Lökosit zenginleştirilmiş Kan Örneklerinde Halojenleyici Peroksidaz Faaliyet Hızlı ve Özgül Değerlendirme
28 Temmuz 2016
Bu protokol, hücreler içindeki halojenleştirici peroksidaz aktivitesinin daha sonra spesifik bir şekilde belirlenmesi için küçük kan örneklerinden lökositlerin hızlı bir şekilde zenginleştirilmesini tanımlar. Yöntem, insan ve insan olmayan materyallere uygulanabilir ve yeni inflamatuar belirteçlerin değerlendirilmesine katkıda bulunabilir.
Bu eritrosit azaltma yönteminin genel amacı, küçük bir kan örneğinden hızlı ve basit bir lökosit zenginleştirmesi sağlamaktır. Bu tekniğin birçok avantajı arasında ucuz, güvenilir ve hızlı olması yer alır. Ayrıca, hem insan hem de insan dışı kan örneklerine uygulanabilir.
Lizis prosedürüne başlamadan önce, su verme pipetini iki mililitreye, PBS pipetini ise beş mililitreye ayarlayın. Ardından, oda sıcaklığındaki lamine akışlı kabin altına açık su ve PBS erlenleri yerleştirin. Hipotonik lizis zaman açısından kritik bir süreç olduğundan, her şey önceden hazırlanmalıdır.
Ayrıca, uyumlu sonuçlar elde etmek için lizis prosedürü her zaman aynı şekilde uygulanmalıdır. Ardından, her bir kan örneğinden 100 µL'yi 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Ve her örneğe, orta ayarda vorteksleyerek iki mL distile su ekleyin.
Hücreleri 60 saniye dinlendirin, ardından beş mililitre PBS ekleyin. Örnekleri vorteksleyerek karıştırın. Şimdi, hücreleri santrifüj ile toplayın ve süpernatanları dökün.
Sıvının mümkün olduğunca fazlasını uzaklaştırmak için tüpleri ters çevirin ve ağızlarını bir kağıt havluya hafifçe vurun. Ardından, az önce gösterilen hipotonik lizis prosedürünü tekrarlayın. İkinci kez kuru bir pelet elde ettikten sonra, homojen bir çözelti oluşana kadar her örneği 500 µL HBSS içinde yeniden süspande edin.
Hücreleri buz üzerinde 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın. Aminofenol floresein veya APF boyamasından sonra örneklerin peroksidaz özgüllüğünü kontrol etmek için, öncelikle uygun örneklere 5 mikrolitre hem peroksidaz inhibitörü 4-ABAH ekleyerek 37 °C'de 15 dakika inkübe edin. Ardından, her tüpe 5 mikrolitre APF çalışma çözeltisi ekleyin ve hücreleri orta ayarda nazikçe vorteksleyin.
Tüm örnekleri 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Ardından her bir örneğe beş µL hidrojen peroksit çalışma çözeltisi ekleyin ve tüpleri hafifçe vorteksleyin. 37 °C'de 60 dakika beklettikten sonra hücreleri santrifüjleyin ve peletlere zarar vermeden süpernatanı dikkatlice uzaklaştırın.
Son olarak, hücreleri 250 µL HBSS içinde yeniden süspanse edin ve fotobleşingi önlemek için numuneleri analiz edilene kadar karanlıkta saklayın. Burada, az önce gösterildiği üzere hipotonik lizis ve APF boyamasından sonraki lökosit popülasyonlarının temsili bir örneği gösterilmektedir. Hücre boyutu ile granülarite karşılaştırmalı olarak grafiğe döküldüğünde, eritrositlerin güçlü bir şekilde uzaklaştırıldığı gözlemlenebilir; kırmızı kan hücresi ve debris popülasyonu olayların yalnızca %22'sini oluşturmaktadır.
Ayrıca, APF kaynaklı floresansın yoğunluk dağılımı; peroksidaz-negatif eritrositlerin ve lenfositlerin net bir şekilde ayırt edilmesini kolaylaştırırken, peroksidaz-pozitif monositler ve eozinofiller için orta düzeyde bir APF oksidasyonu ve nötrofiller için ise güçlü bir peroksidaz oksidasyonu gözlemlenir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde uygulandığı takdirde 50 kan örneğine kadar paralel olarak uygulanabilir. Bu prosedürün ardından, ilgilenilen hücre alt kümelerini tanımlamak için antikor boyama gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.
Geliştirildikten sonra bu teknik, küçük hayvan çalışmaları alanındaki araştırmacıların, kronik inflamatuar hastalıkların hayvan modellerinde MPO ve EPO'nun halojenleme aktivitesinin rolünü keşfetmelerinin önünü açmıştır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, hem insan hem de insan dışı materyaller için uygulanabilen, küçük kan örneklerinden lökositleri zenginleştirmeye yönelik hızlı ve basit bir yöntemi açıklamaktadır. Teknik, yeni inflamatuar belirteçlerin değerlendirilmesini kolaylaştıran, maliyet etkin ve güvenilir bir yöntemdir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- İmmünoloji
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Lökosit zenginleştirmesi, bağışıklık yanıtlarının incelenmesi için kritik öneme sahiptir.
- Geleneksel yöntemler zaman alıcı ve karmaşık olabilir.
- Bu yöntem, süreci basitleştirmeyi amaçlamaktadır.
- Hem insan hem de insan dışı kan örnekleri için kullanılabilir.
Çalışmanın Amacı
- Hızlı bir lökosit zenginleştirme protokolü geliştirmek.
- Lökositlerdeki halojenle peroksidaz aktivitesini değerlendirmek.
- İnflamatuar belirteçlerin tanımlanmasına katkıda bulunmak.
Kullanılan Yöntemler
- Su ve PBS uygulaması için pipetlerin hazırlanması.
- Örnek işleme için laminar akışlı kabinin kullanımı.
- Eritrositlerin uzaklaştırılması için hipotonik lizis.
- Lizis prosedürünün zamana duyarlı şekilde uygulanması.
Temel Sonuçlar
- Küçük kan örneklerinden lökositlerin başarılı şekilde zenginleştirilmesi.
- Peroksidaz aktivitesinin güvenilir değerlendirmesi.
- Hem insan hem de insan dışı örnekler için uygulanabilirlik.
- Yeni inflamatuar belirteçlerin değerlendirilme potansiyeli.
Sonuçlar
- Yöntem verimli ve maliyet etkindir.
- İmmün yanıtların incelenmesini geliştirir.
- Gelecekteki araştırmalar bu protokol üzerine inşa edilebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Endüstriyel Uygulama ve Önemi
Bu protokol, küçük kan örneklerinden hızlı ve standardize lökosit zenginleştirmesine olanak tanıyarak inflamatuar hastalık araştırmalarındaki erken keşif çalışmalarını destekler. MPO ve EPO'nun halojenleyici peroksidaz aktivitesini nicelendirerek, hedef doğrulama ve yolak risk azaltma süreçleri için mekanistik bir okuma sağlar. Yöntemin akış sitometrisi ve antikor boyama ile uyumluluğu, tarama ve translasyonel iş akışlarına entegrasyonunu kolaylaştırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Kronik inflamasyonda MPO ve EPO'nun terapötik hedefler olarak doğrulanması için lökosit spesifik peroksidaz aktivitesinin incelenmesine olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Minimum örnek hacmi (50–100 µL) kullanarak, boylamsal hedef etkileşim çalışmaları için küçük hayvan modellerinden tekrarlı örnekleme yapılmasına imkan sağlar.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Deney standardizasyonu için HOCl/HOBr üretiminin kantitatif, floresan tabanlı okumalarını oluşturmak amacıyla APF boyamasını akış sitometrisi ile birleştirir.
- Operasyonel Değer: 50 örneğe kadar paralel olarak yüksek kapasiteli işlemeye olanak tanıyarak ölçeklenebilir tarama kampanyalarını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Lökosit peroksidaz aktivitesini hastalıkla ilişkili inflamatuar süreçlerle ilişkilendirerek, preklinik modellerde biyobelirteç uyumunu destekler.
- Operasyonel Değer: Hem insan hem de kemirgen kanı ile çalışarak, hedef doğrulamada türler arası translasyonel süreklilik sağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, özellikle immünoloji ve enflamatuar hastalık programlarında, erken hedef hipotez testlerinden preklinik doğrulamaya kadar uzanan keşif sürekliliğine uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Saflaştırılmış lökosit popülasyonlarında enzime özgü peroksidaz aktivitesini nicelendirerek hipotez testlerini destekler.
- Tarama: APF floresansı ve akış sitometrisi aracılığıyla tekrarlanabilir, kantitatif çıktılar sağlayarak bileşiklerin peroksidaz aktivitesi üzerindeki etkisinin değerlendirilmesine olanak tanır.
- Analitikler: Deneysel koşullar altında peroksidaz-pozitif hücre alt kümelerinin (nötrofiller, monositler, eozinofiller) karşılaştırılmasına izin veren ölçülebilir floresan yoğunluk verileri üretir.
- Translasyonel Araştırma: Hücre yüzeyi belirteç boyaması ile birleştirildiğinde, peroksidaz aktivitesini enflamatuar hastalık mekanizmalarıyla ilişkilendirerek preklinik sürekliliği destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Standartlaştırılmış lökosit zenginleştirme ve APF tabanlı tespit, birden fazla enflamatuar hedef programı için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Peroksidaz aktivitesini spesifik lökosit soy hatlarıyla izole ederek hedef doğrulama sürecinde öngörülebilir bir güven sağlar.
- Operasyonel Değer: Minimum enstrümantasyon (santrifüj, vorteksleyici, akış sitometresi) gerektiren düşük maliyetli ve hızlı bir protokol sunar.
- Stratejik Değer: Lökosit örneklerinde hedef modülasyonunun hızlı ve iteratif değerlendirmesine olanak tanıyarak biyolojik risk azaltma sürelerini kısaltır.
- Portföy Etkisi: Fizyolojik olarak ilgili hücrelerden erken fonksiyonel aktivite verileri sağlayarak MPO/EPO inhibitörlerinin riskle uyumlu önceliklendirilmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Lökositlerle çalışma, akış sitometrisi ve floresan prob kimyası konularında uzmanlık gerektirir.
- Santrifüjlere, vortekslere, laminar akışlı kabinlere ve uygun floresan kanallarına sahip akış sitometrelerine erişime bağlıdır.
- Tekrarlanabilir sonuçlar için APF ve hidrojen peroksit çalışma çözeltilerinin laboratuvarlar arasında standartlaştırılması gerekir.
- İnsan dışı türlere uyarlama, hedef lökosit alt kümelerinde peroksidaz ekspresyonunun ve APF boyama verimliliğinin doğrulanmasını gerektirir.
- Yalnızca halojenleyici peroksidaz aktivitesinin tespit edilmesiyle sınırlıdır; ek analizlerle birleştirilmediği sürece diğer lökosit fonksiyonlarını ölçmez.
