gelen bağışıklık sisteminden lökositlerin immünolojik rolüne daha fazla anlayışlar kazanmak için ve belirlemek için hızla bir sonraki özgü küçük kan örneklerinden lökosit zenginleştirmek için bir yöntem geliştirdi bu hücrelerde halojenleştirici peroksidaz etkinliğinin belirlenmesi. eritrosit tükenmesi için biz düşük malzeme maliyetleri hızlı bir lökosit zenginleşmeye yol açar damıtılmış su ile iki müteakip hipotonik lizis adımları içeren bir standart yöntem seçtiniz. Sonraki halojenleme MPO belirlenmesi ve EPO faaliyeti için HOCl- ve HOBr&#39;nin özel boya aminofenil floresein (APF) 25-27 kullanılmıştır. Spesifik olmayan peroksidaz boyama yöntemleri 28,29 uygulanması aksine olarak, bu yaklaşım, genellikle ciddi iltihaplanmaya karşı en bozulur halojenleme peroksidaz aktivitesi seçici algılama sağlar,amasyon 30,31.

<table><tbody><tr><td>Malzemeler/Ekipman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml santrifüj tüpleri</td><td>VWR/Corning</td><td>734-0451-1,5</td><td></td></tr> <tr><td>ml numune tüpleri</td><td>VWR/Eppendorf</td><td>211-2130DE-5</td><td></td></tr> <tr><td>ml'ye kadar hacimler için pipetler</td><td>Eppendorf</td><td>örn., 3120000070</td><td>1-10 ve mikro aralığında ayarlanabilir hacimlere sahip Eppendorf Resarch plus pipetleri kullanıyoruz; L, 10-100 ve mikro; l, 100-1.000 & mikro; l bir 500-5.000 & mikro; l</td></tr><tr><td>laminer akış tezgahı</td><td>Termo Elektron Korelasyonu</td><td>HeraSafe-Vorteks</td><td></td></tr> <tr><td>karıştırıcı</td><td>Bender & Hobein AG</td><td>Vortex Genie</td> <td>2-Masaüstü</td></tr> <tr><td>santrifüj</td><td>Kendro Laboratuvar Ürünleri</td><td>Laborfuge 400R</td><td>Santrifüj 450 x g'da kullanılabilmelidir</td></tr><tr><td>Küçük santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td>Santrifüj 400 x g'da kullanılabilmelidir</td></tr><tr><td>İnkübatör</td><td>Heraeus</td><td>cytoperm 2</td><td>Ayarlar: 37 &°; C, %95 nem, %5 CO2 içeriği</td></tr><tr><td>UV-Vis spektrofotometresi</td><td>Varian</td><td>Cary 50 bio</td><td>200 ile 300 nm arasındaki bir spektrumun kaydedilmesi gerekir. Bu nedenle kuvars küvetlerin uygulanması gerekir</td></tr><tr><td>Akış sitometresi</td><td>Becton, Dickinson</td><td>BD Facs Calibur</td><td>Floresein (örn. , 488 nm argon lazer) uyarılması için uygun bir lazerle donatılmış herhangi bir akış sitometresi kullanılabilir</td></tr><tr><td><güçlü>Adı< ><</td><td>güçlü>Şirket< ></td><td><güçlü>Katalog Numarası</td><td> Yorumlar</td></tr><tr><td>Kimyasallar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>amresco</td><td>K812</td><td>steril solüsyon, kullanıma hazır</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>200 ml miligözenekli suda çözündürmek için</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td> tabletleri</tr><tr><td>Hanks Ca2+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1387</td> <td>ile dengeli tuz çözeltisi (HBSS)970 mg / 100 ml, dikkatlice kontrol edin ve pH değerini 7.4</td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>Merck Millipore</td><td>1.09057.1000</td><td>1 M çözelti</td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Riedel-deHa&euml; n</td><td>30620</td><td>Katı peletler. 1 M'lik bir çözelti için 4 g / 100 ml Millipor su</td></tr><tr><td>Aminofenil floresein</td><td>Cayman</td><td>10157</td><td>5 mg / ml çözelti (11.81 mM) metil asetat, alikotlar ( örn. 100 & mikro; l) -20 ° C'de hazırlanmalı ve saklanmalıdır; C</td></tr><tr><td>Hidrojen peroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td>Bu %30'luk stok çözeltisi yaklaşık 8,8 M'lik bir konsantrasyona karşılık gelir. Diğer seyreltmeler, kullanımdan hemen önce damıtılmış suda taze olarak hazırlanmalı ve absorbans ölçümleri ile ölçülmelidir</td></tr><tr><td>: 4-aminobenzoik asit hidrazid (4-ABAH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A41909</td>: <td>1 M'lik bir ilk stok çözeltisi DMSO'da, ikincisi 100 mM'lik bir HFSS DMSO vwr kimyasallarında 1:10 seyreltme ile hazırlanmalıdır</td></tr>, <tr><td></td><td></td><td>23500.26</td><td>-</td></tr></tbody></table>

lökosit zenginleştirilmiş kan Örneklerinde halojenleyici peroksidaz faaliyet hızlı ve Özgül değerlendirme

Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

Bu yazıda küçük tam kan örneklerinden lökositlerin hızlı ve standardize zenginleştirme için bir protokol tanımlanmıştır. Bu prosedür, eritrositlerin hipotonik liziz dayalıdır ve insan olmayan kökenli kan hem de insan örnekleri uygulanabilir. yaklaşık 50 ile 100 ul az ilk örnek hacmi küçük laboratuar hayvanlarından tekrarlanan kan örneğinin, bu yöntem uygulanabilir hale getirir. Ayrıca, lökosit zenginleştirme birden laboratuvar ortamlarında bu yöntem uygulanabilir hale dakika içinde ve kimyasallar ve enstrümantasyon konusunda düşük malzeme çabaları ile elde edilir. Lökositlerin standardize saflaştırma son derece seçici bir hema peroksidaz halojenleştirici peroksidaz aktivitesinin değerlendirilmesi için boyama yöntemi, miyeloperoksidaz (MPO), eozinofil peroksidaz (EPO) örneğin, hipokloröz ve hipobromus asitinin (HOCI ve HOBr) oluşumu ile birleştirilir. MPO güçlü neut&#39;ait olarak ifade edilirkenrophils, insan kanında olarak monositlerde en bol immün hücre tipi, ilgili enzim EPO özel eozinofil olarak ifade edilir. Bu enzimlerin halojenleme aktivitesi neredeyse HOCl- ve HOBr&#39;nin özgü boya aminofenil fluoresein (APF) ve primer peroksidaz substrat hidrojen peroksit kullanılarak giderilir. daha sonra akım sitometrisi analizi üzerine tüm peroksidaz-pozitif hücrelerin (nötrofiller, monositler, eozinofil) ayırt edilebilir ve halojenleme peroksidaz aktivitesi belirlenebilir. APF lekeli hücre yüzeyi markerlerinin uygulama ile birlikte olabilir için, bu protokol, spesifik olarak, lökosit alt parçacığı gidermek için uzatılabilir. yöntem, insan ve kemirgen lökositleri hem HOCl ve HOBr&#39;nin üretimi tespit etmek için de geçerlidir. kronik inflamatuvar hastalıklarda bu enzimatik ürünlerin yaygın ve çeşitli şekillerde tartışılan immünolojik rol göz önüne alındığında, bu protokol daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunabilirlökosit kaynaklı heme peroksidaz immünolojik alaka.

Daha önce belirtildiği gibi, yukarıda tarif edilen yöntem, insan ve insan-olmayan madde 32 her ikisi de uygulanabilir olduğu ortaya çıktı. astım semptomları olan fareler için gösterilen üstelik olarak APF boyama sistemik pro-enflamatuar durum farklılıkları tespit etmek için uygun bir araç olabilir. Bu nedenle bu protokol kullanılır Takip eden bir çalışmada, art arda, pristan-kaynaklı artrit (PIA) dişi Koyu Agouti sıçanlarda MPO (EPO) ve halojenasyon etkinliğini değerl...

Bu protokol, hücreler içindeki halojenleştirici peroksidaz aktivitesinin daha sonra spesifik bir şekilde belirlenmesi için küçük kan örneklerinden lökositlerin hızlı bir şekilde zenginleştirilmesini tanımlar. Yöntem, insan ve insan olmayan materyallere uygulanabilir ve yeni inflamatuar belirteçlerin değerlendirilmesine katkıda bulunabilir.

Lökosit zenginleştirilmiş Kan Örneklerinde Halojenleyici Peroksidaz Faaliyet Hızlı ve Özgül Değerlendirme

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on ...

Bu eritrosit azaltma yönteminin genel amacı, küçük bir kan örneğinden hızlı ve basit bir lökosit zenginleştirmesi sağlamaktır. Bu tekniğin birçok avantajı arasında ucuz, güvenilir ve hızlı olması yer alır. Ayrıca, hem insan hem de insan dışı kan örneklerine uygulanabilir.Lizis prosedürüne başlamadan önce, su verme pipetini iki mililitreye, PBS pipetini ise beş mililitreye ayarlayın. Ardından, oda sıcaklığındaki lamine akışlı kabin altına açık su ve PBS erlenleri yerleştirin. Hipotonik lizis zaman açısından kritik bir süreç olduğundan, her şey önceden hazırlanmalıdır.Ayrıca, uyumlu sonuçlar elde etmek için lizis prosedürü her zaman aynı şekilde uygulanmalıdır. Ardından, her bir kan örneğinden 100 µL'yi 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Ve her örneğe, orta ayarda vorteksleyerek iki mL distile su ekleyin.Hücreleri 60 saniye dinlendirin, ardından beş mililitre PBS ekleyin. Örnekleri vorteksleyerek karıştırın. Şimdi, hücreleri santrifüj ile toplayın ve süpernatanları dökün.Sıvının mümkün olduğunca fazlasını uzaklaştırmak için tüpleri ters çevirin ve ağızlarını bir kağıt havluya hafifçe vurun. Ardından, az önce gösterilen hipotonik lizis prosedürünü tekrarlayın. İkinci kez kuru bir pelet elde ettikten sonra, homojen bir çözelti oluşana kadar her örneği 500 µL HBSS içinde yeniden süspande edin.Hücreleri buz üzerinde 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın. Aminofenol floresein veya APF boyamasından sonra örneklerin peroksidaz özgüllüğünü kontrol etmek için, öncelikle uygun örneklere 5 mikrolitre hem peroksidaz inhibitörü 4-ABAH ekleyerek 37 °C'de 15 dakika inkübe edin. Ardından, her tüpe 5 mikrolitre APF çalışma çözeltisi ekleyin ve hücreleri orta ayarda nazikçe vorteksleyin.Tüm örnekleri 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Ardından her bir örneğe beş µL hidrojen peroksit çalışma çözeltisi ekleyin ve tüpleri hafifçe vorteksleyin. 37 °C'de 60 dakika beklettikten sonra hücreleri santrifüjleyin ve peletlere zarar vermeden süpernatanı dikkatlice uzaklaştırın.Son olarak, hücreleri 250 µL HBSS içinde yeniden süspanse edin ve fotobleşingi önlemek için numuneleri analiz edilene kadar karanlıkta saklayın. Burada, az önce gösterildiği üzere hipotonik lizis ve APF boyamasından sonraki lökosit popülasyonlarının temsili bir örneği gösterilmektedir. Hücre boyutu ile granülarite karşılaştırmalı olarak grafiğe döküldüğünde, eritrositlerin güçlü bir şekilde uzaklaştırıldığı gözlemlenebilir; kırmızı kan hücresi ve debris popülasyonu olayların yalnızca %22'sini oluşturmaktadır.Ayrıca, APF kaynaklı floresansın yoğunluk dağılımı; peroksidaz-negatif eritrositlerin ve lenfositlerin net bir şekilde ayırt edilmesini kolaylaştırırken, peroksidaz-pozitif monositler ve eozinofiller için orta düzeyde bir APF oksidasyonu ve nötrofiller için ise güçlü bir peroksidaz oksidasyonu gözlemlenir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde uygulandığı takdirde 50 kan örneğine kadar paralel olarak uygulanabilir. Bu prosedürün ardından, ilgilenilen hücre alt kümelerini tanımlamak için antikor boyama gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.Geliştirildikten sonra bu teknik, küçük hayvan çalışmaları alanındaki araştırmacıların, kronik inflamatuar hastalıkların hayvan modellerinde MPO ve EPO'nun halojenleme aktivitesinin rolünü keşfetmelerinin önünü açmıştır.

fast-specific-assessment-halogenating-peroxidase-activity-leukocyte

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Neonatal hipoksi-iskemi biyokimyasal belirteçler ölçmek için bir yöntem açıklanmıştır. Bu yaklaşım, yüksek basınçlı sıvı kromatografi (HPLC) ve Gaz Kromatografisi Kütle Spektrometresi (GC / MS) kullanmaktadır.

Yenidoğan Hipoksi Biyokimyasal Ölçüm

Bu video, miyeloperoksidaz içeren azurofilik granülleri serbest bırakmak için nötrofillerin uyarılmasını içeren, fare nötrofillerindeki azurofilik granüllerin bir degranülasyon testini göstermektedir. Sonraki enzimatik reaksiyon, miyeloperoksidaz seviyelerini ölçmek için kullanılır ve nötrofil aktivasyonu hakkında bilgi sağlar.

Aktivasyonu Takiben Nötrofillerde Azurofilik Granüllerin Degranülasyonunu İzlemek İçin Bir Test

Biz, kalitatif ve kantitatif çalışmalar için çeşitli amoeba ve memeli hücre modellerinde uygulanabilir, reaktif oksijen türlerinin (ROS) ölçümü için protokoller kümesi uyarlanmıştır.

Tespit, görselleştirme ve bir amip Model Sistemde reaktif oksijen türlerinin Üretimi nicelleştirilmesini

Kan lökositleri ve trombosit bireyin genel bioenergetic sağlığının bir belirteci olarak kullanılır ve bu nedenle patolojik süreçlerin ve tedavilerin etkisini izlemek için bir potansiyele sahip olabilir. Burada mitokondriyal fonksiyonu ve bu hücrelerde oksidatif patlama izole etmek ve ölçmek için bir yöntem tarif eder.

İnsan lökosit ve trombosit İzolasyonu ve Değerlendirme Protokolleri: Biyoenerji ve Oksidatif Burst

Biz burada bir Fluorometrik boş hücre biyokimyasal tahlil HDL-lipid peroksidasyon belirlenmesi için tarif. Bu hızlı ve tekrarlanabilir tahlil anlayışımız HDL fonksiyonunu kullanabilirsiniz insan hastalık katkıda bulunabilir ve büyük ölçekli çalışmalarda HDL işlevini belirlemek için kullanılabilir.

Boş hücre biyokimyasal Fluorometrik enzimatik tahlil yüksek yoğunluklu Lipoprotein Lipid peroksidasyon yüksek üretilen iş ölçümü için

Bu el yazması oksidatif stres xenobiotic kaynaklı incelenmesi için genetik olarak kodlanmış fluorogenic gazetecilere canlı hücre görüntüleme bir uygulamada kullanımını açıklar. Bu deneysel yaklaşım eşsiz kronolojik zamanmekansal çözünürlük, duyarlılık ve özgüllük eksiklikleri toksikolojik oksidatif stres tespiti için kullanılan geleneksel yöntemlerden birçoğu kaçınırken sunmaktadır.

Genetik olarak kodlanmış Fluorogenic sensörleri kullanarak toksikolojik oksidatif stres ilişkin Değerlendirmeler yaklaşımlar görüntüleme

Bu makale, menide peroksidaz pozitif lökositlerin incelenmesi için ekonomik ve etkili bir protokol sunmaktadır. Bilgisayar destekli semen analizi (CASA) sisteminin yardımıyla, spermdeki peroksidaz pozitif lökosit konsantrasyonu toplam 60 dakika içinde elde edilebilir ve bu da androloji laboratuvarının ve andrologların verimliliğini etkili bir şekilde artırır.

Semende Peroksidaz Pozitif Lökositlerin İncelenmesi

Bu protokol, yüksek verimli bir tarama yaklaşımı kullanarak bir floresan boya probu olarak dihidroetidyum (DHE) kullanarak hücre içi reaktif oksijen türlerini (ROS) ölçmek için yeni bir yöntemi açıklar. Protokol, üç farklı hepatoselüler karsinom hücre hattında hücre içi reaktif oksijen türlerinin (ROS) kantitatif değerlendirme yöntemlerini açıklar.

Dihidroetidyum (DHE) Floresan Boya Kullanılarak Reaktif Oksijen Türleri (ROS) Üretiminin Yüksek Verimli Tarama Değerlendirmesi

Hem oksitlenmiş hem de indirgenmiş glutatyon formlarının (sırasıyla GSSG ve GSH) miktar tayini, Orto-ftalaldehit (OPA) kullanılarak elde edilmiştir. OPA, GSH'ye konjuge edildiğinde yüksek oranda floresan hale gelir, ancak indirgenene kadar GSSG'yi konjuge edemez. Burada, normalizasyon için protein miktar tayini kullanarak her ikisini de ölçmek için multiparametrik bir tahlili açıklıyoruz.

İn Vitro Kültürlenmiş Memeli Hücrelerinde Orto-ftalaldehit Kullanılarak Oksitlenmiş ve İndirgenmiş Glutatyon Formlarının Hızlı Miktar Tayini

Süperoksit anyonunun oluşumu, trombositlerin uyarılması için gereklidir ve düzensiz ise trombotik hastalıklar için kritik öneme sahiptir. Burada, süperoksit anyonlarının seçici tespiti ve redoksa bağımlı trombosit regülasyonunun incelenmesi için üç protokol sunuyoruz.

Trombositlerde Süperoksit Anyon Oluşumunun Tespiti için Alternatif Yöntemler 

Öğrenin küçük kan örneklerinden lökosit zenginleştirme ve halojenleyici peroksidaz aktivitesi değerlendirme yöntemini. Bu hızlı, ekonomik ve güvenilir teknik insan ve hayvan örneklerinde yeni inflamatuar belirteçlerin incelenmesine olanak tanır.

Lökosit zenginleştirilmiş Kan Örneklerinde Halojenleyici Peroksidaz Faaliyet Hızlı ve Özgül Değerlendirme

Daha fazla video keşfet