İzole Çalışma Sıçan Kalp Glukoz ve Yağ Asidi Oksidasyonu Oranlarının Belirlenmesine Yöntemleri

Bu prosedürün genel amacı, izole çalışan bir sıçan kalbinde miyokardiyal glikoz oksidasyonu ve yağ asidi oksidasyonu hızlarının yanı sıra kardiyak kontraktil fonksiyonun eş zamanlı gerçek zamanlı ölçümlerini elde etmektir. Bu yöntem, kardiyovasküler alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin kalbin enerji taleplerindeki akut değişikliklere metabolik olarak nasıl adapte olduğu ve bu yanıtların patolojik durumlarda nasıl etkilendiği gibi.

Bu tekniğin temel avantajı, araştırmacıya kalbe iletilen substratların, ilaçların veya hormonların doğası ve konsantrasyonları gibi çevresel değişkenler üzerinde tam kontrol sağlamasıdır. Uygulamayı gerçekleştirecek kişi, Mississippi Tıp Merkezi Kardiyovasküler Reno Kaynak Merkezi'nden doktora sonrası araştırmacı Bhavisha Bakrania olacaktır. Başlamak için, perfüzyon düzeneğini hazırlamak ve tampon çözeltiyi oksijenlendirmek amacıyla pompayı çalıştırın.

Materyaller hazırlandıktan sonra, bir sıçanı anestezi altına alın ve cerrahi işlem için hazırlayın. Karın bölgesindeki tüyleri tıraşlayın ve lateral uzantılı bir orta hat insizyonu gerçekleştirin. Vena cava inferior'a erişmek için mideyi ve bağırsağı kenara çekin ve 200 USP ünite Heparin enjekte edin.

Beş ila 10 saniye bekleyin, ardından makas kullanarak diyaframı ve göğüs kafesinin yanlarını keserek göğüs boşluğunun içeriğini açığa çıkarın. Sonrasında, kalbi elinizle nazikçe kavrayın ve hem kalbi hem de akciğerleri birlikte çıkarın. Bu işlem sırasında aort yayı ve çıkan aortuna zarar vermemeye dikkat ederek, inen aorta seviyesinden kesin.

Kalp ve akciğerleri derhal buz gibi soğuk KH tamponu ile doldurulmuş bir diseksiyon kabına aktarın. Kalp atmayı bıraktıktan sonra, bir veya iki dakika içinde yeniden başlatılabilmesi için hızlı çalışmayı öğrenin. Şimdi kalp ve akciğerleri buz gibi soğuk KH tamponu içeren yeni bir kaba daldırın.

Akciğer dokusunun büyük parçalarını hızla kesin, ardından asendan aortu aort arkının hemen üzerinden kesin. Sonraki adımlar için radyoaktif madde kullanımıyla ilgili gerekli önlemleri alın. Daha sonra, bir pens yardımıyla aortu dikkatlice açın ve kalbi kanül üzerine doğru kaydırın.

Kanül ile aortik rotayı aşmamaya çok dikkat edin, çünkü bu durum kalpte hipoperfüzyona ve aort kapakçıklarının hasar görmesine neden olabilir. Şimdi, bağlantı noktasını bir mikro klipsle sabitleyin ve kalbin Lagendorff perfüzyonuna başlayın. Acele etmeden, aortu 3 0 ipek sütür kullanarak aortik kanüle sabitleyin ve mikro klipsi çıkarın.

Ardından pulmoner veni bulun ve gerekirse kardiyak olmayan dokuları budayın. Sol atriumun kanüle sabitlenmesi için yeterli doku bırakın. Sol atriumun kanülasyonu, protokolün en kritik ikinci adımıdır; çünkü kanülün hatalı yerleştirilmesi veya bir sızıntının olması, kasılmaları zayıflatacak ve metabolik hızların kantifikasyonunu riske atacaktır.

Ardından, sağ kanül için yapıldığı gibi sol atriyal hat kanülünü hazırlayın. Sonra pensle pulmoner venin ağzını nazikçe kavrayın ve kalbi atriyal kanülün üzerine doğru kaydırın. Aortayı bükmeden veya kalbi aşırı zorlamadan dokuları gerektiği şekilde hareket ettirin.

Ardından kanülü 3 0 ipek sütür ile sabitleyin. Son olarak, aort hattını çalışma moduna alırken eş zamanlı olarak atriyum hattını açın. Eğer sol atriyumdan tampon sızarsa, atriyum hattını kapatın ve tekrar Lagendorff moduna geçin.

Ardından, kanülü daha iyi sabitlemek için daha fazla sütür kullanın ve tekrar çalışma moduna geçmeyi deneyin. Eğer deney, bir kateter ile LV fonksiyonunun doğrudan ölçümünü içeriyorsa, öncelikle 26 gauge bir iğne kullanarak LV apeksini ponktüre edin, bir basınç-hacim kateteri yerleştirin ve şaftı LV boylamsal ekseniyle hizalayın. Daha sonra distal elektrot E1'i aort kapağının hemen altına, endokardiyal sınırın bitişiğine konumlandırın ve proksimal elektrot E4'ü ventrikül duvarının hemen içine yerleştirin.

Şimdi kalbi su ceketli bir hazneye yerleştirip sızdırmaz hale getirin. Ardından yazılım üzerinden fonksiyonel parametrelerin izlenmesine başlayın. Bazal parametreler en az beş dakika boyunca stabil kaldığında veri kaydını başlatın.

Koroner akışı ölçmek için 20 mililitre eflüent toplamak için geçen süreyi kaydedin. Ardından, üç yollu musluk aracılığıyla eflüentten iki mililitre şırıngaya çekin ve geri kalanını atın. İki mililitrelik örneği hemen bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve glikoz oksidasyon hızını belirlemek için yarım mililitrelik bir alikot alın.

Geriye kalanı buz üzerinde saklayın. Periyodik olarak koroner eflluens örnekleri almaya devam edin ve bitirmeden hemen önce, atrial hatta 10 µL hipertonik salin enjekte edin. Tam kanül ile birleştiği noktadan önce.

Kardiyak hacmin doğru belirlenmesi için paralel iletkenliği hesaplamak amacıyla bu bolus yanıtını kullanın. Ardından, kalp odasını mühürden kurtarın ve LV'deki kateteri çıkarın. Sonra kalbi kanüllerden kesin ve buz soğukluğundaki KH tamponuna bırakın. Şimdi, kalbi kağıt havlu üzerinde hızlıca kurulayın ve ıslak ağırlığını ölçün.

Tartım işlemi tamamlandıktan sonra, gerekli doku örneklerini disseke edin ve ardından kalan dokuyu kuru buz üzerinde soğutulmuş pensler kullanarak dondurun. Hazırlık aşamasında, cam sintilasyon şişelerine bir mililitre 10x hyamine hidroksit doldurun. Her bir koroner efüzyon örneği için bir adet ve kontroller için iki adet şişe hazırlayın.

Bir örnek şişesi yüklendiği anda, onu doğrudan yüklü bir sintilasyon şişesine yerleştirin. Analiz için, şişeyi bir kauçuk kapak tıpasıyla dikkatlice kapatın ve şişeyi mühürlemek için parafilm kullanın. Şimdi, uzun 23 gauge iğneli bir mililitrelik şırınga kullanarak, kauçuk tıpadan 200 µL %60 perklorik asit enjekte edin.

Tüm numune tüplerini gece boyunca bekletin. Ertesi gün, her bir numune tüpünü cımbızla dikkatlice çıkarın ve hyamine hidroksitin tamamını geri kazanmak için tüplerin alt kısımlarını açık şişelerin üzerine bir mililitre sintilasyon kokteyli ile yıkayın. Ardından, her şişeye dokuz mililitre daha sintilasyon kokteyli ekleyin.

Spesifik aktiviteyi elde etmek için, viallerden ikisinin içine 0,5 milliliters profüzyon tamponu ekleyin. Şimdi vialleri kuvvetlice çalkalayın ve ölçümleri yapmadan önce vialin en az altı saat boyunca dinlenmeye bırakın. Miyokardiyal oleat oksidasyon hızlarını belirlemek için öncelikle her örnek için bir anyonik değişim reçine kolonu hazırlayın.

Üç mililitrelik şırınga tüplerinin uçlarını cam yünü ile doldurun. Ardından, bir transfer pipeti kullanarak her kolona iki mililitre çizgisine kadar reçine su bulamacı ekleyin. Sonrasında, her kolondan üç kez iki mililitre ultra saf su geçirerek reçineyi yıkayın.

Ardından, kolonların altına sintilasyon tüplerini yerleştirin ve kolonları yarım mililitre koroner eflüent ile doldurun. Arka plan ölçümü için bunun yerine perfüzyon tamponu kullanın. Şimdi, kolonları sırasıyla yarım mililitre, bir mililitre ve son olarak iki mililitre ultra saf su ile elüye edin.

Kolonları atın. Ardından tüplere 13 mililitre sintilasyon kokteyli ekleyin. Özgül aktivitenin belirlenmesi için, 13 mililitre sıvı sintilasyon kokteyli ile doldurulmuş iki tüpe doğrudan 0,5 mililitre perfüzyon tamponu ekleyin.

Viyalleri kuvvetlice çalkalayın, altı saatten fazla bekletin ve ölçümleri yapın. İki adet 16 haftalık sıçandan kalpler izole edildi ve farklı stres koşullarına tabi tutuldu. Bir kalp için, afterload %40 oranında artırılarak ve perfüzyon tamponuna epinephrine eklenerek iş yükünde akut bir artış simüle edildi.

İş yükü artışı indüksiyonuyla birlikte kalp hızı anında %50'den fazla artmıştır. İş yükü artışında, hem glukoz hem de oleat oksidasyon hızlarındaki artışa eşlik eden kardiyak güç %40'tan fazla artmıştır. Glukoz oksidasyonunun bazal seviyeye göre göreceli artışı çarpıcıydı.

Diğer kalp, 15 dakikalık global iskemi ve 30 dakikalık reperfüzyona tabi tutulmuştur. Bu deneysel koşullar altında, reperfüzyonun birkaç dakika sonrası bir süre içinde neredeyse normal bir nabız basıncı geri kazanılmıştır. 10 dakika içerisinde, kardiyak güç hızla iskemi öncesi değerlerin üzerine çıkmış, ardından tekrar bazal değerlere yakın seviyelere dönmüştür.

Bu durum, artmış oleat oksidasyonundan kaynaklanmıştır. Glukoz oksidasyonu ise iskemik öncesi aktivite düzeyine hızla geri dönmüştür. Uzmanlaşıldığında, kalbin izolasyonundan çalışma modundaki ilk reperfüzyona kadar olan süreç, uygun şekilde gerçekleştirilirse beş dakikadan kısa sürede tamamlanabilir.

Bu prosedürün ardından, bir ilacın veya stres koşulunun moleküler sinyal yolakları üzerindeki etkisi gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla RNA ve protein ekspresyon analizleri gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Radyoaktif izleyicilerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken tam kişisel koruyucu ekipman kullanımı gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.