Lökosit zenginleştirilmiş Kan Örneklerinde Halojenleyici Peroksidaz Faaliyet Hızlı ve Özgül Değerlendirme

Bu eritrosit tüketme yönteminin genel amacı, küçük bir kan örneğinden hızlı ve basit bir lökokti zenginleştirmesi elde etmektir. Bu tekniğin birçok avantajı ucuz, güvenilir ve hızlı olmasıdır. Ayrıca, insan ve insan olmayan kan örneklerine uygulanabilir.

Lizis prosedürüne başlamadan önce, su uygulaması için pipeti iki mililitreye ve PBS pipetini beş mililitreye ayarlayın. Daha sonra açık su ve PBS şişelerini oda sıcaklığında bir laminer akış başlığının altına yerleştirin. Hipotonik lizis zaman açısından kritik bir süreç olduğundan, her şey önceden hazırlanmalıdır.

Ayrıca, uyumlu sonuçlar elde etmek için lizis işlemi her zaman aynı şekilde yapılmalıdır. Daha sonra, her kan örneğinden 100 mikrolitreyi 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Ve orta ayarda girdap ile her numuneye iki mililitre damıtılmış su ekleyin.

Hücreleri 60 saniye dinlendirin, ardından beş mililitre PBS ekleyin. Ve örnekleri girdap yaparak karıştırın. Şimdi, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve süpernatanları boşaltın.

Tüpleri ters çevirin ve mümkün olduğunca fazla sıvıyı çıkarmak için açıklıkları bir kağıt havluya vurun. Daha sonra hipotonik lizis prosedürünü gösterildiği gibi tekrarlayın. İkinci kez kuru bir pelet elde ettikten sonra, homojen bir çözelti elde edilene kadar her numuneyi 500 mikrolitre HBSS içinde yeniden süspanse edin.

Ve hücreleri buz üzerindeki 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın. Amino fenol floresein veya APF boyamadan sonra numunelerin peroksidaz özgüllüğünü kontrol etmek için, önce 37 santigrat derecede 15 dakikalık bir inkübasyon için uygun numunelere beş mikrolitre heme peroksidaz inhibitörü, 4-ABAH ekleyin. Daha sonra, her tüpe beş mikrolitre APF çalışma solüsyonu ekleyin ve orta ayarda hücreleri nazikçe girdaplayın.

Tüm numuneleri 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Daha sonra her numuneye beş mikrolitre hidrojen peroksit çalışma solüsyonu ekleyin ve tüpleri nazikçe girdaplayın. 37 santigrat derecede 60 dakika sonra, hücreleri santrifüjleyin ve peletleri rahatsız etmeden süpernatanı dikkatlice çıkarın.

Son olarak, hücreleri 250 mikrolitre HBSS'de yeniden süspanse edin ve foto ağartmayı önlemek için numuneleri analizlerine kadar karanlıkta saklayın. Burada, az önce gösterildiği gibi hipotonik lizis ve APF boyamadan sonra lökosit popülasyonlarının temsili bir örneği gösterilmektedir. Hücre büyüklüğüne karşı taneciklilik grafiği çizilerek, eritrositlerin sağlam tükenmesi gözlemlenebilir, kırmızı kan hücresi ve enkaz popülasyonu olayların sadece% 22'sini oluşturur.

Ayrıca, APF'den türetilen floresansın yoğunluk dağılımı, peroksidaz pozitif monositler ve eozinofiller için orta derecede bir APF oksidasyonu ve nötrofiller tarafından sergilenen sağlam bir peroksidaz oksidasyonu ile peroksidaz negatif eritrositlerin ve lenfositlerin net bir şekilde ayırt edilmesini kolaylaştırır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde uygulanırsa paralel olarak 50'ye kadar kan örneğine uygulanabilir. Bu prosedürü takiben, ilgilenilen hücre alt kümelerini tanımlamak için antikor boyama gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, küçük hayvan çalışmaları alanındaki araştırmacıların, kronik enflamatuar hastalıklar için hayvan modellerinde MPO ve EPO'nun halojenleyici aktivitesinin rolünü keşfetmelerinin yolunu açtı.