Name: Bir gen ya da ilaç terapisinde kullanım için, HIV-1 üretim yapan RNAlar etkinlik ve toksisite Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Öğrenin, HIV-1 üretimini hedefleyen RNA moleküllerinin etkinlik ve toksisite değerlendirmesi için hızlı tarama yöntemini. 293T hücreleri kullanılarak yeni RNA tasarımları eşzamanlı olarak taranır ve terapötik adaylar belirlenir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Burada sunulan çalışma Sağlık Araştırması (CIHR) Kanada Enstitüleri tarafından desteklenmiştir (DCB-120266, PPP-133377 ve AG için HBF-348967 verir).

1. Hücre ve Transfeksiyonlar <ol><li> Dulbecco&#39;nun modifiye Eagle ortamında (DMEM) içinde kültür HEK 293T hücreleri,% 10 cenin sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin ile takviye edilmiştir. Hücre kültürü ortamı içinde 2 x 10 5 hücre / ml&#39;lik bir süspansiyon hazırlayın. Her çukuruna hücre süspansiyonundan 500, 100 ve 1000 ul, 24 oyuklu, 96 gözlü, 12 gözlü levhalar, viral üretimi, hücre canlılığı ve immün aktivasyon deneyleri sırasıyla (Şekil 2A) için. </li><li> Yavaşça girdap plakalar ve% 5 CO 2 ile 37 ° C&#39;de / Ç N onları kuluçkaya yatmaktadır. % 50-70 confluency hücreleri büyür. </li><li> Bir transfeksiyon planına göre, 1.5 ml mikro tüpler (örneğin Şekil 2B) test RNA&#39;lar ve kontrol seyreltileri hazırlanır. <ol><li> Viral üretimi deneyi için, bir HIV-1 ifade plazmidinin 10 ng / | il seyreltme hazırlanması ve her bir tüpe 10 ul ekle. Sonraki 5 uM test RNA&#39;lar dilüsyonları ve negatif kontrol RN hazırlamakC. 25 ya da 100 nM nihai konsantrasyonlarda, ilgili tüplere her bir test RNA ve negatif kontrol seyreltme 2.5 ya da 10 ul ekle. </li><li> C: Hücre canlılığı deneyi için 5 uM test RNA dilüsyonları ve pozitif kontrol RNA, düşük molekül ağırlıklı poli I bir 10 mg / ml seyreltme hazırlar. sırasıyla, 100 nM veya 200 ug / ml nihai konsantrasyonları, tekabül eden tüpler test RNA ya da pozitif kontrol RNA dilüsyonları 2 ul ekle. </li><li> immün aktivasyon deneyi için, deney RNA veya adım 1.3.2 hazırlanan pozitif kontrol RNA dilüsyonları 20 ul ekle. sırasıyla, 100 nM veya 200 ug / ml nihai konsantrasyon, tekabül eden tüplere. Aşama 1.3.1 ng 25 ve 100 nihai miktarda vererek, test RNA ekspresyon plazmidleri, deney RNA&#39;lar 5 uM dilüsyonları yerine 10 ng / | il dilüsyonları hazırlamak: edin. 100 adım 1.3.2 ng. ve 1.3.3. </li></ol></li><li> Viral ürünler için, her transfeksiyon tüpüne DMEM 50, 25 ya da 75 ul eklesırasıyla uction, hücre canlılığı ve bağışıklık aktivasyon tahlilleri. Viral üretim deneyleri için, bir sonraki adımdan önce bir biyo-güvenlik seviyesi 3 (BSL3) laboratuvara hücreleri ve hazırlanan transfeksiyon tüpleri getirmek. </li><li> transfeksiyon tüplerine transfeksiyon reaktif sırayla 2 ul ekleyin ve kompleksleri oluşturmak için izin vermek için 15 ila 20 dakika inkübe edin. Belirli transfeksiyon reaktif Malzemesi Tabloya bakınız kullanılacak. </li><li> damla damla hücre kültür plakaları içinde karşılık gelen pozisyonlarda, her mikro tüp tamamını transfeksiyon karışımı ekleyin. Yavaşça girdap ve% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de 48 saat süre ile inkübe edin. </li><li> Hücre kültürü plakaları (Şekil 2C), HIV-1 üretimini (Bölüm 2), hücre canlılığı (bölüm 3) ve immün aktivasyon (bölüm 4) ölçün. </li></ol> 2. Viral Üretim Deneyi <ol><li> inkübatör 24-iyi hücre kültür plakaları çıkarın ve BSL-3 hücre kültürü içindeki girdap plakalar hafifçedavlumbaz. HIV-1 üretimini ölçmek için kullanılacak olan 96-gözenekli düz tabanlı plaka içinde de karşılık gelen her gözden üst fazın 150 ul aktarın. Not: Genel viral miktar deneyleri, enzim-bağlı immünosorbent deneyi (ELISA), 20, ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) 21 yoluyla viral RNA miktarının HIV-1 kapsid proteini (p24) ekspresyonunu ölçmek ve aktivitesinin ölçülmesi bulunmaktadır HIV-1 RT enziminin. 2.2 2.5 HIV-1 RT aktivitesinin 13,15,16 ölçmek için yöntemler açıklar Adımları. </li><li> Aktarım, bir viral bozulması kokteyli 15 (Tablo 1) 25 ul ihtiva eden 96 oyuklu bir plaka gözenekleri içinde karşılık gelen süpernatan 5 ul. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe karışımı ve radyoaktivite iş istasyonuna plaka aktarın. Not: Adım 2.2. Bir radyoaktivite iş istasyonu BSL3 laboratuarda mevcut değilse gereklidir. Plakalar kaldırılması gerekmiyorsaBSL3 laboratuar, 2.3 adıma geçin. ve radyoaktif kokteyl 25 ul yerine viral / radyoaktif bozulması kokteyli (Tablo 1) 50 ul ekle. </li><li> Radyoaktif bir kokteyl 15 (Tablo 1) Hazırlama ve viral süpernatan ve baskıyı kokteyl her çukuruna 25 ul ekle. 2 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Nokta 5 cam elyaf Di Etil Amino Etil (DEAE) Filtermat kağıdı karşılık gelen kareler üzerine reaksiyon karışımının ul ve noktalar 10 dakika kurumasını bekleyin. hiçbir iki numune doğrudan birbirlerine yatılı böylece her meydanda reaksiyon karışımı nokta. Bu aşamada 2.6 dakikada (cpm) başına sayıları belirlerken örnekler arasında çapraz-over önlemeye yardımcı olur. </li><li> Kağıtlar% 95 etanol ile iki kez 1 dakika yıkama yapılmıştır 2x tuzlu su, sodyum sitrat (SSC) tampon maddesi (Tablo 1) 5 dakika için 5 kat yıkayın. kağıtlar kurumaya ve örnek torbalarına bunları mühürlemek için izin verir. </li><li> Klip örnek çanta coBir kaset içine Filtermat kağıt ntaining ve bir mikroplaka sintilasyon sayacı içine kaset takın. Deneyde kullanılan [32 P] dTTP parti için sağlanan referans tarihi ile 32 P cpm okumak için sayaç ayarlayın. plaka haritayı kullanarak okuma ve sayaç başlatmak için hangi örnekler seçin. </li><li> herhangi bir virüs ölçümü yöntemi için, komşu negatif kontrol ile her test RNA için elde edilen değerler bölmek ve test RNA&#39;ların her tekrarında HIV-1 üretiminin yüzde inhibisyonunu elde etmek için 100 ile bu değeri çarpın. Farklı konsantrasyonlarda farklı test RNA karşılaştırma sonuçlarının bir örneği Şekil 3&#39;te verilmektedir. </li></ol> 3. Hücre Canlılık Testi <ol><li> / Ml MTT (3- [4,5-dimetil-2-tiyazolil] -2,5-difenil-2H-tetrazolyum bromid) Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su içinde seyreltildi (inkübatör, 96 gözlü levhalar çıkarın ve 5 mg 20 ul her bir kuyunun DPBS). f inkübeveya 37 ° C&#39;de 3 saat. </li><li> deterjan (% 1 NP-40, izopropanol içinde 4 mM HCI) her ile asitleştirildi izopropanol 150 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe edin. </li><li> Bir mikrolevha spektrofotometre 570 nm&#39;de absorbans belirler. </li><li> bitişik transfeksiyon kontrolü ile her numune için elde edilen değer bölünerek, her pozitif kontrol ve test RNA göreceli MTT metabolizmasını hesaplayın. Farklı test RNA ve pozitif kontrol karşılaştırma sonuçlarının bir örneği Şekil 4&#39;te verilmektedir. </li></ol> 4. Bağışıklık Aktivasyon Testi <ol><li> inkübatör 12-kuyu plakaları kaldırmak ve kültür ortamı aspire. Yavaşça DPBS hücreler iki kez yıkayın ve her bir (proteaz ve fosfataz inhibitörleri, Tablo 1 de dahil olmak üzere), soğuk lisiz tamponu 22 70 ul ekle. Buz üzerinde 10 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> mikro tüpler hücre lizatları aktarın ve hızlı daldırarak bunları dondurmaksıvı nitrojen içinde borular. Numuneler Çözülme ve 3 olmak üzere toplam 2 daha donma çözülme döngüleri için tekrar izin verin. </li><li> Hücre yıkıntıları pelet haline getirildi, 4 ° C&#39;de, 15.700 x g&#39;de 15 dakika boyunca santrifüj lizatları. Yeni bir mikro tüpler süpernatantı aktarın ve Coomassie mavisi (Bradford) yöntemini 23,24 kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin. </li><li> % 10 denatüre edici poliakrilamid jel içinde her bir numunenin proteinin 75 ug çözmek ve daha önce 25,26 tarif edildiği gibi bir nitroselüloz zara transfer. </li><li> Bir membrana elektroforezi ve aktarımı sonra, iki kez distile su ile yıkama, ardından 1 dakika boyunca Ponceau S (Tablo 1) &#39;de membran inkübe edilerek protein bantları görülebilir. 80 ve 55 kDa zar kesmek için bir kılavuz olarak bantlar ve protein merdiven kullanın. Not: Adım 4.4 örnekleri 16 x 18 cm 34 kDa aşağı 2 jelleri çalıştırılabilir, belirtilen pozisyonlarda membran kesip kesip değil kolay şekildeilgi bantları. Alternatif olarak, çeşitli jeller zarı kesme önlemek için aynı örnekleri ile çalıştırılabilir. </li><li> % 0.05 Tween 20 (TBST, Tablo 1) ihtiva eden Tris-tamponlu tuzlu su ile Ponceau S boyama yıkayın. Tamamen zarları kapsayan% 5 yağsız süt ile TBST ilave edin. 1 saat boyunca çalkalama ile, oda sıcaklığında membranlar inkübe edin. </li><li> membranlar inkübe O / N ADAR1 (110 ve 150 kDa), fosfo-PKR (62 kDa) ve fosfo-IRF3 (47-kDa) karşı 1,000&#39;de 1 seyreltilmiş% 3 sığır serum albümini ile TBST (BSA) ve antikorlarda, sırasıyla membran, üst orta ve alt parçalar için. </li><li> Membranlar TBST ile 5 dakika için 5 kat ve 1 saat (5,000 içinde 1 seyreltilmiş),% 5 yağsız süt ve peroksidaz-etiketli keçi anti-tavşan sekonder antikor ile TBST içinde inkübe yıkayın. </li><li> TBST ile 5 dakika boyunca membranlar 5x yıkayın ve üreticinin talimatlarına göre filmler bantları görselleştirmek için elektrokemiluminesan (ECL) çözümü uygulayın. </li><li> filmler protein bantları görselleştirmek sonra bir antikor sıyırma çözeltisi ile 10 dakika boyunca zarın, orta ve alt parçaları yıkayın. ve IRF3 (500 &#39;de 1 olarak), toplam PKR karşı% 3 BSA ile TBST içinde membranlar O / N ve antikor inkübe (1.000 de 1), sırasıyla, orta ve alt parçalar için. Yineleyin 4.8 adımları. ve 4.9. PKR membran (orta), anti-tavşan ikincil antikoru yerine peroksidaz etiketli keçi anti-fare kullanılmıştır. </li><li> TBST ile 5 dakika için membran 5x alt parça yıkayın (5,000 içinde 1 seyreltilmiş) aktine karşı bir antikor ile 1 saat boyunca% 3 BSA ile TBST içinde membran inkübe edin. Yineleyin 4.8 adımları. ve 4.9. anti-tavşan sekonder antikor yerine peroksidaz etiketli keçi anti-fare kullanılmıştır. Farklı test RNA ve pozitif kontrol karşılaştırma sonuçlarının bir örneği Şekil 5&#39;te sağlanmaktadır. Kullanılacak özel antikorlar için Malzemelerin tabloya bakınız. </li></ol>

<ol><li>Hoxie, J. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+and+gene+therapies+for+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Novel cell and gene therapies for HIV.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a007179(2012).</li>
<li>Bobbin, M. L., Burnett, J. C., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+approaches+for+treatment+of+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">RNA interference approaches for treatment of HIV-1 infection.</a> Genome Med. 7, 50(2015).</li>
<li>Allers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+cure+of+HIV+infection+by+CCR5Delta32%2FDelta32+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Evidence for the cure of HIV infection by CCR5Delta32/Delta32 stem cell transplantation.</a> Blood. 117, 2791-2799 (2011).</li>
<li>DiGiusto, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+hematopoietic+stem+cell+based+gene+therapy+for+HIV-1+infection%3A+considerations+for+proof+of+concept+studies+and+translation+to+standard+medical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Development of hematopoietic stem cell based gene therapy for HIV-1 infection: considerations for proof of concept studies and translation to standard medical practice.</a> Viruses. 5, 2898-2919 (2013).</li>
<li>Burke, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Cellular+Resistance+to+HIV-1+Infection+In+Vivo+Using+a+Dual+Therapeutic+Lentiviral+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Engineering Cellular Resistance to HIV-1 Infection In Vivo Using a Dual Therapeutic Lentiviral Vector.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 4, e236(2015).</li>
<li>DiGiusto, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-based+gene+therapy+for+HIV+with+lentiviral+vector-modified+CD34%28%2B%29+cells+in+patients+undergoing+transplantation+for+AIDS-related+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma.</a> Sci Transl Med. 2, 36ra43(2010).</li>
<li>Scarborough, R. J., Gatignol, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+and+Ribozymes%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">HIV and Ribozymes.</a> Adv Exp Med Biol. 848, 97-116 (2015).</li>
<li>Eekels, J. J., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+durable+treatment+of+HIV-1+infection+using+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Mol+Biol+Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">Toward a durable treatment of HIV-1 infection using RNA interference.</a> Prog Mol Biol Transl Sci. 102, 141-163 (2011).</li>
<li>Blazquez, L., Fortes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U1+interference+%28U1i%29+for+Antiviral+Approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">U1 interference (U1i) for Antiviral Approaches.</a> Adv Exp Med Biol. 848, 51-69 (2015).</li>
<li>McIntyre, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((96+shRNAs+designed+for+maximal+coverage+of+HIV-1+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">96 shRNAs designed for maximal coverage of HIV-1 variants.</a> Retrovirology. 6, 55(2009).</li>
<li>Sajic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+modified+U1+snRNAs+to+inhibit+HIV-1+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Use of modified U1 snRNAs to inhibit HIV-1 replication.</a> Nucleic Acids Res. 35, 247-255 (2007).</li>
<li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHAPE-directed+discovery+of+potent+shRNA+inhibitors+of+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">SHAPE-directed discovery of potent shRNA inhibitors of HIV-1.</a> Mol Ther. 20, 820-828 (2012).</li>
<li>Scarborough, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Conserved+Target+Site+in+HIV-1+Gag+RNA+is+Accessible+to+Inhibition+by+Both+an+HDV+Ribozyme+and+a+Short+Hairpin+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">A Conserved Target Site in HIV-1 Gag RNA is Accessible to Inhibition by Both an HDV Ribozyme and a Short Hairpin RNA.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 3, e178(2014).</li>
<li>Lainé, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+cleavage+of+HIV-1+RNA+by+new+SOFA-HDV+ribozymes+and+their+potential+to+inhibit+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo cleavage of HIV-1 RNA by new SOFA-HDV ribozymes and their potential to inhibit viral replication.</a> RNA Biol. 8, 343-353 (2011).</li>
<li>Scarborough, R. J., Lévesque, M. V., Perreault, J. P., Gatignol, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Evaluation+of+Clinically+Relevant+SOFA-HDV+Ribozymes+Targeting+HIV+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Design and Evaluation of Clinically Relevant SOFA-HDV Ribozymes Targeting HIV RNA.</a> Methods Mol Biol. 1103, 31-43 (2014).</li>
<li>Scarborough, R. J., Adams, K. L., Daher, A., Gatignol, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+Inhibition+of+HIV-1+Production+by+Short+Hairpin+RNAs+and+Small+Interfering+RNAs+Targeting+a+Highly+Conserved+Site+in+HIV-1+Gag+RNA+Is+Optimized+by+Evaluating+Alternative+Length+Formats%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Effective Inhibition of HIV-1 Production by Short Hairpin RNAs and Small Interfering RNAs Targeting a Highly Conserved Site in HIV-1 Gag RNA Is Optimized by Evaluating Alternative Length Formats.</a> Antimicrob Agents Chemother. 59, 5297-5305 (2015).</li>
<li>Sarzotti-Kelsoe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+validation+of+the+TZM-bl+assay+for+standardized+assessments+of+neutralizing+antibodies+against+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization and validation of the TZM-bl assay for standardized assessments of neutralizing antibodies against HIV-1.</a> J Immunol Methods. 409, 131-146 (2014).</li>
<li>Campos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+lasting+control+of+viral+rebound+with+a+new+drug+ABX464+targeting+Rev+-+mediated+viral+RNA+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Long lasting control of viral rebound with a new drug ABX464 targeting Rev - mediated viral RNA biogenesis.</a> Retrovirology. 12, 1-15 (2015).</li>
<li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR%2FCas9+system+inactivates+latent+HIV-1+proviral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">The CRISPR/Cas9 system inactivates latent HIV-1 proviral DNA.</a> Retrovirology. 12, 22(2015).</li>
<li>Bounou, S., Leclerc, J. E., Tremblay, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+host+ICAM-1+in+laboratory+and+clinical+strains+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+increases+virus+infectivity+and+CD4%28%2B%29-T-cell+depletion+in+human+lymphoid+tissue%2C+a+major+site+of+replication+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Presence of host ICAM-1 in laboratory and clinical strains of human immunodeficiency virus type 1 increases virus infectivity and CD4(+)-T-cell depletion in human lymphoid tissue, a major site of replication in vivo.</a> J Virol. 76, 1004-1014 (2002).</li>
<li>Shan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+PCR+assay+for+quantification+of+HIV-1+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22+J+Virol%22%5BJournal%5D)">A novel PCR assay for quantification of HIV-1 RNA.</a> J Virol. 87, 6521-6525 (2013).</li>
<li>Clerzius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PKR+activator%2C+PACT%2C+becomes+a+PKR+inhibitor+during+HIV-1+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">The PKR activator, PACT, becomes a PKR inhibitor during HIV-1 replication.</a> Retrovirology. 10, 96(2013).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Stoscheck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Quantitation of protein.</a> Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).</li>
<li>Battisti, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additive+activity+between+the+trans-activation+response+RNA-binding+protein%2C+TRBP2%2C+and+cyclin+T1+on+HIV+type+1+expression+and+viral+production+in+murine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res+Hum+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Additive activity between the trans-activation response RNA-binding protein, TRBP2, and cyclin T1 on HIV type 1 expression and viral production in murine cells.</a> AIDS Res Hum Retroviruses. 19, 767-778 (2003).</li>
<li>Bannwarth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+regulation+of+TRBP1+promoter+by+NF-Y+transcription+factor+in+lymphocytes+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-specific regulation of TRBP1 promoter by NF-Y transcription factor in lymphocytes and astrocytes.</a> J Mol Biol. 355, 898-910 (2006).</li>
<li>Clerzius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADAR1+interacts+with+PKR+during+human+immunodeficiency+virus+infection+of+lymphocytes+and+contributes+to+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">ADAR1 interacts with PKR during human immunodeficiency virus infection of lymphocytes and contributes to viral replication.</a> J Virol. 83, 10119-10128 (2009).</li>
<li>Burugu, S., Daher, A., Meurs, E. F., Gatignol, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+translation+and+its+regulation+by+cellular+factors+PKR+and+PACT%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">HIV-1 translation and its regulation by cellular factors PKR and PACT.</a> Virus Res. 193, 65-77 (2014).</li>
<li>ter Brake, O., Konstantinova, P., Ceylan, M., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+HIV-1+with+RNA+interference%3A+a+multiple+shRNA+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Silencing of HIV-1 with RNA interference: a multiple shRNA approach.</a> Mol Ther. 14, 883-892 (2006).</li>
<li>Naito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+design+and+validation+of+antiviral+siRNA+for+targeting+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Optimal design and validation of antiviral siRNA for targeting HIV-1.</a> Retrovirology. 4, 80(2007).</li>
<li>Mandal, D., Feng, Z., Stoltzfus, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excessive+RNA+splicing+and+inhibition+of+HIV-1+replication+induced+by+modified+U1+small+nuclear+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Excessive RNA splicing and inhibition of HIV-1 replication induced by modified U1 small nuclear RNAs.</a> J Virol. 84, 12790-12800 (2010).</li>
<li>Chang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+expression+and+HIV-1+inhibition+of+chimeric+tRNA%28Lys3%29-ribozymes+under+dual+U6+snRNA+and+tRNA+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Enhanced expression and HIV-1 inhibition of chimeric tRNA(Lys3)-ribozymes under dual U6 snRNA and tRNA promoters.</a> Mol Ther. 6, 481-489 (2002).</li>
<li>Chang, L. J., Liu, X., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+siRNAs+targeting+multiple+highly+conserved+RNA+sequences+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Lentiviral siRNAs targeting multiple highly conserved RNA sequences of human immunodeficiency virus type 1.</a> Gene Ther. 12, 1133-1144 (2005).</li>
<li>Daniels, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+RRE+RNA+acts+as+an+RNA+silencing+suppressor+by+competing+with+TRBP-bound+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 RRE RNA acts as an RNA silencing suppressor by competing with TRBP-bound siRNAs.</a> RNA Biol. 12, 123-135 (2015).</li>
<li>Castanotto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+delivery+of+small+interfering+RNAs+reduces+RNAi+efficacy+by+selective+incorporation+into+RISC%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Combinatorial delivery of small interfering RNAs reduces RNAi efficacy by selective incorporation into RISC.</a> Nucleic Acids Res. 35, 5154-5164 (2007).</li>
<li>Vickers, T. A., Sabripour, M., Crooke, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U1+adaptors+result+in+reduction+of+multiple+pre-mRNA+species+principally+by+sequestering+U1snRNP%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">U1 adaptors result in reduction of multiple pre-mRNA species principally by sequestering U1snRNP.</a> Nucleic Acids Res. 39, e71(2011).</li>
<li>Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Viral+Entry+Assays+for+the+Identification+and+Evaluation+of+Antiviral+Compounds%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds.</a> J Vis Exp. , (2015).</li>
<li>Riss, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRiss%2C+TL+%22Assay+Guidance+Manual%22">Assay Guidance Manual</a>. Sittampalam, G. S., et al. , (2004).</li>
<li>Reynolds, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+the+interferon+response+by+siRNA+is+cell+type-+and+duplex+length-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">Induction of the interferon response by siRNA is cell type- and duplex length-dependent.</a> Rna. 12, 988-993 (2006).</li>
<li>Whitehead, K. A., Dahlman, J. E., Langer, R. S., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+or+stimulation%3F+siRNA+delivery+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Chem+Biomol+Eng%22%5BJournal%5D)">Silencing or stimulation? siRNA delivery and the immune system.</a> Annu Rev Chem Biomol Eng. 2, 77-96 (2011).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Tanımlanan HIV-1 üretimi deneyi HEK293T hücreleri (Şekil 2) kullanılarak gerçekleştirilmiştir ve etkili bir ribozim 13 shRNA 10,29, siRNA 30 ve U1i RNA 11,31 hedef sitesi HIV-1 RNA taramak için kullanılan deneyler benzer edildi. HIV-1 üretimini ölçmek için çeşitli yöntemler kullanılarak, çalışmaların çoğu, aday RNA&#39;lar ile bir HIV-1 ifade plazmidinin Müşterek transfeksiyon sonrasında, virüs üretimini 48 saat ölçtük. HIV-1 üretiminin ardından, olgun virionl...

Mevcut HIV-1 terapileri sınırlaması, kronik hastalığın ilerlemesini engellemek için de uygulanabilir olmasıdır. HIV-1 karşı T lenfosit veya hematopoietik kök hücre nakli, ilaç tedavisi 1,2 yokluğunda HIV-1 replikasyonu, uzun süreli kontrolünü sağlama potansiyeline sahiptir ve aynı zamanda, bir HIV-1 ilacı elde etmek için etkili bir yaklaşım olabilir 3.. HIV-1 replikasyonu dirençli hücre oluşturmak için bir yolu, otolog transplant 4 sırasında enfekte bireyin hücrelerine anti-HIV-1 RNA veya peptitler kodlayan bir ya da daha fazla gen eklemektir. Çeşitli aday anti-HIV-1 genlerinin herhangi bir tek genin HIV-1 direnç gelişmesini önlemek için, iki adet 5 ya da üç 6 kombinasyonları bazı giren klinik çalışmalarda dizayn edilmiştir. Anti-HIV-1 RNA immün yanıtları ortaya çıkarmak için düşük potansiyel ve onlar için kombine gen terapisi için en iyi adaylar arasındaÇok kısa bir gen sekanslarından transkribe edilmektedir. Bazı anti-HIV-1 RNA, viral giriş ve bütünleşmesini hedeflemek üzere dizayn edilmiştir. Bununla birlikte, en anti-HIV-1 RNA, viral yaşam çevriminde sonrası entegrasyon adımlar (Şekil 1) hedefler. Sonrası entegrasyon inhibitörleri ribozimler 7, 8 ve shRNAs U1i RNA&#39;lar 9 olarak, HİV-1 düzenleyici proteinleri tat veya rev 1 ve antisens dayalı RNA hedef HIV-1 RNA farklı sitesi hedef, yem RNA içerir. Anti-HIV-1 RNA etkinliğini karşılaştırmak için kullanılmış olan yöntemler genlerin aday RNA&#39;lar kodlayan ve viral geçici aday RNA ifade eden plasmidler ile transfekte edilen hücrelerde üretim ve HIV-1 ifade plazmid ölçüm ile dönüştürülmüş hücrelerin viral replikasyonu izlenmesini, 10 -13. Daha önce yeni bir ribozim, hedef siteye 13-15 HIV-1 RNA taranması için bir HIV-1 üretimi deneyi kullandık. Bu yöntemler beri bir RNA biçimini optimize etmek için rafine edilmişgirişim molekülü, bir shRNA plazmid DNA&#39;sından ifade edilen ya da sentetik bir siRNA 16 olarak verilir. Deney insan embriyonik böbrek (HEK) 293T hücrelerinde olgun virüs üretimini ölçer ve (Şekil 1), HIV-1 replikasyon döngüsünde sonrası entegrasyon evreleri hedefleyen önleyicilerinin etkilerini karşılaştırmak için kullanılabilir. Ön entegrasyon basamakları hedefleyen inhibitörleri, böyle bir tzm-bl hücre enfektivite tahlil 17 gibi alternatif deneyler antiviral etkinliğini değerlendirmek için gereklidir. Klinikte anti-HIV-1 RNA teslimi için önemli güvenlik kaygıları, insan RNA veya protein ve doğuştan gelen bağışıklık sensör aktivasyonu üzerindeki potansiyel hedef dışı etkiler bulunmaktadır. Anti-HIV-1 siRNA&#39;lar toksisitesini değerlendirmek için, farklı hücre hatları 16 bir hücre canlılığı deneyi kullandık. Ayrıca, iki iplikçikli bir RNA bağışıklık sensörler aktivasyonu ölçülmüştür RNA aktive edilmiş protein kinaz R (PKR) reseptör 3 (TLR3) Toll benzeri gibi exinterferon pression geni ADAR1 P150 uyarılmış. Bu deneyler, anti-HIV-1 RNA etkinliği hücre canlılığı veya immün sensör aktivasyon dolaylı etkileri nedeniyle olmadığını teyit etmek için kullanılabilir. Ayrıca, daha da geliştirilmesi, potansiyel toksisite aday RNA&#39;ların hariç yararlıdır. Aşağıdaki protokollerde, prosedürler yeni tedavi RNA&#39;lar belirlemek ve mevcut biçimi açıklanmıştır optimize etmek. Yöntemleri, HIV-1 replikasyonu tarama RNA temelli sonrası entegrasyon inhibitörleri için faydalı olan ve bu tür viral RNA 18 ya da CRISPR Rev aracılı ihracat hedefleme küçük moleküller gibi diğer sonrası entegrasyon inhibitörlerinin taranması için adapte edilebilir / tasarlanan Cas sistemleri entegre hedef HIV-1 DNA&#39;sı 19.

<table><tbody><tr><td>DMEM HyClone</td><td>GE Sağlık</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS HyClone</td><td>GE Sağlık</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin Gibco</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü plakaları, 96 kuyulu, 24 kuyulu, 6 kuyulu.</td><td>Corning</td><td>353075, 353047, 353043</td><td></td></tr><tr><td>Mikro tüpler Axygen</td><td>Corning</td><td>311-08-051</td><td></td></tr><tr><td>Düşük moleküler ağırlıklı Poly I:C</td><td>InvivoGen</td><td>3182-29-6</td><td></td></tr><tr>Sentetik RNA'lar için<td>DharmaFECT-1</td><td>Dharmacon</td><td>T-2001-01</td><td>transfeksiyon reaktifi</td></tr><tr><td>TransIT-LT1</td><td>RNA ekspresyon plazmitleri için</td> <td>Mirus</td><td>MIR 2300</td> transfeksiyon reaktifi</tr><tr><td>Nonidet P40 (NP-40)</td><td>USB</td><td>19628</td><td></td></tr><tr><td>[32P]dTTP</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU505H</td><td></td></tr><tr><td>poli(A) RNA şablonu&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10108626001</td><td></td></tr><tr><td>oligo(dT)12-18 DNA astarı</td><td>Thermo Fisher</td><td>18418-012</td><td></td></tr><tr><td>DEAE filtre matı kağıdı&nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>1450-522</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplaka sintilasyon sayacı</td><td>Perkin Elmer</td><td>1450-024</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2128</td><td></td></tr><tr><td>DPBS HyClone</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplaka spektrofotometresi</td><td>Bio-rad</td><td>1706930</td><td></td></tr><tr><td>Lizis tampon tabletleri</td><td>Roche</td><td>4693159001, 4906837001</td><td>proteaz ve fosfataz inhibitörleri</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Bradford reaktifi</td><td>Bio-rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Jel çalışma odası</td><td>Hoefer</td><td>SE600</td><td></td></tr><tr><td>Yarı kuru transfer hücresi</td><td>Bio-rad</td><td>1703940</td><td></td></tr><tr><td>Protein merdiveni EZ-Run</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP3603-500</td><td></td></tr><tr><td>Nitroselüloz membran</td><td>Bio-rad</td><td>162-0094</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-1006</td><td></td></tr><tr><td>Antikor sıyırma çözeltisi</td><td>Millipore</td><td>2504</td><td></td></tr><tr><td>ECL - Pierce</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PI32106 Dr. BL Bass</td>fosfo-T446-PKR antikoru Abcam ab32036<td></td> fosfo-S396-IRF3 antikorundan ADAR1 antikoru <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Hücre Sinyali Dr. A. Hovanessian IRF3 antikorundan 4947 PKR antikoru Hücre Sinyalizasyonu 11904 Aktin antikoru <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Millipore</td><td>MAB1501</td><td></td></tr><tr><td>Peroksidaz etiketli keçi tavşan önleyici</td><td>KPL</td><td>474-1506</td><td></td></tr><tr><td>Peroksidaz etiketli keçi fare karşıtı</td><td>KPL</td><td>474-1806</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6226-79-5</td><td></td></tr></tbody></table>

bir gen ya da ilaç terapisinde kullanım için, hiv-1 üretim yapan rna&#39;lar etkinlik ve toksisite değerlendirilmesi

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

HIV-1 replikasyon döngüsündeki entegrasyon sonrası adımları hedefleyen küçük RNA tedavileri, gen terapisi için en iyi adaylar arasındadır ve HIV-1 enfeksiyonu için ilaç tedavileri olarak kullanılma potansiyeline sahiptir. Entegrasyon sonrası inhibitörler arasında ribozimler, kısa firkete (sh) RNA'lar, küçük enterferans yapan (si) RNA'lar, U1 girişim (U1i) RNA'ları ve RNA aptamerleri bulunur. Bunların çoğu, bir HIV-1 ekspresyon plazmidi ile geçici ko-transfeksiyon testleri kullanılarak tanımlanmıştır ve bazıları klinik çalışmalara ilerlemiştir. Etkinlik ölçümlerine ek olarak, küçük RNA'lar, insan RNA'larının ekspresyonunu etkileme, hücre büyümesini ve / veya farklılaşmasını değiştirme ve doğuştan gelen bağışıklık tepkilerini ortaya çıkarma potansiyelleri açısından değerlendirilmiştir. Burada açıklanan protokollerde, HIV-1 replikasyon döngüsündeki entegrasyon sonrası adımları hedefleyen RNA moleküllerinin etkinliğini ve toksisitesini değerlendirmek için tasarlanmış bir dizi geçici transfeksiyon testi açıklanmaktadır. Bu tahlilleri, yeni ribozimleri tanımlamak ve HIV-1 RNA'yı hedefleyen shRNA'ların ve siRNA'ların formatını optimize etmek için kullandık. Yöntemler, yeni anti-HIV-1 RNA'larını taramak için yararlı olan ve HIV-1 replikasyonunun diğer entegrasyon sonrası inhibitörlerini taramak için uyarlanabilen hızlı bir test seti sağlar.

Prosedürleri genel şematik bir üç test RNA ve Şekil 2B&#39;de sağlanan bir kontrol RNA için bir örnek transfeksiyon planı, Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. Viral üretimi ve hücre yaşayabilirliği tahlilleri için, her bir test yapı için Okuması bir negatif kontrol normalize edilir. Her test RNA bitişiğindeki negatif kontrol normalize böylece çoğaltır, setler halinde transfekte edilir. Bu durum, örneğin, negatif kontroller tüm birinci transfekte edilir, eğer...

HIV-1 replikasyon döngüsünün entegrasyon sonrası adımlarını hedefleyen RNA moleküllerinin etkinliğini ve toksisitesini değerlendirme yöntemleri açıklanmıştır. Bu yöntemler, yeni molekülleri taramak ve mevcut moleküllerin formatını optimize etmek için kullanışlıdır.

Bir gen ya da ilaç terapisinde kullanım için, HIV-1 üretim yapan RNA&#39;lar etkinlik ve toksisite Değerlendirilmesi

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Bu prosedürün genel amacı, HIV-1 üretimini hedefleyen yeni RNA'ların etkinliğini ve toksisitesini karşılaştırmaktır. Bu yöntem; kısa saç tokası (short hairpin) veya küçük interferans RNA'lar, ribozimler ve RNA tuzakları (RNA decoys) gibi, HIV-1 gen veya ilaç tedavilerinde kullanılacak yeni RNA moleküllerinin belirlenmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, birkaç yeni RNA tasarımının hızlı bir geri dönüş süresiyle eş zamanlı olarak taranabilmesidir.Bu yöntem HIV için yeni RNA ilaçlarını veya gen terapisini değerlendirmek üzere tasarlanmış olsa da, küçük moleküller veya CRISPR görevleri gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu yönteme dair ilk fikri, çok sayıda ribozimi anti-HIV etkileri açısından taramak için deneyler kurarken geliştirdik. Başlamak için, %10 FPS ve %1 penisilin streptomisin içeren DMEM içerisinde, mililitre başına 2 × 10⁵ hücre konsantrasyonunda insan embriyonik böbrek 293T hücresi süspansiyonu hazırlayın.Viral üretim, hücre canlılığı ve immün aktivasyon analizleri için sırasıyla 24, 96 ve 12 kuyucuklu plakaların her bir kuyucuğuna 500, 100 ve 1,000 µL hücre süspansiyonu ekleyin. Plakaları hafifçe çalkalayın ve %5 CO2 içeren 37 °C ortamda, %50 ila %70 konfluens düzeyine ulaşana kadar gece boyunca inkübe edin. Viral üretim analizi için, bir HIV-1 ekspresyon plazmidinin 10 ng/µL konsantrasyonunda bir dilüsyonunu hazırlayın ve her bir analiz tüpüne 10 µL ekleyin.Ardından, test RNA'larının beş mikromolar dilüsyonlarını ve bir negatif kontrol RNA dilüsyonu hazırlayın. Daha sonra, 25 nanomolar veya 100 nanomolar final konsantrasyonlar elde etmek için her bir test RNA ve negatif kontrol dilüsyonundan sırasıyla 2,5 mikrolitre veya 10 mikrolitre ilgili tüplere ekleyin. Hücre canlılığı analizi için, test RNA'larının beş mikromolar dilüsyonlarını ve pozitif kontrol RNA olan düşük molekül ağırlıklı poly(I:C)'nin 10 miligram/mililitre dilüsyonunu hazırlayın. Test RNA veya pozitif kontrol RNA dilüsyonlarından sırasıyla 100 nanomolar veya 200 mikrogram/mililitre final konsantrasyonlar için ilgili tüplere iki mikrolitre ekleyin.İmmün aktivasyon deneyi için, hücre canlılığı deneyi için hazırlandığı şekilde, test RNA veya pozitif kontrol RNA dilüsyonlarından sırasıyla 100 nanomolar veya 200 micrograms per milliliter final konsantrasyonlar için karşılık gelen tüplere 20 microliters ekleyin. Ardından, viral üretim, hücre canlılığı ve immün aktivasyon deneyleri için her bir transfeksiyona tüpüne sırasıyla 50, 25 veya 75 microliters DMEM ekleyin. Viral üretim deneyleri için, bir sonraki adımdan önce hücreleri ve hazırlanan transfeksiyon tüplerini biyogüvenlik seviyesi üç veya BSL-3 laboratuvarına taşıyın.Transfeksiyon reaktifinden iki mikrolitre sırayla transfeksiyon tüplerine ekleyin ve komplekslerin oluşması için 15 ila 20 dakika inkübe edin. Her mikrotüpteki transfeksiyon karışımının tamamını, hücre kültürü plakalarının karşılık gelen konumlarına damla damla ekleyin. Plakaları nazikçe dairesel hareketlerle sallayın ve 37 °C'de %5 karbondioksit altında 48 saat boyunca inkübe edin.Viral üretim analizini gerçekleştirmek için, 24 kuyucuklu hücre kültürü plakalarını inkübatörden çıkardıktan sonra BSL-3 hücre kültürü davlumbazına aktarın. Plakaları nazikçe çalkalayın ve ardından HIV-1 üretimini miktarlandırmak için kullanılacak 96 kuyucuklu düz tabanlı bir plakanın ilgili kuyucuklarına, her kuyucuktan 150 microliters süpernatan aktarın. Beş microliters süpernatanı, 25 microliters viral parçalama kokteyli içeren 96 kuyucuklu bir plakanın ilgili kuyucuklarına aktarın.Karışımı oda sıcaklığında beş dakika inkübe ettikten sonra, plakayı bir radyoaktivite çalışma istasyonuna aktarın. Ardından, radyoaktif bir kokteyl hazırlayın ve viral süpernatan ile parçalama kokteyli bulunan her bir kuyucuğa 25 µL ekleyin. Plakaları 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin.Reaksiyon karışımının beş mikrolitresini cam fiber/DEAE filtre mat kağıdındaki karşılık gelen karelere damlatın ve lekelerin 10 dakika boyunca kurumasına izin verin. Kağıtları beş kez, her biri beş dakika sürecek şekilde 2x SSC tamponu ile yıkayın ve ardından iki kez birer dakika boyunca %95 etanol ile yıkayın. Kağıtları numune torbalarına mühürlemeden önce kurumaya bırakın.Filtre mat kağıdı içeren örnek torbalarını bir kasete tutturun ve kaseti bir mikroplaka sintilasyon sayacına yerleştirin. Ardından sayacı başlatın. Herhangi bir viral kantifikasyon yöntemi için, her bir test RNA'sı için elde edilen değerleri bitişikteki negatif kontrole bölün ve test RNA'larının her bir replikası için HIV-1 üretiminin yüzde inhibisyonunu elde etmek için bu değeri 100 ile çarpın.Hücre canlılık testi gerçekleştirmek için, 96 kuyucuklu plakaları inkübatörden çıkardıktan sonra her kuyucuğa 20 µL 5 mg/mL MTT ve DPBS ekleyin. Ardından plakaları 37 °C'de üç saat boyunca inkübe edin. Her kuyucuğa 150 µL deterjanlı asitlendirilmiş izopropanol ekleyin ve plakaları oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin.Ardından, 570 nanometredeki absorbansı belirlemek için bir mikroplaka spektrofotometresi kullanın. Her bir pozitif kontrol ve test RNA'sı için, her örnekten elde edilen değeri ilgili transfeksiyon kontrolüne bölerek göreceli MTT metabolizmasını hesaplayın. İmmün aktivasyon analizi için, 12 kuyucuklu plakaları inkübatörden çıkardıktan sonra kültür ortamını aspire edin ve hücreleri nazikçe iki kez yıkamak için DPBS kullanın.Ardından, her bir kuyucuğa proteaz ve fosfataz inhibitörleri içeren 70 µL soğuk lizis tamponu ekleyin ve plakaları 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Hücre lizatlarını mikrotüplere aktarın ve tüpleri sıvı azota daldırarak hızlıca dondurun. Örneklerin çözülmesine izin verdikten sonra, toplam üç dondurma-çözme döngüsü olacak şekilde onları iki kez daha dondurup çözün.Ardından, hücre kalıntılarını çöktürmek için lizatları 15.700 ×g'de ve 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Daha sonra, elektroforez ve bir membrana aktarım işlemlerinin ardından, membranı bir dakika boyunca Ponceau S içinde inkübe ederek protein bantlarını görünür hale getirin. Sonrasında membranı çift distile su ile yıkayın.Membranı 80 ve 55 kilodalton seviyelerinden kesmek için bantları ve protein merdivenini kılavuz olarak kullanın. Şimdi, Ponceau S boyamasını temizlemek için %0,05 TWEEN 20 içeren TBS veya TBST kullanın. Membranları tamamen kaplayacak şekilde %5 yağsız süt içeren TBST ekleyin ve oda sıcaklığında, ajitasyon altında bir saat boyunca inkübe edin.Membranları, sırasıyla membranın üst, orta ve alt parçaları için 1:1.000 oranında seyreltilmiş ADAR, phosphor-PKR ve phosphor-IRF3 antikorları içeren %3 BSA'lı TBST içine aktarın. Ajitasyon eşliğinde 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi sabah, membranları beşer dakikalık beş yıkama ile TBST kullanarak yıkayın ve ardından %5 yağsız süt içeren TBST ve 1:5.000 oranında peroksidaz işaretli keçi anti-tavşan sekonder antikorlar ile bir saat boyunca inkübe edin.Protein bantları filmler üzerinde görselleştirildikten sonra, membranın orta ve alt parçalarını 10 dakika boyunca bir stripping solüsyonu ile yıkayın; ardından membranın orta parçasını PKR antikorları ile, alt parçasını ise IRF3 antikorları ile inkübe edin. Pozitif kontrol olarak, alt membranı metin protokolüne uygun şekilde Actin antikorları ile probe edin. Deneylerin genel şeması, üç test RNA'sı ve bir kontrol RNA'sı için örnek bir transfeksiyon planı ile birlikte burada gösterilmiştir.Viral üretim ve hücre canlılığı analizleri için, her bir test konstrüktünün okuma değeri negatif bir kontrole göre normalize edilir. HIV-1 suşu NL4-3 eksprese eden bir plazmit ile transfekte edilmiş hücrelerdeki HIV-1 üretim analizi kullanılarak, burada gösterilen siRNA'lardan biriyle ko-transfekte edilen hücrelerdeki RT aktivitesi yüzdesi, uzun bir Dicer substratı anlamsız siRNA ile transfekte edilen hücrelerle karşılaştırılmış ve böylece HIV-1 RNA'sındaki korunmuş bir bölgeyi hedefleyen RNA interferans moleküllerinin optimal uzunluğu belirlenmiştir. Tespit edilen en etkili siRNA'lar kullanılarak, transfekte edilen hücreler için MTT metabolizma yüzdesi belirlenmiştir.Çift zincirli RNA olan poly(I:C), hücre canlılığını yalnızca en yüksek dozda azalttı. HIV-1 RNA'sındaki 1498 bölgesini hedefleyen siRNA'lar için, uzunluklarından bağımsız olarak, hücre canlılığında anlamlı bir azalma gözlemlenmedi. Burada Western blot ile gösterildiği üzere, aynı RNA seti immün aktivasyon analizinde değerlendirildi.poly(I:C)'nin ADAR1-p150 ekspresyonunu aktive ettiği ve PKR ile IRF3 fosforilasyonunu indüklediği koşullar altında, test edilen RNA'ların hiçbirinde herhangi bir inaktivasyon belirteci üzerinde anlamlı bir etki gözlemlenmemiştir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde yürütüldüğü takdirde yedi günde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, transfeksiyon için hem RNA hem de DNA'nın yüksek kaliteli preparatlarının kullanılması önemlidir.Ayrıca, uygun negatif ve pozitif kontrolleri dahil etmek için. Bu prosedürün ardından, potansiyel anti-HIV adaylarının uzun süreli etkinliğini ve toksisitesini değerlendirmek için transdükte edilmiş hücrelerin HIV enfeksiyonu gibi diğer yöntemler kullanılabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, HIV RNA'sında erişilebilir ve korunmuş bir hedef bölge belirlememize ve burayı hedefleyen ribozimlerin, shRNA'ların ve siRNA'ların formatlarını optimize etmemize olanak sağlamıştır.Bu videoyu izledikten sonra, HIV üretimini hedefleyen yeni RNA adaylarının etkinliğinin viral üretim analiziyle ve potansiyel toksisitesinin immün aktivasyon ve hücre canlılığı analizleriyle nasıl hızlı bir şekilde taranacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. HIV ve radyoaktif olarak işaretlenmiş nükleotidlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu prosedür uygulanırken, sertifikalı biyogüvenlik ve radyoaktivite laboratuvarlarının kullanılması gibi önlemler her zaman alınmalıdır.

evaluation-efficacy-toxicity-rnas-targeting-hiv-1-production-for-use

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Günümüzde HIV-1 stratejileri, viral bir yaşam döngüsü bastırmak için değil, etkili bir şekilde enfeksiyonu ortadan kaldırmak hareket ederler. Burada göstermektedir ki enfekte hücreleri genom bir mühendislik recombinase verimli tüketim entegre HIV-1 proviral DNA.

Röportaj: Evolved Recombinase kullanarak HIV-1 Proviral DNA eksizyonu

Nanomole afinite ile HIV 1BA-L gp120 karşı çeşitli 2'-Fluoro RNA aptamers bir RNA kütüphanesi ile izole edilmiştir.

Hücre tipi siRNA teslimat için özel anti-HIV gp120 aptamers Geliştirme

HIV-1 coreceptor kullanımının tahmin antiretroviral ilaçlara, örneğin coreceptor antagonistlerinin yeni bir sınıfını idaresi için gereklidir. Bu, bir dizi analizi ile...

Bir Genotipik Yöntemi&#39;ne Dizi Analizi ile HIV-1 coreceptor Kullanımı (tropizm) Tahmin

RNA müdahalesi (RNAi) gen nakavt üzerinden pek çok avantajı sahip ve geniş gen işlevsel çalışmalarda bir araç olarak kullanılmıştır. DNA vektör tabanlı RNAi teknolojisi buluşu uzun vadeli ve olası indüklenebilir gen Knockdown yaptı, hem de gen susturulması fizibilite...

Kanser gen Fonksiyon Eğitim için DNA vektör tabanlı RNA Girişim

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

Burada tarif ve hücresel sitotoksisitesi bileşiklerin hızlı ve doğru tarama için izin tek tur enfekte edebilirlik analizleri, kendi hücresel sitotoksisiteye (CC 50) tespit etmek ve WT ve ilaç dirençli HIV-1 karşı IC50 değerleri.

HIV ters transkriptaz ve integraz inhibitörleri hızlı taranması

Burada bir iletişim kuralı açıklamak yüksek üretilen iş RNAi tarama oncolytic virüs tedavisi geliştirmek için manipüle edilebilir ana hedefleri ortaya çıkarmak için istihdam için özellikle rhabodvirus ve vaksinia virüs tedavisi, ama -ebilmek var olmak diğer oncolytic için kolayca adapte virüs platformlar veya virüs çoğaltma genellikle modüle ana bilgisayar genler keşfetmek için.

Tedavi Oncolytic virusu modüle ana faktörleri tanımlamak için genom çapında RNAi tarama

HIV verimli yeniden etkinleştirme işlev değerlendirmesi ve gizli proviruses boşluk için yüksek aktarım protokolü açıklanan ve müdahaleler HIV transkripsiyon üzerinde etkisini test ve yapıştırma uygulanır. Soldan sağa dayalı transkripsiyon ajanlara geri ve yapıştırma gecikme etkisi temsilcisi sonuçları sağlanır.

Vitro değerlendirme HIV transkripsiyon ve yapıştırma ajanları geri gecikme süresi yüksek işlem hacmi

Biz nesil ve insanlaşmış ve insan immün yetmezlik virüs enfekte NOG fare modeli kök hücre nakli, intravajinal insan immün yetmezlik virüsü maruz kalma ve damlacık dijital PCR RNA dayalı değerlendirilmesi için bir protokol geliştirdik Miktar.

Intravajinal HIV Maruziyeti ve HIV Enfeksiyonu Tedavisi için İnsanize NOG Fareler

Burada, gen tedavisi vektörlerinin klinik gelişimini desteklemek için damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonu ile insan gözyaşlarında adeno ilişkili viral vektörlerin uyumlu tespitinde iyi laboratuvar uygulamalarının geliştirilmesi ve doğrulanması için bir protokol sunuyoruz.

Gözyaşlarının Biyodökülme Çalışmalarında Adeno-İlişkili Viral Vektörlerin Tespiti için Doğrulanabilir Bir Damlacık Dijital Polimeraz Zincir Reaksiyonu Testi

Bu çalışma, Numaralandırılmış Etravirin'i HIV için umut verici bir terapötik ajan olarak tanımlamak için in silico stratejiler kullanmıştır. Moleküler etkileşimler ve dinamikler hakkındaki bulgularımız, olası HIV tedavi alternatifleri olarak yeni NNRTI'lerin rasyonel tasarımını desteklemektedir.

Nükleotid Olmayan Ters Transkriptaz İnhibitörlerinin Kantitatif Yapı-Aktivite İlişkisi, Aktivite Tahmini ve Moleküler Dinamiği

Öğrenin, HIV-1 üretimini hedefleyen RNA moleküllerinin etkinlik ve toksisite değerlendirmesi için hızlı tarama yöntemini. 293T hücreleri kullanılarak yeni RNA tasarımları eşzamanlı olarak taranır ve terapötik adaylar belirlenir.

Bir gen ya da ilaç terapisinde kullanım için, HIV-1 üretim yapan RNA'lar etkinlik ve toksisite Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet